RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 161142 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 282299 (22) Data zgłoszenia: 14.11.1989 (51) IntCl5: A23K 3/00 C12N 1/20 Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób konserwowania paszy 30) Pierwszeństwo: 14.11.1988,FI,885252 Uprawniony z patentu: Valio Meijerien Keskusosuusliike, Helsinki, FI (43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.07.1990 BUP 14/90 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.1993 WUP 05/93 Twórcy wynalazku: Jouko Setala, Helsinki, FI Martin Suominen, Hyvinkaa, FI Aino Rauramaa, Espoo, FI Seppo Sivela, Helsinki, FI (74) Pełnomocnik: PHZ Polservice" (57) 1. Sposób konserwowania paszy przez zakiszenie przy użyciu bakterii Lactobacillus plantarum, znamienny tym, że do paszy dodaje się bakterie Lactobacillus plantarum o właściwościach szczepu DSM 4904, ewentualnie w połączeniu z dodatkiem innego rodzaju bakterii kwasu mlekowego i/lub środka konserwującego. PL 161142 B1
Sposób konserwowania paszy Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób konserwowania paszy przez zakiszenie przy użyciu bakterii Lactobacillus plantarum, znamienny tym, że do paszy dodaje się bakterie Lactobacillus plantarum o właściwościach szczepu DSM 4904, ewentualnie w połączeniu z dodatkiem innego rodzaju bakterii kwasu mlekowego i/lub środka konserwującego. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bakterie dodaje się w ilości 105-107cfu/g paszy, korzystnie 106cfu/g. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że szczep bakteryjny dodaje się w połączeniu z co najmniej jednym innym środkiem konserwującym. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep bakteryjny i środek (środki) konserwujący(e) dodaje się w jednym roztworze. 5. Sposób według zastrz. 1 lub 4, znamienny tym, że jako środek konserwujący stosuje się enzym rozkładający włókno roślinne, korzystnie celulozę. 6. Sposób według zastrz. 1 lub 4, znamienny tym, że jako środek konserwujący stosuje się kwasy organiczne lub ich sole, korzystnie mrówczany, benzoesan, kwas propionowy lub akrylowy. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że mrówczan stosuje się w ilości 1500 g/t paszy. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo co najmniej jeden inny szczep L. plantarum lub inny z rodzaju bakterii kwasu mlecznego, korzystnie Pediococcus. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób konserwowania paszy przez jej zakiszenie w silosach, przy użyciu bakterii Lactobacillus plantarum. Konserwowanie paszy takiej jak trawa czy sieczka sporządzona z trawy polega na tym, że zamyka się ją przed dostępem powietrza w silosie w celu sfermentowania zawartych w trawie węglowodanów (głównie glikozy, fruktozy i fruktozanów) do kwasów. W dogodnych warunkach w takich procesach fermentacyjnych powstaje głównie kwas mlekowy. Daje to kiszonkę o wysokiej jakości z niewielkimi stratami fermentacji. Na ogół fermentacja wytwarza w paszy również lotne kwasy tłuszczowe takie jak kwas octowy. Wszystkie kwasy pow stałe w wyniku fermentacji obniżają ph kiszonki. Jak wiadomo konserwowanie paszy wymaga aby wartość jej ph była zmniejszona do 4 lub niżej, co wymaga 100 równoważników kwasu na tonę paszy. Wolna fermentacja przebiegająca w paszy jest trudna do regulowania w pożądanym kierunku to znaczy w kierunku możliwie czystej fermentacji z wytwarzaniem kwasu mlekowego. Z tego względu czyniono wiele wysiłków w kierunku lepszego konserwowania pasz przez środki konserwujące. Wśród tych metod najlepiej znana jest metoda wprowadzona przez A. I. Virtanena, zwana metodą AIV, według której do paszy dodaje się oddzielnie lub w postaci mieszaniny kwas organiczny lub nieorganiczny. Kwas(y) dodaje się do paszy w ilości wystarczającej do obniżenia wartości jej ph do 4 lub niżej. Najczęściej obecnie stosuje się sam kwas mrówkowy lub w połączeniu z innymi kwasami. Inne środki konserwujące zostały opisane na przykład przez Vanbelle i Bertina w Ensilage - new biological aspects, Sanofi Sante Animale, 1985. Środki konserwujące o bezpośrednim działaniu inhibitującym fermentację obejmują te, które zawierają formalinę. Ich przykłady zawarte są we wspomnianej publikacji. Jednakże stosowaniu kwasów i mieszanin kwasowo-formalinowych towarzyszą problemy takie jak korozja typowa dla kwasów i objawy alergii wywołane przez formalinę. W związku z tym czyni się wiele wysiłków dla wprowadzenia środków konserwujących, które nie miałyby tych niekorzystnych właściwości. Alternatywne środki zawierają enzymy rozkładające włókno roślinne. Enzymy takie wytwarzają w paszy dodatkowe cukry, które mogą być wykorzystane w fermentacji wywołanej przez mikroflorę zawartą w trawie.
161 142 3 Ponieważ mikroflora obecna w trawie jest bardzo heterofermentatywna, samo wytwarzanie cukru nie jest wystarczające do zapewnienia wysokiej jakości paszy i małych strat przechowywania (na przykład według Setalä, Enzymes in the forefront of food and feed industries, Seminar at Espoo/Otaniemi, 16-17 - czerwiec, 1988). W celu zapobieżenia problemom wywołanym przez heterofermentatywność mikroflory, wraz z dodawaniem enzymów zaczęto dodawać do paszy bardziej homofermentatywne bakterie kwasu mlekowego. Stosowanie i badanie tych bakterii opisali na przykład Woolford i Sawczyc w Grass and Forage Science 39 (1984) 139-158. Stosowanie pewnych szczepów bakterii proponowano również do konserwowania paszy, na przykład w opisie europejskiego zgłoszenia patentowego EP 250 786. W większości przypadków pochodzenie szczepów, ich zachowanie się w warunkach silosowych i właściwości zidentyfikowano i opisano w omawianych publikacjach niedokładnie, i stąd przeprowadzane próby z różnymi szczepami na podstawie danych uzyskanych z publikacji miały słabe wyniki, również jeśli chodzi o jakość kiszonki. Różni badacze stosowali bardzo zróżnicowane kryteria wobec bakterii przeznaczonych do szczepienia w procesie konserwowania paszy. Na ogół do najważniejszych kryteriów należą: dobry wzrost w szerokim zakresie temperatur zarówno w warunkach aerobowych jak i anaerobowych; homofermentatywność; tolerancja kwasów; szybkie wytwarzanie kwasu; brak aktywności proteolitycznej; zdolność do fermentowania glikozy, fruktozy i sacharozy; nie wytwarzanie dekstranu z sacharozy ani mannitu z fruktozy; aktywność wobec szerokiego zakresu suchych materiałów; stabilność właściwości. Uboczną fermentację w kiszonce próbuje się powstrzmywać przez dodatek środka konserwującego, który nie powinien działać na użyte homofermentatywne bakterie kwasu mlekowego i ich właściwości. Najlepszym znanym środkiem konserwującym jest kwas mrówkowy, jednak jego użycie w połączeniu z bakteriami kwasu mlekowego było dotąd niemożliwe ponieważ kwas mrówkowy jako taki działa restrykcyjnie na aktywność bakteryjną. Nieoczekiwanie stwierdzono, że możliwe jest izolowanie z kiszonki wysoce aktywnego i tolerującego mrówczany homofermentatywnego szczepu bakterii kwasu mlekowego L. plantarum (AIV 755), zdeponowanego 20 października 1988 r. w Deutsche Sammulung von Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 4904. Szczep ten może być stosowany do konserwowania paszy ze względu na jego bardzo dobre działanie konserwujące. Sposób według wynalazku nadaje się do stosowania w konserwowaniu pasz takich jak trawa, na przykład kostrzewa łąkowa, tymotka i kupkówka. Sposób konserwowania paszy według wynalazku polega na dodaniu do paszy szczepu L. plantarum dającego się identyfikować według właściwości wymienionych niżej w punktach I do IV. W celu konserwowania do paszy dodaje się bakterie w ilości 105-107cfu/g paszy (cfu - colony forming unit - jednostka kolonizująca); korzystnie 106cfu/g paszy. Korzystne jest dodawanie bakterii w połączeniu z co najmniej jednym innym środkiem konserwującym i ewentualnie w połączeniu z co najmniej jednym innym szczepem L. plantarum lub innym rodzajem bakterii kwasu mlekowego. Bakterie i środki konserwujące mogą być dodawane w tym samym roztworze. Do odpowiednich środków konserwujących należą enzymy rozkładające włókno roślinne (takie jak celuloza), mrówczan, benzoesan, kwas propionowy i/lub kwas akrylowy. Mrówczan dodaje się korzystnie w ilości 1500 g/t paszy. Stosowany według wynalazku szczep bakterii identyfikuje się według właściwości opisanych niżej w p. I do IV. Właściwości takie posiada właśnie szczep 4904. W dalszej części zilustrowano bliżej wynalazek. Rysunek fig. 1 i 2 ilustrują opis szczepu bakteryjnego. Rysunek fig. 1 przedstawia profil plazmidowy szczepu DSM 4904. Rysunek fig. 2 przedstawia obraz elektroforezy plazmidowego DNA szczepu DSM 4904 i hodowli wyizolowanych w momencie opróżnienia silosu, trawionych enzymem restrykcyjnym BgIII (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Penzberg, RFN). Stężenia środków konserwujących podano w procentach wagowo/objętościowych, a dla zawartości suchej masy w procentach wagowo/wagowych.
4 161 142 Właściwości szczepu DSM 4904 L. plantarum. I Szczep L. plantarum wyizolowany z silosu ma następujące właściwości: gram dodatni; proste, pojedyncze pręty o jednolitej grubości; katalazoujemne; homofermentatywne; wzrost przy + 15 C; brak wzrostu przy +45 C; nie wytwarza amoniaku z argininy; wytwarza kwas L- i D-mlekowy lub specyficzną aktywność racemazy; ilość kwasu L-. mlekowego około 45% całkowitej ilości kwasu mlekowego, a ilość kwasu D-mlekowego około 55% całkowitej ilości kwasu mlekowego; przy wzroście na pożywce MRS (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) w temperaturze 30 C w ciągu 17 godzin, całkowita ilość kwasu mlekowego około 2 g /100 ml pożywki MRS. II Szczep DSM 4904 ma pojedynczy plazmid raczej o wysokim ciężarze cząsteczkowym (35-40 kb)-rys. fig. 1. III Szczep DSM 4904 fermentuje następujące cukry lub alkohole cukrowe według A PI50 CH (API System S. A. Francja): L-arabinozę, ryobozę, galaktozę, D-galaktozę, D-fruktizę, D- mannozę, mannit, alfa-metylo-d-mannozyd, N-acetyloglikozaminę, amygdalinę, arobutynę, eskulinę, salicynę, cellobiozę, maltozę, laktozę, melibiozę, sacharozę, trehalozę, melezytozę, D- rafinozę, beta-gencjobiozę, D-turanozę. IV. Inne właściwości szczepu DSM 4904. A. Szczep wykazuje tolerancję kwasu mrówkowego i co najmniej kwasu benzoesowego, akrylowego i propionowego - w wodnym roztworze mrówaczanu sodu (na przykład w 30% ph 6,25, liofilizowany preparat szczepu pozostaje co najmniej 4 godziny na poziomie wyjściowym (109cfu/ml); rośnie bardzo dobrze w pożywce MRS (ph 6,8) zawierającej 0,3% kwasu benzoesowego, oceniany w jednostkach KIett'a (Kolorymetr fotoelektryczny Kleet-Summersona, Arthur H. Thomas comp. Philadelphia P. A. USA). Przy stężeniu 0,05% kwasu benzoesowego w tej samej pożywce przy ph 4 wzrost jest jeszcze zadowalający. Inkubacja w ciągu 4 dni przy 30 C. Tabela 1 Wzrost szczepu DSM 4904 w pożywce MRS i przy różnych stężeniach kwasu benzoesowego (4 dni, 30 C) ph 6,8 ph 4,0 % jednostki Klett'a 0 600 500 0,05 600 460 0,1 600 190 0,2 600 15 0,3 550 6 0,4 510 0,5 470 tolerancja kwasu propionowego (pożywka MRS, ph 4,0). Szczep DSM 4904 rośnie dobrze w pożywce zawierającej 0,5% kwasu propionowego; szczep wykazuje tolerancję kwasu akrylowego przy jego stężeniu 0,1-0,15% (MRS, ph 4,0); szczep nie toleruje heksametylenotetraminy; B. Wrażliwość szczepu na antybiotyki. DSM 4904 jest w pełni oporny wobec następujących antybiotyków: gentamycin, kanamycin, neomycin, novobiocin, streptomycyna, sulfonamidy, vanocomycin; pewną oporność lub całkowity jej brak wykazuje wobec następujących antybiotyków: ampicyllin, bacitracin, chloramphenicol, erytromycyna, penicylina G, rifamycin, lincomycin, tetracyklina, virginiamycin, spectinomycin. V. Retencja szczepu w kiszonce.
161 142 5 Retencja DSM 4904 w kiszonce była dobra. Nawet po 5 miesiącach po sporządzeniu kiszonki (patrz przykład II) stwierdzono bakterie L. plantarum o charakterystyce identycznej z tym, jakie ma DSM 4904. Były one identyczne w reakcjach biochemicznych i profilu plazmidów i były identycznie trawione przez BgIII (rysunek fig. 2). podczas hodowli anaerobowej w pożywce MRS wraz z E. coli szczep NB (wyizolowanym z wody), DSM 4904 był zdolny do niszczenia coli w ciągu 9 dni, przy czym ilość DSM 4904 wynosiła nadal 9X 106cfu/ml po 9 dniach. VI. Wytwarzanie komórek. szczep wzrasta w środowisku opartym na serwatce. Szczep liofilizuje się. Taki preparat liofilizowany może być przechowywany w zamrażarce (-18 C) co najmniej w ciągu 6 miesięcy. VII. Stosowanie do konserwowania paszy. Liofilizowany szczep miesza się z wodą wraz z innymi środkami stosowanymi w konserwowaniu pasz takimi jak enzym i w ciągu czterech godzin od zmieszania stosuje się do konserwowania paszy w dawce 105-10 żywych komórek/g paszy. Korzystną dawką jest 106 żywych komórek/g paszy. Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. Przykład I. Sieczkę trawy o zawartości suchej masy 16,5%, w której 16,2% to surowe proteiny, 24,2% surowy błonnik, a 12,4% to cukier, zakwaszono w 10 kg szklanym słoju. Paszę upakowano starannie, a słój zamknięto arkuszem folii, zabezpieczając przed dostępem powietrza. Dodatki wprowadzano w jednym roztworze przez opryskanie przy obracaniu paszy. Wprowadzono następujące dodatki: A. bez środków konserwujących, B. AIV II roztwórx 5 l/ t paszy; C. Szczep DSM 4904 10 cfu/g paszy, enzym 150 ml/t paszy; D. jak w p. C i dodatkowo mrówczan sodu 1000 g/t paszy; E. jak w p. C i dodatkowo propionian sodu 2000 g/t paszy oraz Pediococcus pentosaceus 107 cfu/g; XAIV II roztwór zawiera 80% kwasu mrówkowego i 2% kwasu ortofosforowego. Enzym jest preparatem enzymatycznym rozkładającym włókno roślinne i zawierający głównie celulozę jak też enzymy o innej aktywności jak hemicelulaza. Wyniki prób konserwowania wykazują, że dodatek C, D i E ma bardzo korzystny wpływ na konserwowalność kiszonki. Kiszonki C, D i E zawierają więcej cukrów i mniej amoniaku jako produktu rozkładu białek niż kiszonki A i B. Wysoki stosunek zawartości kwasu mlekowego do kwasu octowego w kiszonce C, D i E jest wskaźnikiem intesywnej, wysoce homofermentatywnej fermentacji w kierunku kwasu mlekowego. Tabela 2 Skład chemiczny próbnych kiszonek, po 60 dniach kiszenia Kiszonka próbna PH Kwas mlekowy Kwas octowy Kwas masłowy Cukier NH3 % suchej masy g /l A 3,86 10,8 2,3 1,2 0,32 B 3,95 4,4 1,8 2,1 0,18 C 3,72 10,4 0,9 2,7 0;10 D 3,77 10,0 0,8 3,3 0,12 E 3,80 11,0 1,2 2,9 0,17 Ponadto skład mikrobiologiczny próbnych kiszonek wskazuje, że szczep 4904 wytrzymał dodatek mrówczanu i łączna ilość bakterii kwasu mlekowego pozostała na tym samym poziomie jak bez dodatku mrówczanu (tabela 3).
6 161 142 Tabela 3 Skład mikrobiologiczny próbnych kiszonek po 60 dniach kiszenia Kiszonka próbna LAB (X 106) Drożdże (X 103) Pleśnie CB Klostridia cfu/g kiszonki A 6 1,5-510 <100 <10 3-7 B 12 2-110 100-500 <10 3-15 C 11 11-100 100-3000 <10 4 D 7 17-110 40-1100 <10 3-40 E 10 1900-3900 <100 <10 3-50 LAB - bakterie kwasu mlekowego; CB - grupa pałeczek okrężnicy; Przykład II. Trawę o zawartości suchej masy 18,0%, w której 15,3% to surowe proteiny, 27,1 % surowy błonnik, a 10,6% to cukier, pocięto w sieczkarni i zakiszono w 500 kg silosie. Każdą z pasz upakowano starannie w dwóch równoległych silosach, które zamknięto arkuszem folii i obciążono zbiornikiem z wodą (ciśnienie około 250 kg/m2). Do pasz wprowadzono następujące dodatki: A - bez środków konserwujących; B - AIV II roztwór 5 l/t paszy (patrz przykład I); C - szczep DSM 4904 106 cfu/g; enzym 300 ml/t paszy; D - jak w p. C i dodatkowo mrówczan sodu 1000 g/t paszy; Różnice składów próbnych kiszonek były podobne jak w przykładzie I (tabela 4). Z porównania kiszonek C i D widać, że mrówczan korzystnie wpłynął na skład mikrobiologiczny w odniesieniu do obecności w kiszonce drożdży i pleśni (tabela 5). Tabela 4 Skład chemiczny próbnych kiszonek, po 140 dniach kiszenia Kiszonka próbna ph Kwas mlekowy Kwas octowy Kwas masłowy Cukier NH3-N % suchej masy % N A 3,92 11,2 2,6 0,2 10,9 B 4,15 5,2 2,0 0,9 0,5 8,7 C 3,71 10,3 1,0 3,3 1,8 D 3,69 10,5 1,0 3,7 1,8 Tabela 5 Skład mikrobiologiczny próbnych kiszonek Kiszonka próbna LAB (X 106) Drożdże (X 103) Pleśnie CB Klostridia cfu/g paszy A 67-110 35-51 10-100 <10 14-45 B 12-55 300-440 100-200000 10-6700 450-45000 C 1-8 150-46000 10-12000 10-60 <3 D 1 25-170 <10 <10 3-20 Kiszonki badano na ich trwałość na powietrzu i stopień zakonserwowania przez przetrzymywanie ich w temperaturze 24 C i pomiar wzrostu temperatury w każdej z nich. Pomimo wyższej zawartości cukru, kieszonki C i D pozostały trwałe w ciągu dwóch dni (tabela 6).
161 142 7 Tabela 6 Wzrost temperatury w kiszonkach ( C) Próbna kiszonka 1 dzień 2 dni 7 dni A 14 18 30 B 10 18 20 C 11 18 34 D 10 18 31 Mrówczan poprawia stabilność kiszonki, a wzrost temperatury w kiszonce D był wolniejszy niż w kiszonce C. Przykład III. Trawę o zawartości suchej masy 20-22%, w której 17,3% to surowe proteiny, 24,3% surowy błonnik, a 12,2% to cukier, zakiszono w 90 tonowym silosie bunkrowym. Trawę zbierano kosiarką, a dodatki wprowadzono w czasie krojenia (sieczkarnia). Pasze ułożono dokładnie, ubito traktorem i przykryto folią. Wprowadzono następujące dodatki: A - bez środków konserwujących; B - AIV II roztwór 5 l/t paszy (patrz przykład I); C - szczep DSM 4904 10 cfu/g paszy; enzym 300 ml/t paszy; D - jak w p. C i dodatkowo 1500g mrówczanu sodu/t paszy; E - jak w p. C i dodatkowo 103cfu Pediococcus pentosaceus/g paszy Jeśli chodzi o jakość kiszonek, to wyniki były podobne jak w przykładach I i II (tabela 7). Tabela 7 Skład chemiczny próbnych kiszonek, po 56 dniach kiszenia Kiszonka próbna ph Kwas mlekowy Kwas octowy Kwas masiowy Cukier NH3 % suchej masy g/l A 3,89 10,1 1,6 0 1,8 0,51 B 4,05 1,9 0,8 0,1 10,2 0,16 C 3,87 10,7 1,6 0 4,5 0,37 D 3,84 10,4 1,2 0 4,0 0,30 E 3,78 10,8 0,8 0 5,3 0,21 Przykład IV. W tabeli 8 przedstawiono szybkość zmniejszania się wartości ph i wytwarzania kwasów L- i D-mlekowego w różnych kiszonkach z przykładu II. Tabela 8 Zmniejszanie się wartości ph i wytwarzanie kwasu mlekowego w różnych kiszonkach w okresie 0-14 dni po zakiszeniu Próbna kiszonka Oznaczenie 0 2 Czas - dni 3 7 14 A ph 5,8 5,6 4,6 4,1 4,1 kwas L-mlekowy 0,1 1,4 2,7 3,9 4,7 kwas D-mlekowy 0,1 0,4 2,2 3,3 3,9 kwas octowy 0,0 0,5 0,7 1,0 1,2 B ph 4,1 4,2 4,1 4,2 4,3 kwas L-mlekowy 0,1 0,0 0,1 0,1 0,4 kwas D-mlekowy 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 kwas octowy 0,0 0,0 0,0 0,1 0,3 C ph 5,7 3,9 3,8 3,9 3,8 kwas L-mlekowy 0,1 3,1 4,1 4,4 4,7 kwas D-mlekowy 0,1 5,3 5,6 5,3 5,4 kwas octowy 0,0 0,4 0,5 0,9 1,0 D ph 5,8 4,0 3,9 3,8 3,8 kwas L-mlekowy 0,1 2,5 2,8 3,9 4,0 kwas D-mlekowy 0,1 5,7 5,7 5,5 5,6 kwas octowy 0,0 0,4 0,4 0,7 0,9
8 161 142 Po dwóch dniach szczep DSM 4904 i enzym z dodatkiem lub bez dodatku mrówczanu zredukował wartość ph kiszonki poniżej 4, co jest poziomem pożądanym ze względu na konserowanie paszy. Również szybkość wytwarzania kwasu mlekowego była wysoka, jako że łączna ilość tego kwasu po dwóch dniach wynosiła już powyżej 8% suchej masy. W sposób typowy dla szczepu DSM 4904 fermentacja w kiszonkach była bardzo jednorodna od samego początku. Niewielka ilość kwasu octowego w kiszonce jest wskaźnikiem czystej fermentacji, przy czym dodatek mrówczanu powodował dalsze obniżenie wytwarzania kwasu octowego w kiszonce. Przykład Va. Trawę w przeważającej części tymotkę zakiszono w 10 kg silosie laboratoryjnym. Dodatkami ręcznie opryskano paszę, kiszonkę ubito, zważono i zamknięto przed dostępem powietrza. Kiszenie prowadzono w ciągu 60 dni. Wyniki badań zawarte w tabeli 9 wskazują, że szczep DSM 4904 daje dobre rezultaty konserwowania. Jeśli chodzi o kwasy fermentacyjne to kiszonka bez dodatku środków konserwujących była bardzo podobna do kiszonki z dodatkiem DSM 4904, podczas gdy ta ostatnia miała wyraźnie miejsze stężenien niepożądanego NH3. Tabela 9 Konserwowanie trawy roztworem AIV II i szczepem DSM 4904 (AJV II - 5 l/ t paszy, szczep DSM 4904 106cfu/g paszy) Dodatek do paszy ph Kwas mlekowy Kwas octowy Kwas masłowy Cukier NH3 % suchej masy g/l Bez dodatku 4,0 8,3 1,8 0 1,3 0,39 AIV II 4,1 3,6 0,9 0 7,1 0,24 Szczep DSM 4904 3,9 7,5 1,8 0 1,4 0,12 Przykład Vb. Trawę, w przeważającej części tymotkę, zakiszono w około 10 tonowym silosie bunkrowym. Paszę zbierano kombajnem do traw, przy czym jednocześnie, podczas zbioru dodawano dodatki konserwujące. Silos zabezpieczono przed dostępem powietrza folią i obciążono ciężarem wodnym. Jak wynika z tabeli 10 kiszonka z dodatkiem enzymu była bardzo podobna do kiszonki bez dodatku środków konswerwujących. Z porównania wyników przedstawionych w tabeli 9 i 10 widać, że kiszonka z dodatkiem enzymu wyraźnie ustępuje kiszonce z dodatkiem szczepu DSM 4904 pod względem stężenia amoniaku. Tabela 10 Wpływ enzymu celulazy na fermentację trawy w czasie kiszenia w ciągu 140 dni Kwas mlekowy Kwas octowy Kwas masłowy Środek konserwujący ph Cukier NH3 % suchej masy g/l Bez dodatków 3,89 7,4 1,0 0 2,7 0,77 Enzym 3,82 9,5 0,9 0 3,1 0,59 Przykład VI. Trawę, w przeważającej części tymotkę, zakiszono w 10kg silosie laboratoryjnym takim jak w przykładzie Va. Tabela 11 Wpływ propionianu sodu na fermentację kiszonki Kwas mlekowy Kwas octowy Kwas masłowy Cukier NH3 LAB ph do paszy % suchej masy g/l cfu/g X 106 DSM 4904 + enzym 3,8 12,1 1,3 0 2,4 0,15 9,5 DSM 4904 4- enzym + 0,2% Na propionianu 3,8 12,6 1,1 0 2,9 0,13 160
161 142 9 Propionian sodu nie wpłynął szkodliwie na ilość bakterii kwasu mlekowego (LAB), podczas gdy jakość fermentacji (stosunek ilości kwasu mlekowego do kwasu octowego, ilość NH3) była lepsza (tabela 11). Przykład VII. Około 45 ton trawy, przeważnie tymotki i kostrzewy łąkowej, zakiszono w silosie bunkrowym. Trawę posiekano, przy czym wprowadzono jednocześnie dodatki. Trawę ubito w silosie traktorem, przykryto folią przed dostępem powietrza i obciążono. Tabela 12 Wpływ benzoesanu sodu na fermentację kiszonki w ciągu 56 dni Dodatek do paszy ph Kwas mlekowy Kwas octowy Kwas masłowy Cukier NH3 % suchej masy g /l D SM 4904 + 3,9 10,7 1,6 0 4,5 0,37 enzym DSM 4904 + enzym + 0,05% SB 3,9 10,3 1,5 0 3,0 0,37 DSM 4904 + enzym + 0,1% SB 3,8 11,1 1,1 0 4,7 0,24 (SB - benzoesan sodu) Benzoesan sodu nie wpłynął szkodliwie na ilość bakterii kwasu mlekowego (LAB). We wszystkich kiszonkach ilość bakterii kwasu mlekowego wahała się pomiędzy 106 i 108cfu/g. Działanie benzoesanu wydatnie wpłynęło na zmniejszenie ilości drożdży. Bez benzoesanu ilość drożdży wynosiła 100cfu/g. Kiszonki poddane działaniu benzoesanu nie zawierały drożdży. Jakość fermentacji była jednak lepsza przy dawce 0,1% benzoesanu sodu (tabela 12).
161 142 FIG. 1 FIG. 2 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł