Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + i CD133 +, uzyskanych ze szpiku kostnego chorych ze świeŝym zawałem mięśnia sercowego

PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 1, str. 73 86 ANNA KORYCKA 1, MICHAŁ PLEWKA 2, ANNA KRAWCZYŃSKA 1, MARTA ZUBKOWICZ 1, AGNIESZKA WIERZBOWSKA 1, AGATA WRZESIEŃ- KUŚ 1, AGNIESZKA PLUTA 1, MARIA KRZEMIŃSKA-PAKUŁA 2, TADE- USZ ROBAK 1 Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + i CD133 +, uzyskanych ze szpiku kostnego chorych ze świeŝym zawałem mięśnia sercowego The evaluation of efficacy of bone marrow CD34 + and CD133 + cells, isolated from patients with acute myocardial infarction 1 Z Kliniki Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak 2 Z Kliniki Kardiologii II Katedry Kardiologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. med. Maria Krzemińska-Pakuła STRESZCZENIE U chorych ze świeŝym zawałem serca w ostatnich latach zainteresowanie budzi moŝliwość terapeutycznego wykorzystania szpikowych komórek macierzystych CD34+ oraz CD133+, potencjalnie zdolnych do regeneracji uszkodzonego miokardium. Wielu badaczy wykazało skuteczność przeszczepiania tych komórek do strefy zawału, jako bezpiecznej metody stanowiącej uzupełnienie farmakoterapii lub konwencjonalnej terapii inwazyjnej. Celem naszych badań była ocena efektywności izolacji komórek CD34 + oraz CD133 + uzyskanych ze szpiku kostnego 38 chorych ze świeŝym zawałem mięśnia sercowego przed ich autotransplantacją do naczyń wieńcowych. Wykazaliśmy, Ŝe liczba wyizolowanych komórek CD34 + ze szpiku kostnego zmniejsza się wraz z wiekiem chorych. Badania nasze wskazały ponadto, Ŝe izolacja komórek jednojądrowych ze szpiku w celu przeprowadzenia dowieńcowego przeszczepu moŝe być wykonywana pomiędzy 3 11 dobą. Pomimo uzyskania największej liczby komórek CD34 + w 3 6 dobie zawału, wpływ zastosowanego leczenia na perfuzję i funkcję lewej komory będzie moŝna ocenić po przeanalizowaniu wyników uzyskanych u chorych leczonych tą metodą po zakończeniu rocznego okresu obserwacji. SŁOWA KLUCZOWE: Komórki macierzyste Komórki CD34/CD45 + Komórki CD133/CD45 + ŚwieŜy zawał mięśnia sercowego SUMMARY In the last few years the possibility of therapeutic use of CD34 + and CD133 + bone marrow progenitor cells that are potentially capable of regenerating the damaged myocardium in patients with acute myocardial infarction has been arousing more and more interest. Many authors have demonstrated the efficacy of bone marrow progenitor cells autotransplantation as a safe method supplementary to pharmacotherapy and to standard invasive therapy. The aim of our study was to evaluate the efficacy of bone marrow CD34 + and CD133 + cells isolation in 38 patients with acute

74 A. KORYCKA i wsp. myocardial infarction. We have demonstrated that the number of CD34 + cells isolated from bone marrow decreases with the age of patients. Moreover, our study has demonstrated that the isolation of mononuclear cells for intracoronary transplantation can be performed between 3 11 day after infarction. The number of CD34 + cells was found to be the highest when obtained at 3-6 days following infarction, however the efficacy of autotransplantation on the perfusion and left vertricle performance can be assessed only after 12-month follow-up. KEY WORDS: Progenitor cells CD34/CD45 + cells CD133/CD45 + cells Acute myocardial infarction WSTĘP Komórki macierzyste pnia stanowią pulę niewyspecjalizowanych komórek prekursorowych, zdolnych zarówno do róŝnicowania w komórki potomne, które będą pełniły wyspecjalizowane funkcje, jak równieŝ do samoodnowy, zapewniającej uzupełnianie i utrzymywanie stałej liczby komórek macierzystych, niezbędnej dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Przez wiele lat uwaŝano, Ŝe jedynym źródłem krwiotwórczych komórek macierzystych jest szpik kostny, a przeszczepianie hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku stało się jedną z metod leczenia niektórych chorób układu krwiotwórczego. Wyniki kolejnych badań wykazały jednak, Ŝe komórki macierzyste są takŝe obecne w tzw. mobilizowanej krwi obwodowej oraz we krwi pępowinowej. Zastosowanie cytokin lub leków cytostatycznych powoduje przesunięcie puli macierzystych komórek hematopoetycznych ze szpiku kostnego do krwi obwodowej, a autologiczne przeszczepy tych komórek stały się w wielu przypadkach alternatywą dla przeszczepiania szpiku (1). Potencjalnym źródłem macierzystych komórek krwiotwórczych do celów przeszczepowych okazała się być takŝe krew pępowinowa (2,3). Badania następnych lat wykazały, Ŝe w szpiku kostnym oprócz macierzystych komórek krwiotwórczych znajduje się równieŝ populacja macierzystych komórek podścieliska tzw. macierzystych komórek mezenchymalnych, nie związanych bezpośrednio z hematopoezą, natomiast zdolnych do róŝnicowania m.in. do hepatocytów, adipocytów, fibroblastów, osteocytów, miocytów, kardiomiocytów i neuronów (4 6). W przeciwieństwie do macierzystych komórek krwiotwórczych, komórki te nie są jednak wykrywane we krwi obwodowej i krwi pępowinowej i nie wykazują ekspresji antygenów CD34 i CD45. Z komórek macierzystych szpiku wywodzą się ponadto prekursorowe komórki śródbłonka (endotelialne), fenotypowo zbliŝone do komórki hematopotycznej pnia i spokrewnione z angioblastami. RóŜnicują się one do komórek śródbłonka i są odpowiedzialne za formowanie nowych naczyń z naczyń juŝ istniejących (angiogeneza) lub z naczyń powstałych de novo (neowaskularyzacja) (7). Prawdopodobnie macierzysta komórka krwiotwórcza, jak równieŝ prekursorowa komórka śródbłonka wywodzą się ze wspólnej hemangioblastycznej komórki prekursorowej, niezbędnej do rozwoju zarówno komórek hematopoetycznych, jak i naczyń krwionośnych (8). Macierzyste komórki śródbłonkowe zidentyfikowano w szpiku kostnym, krwi obwodowej i pępowinowej oraz przestrzeni śródmiąŝszowej mięśni szkieletowych (9).

Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + I CD 133 + 75 Na powierzchni krąŝących prekursorowych komórkek endotelialnych wykazano obecność antygenów CD34, CD31, CD45, HLA-DR, VE-kateryny, receptora R2 dla naczyniowa-śródbłonkowgo czynnika wzrostu (VEGFR2) oraz receptora c-kit (7, 10) Ekspresję antygenu CD34 +, glikozylowanego białka transbłonowego, naleŝącego do rodziny cząsteczek adhezyjnych i homologicznego z sialomucyną, wykryto takŝe na powierzchni wczesnych macierzystych komórek krwiotwórczych (11). W szpiku kostnym osób zdrowych ekspresję tego antygenu obserwuje się na 1 3% komórek jednojądrowych, we krwi pępowinowej waha się ona w granicach 0,1 0,4%, natomiast we krwi obwodowej wynosi zaledwie 0,01 01% (12). Około 1/10 populacji komórek CD34 + stanowią mniej dojrzałe komórki CD34 + CD38 - i CD34 + HLA-DR - (12). Wczesne komórki CD34 + charakteryzuje ponadto słaba ekspresja antygenu CD117, podczas gdy komórki bardziej dojrzałe, wśród których znajdują się komórki HLA-DR + wykazują wysoką ekspresję receptora c-kit (13). Ostatnio na pierwotnych macierzystych komórkach krwiotwórczych, jak równieŝ na prekursorowych komórkach endotelialnych stwierdzono ponadto obecność transbłonowej glikoproteiny będącej homologiem promininy-5 i oznaczonej jako antygen CD133 +. Przypuszcza się, Ŝe antygen ten moŝe uczestniczyć w regulacji wzrostu i róŝnicowania komórek macierzystych. Wykazano, Ŝe jego ekspresja gwałtownie maleje w miarę róŝnicowania i dojrzewania komórek macierzystych. Antygen CD133 nie jest obecny na dojrzałych komórkach śródbłonka, moŝe natomiast występować na komórkach młodszych zarówno samodzielnie, jak i łącznie z antygenem CD34, który nie jest obecny na niezróŝnicowanych komórkach macierzystych, z których wywodzą się prekursorowe komórki endotelialne (10, 11). Dlatego teŝ obydwa antygeny są często wykorzystywane jako markery słuŝące do selekcji i oczyszczania prekursorowych komórek śródbłonkowych. Odkrycia te, a w szczególności omówiona wyŝej zdolność wielokierunkowego róŝnicowania komórek macierzystych, stały się podstawą do rozpoczęcia badań nad zastosowaniem ich przeszczepiania w leczeniu chorób niehematologicznych, między innymi w neurologii, w uszkodzeniach ośrodkowego układu nerwowego oraz w chirurgii ortopedycznej w celu regeneracji tkanki chrzestnej i kostnej (6, 9, 14). Od ponad 10 lat zainteresowanie budzi takŝe moŝliwość terapeutycznego wykorzystanie komórek macierzystych, potencjalnie zdolnych do regeneracji uszkodzonego mięśnia sercowego (15, 16). Wielu autorów wykazało skuteczność wykonywania przeszczepów komórek macierzystych u ludzi, jako bezpiecznej metody stanowiącej uzupełnienie farmakoterapii lub konwencjonalnej terapii inwazyjnej u chorych ze świeŝym zawałem mięśnia sercowego (17 19). W następstwie zawału dochodzi do spontanicznej mobilizacji szpikowych komórek macierzystych CD34 + i CD133 +. Wśród izolowanej do autoprzeszczepu populacji komórek CD45 + znajdują się komórki wykazujące ekspresje antygenów CD34/45 + oraz CD133/45 +. Liczba uzyskanych komórek moŝe mieć istotne znaczenie dla efektywności neowaskularyzacji, a w konsekwencji poprawy funkcji mięśnia sercowego po zawale. Celem naszych badań była ocena efektywności izolacji komórek CD34+ oraz CD133+ uzyskanych ze szpiku kostnego chorych na świeŝy zawał mięśnia sercowego

76 A. KORYCKA i wsp. przed ich autotransplantacją do naczyń wieńcowych. Podjęliśmy ponadto próbę odpowiedzi na pytanie czy efektywność izolacji komórek macierzystych jest zaleŝna od wieku chorych oraz czy czas pomiędzy zawałem, a izolacją komórek macierzystych ma wpływ na liczbę uzyskiwanych komórek. MATERIAŁY I METODY Pacjenci Do badania zakwalifikowano 38 chorych (11 kobiet i 27 męŝczyzn) w wieku od 34 do 72 lat (średnia 56,3±8,9), którzy latach 2006 2007 byli hospitalizowani w Klinice Kardiologii II Katedry Kardiologii UM w Łodzi, z powodu świeŝego zawału mięśnia sercowego. Chorzy ci byli leczeni pierwotną angioplastyką z implantacją stentu do gałęzi przedniej zstępującej lewej tętnicy wieńcowej, z napływem TIMI III bezpośrednio po zabiegu. Kryteriami włączenia do badania była nieobecność istotnych zmian w pozostałych naczyniach wieńcowych oraz znaczna dysfunkcja skurczowa lewej komory, z frakcją wyrzutową w ciągu pierwszych trzech dni zawału poniŝej 40%. Kryteriami wykluczenia były: niestabilność hemodynamiczna w okresie pozawałowym, czynna infekcja, choroba nowotworowa oraz przewlekła choroba układowa. Wszyscy chorzy wyrazili świadoma zgodę na udział w badaniu. W 3-11 dobie zawału, u chorych w znieczuleniu miejscowym i krótkotrwałej sedacji doŝylnej, z talerzy kości biodrowej pobierano 100 ml szpiku kostnego. Izolację komórek jednojądrowych szpiku kostnego, jak równieŝ ocenę ekspresji antygenów CD34 oraz CD133 metodą cytometrii przepływowej wykonywano u wszystkich chorych w Klinice Hematologii UM w Łodzi. Izolacja komórek jednojądrowych Procedurę izolacji komórek jednojądrowych wykonywano w warunkach jałowych w przeznaczonej do tego celu i spełniającej kryteria bezpieczeństwa mikrobiologicznego komorze laminarnej Safe Flow 1.2 firmy Bioair (USA), stosując metodykę opisaną przez Fotino i wsp. (20) oraz Boyum i wsp. (21) we własnej modyfikacji (22). Szpik kostny w objętości 100ml pobierany w obecności antykoagulanta (10 ml cytrynianu sodu) umieszczano w worku przeszczepowym firmy Baxter (USA) o pojemności 600 ml i rozcieńczano 20 ml jałowego, izotonicznego roztworu soli fizjologicznej firmy Braun (Niemcy). W celu usunięcia szkodliwych mikrocząsteczek z materiału przeszczepowego, przeprowadzano wstępne filtrowanie z zastosowanie filtrów do transfuzji krwi, z membraną o porach o średnicy 40 µm, firmy PALL (PALL Co, USA). Do wyjaławianych metodą gazową probówek firmy Sarstedt (Niemcy) o pojemności 50 ml pipetowano po 20 ml jałowego preparatu Ficoll-Paque Plus firmy Amersham Biosciences (Wielka Brytania), a następnie delikatnie nawarstwiano po ok. 20 ml przefiltrowanego szpiku kostnego. Probówki umieszczano w uprzednio wysterylizowanych i szczelnie zamykanych koszyczkach wirowniczych, które instalowano w rotorze wi-

Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + I CD 133 + 77 rówki Multifuge 1S-R firmy Heraeus (Niemcy) i wirowano w przez 20 min, w temp. 15 0 C przy szybkości 2600 obrotów/min. Następnie izolowano pierścień komórek jednojądrowych, komórki dwukrotnie płukano, dodając jałowy roztwór soli fizjologicznej i wirując przez 10min.w temp. 15 0 C przy szybkości 1800 obrotów/min. Nadsącz usuwano, a pozostałe komórki jednojądrowe zawieszono w 32 ml soli fizjologicznej. Jednorodną zawiesinę zawierającą komórki jednojądrowe w objętości 30 ml filtrowano przez filtr PALL do worka przeszczepowego o pojemności 150 ml. Tak przygotowaną zawiesinę komórek macierzystych przeszczepiano pacjentom w Klinice Kardiologii, w ciągu 2 3 godzin od izolacji, wykonując ich dowieńcowe podanie przez cewnik balonowy ze światłem wewnętrznym (typu over the wire, Ninja, Cordis), dystalnie do miejsca uprzedniej okluzji naczynia. Podawano 20 ml zawiesiny w 4 porcjach po 5 ml, w czasie 2 minut, z 2-minutową przerwą pomiędzy kolejnymi inflacjami balonu. Pozostałe 2 ml zawiesiny wykorzystywano w Klinice Hematologii w celu morfologicznej oceny uzyskanych komórek jednojądrowych, pod kątem ich całkowitej liczby, z uwzględnieniem wzoru odsetkowego, jak równieŝ do cytofotometrycznej oceny ekspresji antygenów CD34 + i CD133 +. śywotność komórek oceniano testem z uŝyciem błękitu trypanu. Cytofluorometryczna ocena antygenów CD34 + i CD133 + Do zawiesiny komórek jednojądrowych dodawano następujące przeciwciała monoklonalne: anty-45 (Becton Dickinson, USA) sprzęŝone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), anty-cd34 (Becton Dickinson, USA) sprzęŝone z fikoerytryną (PE) oraz anty-cd133 (Milteyi Biotec GmbH,Niemcy) sprzęŝone z fikoerytryną (PE). Jako kontrole stosowano przeciwciała: IgG1/IgG2. Próbki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej i lizowano chlorkiem amonu. Zawiesinę komórek jednojądrowych oceniano w cytometrze przepływowym Facs Calibur firmy Becton Dickinson, analizując 100.000 krwinek białych w jednej próbce (23 25). Bezwzględną liczbę uzyskanych komórek CD34+ lub CD133+ obliczano wg wzoru (25): Całkowita liczba wyizolowanych komórek [x10 9 /l] x liczna komórek CD34 + (CD133 + ) 100 000 komórek CD45 + Analiza statystyczna Analizę statystyczną przeprowadzano za pomocą testów nieparametrycznych. Rozkład zmiennych ilościowych w badanych grupach porównywano testem Manna- Whitneya lub Kruskala-Wallisa dla prób niezaleŝnych, natomiast współzaleŝność pomiędzy zmiennymi ilościowymi oceniano za pomocą testu Spearmana. Jako próg znamienności statystycznej przyjęto p<0,05.

78 A. KORYCKA i wsp. WYNIKI Chorych podzielono na dwie grupy wiekowe. Grupę poniŝej 55 rŝ stanowiło 16 chorych (3 kobiety i 13 męŝczyzn) w wieku 34 54 lata (mediana 49; x=47,7±5,5), natomiast w grupie powyŝej 55 rŝ znajdowało się 22 chorych (7 kobiet i 15 męŝczyzn) w wieku 56 72 lata (mediana 62,5; x=62,5±4,0). Materiał przeszczepowy oceniano pod kątem Ŝywotności uzyskanych komórek oraz podstawowych parametrów hematologicznych, takich jak: wartość hematokrytu, całkowita liczba wyizolowanych komórek jednojądrowych, odsetek granulocytów obojętnochłonnych, limfocytów i monocytów oraz liczba płytek krwi. śywotność komórek wynosiła ok. 99%, natomiast wartość hematokrytu we wszystkich przypadkach nie przekraczała 0,1%. Pozostałe parametry nie róŝniły się statystycznie w obydwu grupach chorych (Tabela 1). Tabela 1. Charakterystyka materiału przeszczepowego w zaleŝnosci od wieku chorych Table 1. Characteristics of autograft dependence on the age of patients Chorzy <55rŜ n=16 Chorzy > 55rŜ n= 22 P Całkowita liczba wyizolowanych 7,54±2,3 6,57±2,7 0,18 komórek [x10 9 /l] (3,2 11,02) (1,3 12,3) Granulocyty obojętnochłonne [%] 18,6±5,3 18,7±8,0 0,93 (9,2 28,8) (6,6 39,3) Limfocyty [%] 57,7±7,7 58,9±10,5 0,93 (46 69,4) 43,2±79,6) Monocyty [%] 20,7±5,3 20,4±9,7 0,68 (12 29,8) (4,8 41,9) Płytki krwi [ 10 9 /l] 51,0±30,7 57,0±28,6 0,65 (21 96) (16 115) Bezwzględna liczba komórek CD34+ /µl 171,9±67,3 (60,8 280,7) 125,3±83,0 (47,1 347,8) 0,032 R= 0,37 Bezwzględna liczba komórek CD133+ /µl 13,4±5,9 (5,7 24,4) 16,4±9,2 (4,1 39,1) 0,43 W odniesieniu do zmiennych ilościowych podano wartość średnią ± odchylenie standardowe oraz w nawiasie zakres obserwowanych wartości. W wyizolowanym materiale komórki CD34 + stanowiły 2,03±0,7% (0,7 3,8%), a komórki CD133 + 0,21±0,1% (0,06 0,63%) komórek uzyskanych ze szpiku kostnego. Bezwzględna liczba wyizolowanych komórek CD34 + była znamiennie wyŝsza w grupie chorych poniŝej 55 rŝ, niŝ w grupie starszych chorych (p=0,032) (Tabela 1) (Ryc.1). Wykazano takŝe ujemną korelację pomiędzy wiekiem chorych, a bezwzględną liczbą komórek CD34 + (R=-0,37; p=0,03) (Ryc.2). Bezwzględna liczba komórek CD133 + nie róŝniła się natomiast istotnie w obydwu badanych grupach (Tabela 1) (Ryc. 1). Czas pomiędzy wystąpieniem zawału serca, a izolacją komórek jednojądrowych do autotransplantacji wynosił 3 11 dni. Chorych podzielono na trzy grupy. Grupę pierwszą stanowiło 14 chorych (2 kobiety i 12 męŝczyzn), u których izolację komórek wy-

Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + I CD 133 + 79 260 220 konywano pomiędzy 3 6 dobą zawału, grupę drugą stanowiło 12 chorych (4 kobiety i 7 męŝczyzn), u których izolację wykonano w 7 dobie oraz trzecią grupę 12 chorych (4 kobiety i 8 męŝczyzn), u których izolację wykonywano pomiędzy 8 11 dobą zawału. Pomimo, Ŝe liczba komórek CD34 + zmniejszała się wraz z wydłuŝaniem czasu od wyp=0,032 Bezwzględna liczba CD34+/ul 180 140 100 60 20 Chorzy poniŝej 55rŜ 1 2 Chorzy powyŝej 55rŜ ±Odch. std. ±Błąd std. Średnia 28 24 p=0,43 Bezwzględna liczba CD133+/ul 20 16 12 8 4 Chorzy poniŝej 55rŜ 1 2 Chorzy powyŝej 55rŜ ±Odch. std. ±Błąd std. Średnia Ryc. 1. Bezwzględna liczba komórek CD34 + i 133 + w zaleŝności od wieku chorych Fig. 1. The absolute number of CD34 + and CD133 + cells dependence on the age of patients

80 A. KORYCKA i wsp. stąpienia zawału, uzyskane wartości nie róŝniły się statystycznie istotnie (Tabela 2) (Ryc. 3). W przypadku komórek CD133 + nie uzyskano róŝnic w zaleŝności od doby, w której wykonywano izolację komórek. Tabela 2. Porównanie liczby komórek CD34 + i CD133 + w zaleŝności od czasu pomiędzy zawałem, a izolacją komórek macierzystych do autotransplantacji Table 2. The comparison of the absolute number of CD34 + and CD133 + progenitor cells dependence on the time of their autotransplantation Izolacja <7 doby Izolacja w 7 dobie Izolacja > 7 doby p n=14 n=12 n=12 Liczba komórek CD 34 + 165,7±84,0 134,5±95,9 127,9±48,8 >0,05 (66,2-347,8) (47,1-319,2) (60,8-233,8) Liczba komórek CD133 + 16,0±9,6 (4,1-39,1) 14,7±7,3 (5,2-28,7) 15,4±6,9 (5,2-28,7) >0,05 W odniesieniu do zmiennych ilościowych podano wartość średnią ± odchylenie standardowe oraz w nawiasie zakres obserwowanych wartości. 347,8 319,2 R=-0,37 p=0,03 LICZBA KOMÓREK CD34/ul 270,5 222,9 189,4 156,8 121,4 81,7 47,1 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 WIEK Ryc. 2. ZaleŜność pomiędzy wiekiem, a ilością uzyskanych komórek CD34 + Fig. 2. Dependence between age and number of CD34 + cells

Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + I CD 133 + 81 300 260 p>0,05 Bezwzględna liczba komórek CD34+/ul 220 180 140 100 60 20 <7 7 >7 ±Odch. std. ±Błąd std. Średnia Doba po zawale Ryc. 3. Bezwzględna liczba komórek CD34 + w zaleŝności od czasu wykonania izolacji komórek Fig. 3. The absolute number of CD34 + cells dependence on the time of mononuclear cells isolation DYSKUSJA Znaczny rozwój nowoczesnych, inwazyjnych technik diagnostycznych i leczniczych umoŝliwił istotny postęp w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych. Stosując pierwotną angioplastykę wieńcowa, połączoną z farmakoterapią, u znacznego odsetka chorych udaje się ograniczyć rozmiar strefy martwicy pozawałowej. JednakŜe, zawał mięśnia sercowego nadal często prowadzi do rozwoju niewydolności serca. U części chorych, pomimo zastosowania nowoczesnych metod terapeutycznych, dochodzi do niekorzystnej przebudowy pozawałowej serca, dysfunkcji lewej komory, a w konsekwencji do rozwoju niewydolność mięśnia sercowego (26, 27). W ostatnich latach wykazano, Ŝe prekursorowe komórki śródbłonka odgrywają istotną rolę w naprawie naczyń wieńcowych uszkodzonych po zawale. Stało się to przesłanką ich wykorzystania w kardiologii, w celu regeneracji martwiczo uszkodzonej tkanki mięśnia sercowego, jak równieŝ w prewencji przebudowy serca. Ukazały się liczne publikacje przedstawiające skuteczność tej metody, z wykorzystaniem róŝnych dróg podawania komórek macierzystych (18, 19, 28). Obecnie, u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym komórki macierzyste najczęściej podaje się drogą dowieńcową przez balonowy cewnik ze światłem wewnętrznym dzięki czemu docierają one w obszar unaczynienia tętnicy odpowiedzialnej za zawał (28). Aktywacja cząsteczek adhezyjnych i cytokin umoŝliwia przenikanie komórek poza ścianę naczynia, co prawdopodobnie prowadzi do neowaskularyzacji mięśnia sercowego.

82 A. KORYCKA i wsp. W naszych badaniach zarówno izolacja, jak i autotransplatacja komórek wykonywana była w pomiędzy 3 11 dobą po zawale. Uzyskane przez nas wyniki wskazują, Ŝe czas wykonania izolacji nie wpływał na liczbę uzyskanych komórek CD34 + i CD133 +, mimo, Ŝe obserwowaliśmy tendencję do zmniejszania się liczby komórek CD34 + wraz z wydłuŝeniem czasu od wystąpienia zawału do pobrania materiału. Wielu autorów opublikowało wyniki badań, w których porównywano funkcję mięśnia sercowego u chorych poddanych autotransplantacji komórek jednojądrowych izolowanych ze szpiku kostnego do naczynia wieńcowego odpowiedzialnego za zawał, ze stosowaniem standardowej terapii inwazyjnej (19, 29, 30). Izolacja komórek, podobnie jak w naszych badaniach, odbywała się w róŝnym czasie od wystąpienia zawału, a autotransplantacja wpływała korzystnie na funkcję lewej komory i poprawę kurczliwości mięśnia sercowego. Strauer i wsp. podawali komórki jednojądrowe w 7 dobie zawału, uzyskując poprawę w tym zakresie, w porównaniu z grupą kontrolną (28). W randomizowanym badaniu TOPCARE-AMI autotransplantacje wykonywano u 59 chorych w 4 dobie zawału, natomiast w randomizowanym badaniu BOOST u 60 chorych z ostrym zawałem serca porównywano implantację komórek jednojądrowych szpiku kostnego wykonaną w 4-8 dobie, ze standardową terapię inwazyjną (18, 19). Randomizowane badanie REPAIR-AMI wykonane u 204 chorych, dotyczące wpływu przeszczepienia szpikowych komórek jednojądrowych pobranych w 3 5 dobie zawału, wykazało poprawę frakcji wyrzutowej lewej komory w porównaniu z grupą kontrolną (29). Inni badacze przedstawili pozytywne efekty podania komórek macierzystych szpiku kostnego nawet w 11 dobie po zawale serca, uzyskując poprawę frakcji wyrzutowej lewej komory przy braku poprawy w grupie kontrolnej (30). W przeciwieństwie do zachęcających wyników badań przedstawionych powyŝej, Janssens i wsp., wykonując autoprzeszczep w 1 dobie po zawale, nie uzyskali poprawy funkcji lewej komory, ani poprawy perfuzji (31). Podobnie brak wpływu zastosowanego leczenia na parametry hemodynamiczne serca przedstawił Lunde i wsp. (32). Wyniki badań Schächinger i wsp. (29) oraz Janssens i wsp. (31) wskazują, Ŝe najlepsze efekty podawania komórek macierzystych uzyskano, gdy autotransplantacja wykonywana była powyŝej 5 dnia zawału, natomiast nie powinna ona być stosowana w 1 dobie zawału. MoŜe to wynikać z aktywnego procesu zapalnego w pierwszych dobach zawału oraz z resorpcji komórek martwicy. Nie moŝna bowiem wykluczyć negatywnego wpływu zbyt wczesnego podania zawiesiny komórek jednojądrowych, co byłoby zgodne z hipotezą przedstawioną przez autorów badania REPAIR-AMI, Ŝe podanie do strefy zawału komórek macierzystych wcześniej niŝ w 3 dobie moŝe zmniejszać korzystny efekt terapii (29). Poczynioną przez nas obserwację, Ŝe maksymalną liczbę komórek CD34 + uzyskuje się pobierając szpik pomiędzy 3 6 dniem po zawale moŝna tłumaczyć migracją komórek macierzystych do utraconego miokardium podczas procesu określanego jako homing, w odpowiedzi na stres spowodowany zawałem (33,34). W materiale uzyskiwanym w wyniku izolacji komórek jednojądrowych wykonywanych 7 dnia po zawale i później obserwowaliśmy natomiast tendencję do obniŝenia bezwzględnej liczby komórek CD34 + w szpiku. Wyniki naszych badań dotyczących komórek CD34 są zgodne z doniesieniami Turan i wsp. (35), którzy oce-

Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + I CD 133 + 83 niając czynniki spontanicznej mobilizacji komórek CD34 + i CD133 + wykazali, ze liczba obydwu populacji komórek wzrastała począwszy od 1-go dnia zawału, osiągając najwyŝszą wartość 7 dnia, natomiast od 8 dnia zaczynała się zmniejszać (35). Obserwowana przez nas liczba komórek CD133 + nie róŝniła się jednak w zaleŝności od czasu wykonania autotransplsantacji. Turan i wsp. oceniali liczbę komórek prekursorowych śródbłonka, obecnych w mobilizowanej podczas zawału krwi obwodowej, podczas gdy nasze badania wykonywane były na podstawie izolacji komórek uzyskanych ze szpiku. Badania ostatnich lat wskazują ponadto, Ŝe procedura izolacji komórek ze szpiku kostnego równieŝ wpływa na ilość i jakość uzyskiwanych komórek jednojądrowych, a w konsekwencji na poprawę parametrów hemodynamicznych u chorych na zawał. Izolację komórek jednojądrowych przeprowadzano stosując róŝne komercyjnie dostępne media, zawierające polisacharydy oraz antykoagulant, i umoŝliwiające rozdział komórek krwi lub szpiku na drodze wirowania w gradiencie gęstości. Większość autorów wykonywała izolację na Ficollu (17, 18, 28, 29). JednakŜe autorzy radmonizowanego badania ASTAMI, wykonywali izolację komórek na limfoprepie, natomiast Wollert i wsp. jako jedyni zastosowali technikę sedymentacji na Ŝelu wielobursztynianowym (19, 36). Seeger i wsp. porównali skuteczność izolacji na Ficollu (Cambrex) i limfoprepie (Axis Shield), wykazując, Ŝe z podobnej objętości szpiku kostnego, w wyniku izolacji na Ficollu uzyskiwana jest większa niŝ na limfoprepie liczba komórek jednojądrowych, co wpływa korzystnie na zmniejszenie rozległości zawału i poprawę parametrów hemodynamicznych (37). W przeprowadzonych przez nas badaniach do izolacji komórek stosowaliśmy wirowanie w gradiencie gęstości, stosując Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosceinces, Wielka Brytania). Uzyskana przez nas liczba komórek wykazujących ekspresję antygenu CD34 + wynosiła ok. 2%, natomiast komórek wykazujących ekspresję CD133 + ok. 0,21% wszystkich wyizolowanych komórek, co jest zgodne z danymi piśmiennictwa (12). W badaniach naszych, podobnie jak w badaniach TOPCARE-AMI (18), BOOST (19) oraz Janssen i wsp. (31) komórki przeszczepiano w dniu izolacji, podczas gdy Strauer i wsp. (28) oraz Fernandez-Aviles i wsp. (17) zawieszali je w 20% autologicznym osoczu i stosowali całonocną inkubację. Nie ma jak dotąd jednoznacznych dowodów potwierdzających, Ŝe czas, po którym izolowane komórki poddawane są autotransplantacji wpływa na efekt zastosowanego leczenia. W celu zapewnienia maksymalnej Ŝywotności komórek przestrzegaliśmy jednak aby nie przekraczać 3 godzin pomiędzy zakończeniem izolacji, a autoprzeszczepem. W badaniach naszych wykazaliśmy ponadto, Ŝe liczba komórek CD34 + jest większa u ludzi młodszych (poniŝej 55 rŝ), niŝ u chorych starszych. Podobne wyniki uzyskali Turan i wsp, którzy oceniali tę zaleŝność w 1 dobie zawału (35). Wydaje się prawdopodobne, Ŝe liczba komórek CD34 + w szpiku maleje wraz z wiekiem ze względu na spowodowane apoptozą postępujące uszkodzenie śródbłonka, prowadzące do wyczerpywania się liczby macierzystych komórek szpiku. Podsumowując, u chorych z ostrym zawałem mięśnia sercowego wydajność izolacji komórek CD34 + do celów autotransplantacji dowieńcowej zmniejsza się wraz z wiekiem chorych. Izolacja tych komórek ze szpiku moŝe być wykonywana pomię-

84 A. KORYCKA i wsp. dzy 3 11 dobą po zawale. Pomimo uzyskania największej liczby komórek CD34 + w 3 6 dobie zawału, wpływ zastosowanego leczenia na perfuzję i funkcję lewej komory będzie jednak moŝna ocenić dopiero po przeanalizowaniu wyników uzyskanych u chorych leczonych tą metodą i porównaniu z grupą leczoną standardowo, po zakończeniu rocznego okresu obserwacji. Praca finansowana ze środków Ministerstwa Nauki jako projekt badawczy nr 2 (PO5B 178 28) PIŚMIENNICTWO 1. Arai S, Klingemann HG. Hematopoietic stem cell transplantation: bone marrow vs. mobilized peripheral blood. Arch. Med. Res., 2003; 34: 545 553. 2. Broxmayer HE, Douglas GW, Hangoc G, Cooper S, Bard J, English D i wsp. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86: 3828 3832. 3. Cairo M, Magner JE. Placental and /or umbilical cord blood: An alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood, 1997; 90: 4665 4678. 4. Urbaniak-Kujda D, Wołowiec D, Tomaszewska-Toporska B, Kapelko-Słowik K, Kuliczkowski K. Mezenchymalne komórki macierzyste: ich biologia i perspektywy zastosowań klinicznych. Acta. Haematol. Pol., 2005; 36: 161 166. 5. Hui JH, Ouyang HW, Hutmacher DW, Goh JC, Lee EH. Mesenchymal stem cells in musculoskeletal tissue enginieering: a review of recent advances in National University of Singapore. Ann. Acad. Med. Singapore, 2005; 34: 206 212. 6. Yen AH, Sharpe PT. Regeneration of teeth using stem cell-based tissue engineering. Expert Opin. Biol. Ther., 2006; 6: 9 16. 7. Góra-Tybor J, Krawczyńska A. KrąŜące komórki śródbłonka - nieinwazyjny marker angiogenezy. Acta Haematol. Pol., 2007; 38: 195 202. 8. Asahara T, Nasuda H, Takahashi T i wsp. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ. Res., 1999; 85: 221 228. 9. Brzozowski A, Dmoszyńska A. Perspektywy leczniczego zastosowania komórek macierzystych szpiku w chorobach niehematologicznych. Acta Haematol. Pol., 2003; 34: 139 149. 10. Shaw JP, Basch R, Shamamian P. Hematopoietic stem cells and endothelial cell precursors express Tie-2, CD31 and CD45. Blood Cells Mol. Dis., 2004; 32: 168 175. 11. He X, Gonzalez V, Tsang A, Thompson J, Tsang TC, Harris DT. Differential gene expression profiling of CD34+ CD133+ umbilical cord blood hematiopoietic srem progenitor cells. Stem Cells Dev., 2005; 14: 188 198. 12. D Arena G, Musto P, Cascavilla N, Di Giorgio G, Zendoli F, Carotenuto M. Human umbilical cord blood: Immunophenotypic heterogeneity of CD34+ hematopoietic progenitor cells. Haematologica, 1996; 81: 404 409. 13. Kopeć-Szlęzak J, Podstwka U. Komórki hematopoetyczne CD34+ krwi pępowinowej. Acta Haematol. Pol., 2001; 32: 61 69. 14. Langston JW. The promise of stem cells in Parkinson disease. J. Clin. Invest., 2005; 115: 23-25. 15. Forrester JS, Price MJ, Makkar RR. Stem cell repair of infarcted myocardium. An overview for clinicians. Circulation, 2003; 108: 1139 1145.

Ocena efektywności izolacji komórek CD34 + I CD 133 + 85 16. Beeres S, Bengel F, Bartunek J i wsp. Role of imaging in cardiac stem cell therapy. J. Am. Coll. Cardiol., 2007; 49: 1137 1148. 17. Fernández-Avilés F, San Roman JA, Garcia-Frade J. i wsp. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res., 2004; 95: 742 748. 18. Schachinger V, Assmus B, Britten MB i wsp. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction: final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial. J. Am. Coll. Cardiol., 2004; 44: 1690 1696. 19. Wollert KC, Meyer GP, Lotz J i wsp. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet, 2004; 364: 141 148. 20. Fotino M, Merson EJ, Allen FH. Micromethod for rapid separation of lymphocytes from peripheral blood. Ann. Clin. Lab. Sci., 1971; 1: 131 133. 21. Boyum A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol., 1976; 5 supl. 5: 9 15. 22. Korycka A, Smolewski P, Robak T. The influence of farnesyl protein transferase inhibitor R115777 (Zarnestra) alone and in combination with purine nucleoside analogs in vitro. Eur. J. Haematol., 2004; 73: 418 426. 23. Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, Popma J, Nayar R, Sutherland DR. Single platform flow cytometric absolute CD34+cell counts based on the ISHAGE guidelines. Cytometry, 1998; 34: 61 70. 24. Basso G, Timeus F. Cytofluorometric analysis of CD34 cells. Bone Marrow Transplant. 1998; 22, Supl. 5: 17 20. 25. Leuner S, Arland M, Kahl C, Jentsch-Ulrich K, Franke A, Hoffkes HG. Enumaration of CD34- positice hematopoietic progenitor cells by flow cytometry: comparison of valumetric assay and ISHAGE gating strategy. Bone Marrow Transplant. 1998; 22: 699 706. 26. Plewka M, Krzemińska-Pakuła M, Korycka A, JeŜewski T, Kasprzak JD. Transplantacja komórek macierzystych u pacjentów z zawałem serca- fakty i mity. Pol. Przegl. Kardiol., 2006; 8: 422 425. 27. Plewka M, Krzemińska Pakuła M, JeŜewski T, Lipiec P, Wierzbowska K, Peruga JZ, Korycka A, Robak T, Kasprzak JD. Wczesna ocena rezerwy wieńcowej w badaniu echokardiograficznym po dowieńcowym podaniu jednojądrzastych komórek szpiku kostnego w grupie pacjentów po zawale. Pol. Przegl. Kardiol., 2008 (w druku). 28. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, i wsp. Repair infarcted myecardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cells transplantation in humans. Circulation. 2002; 106: 1913 1918. 29. Schächinger V, Erbs S, Elsässer A i wsp. Improved clinical outcome after intracoronary administration of bone-marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction: final 1-year results of the REPAIR-AMI trial. Eur. Heart J., 2006; 27: 2775 2783. 30. Bartunek J, Vanderheyden M, Vandekerckhove B i wsp. Intracoronary injection of CD133- positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction; feasibility and safety. Circulation, 2005; 112 [suppl I]:178 183. 31. Janssens S, Dubois C, Bogaert J i wsp. Autologous bone marrow derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet, 2005; 367: 113 121. 32. Lunde K, Solheim S, Aakhus S i wsp. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med., 2006; 355: 1199 1209. 33. Lapidot T, Dar A, Kollet O. How do stem cells find their way home? Blood, 2005; 106: 1901 1910. 34. Laird D, von Andrian UH, Wagers AJ. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell, 2008; 132: 612 630. 35. Turan RG, Brehm M, Koestering M i wsp. Factors influencing spontaneous mobilization of CD34+ and CD133+ progenitor cells after myocardial infarction. Eur. J. Clin. Invest., 2007; 37: 842 851. 36. Lunde K, Solheim S, Aakhus S, Arnesen H, Abdelnoor M, Forfang K. Autologous stem cell transplantation in acute myocardial infarction: The ASTAMI randomized controlled trial. Intracoronary

86 A. KORYCKA i wsp. transplantation of autologous mononuclear bone marrow cells, study design and safety aspects. Scand. Cardiovasc., 2005; 39: 150 158. 37. Seeger F, Tonn T, Krzossok N, Zeiher AM, Dimmeler S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mono nuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 2007; 28: 766 772. Praca wpłynęła do Redakcji 14.02.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 28.03.2008 r. Adres Autorów: Dr hab. med. Anna Korycka Katedra i Klinika Hematologii UM w Łodzi ul. Pabianicka 62 93-513 Łódź