RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1957106 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 02.11.2006 06809207.1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/26 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 16.10.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/42 EP 1957106 B1 (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała antagonistyczne skierowane przeciw peptydowi związanemu z genem kalcytoniny i sposoby je wykorzystujące (30) Pierwszeństwo: 14.11.2005 US 736623 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: 20.08.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/34 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.03.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/03 (73) Uprawniony z patentu: Labrys Biologics Inc., San Francisco, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1957106 T3 JOERG ZELLER, South San Francisco, US KRISTIAN TODD POULSEN, South San Francisco, US YASMINA NOUBIA ABDICHE, South San Francisco, US JAUME PONS, South San Francisco, US SIERRA JONES COLLIER, South San Francisco, US ARNON ROSENTHAL, Woodside, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla 12 53-114 Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
PZ/2199/AGR 1 EP 1 957 106 B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek odnosi się do stosowania przeciwciał antagonistycznych anty-cgrp w celu zapobiegania, łagodzenia lub leczenia objawów naczynioruchowych, takich jak bóle głowy związane z CGRP (np. migreny) i uderzenia gorąca. Stan techniki [0002] CGRP (peptyd związany z genem kalcytoniny) jest 37 aminokwasowym neuropeptydem, który należy do rodziny peptydów obejmującej kalcytoninę, adrenomedulinę i amylinę. U ludzi istnieją dwie postacie CGRP (α-cgrp i β-cgrp) i mają podobne aktywności. Różnią się trzema aminokwasami i wykazują zróżnicowaną dystrybucję. Za zróżnicowane aktywności mogą także odpowiadać przynajmniej dwa podtypy receptora CGRP. CGRP jest neurotransmiterem w centralnym układzie nerwowym i wykazano, że jest silnym czynnikiem rozszerzającym naczynia na obwodzie, gdzie neurony zawierające CGRP są blisko powiązane z naczyniami krwionośnymi. Rozszerzanie naczyń za pośrednictwem CGRP jest również powiązane z neurogennym stanem zapalnym, jako część kaskady zdarzeń, która skutkuje wynaczynieniem osocza i rozszerzeniem naczyń włosowatych i ma miejsce przy migrenie. [0003] Zwracano uwagę na możliwy związek CGRP z objawami naczynioruchowymi (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol. 35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Objawy naczynioruchowe (VMS, ang. vasomotor symptoms), takie jak uderzenia gorąca i nocne poty, są najczęstszymi objawami powiązanymi z menopauzą, występującymi u 60% do 80% wszystkich kobiet w następstwie naturalnej lub wywołanej chirurgicznie menopauzy. Uderzenia gorąca są prawdopodobnie odpowiedzią adaptacyjną centralnego układu nerwowego (CNS, ang. central nervous system) na obniżenie sterydowych hormonów płciowych (Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001)). Do dzisiaj, najskuteczniejszymi terapiami przeciw uderzeniom gorąca są terapie oparte o hormony, w tym estrogeny i/lub niektóre progestyny. Terapie hormonalne mogą być skuteczne w łagodzeniu uderzeń gorąca, ale nie są odpowiednie dla wszystkich kobiet. Uważa się, że obserwowane objawy psychologiczne i emocjonalne, takie jak nerwowość, zmęczenie, drażliwość, bezsenność, depresja, utrata pamięci, bóle głowy, stany lękowe, nerwowość lub brak zdolności do koncentracji są wywoływane przez zaburzenia snu w następstwie uderzeń gorąca lub nocnych potów (Kramer et al., W: Murphy et al., 3.sup.rd Int l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Paryż, Francja: SCI: 3-7 (1992)). [0004] Mężczyźni także doświadczają uderzeń gorąca w następstwie spadku hormonów sterydowych (androgenów). Ma to miejsce w przypadkach zaniku androgenów powiązanego z wiekiem (Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35) jak również w ekstremalnych przypadkach deprywacji hormonalnej powiązanych z leczeniem raka prostaty (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47-54). Nawet jedna trzecia tych pacjentów doświadczy utrzymujących się i częstych objawów, na tyle ciężkich żeby sprawiać istotne dolegliwości i niedogodności. [0005] CGRP jest silnym czynnikiem rozszerzającym naczynia, który powiązano z patologią innych objawów naczynioruchowych, takich jak wszystkie postacie naczyniowego bólu głowy, w tym migreny
PZ/2199/AGR 2 EP 1 957 106 B1 (bez lub z objawem aury) i klasterowy ból głowy. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1075, 2004. Poziomy CGRP w surowicy w żyle szyjnej zewnętrznej są podniesione u pacjentów podczas migrenowego bólu głowy. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. Dożylne podawanie ludzkiego α-cgrp wywoływało ból głowy i migrenę u pacjentów cierpiących z powodu migreny bez objawu aury, co wskazuje, że CGRP pełni rolę sprawczą w migrenie. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002. [0006] Możliwy udział CGRP w migrenie był podstawą opracowania i badania wielu związków, które hamują uwalnianie CGRP (np. sumatryptanu), są antagonistami receptora CGRP (np. dwupeptydowej pochodnej BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim) ; CGRP (8-37) ) lub oddziałują z jednym lub więcej białek powiązanych z receptorem, takich jak, błonowe białko modyfikujące aktywność receptora (RAMP, ang. receptor activity membrane protein) lub białko składowe receptora (RCP, ang. receptor component protein), które to oba wpływają na wiązanie się CGRP z jego receptorem. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23: 51-53, 2002. Podtypy alfa-2 receptora andrenergicznego i receptory adenozyny A1 również kontrolują (hamują) uwalnianie CGRP i aktywację nerwu trójdzielnego (Goadsby et al., Brain 125: 1392-401, 2002). Agonista receptora adenozyny A1 GR79236 (metrafadil), dla którego wykazano, że hamuje neurogenne rozszerzanie naczyń i nocycepcję nerwu trójdzielnego u ludzi, może także mieć aktywność przeciw-migrenową (Arulmani et al., Cephalalgia 25: 1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23: 287-292, 2003.). [0007] Teorię tę zaciemnia fakt zaobserwowania, że dla leczenia związkami, które hamują wyłącznie neurogenny stan zapalny (np. antagoniści receptora NK1 tachykininy) lub aktywację nerwu trójdzielnego (np. antagoniści receptora 5HT 1D ), wykazano względny brak skuteczności w doraźnym leczeniu migreny, co prowadzi niektórych badaczy do wątpliwości czy hamowanie uwalniania CGRP jest głównym mechanizmem aktywności skutecznych terapii przeciw-migrenowych. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004. [0008] Migrena jest złożonym, powszechnym stanem neurologicznym, który charakteryzuje się ciężkimi, epizodycznymi napadami bólu głowy oraz powiązanymi cechami, które mogą obejmować nudności, wymioty, wrażliwość na światło, dźwięk lub ruch. U niektórych pacjentów, ból głowy poprzedzony jest połączony z objawem aury. Ból głowy może być silny i może również u niektórych pacjentów być jednostronny. [0009] Napady migreny są uciążliwe w codziennym życiu. W USA i Zachodniej Europie, ogólna częstość występowania cierpiących na migreny wynosi 11% populacji ogólnej (6% mężczyzn; 15-18% kobiet). Ponadto, mediana częstotliwości napadów u jednostki wynosi 1,5/miesiąc. Chociaż są dostępne liczne terapie łagodzące lub zmniejszające objawy, dla tych pacjentów, którzy mają więcej niż 3-4 napady migreny na miesiąc, zalecane jest leczenie zapobiegawcze. Goadsby et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002. [0010] Różnorodność interwencji farmakologicznych, które stosowano w leczeniu migreny i różnorodność odpowiedzi wśród pacjentów są dowodem na zróżnicowany charakter tego zaburzenia. Tak więc, w ciągu osiemdziesięciu lat do leczenia migreny stosowano takie, względnie nieselektywne, leki jak alkaloidy sporyszu (np. ergotaminę, dihydroergotaminę, metysergid), które wykazują aktywność serotoninergiczną, jak również adrenergiczną, noradrenergiczną i dopaminergiczną. Inne terapie obejmują opiaty (np.
PZ/2199/AGR 3 EP 1 957 106 B1 oksykodon) i antagonistów β-adrenergicznych (np. propranolol). Niektórzy pacjenci, zwykle ci z łagodniejszymi objawami, mogą kontrolować swoje objawy z pomocą środków wydawanych bez recepty, takich jak jeden lub więcej z niesterydowych środków przeciwzapalnych (NSAID, ang. non-steroidal antiinflammatory agents), takich jak połączenie aspiryny, acetaminofenu i kofeiny (np. Excedrin Migraine). [0011] Ostatnio, niektórych pacjentów z migreną leczono topiramatem, środkiem przeciwdrgawkowym, który blokuje kanały sodowe zależne od napięcia i pewne receptory glutaminianu (AMPA- kainian), nasila aktywność receptora GABA- A i blokuje anhydrazę węglanową. Względnie niedawne powodzenie antagonistów receptora serotoniny 5HT-1B/1D i/lub 5HT-1a, takich jak sumatryptan, u niektórych pacjentów, doprowadziło badaczy do zaproponowania serotoninergicznej etiologii zaburzenia. Niestety, chociaż niektórzy pacjenci dobrze odpowiadają na tą terapię, inni są względnie oporni na jej wpływ. [0012] Postulowano, że u podstaw zaburzenia leży dysfunkcja kanału jonowego w aminergicznych jądrach pnia mózgu, jednakże dokładna patofizjologia migreny nie jest dotąd dobrze zrozumiana. Dla jednej z postaci migreny, rodzinnej migreny połowicznoporaźnej, wykazano powiązanie z mutacjami missens w podjednostce α1 sterowanego napięciem kanału wapniowego typu P/Q i uważa się za prawdopodobne, że zostaną także znalezione inne mutacje kanałów jonowych w innych populacjach pacjentów. Chociaż rozszerzenie naczyń krwionośnych jest powiązane z i zaostrza objawy bólowe migreny, takie zdarzenia naczynioruchowe uważa się za skutek, a nie przyczynę, stanu. Ogólnie, za wspólną cechę migreny uważa się dysfunkcję szlaków pnia mózgu modulujących bodźce zmysłowe. Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002. Istota wynalazku [0013] Ujawniony tu wynalazek dotyczy przeciwciał antagonistycznych anty-cgrp i przeciwciał antagonistycznych anty-cgrp do zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania objawom naczynioruchowym, takim jak bóle głowy, takim jak migrena z lub bez objawu aury, migrena połowicznoporaźna, klasterowe bóle głowy, nerwoból migrenowy, przewlekłe bóle głowy, napięciowe bóle głowy i bóle głowy wynikające z innych stanów medycznych (takich jak zakażenie lub zwiększone ciśnienie w czaszce z powodu guza). Inne objawy naczynioruchowe obejmują uderzenia gorąca. [0014] Według niniejszego wynalazku, zapewnione jest przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp, którym jest ludzkie przeciwciało lub przeciwciało humanizowane z powinowactwem wiązania (K D ) dla ludzkiego α-cgrp wynoszącym 50 nm lub mniej, mierzonym powierzchniowym rezonansem plazmonowym (ang. surface plasmon resonance) w 37 C. [0015] W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia przeciwciało do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania przynajmniej jednemu objawowi naczynioruchowemu u osobnika, obejmującym podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp według wynalazku. [0016] W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia przeciwciało do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania bólowi głowy (np. migrenie i klasterowemu bólowi głowy) u osobnika, obejmującym podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp według wynalazku.
PZ/2199/AGR 4 EP 1 957 106 B1 [0017] W innym aspekcie, wynalazek zapewnia przeciwciało do stosowania w sposobie łagodzenia, kontrolowania, zmniejszania częstości lub opóźniania rozwinięcia lub postępowania bólu głowy (np. migreny i klasterowego bólu głowy) u osobnika, obejmującym podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp według wynalazku. [0018] W kolejnym przykładzie wykonania, wynalazek zapewnia przeciwciało do stosowania w sposobach łagodzenia, kontrolowania, zmniejszania częstości lub opóźniania rozwinięcia lub postępowania bólu głowy (np. migreny i klasterowego bólu głowy) u osobnika, obejmującym podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp według wynalazku, w połączeniu z przynajmniej jednym dodatkowym środkiem przydatnym dla leczenia bólu głowy. Takie dodatkowe środki obejmują agonistów podobnych do 5-HT 1 (i agonistów działających na inne miejsca 5- HT1) oraz niesterydowe leki przeciwzapalne (NSAID). [0019] Przykłady agonistów 5-HT1, których można stosować w połączeniu z przeciwciałem anty-cgrp, obejmują klasę związków znanych jako tryptany, takich jak sumtryptan, zolmitryptan, naratryptan, rizatryptan, eletryptan, almotryptan i frowatryptan. Dla alkaloidów sporyszu i powiązanych związków również znana jest aktywność agonistyczna dla 5-HT i były one stosowane do leczenia bólów głowy takich jak migrena. Pośród tych związków są winian ergotaminy, maleinian ergonowiny, mesylaty ergoloidu (np. dihydroergokomina, dihydroergokrystyna, dihydroergokryptyna i mesylat dihydroergotaminy (DHE 45)). [0020] Przykłady NSAID, które można stosować w połączeniu z przeciwciałem anty-cgrp obejmują naproksen, flurbiprofen, ketoprofen, oksaprozynę, etodolak, indometacynę, ketorolak, nabumeton, kwas mefenamowy i piroksykam. Dodatkowe NSAID obejmują inhibitory cyklooksygenazy-2 (COX-2). Członkowie tej grupy obejmują: celekoksyb, rofekoksyb, meloksykam; JTE-522; L-745,337; NS398; oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. [0021] W innym aspekcie, wynalazek zapewnia przeciwciało do stosowania w sposobie łagodzenia, kontrolowania, zmniejszania częstości lub opóźniania rozwinięcia lub postępowania uderzeń gorąca u osobnika, obejmującym podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp według wynalazku. [0022] W innym aspekcie, wynalazek zapewnia przeciwciało do stosowania w sposobie łagodzenia, kontrolowania, zmniejszania częstości lub opóźniania rozwinięcia lub postępowania uderzeń gorąca u osobnika, obejmującym podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp według wynalazku, w połączeniu z przynajmniej jednym dodatkowym środkiem przydatnym dla leczenia uderzeń gorąca. Takie dodatkowe środki obejmują, ale bez ograniczenia, terapie oparte na hormonach, w tym estrogenach i/lub progestynach. [0023] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp rozpoznaje ludzki CGRP. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp wiąże się zarówno z ludzkim α-cgrp jak i β-cgrp. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp wiąże ludzki i szczurzy CGRP. Przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp wiąże C-końcowy fragment, zawierający aminokwasy 25-37 z CGRP. W niektórych przykładach
PZ/2199/AGR 5 EP 1 957 106 B1 wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp wiąże C-końcowy epitop w obrębie przeciwciał 25-37 z CGRP. [0024] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp jest przeciwciałem monoklonalnym. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty- CGRP jest humanizowane. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało jest ludzkie. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciałem antagonistycznym anty-cgrp jest przeciwciało G1 (jak tu opisano). W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp obejmuje jeden lub więcej CDR (tak jak jeden, dwa, trzy, cztery, pięć lub, w niektórych przykładach wykonania, wszystkie sześć CDR) z przeciwciała G1 lub wariantów G1 przedstawionych w Tabeli 6. W jeszcze innych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp obejmuje sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przedstawioną na Figurze 5 (SEQ ID NO: 1) i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego przedstawioną na Figurze 5 (SEQ ID NO: 2). [0025] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało obejmuje zmodyfikowany region stały, taki jak region stały, który jest immunologicznie obojętny (w tym częściowo immunologicznie obojętny), np. nie wywołuje lizy za pośrednictwem dopełniacza, nie stymuluje cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), nie aktywuje mikrogleju lub ma zmniejszoną jedną lub więcej z tych aktywności. W niektórych przykładach wykonania, region stały jest zmodyfikowany jak opisano w Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; zgłoszeniu PCT nr. PCT/GB99/01441; i/lub brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr 9809951.8. W innych przykładach wykonania, przeciwciało obejmuje ludzki region stały łańcucha ciężkiego IgG2, obejmujący następujące mutacje: A330P331 na S330S331 (numerowanie aminokwasów w odniesieniu do sekwencji IgG2 typu dzikiego). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. W niektórych przykładach wykonania, regionem stałym łańcucha ciężkiego przeciwciała jest ludzki łańcuch ciężki IgG1 z dowolną z następujących mutacji: 1) A327A330P331 na G327S330S331; 2) E233L234L235G236 na P233V234A235 z delecją G236; 3) E233L234L235 na P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 na P233V234A235G327S330S331 z delecją G236; 5) E233L234L235A327A330P331 na P233V234A235G327S330S331; oraz 6) N297 na A297 lub dowolny inny aminokwas z wyjątkiem N. W niektórych przykładach wykonania, regionem stałym łańcucha ciężkiego przeciwciała jest ludzki łańcuch ciężki IgG4 z dowolną z następujących mutacji: E233F234L235G236 na P233V234A235 z delecją G236; E233F234L235 na P233V234A235; oraz S228L235 na P228E235. [0026] W jeszcze innych przykładach wykonania, region stały jest aglikozylowany pod względem N- glikozylacji. W niektórych przykładach wykonania, region stały jest aglikozylowany pod względem N- glikozylacji przez zmutowanie reszty przyłączającej oligosacharyd (takiej jak Asn297) i/lub reszt flankujących, które są częścią sekwencji rozpoznawanej dla N-glikozylacji w regionie stałym. W niektórych przykładach wykonania, region stały jest aglikozylowany pod względem N-glikozylacji. Region stały może być aglikozylowany pod względem N-glikozylacji enzymatycznie lub przez ekspresję w komórce gospodarzu z defektem glikozylacji. [0027] Powinowactwo wiązania (K D ) przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp dla CGRP (takiego jak ludzki α-cgrp, przy pomiarze powierzchniowym rezonansem plazmonowym w odpowiedniej temperaturze, takiej jak 25 lub 37 C) może wynosić około 0,02 do około 200 nm. W niektórych
PZ/2199/AGR 6 EP 1 957 106 B1 przykładach wykonania, powinowactwo wiązania ma dowolną wartość spośród około 200 nm, około 100 nm, około 50 nm, około 10 nm, około 1 nm, około 500 pm, około 100 pm, około 60 pm, około 50 pm, około 20 pm, około 15 pm, około 10 pm, około 5 pm, lub około 2 pm. W niektórych przykładach wykonania, powinowactwo wiązania wynosi mniej niż dowolna wartość spośród 250 nm, około 200 nm, około 100 nm, około 50 nm, około 10 nm, około 1 nm, około 500 pm, około 100 pm, lub około 50 pm. [0028] Przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp można podawać przed, w trakcie i/lub po bólu głowy. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp jest podawane przed napadem bólu głowy (np. migreny i klasterowego bólu głowy). Podawanie przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp można przeprowadzać dowolnymi środkami znanymi w dziedzinie, w tym: doustnie, dożylnie, podskórnie, dotętniczo, domięśniowo, dosercowo, dordzeniowo, dopłucnie, dootrzewnowo, dokomorowo, podjęzykowo, przezskórnie i/lub przez inhalacje. Podawanie może być ogólnoustrojowe np. dożylne lub miejscowe. [0029] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp można podawać w połączeniu z innym środkiem, takim jak inny środek do leczenia bólu głowy. [0030] W innym aspekcie, wynalazek zapewnia zastosowanie przeciwciała antagonistycznego anty- CGRP według wynalazku do wytwarzania leku do stosowania w dowolnym z opisanych tu sposobów, na przykład, do leczenia lub zapobiegania bólowi głowy. [0031] W innym aspekcie, wynalazek zapewnia kompozycję farmaceutyczną do zapobiegania lub leczenia bólu głowy (np. migreny i klasterowego bólu głowy), obejmującą skuteczną ilość przeciwciała antagonistycznego anty-cgrp według wynalazku, w połączeniu z jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek. [0032] W innym aspekcie, wynalazek zapewnia zestaw do stosowania w dowolnym z opisanych tu sposobów. W niektórych przykładach wykonania, zestaw obejmuje pojemnik, kompozycję obejmującą opisane tu przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem oraz instrukcje do stosowania kompozycji w dowolnym z opisanych tu sposobów. [0033] Niniejszy wynalazek zapewnia także przeciwciała i polipeptydy antagonistyczne anty-cgrp, pochodzące od przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6. W związku z tym, w jednym aspekcie, wynalazkiem jest przeciwciało G1 (zamiennie określane jako G1 ), które jest wytwarzane przez wektory ekspresyjne mające nr dostępu ATCC PTA-6866 i PTA-6867. Na przykład, w jednym z przykładów wykonania, jest to przeciwciało obejmujące łańcuch ciężki wytworzony przez wektor ekspresyjny z nr dostępu ATCC PTA-6867. W kolejnym przykładzie wykonania, jest to przeciwciało obejmujące łańcuch lekki wytworzony przez wektor ekspresyjny z nr dostępu ATCC PTA-6866. Sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego z G1 przedstawiono na Figurze 5. Części regionu determinującego dopasowanie (CDR) przeciwciała G1 (w tym CDR wg Chothii i Kabata) również przedstawiono na Figurze 5. Należy rozumieć, że odniesienie do dowolnej części lub całego regionu z G1 obejmuje sekwencje wytworzone przez wektory ekspresyjne mające nr dostępu ATCC PTA-6866 i PTA-6867, i/lub sekwencje przedstawione na Figurze 5. Wynalazek zapewnia także warianty przeciwciała G1 z sekwencjami aminokwasowymi przedstawionymi w Tabeli 6.
PZ/2199/AGR 7 EP 1 957 106 B1 [0034] W jednym aspekcie, wynalazkiem jest przeciwciało obejmujące domenę V H, która jest w przynajmniej 85%, przynajmniej 86%, przynajmniej 87%, przynajmniej 88%, przynajmniej 89%, przynajmniej 90%, przynajmniej 91 %, przynajmniej 92%, przynajmniej 93%, przynajmniej 94%, przynajmniej 95%, przynajmniej 96%, przynajmniej 97% przynajmniej 98%, przynajmniej 99% lub w 100% identyczna z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 1. [0035] W innym aspekcie, wynalazkiem jest przeciwciało obejmujące domenę V L, która jest która jest w przynajmniej 85%, przynajmniej 86%, przynajmniej 87%, przynajmniej 88%, przynajmniej 89%, przynajmniej 90%, przynajmniej 91 %, przynajmniej 92%, przynajmniej 93%, przynajmniej 94%, przynajmniej 95%, przynajmniej 96%, przynajmniej 97% przynajmniej 98%, przynajmniej 99% lub w 100% identyczna z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 2. [0036] W innym aspekcie, wynalazkiem jest przeciwciało obejmujące fragment lub region przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6. W jednym z przykładów wykonania, fragmentem jest łańcuch lekki z przeciwciała G1. W innym przykładzie wykonania fragmentem jest łańcuch ciężki z przeciwciała G1. W jeszcze innym przykładzie wykonania, fragment zawiera jeden lub więcej regionów zmiennych z łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała G1. W jeszcze innym przykładzie wykonania, fragment zawiera jeden lub więcej regionów zmiennych z łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przedstawionych na Figurze 5. W jeszcze innym przykładzie wykonania, fragment zawiera jeden lub więcej CDR z łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała G1. [0037] W innym aspekcie, ujawnienie zapewnia polipeptydy (które mogą być lub nie być przeciwciałem) obejmujące CDR3 V H jak przedstawiony w SEQ ID NO: 5 lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: 5 o 1, 2, 3, 4 lub 5 substytucji aminokwasowych. W konkretnym przykładzie wykonania, takimi substytucjami aminokwasowymi są substytucje konserwatywne. [0038] W innym aspekcie, ujawnienie zapewnia polipeptydy (które mogą być lub nie być przeciwciałem) obejmujące CDR3 V L jak przedstawiony w SEQ ID NO: 8 lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: 8 o 1, 2, 3, 4 lub 5 substytucji aminokwasowych. W konkretnym przykładzie wykonania, takimi substytucjami aminokwasowymi są substytucje konserwatywne. [0039] W innym aspekcie, ujawnienie zapewnia polipeptydy (które mogą być lub nie być przeciwciałem) obejmujące dowolne jedno lub więcej z następujących: a) jeden lub więcej CDR z przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6; b) CDR H3 z łańcucha ciężkiego przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6; c) CDR L3 z łańcucha lekkiego przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6; d) trzy CDR z łańcucha lekkiego przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6; e) trzy CDR z łańcucha ciężkiego przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6; f) trzy CDR z łańcucha lekkiego i trzy CDR z łańcucha ciężkiego przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6. Wynalazek ponadto zapewnia polipeptydy (które mogą być lub nie być przeciwciałem) obejmujące dowolne jedno lub więcej z następujących: a) jeden lub więcej (jeden, dwa, trzy, cztery, pięć lub sześć) CDR pochodzących od przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6; b) CDR pochodzący od CDR H3 z łańcucha ciężkiego przeciwciała G1; i/lub c) CDR pochodzący od CDR L3 z łańcucha lekkiego przeciwciała G1. W niektórych przykładach wykonania, CDR to CDR przedstawiony na Figurze 5. W
PZ/2199/AGR 8 EP 1 957 106 B1 niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej CDR pochodzących od przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6, jest w przynajmniej około 85%, przynajmniej około 86%, przynajmniej około 87%, przynajmniej około 88%, przynajmniej około 89%, przynajmniej około 90%, przynajmniej około 91 %, przynajmniej około 92%, przynajmniej około 93%, przynajmniej około 94%, przynajmniej około 95%, przynajmniej około 96%, przynajmniej około 97%, przynajmniej około 98%, lub przynajmniej około 99% identycznych z przynajmniej jednym, przynajmniej dwoma, przynajmniej trzema, przynajmniej czterema, przynajmniej pięcioma lub przynajmniej sześcioma CDR z G1 lub jego wariantów. [0040] W niektórych przykładach wykonania, CDR to CDR wg Kabata. W innych przykładach wykonania, CDR to CDR wg Chothii. W innych przykładach wykonania, CDR to połączenie CDR wg Kabata i wg Chothii (określany także jako połączony CDR lub rozszerzony CDR ). Innymi słowy, dla danego przykładu wykonania zawierającego więcej niż jeden CDR, CDR mogą być dowolnymi spośród wg Kabata, wg Chothii i/lub połączonych. [0041] W niektórych przykładach wykonania, polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmuje sekwencję aminokwasową KASKXaaVXaaTYVS, w której Xaa w pozycji 5 to R, W, G, L lub N; i w której Xaa w pozycji 7 to T, A, D, G, R, S, W, lub V. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja aminokwasowa KASKXaaVXaaTYVS to CDR1 łańcucha lekkiego przeciwciała. [0042] W niektórych przykładach wykonania, polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmuje sekwencję aminokwasową XaaXaaSNRYXaa, w której Xaa w pozycji 1 to G lub A; w której Xaa w pozycji 2 to A lub H; i w której Xaa w pozycji 7 to L, T, I lub S. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja aminokwasowa XaaXaaSNRYXaa to CDR2 łańcucha lekkiego przeciwciała. [0043] W niektórych przykładach wykonania, polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmuje sekwencję aminokwasową EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG, w której Xaa w pozycji 5 to E, R, K, Q lub N; w której Xaa w pozycji 8 to A, G, N, E, H, S, L, R, C, F, Y, V, D lub P; w której Xaa w pozycji 9 to S, G, T, Y, C, E, L, A, P, I, N, R, V, D lub M; w której Xaa w pozycji 12 to H lub F; w której Xaa w pozycji 15 to E lub D. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja aminokwasowa EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG to CDR2 łańcucha ciężkiego przeciwciała. [0044] W niektórych przykładach wykonania, polipeptyd (taki jak przeciwciało) obejmuje sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 1, w której reszta aminokwasowa w pozycji 99 z SEQ ID NO: 1 to L lub jest ona podstawiona przez A, N, S, T, V lub R; i w której reszta aminokwasowa w pozycji 100 z SEQ ID NO: 1 to A lub jest ona podstawiona przez L, R, S, V, Y, C, G, T, K lub P. [0045] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciałem według wynalazku jest ludzkie przeciwciało. W innych przykładach wykonania, przeciwciałem według wynalazku jest przeciwciało humanizowane. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało jest monoklonalne. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało (lub polipeptyd) jest izolowane. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało (lub polipeptyd) jest zasadniczo oczyszczone. [0046] Region stały łańcucha ciężkiego przeciwciał może być z dowolnego typu regionu stałego, takiego jak IgG, IgM, IgD, IgA i IgE; i dowolnego izotypu, takiego jak IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
PZ/2199/AGR 9 EP 1 957 106 B1 [0047] W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało obejmuje zmodyfikowany region stały, jak tu opisano. [0048] W innym aspekcie, ujawnienie zapewnia polinukleotyd (który może być izolowany) obejmujący polinukleotyd kodujący fragment lub region przeciwciała G1 lub jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6. W jednym z przykładów wykonania, fragmentem jest łańcuch lekki przeciwciała G1. W innym przykładzie wykonania, fragmentem jest łańcuch ciężki przeciwciała G1. W jeszcze innym przykładzie wykonania, fragment zawiera jeden lub więcej regionów zmiennych z łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała G1. W jeszcze innym przykładzie wykonania, fragment zawiera jeden lub więcej (tj. jeden, dwa, trzy, cztery, pięć lub sześć) regionów determinujących dopasowanie (CDR) z łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego przeciwciała G1. [0049] W innym aspekcie, ujawniony jest polinukleotyd (który może być izolowany) obejmujący polinukleotyd, który koduje przeciwciało G1 lub jego warianty przedstawione w Tabeli 6. W niektórych przykładach wykonania, polinukleotyd obejmuje jeden z lub oba polinukleotydy przedstawione w SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10. [0050] W innym aspekcie, ujawnienie zapewnia polinukleotydy kodujące dowolne z opisanych tu przeciwciał (w tym fragmenty przeciwciał) lub polipeptydów. [0051] W innym aspekcie, ujawnienie zapewnia wektory (w tym wektory ekspresyjne i do klonowania) oraz komórki gospodarzy obejmujące dowolny z ujawnionych tu polinukleotydów. W niektórych przykładach wykonania, wektorem jest pdb.cgrp.hfcgi mający nr dostępu ATCC PTA-6867. W innych przykładach wykonania, wektorem jest peb.cgrp.hkgi mający nr dostępu ATCC PTA-6866. [0052] W innym aspekcie, ujawniona jest komórka gospodarz obejmująca polinukleotyd kodujący dowolne z opisanych tu przeciwciał. [0053] W innym aspekcie, ujawniony jest kompleks CGRP związanego z dowolnym z opisanych tu przeciwciał lub polipeptydów. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciałem jest przeciwciało G1 lub jego warianty przedstawione w Tabeli 6. [0054] W innym aspekcie, ujawniona jest kompozycja farmaceutyczna obejmująca skuteczną ilość dowolnego z opisanych tu polipeptydów ( w tym przeciwciał, takich jak przeciwciało obejmujące jeden lub więcej CDR z przeciwciała G1) lub polinukleotydów oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. [0055] W innym aspekcie, ujawniony jest sposób wytwarzania przeciwciała G1, obejmujący hodowlę komórki gospodarza lub jej potomnych, w warunkach, które pozwalają na wytwarzania przeciwciała G1, przy czym komórka gospodarz obejmuje wektor ekspresyjny, który koduje przeciwciało G1; oraz; w niektórych przykładach wykonania, oczyszczanie przeciwciała G1. W niektórych przykładach wykonania, wektor ekspresyjny obejmuje jedną z lub obie sekwencje polinukleotydowe przedstawionych w SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10. [0056] W innym aspekcie, ujawnienie zapewnia sposoby wytwarzania dowolnych z opisanych tu przeciwciał lub polipeptydów, przez wyrażanie jednego lub więcej z polinukleotydów kodujących przeciwciało (które może być wyrażane osobno jako łańcuch lekki i łańcuch ciężki lub tak, że łańcuch leki
PZ/2199/AGR 10 EP 1 957 106 B1 i ciężki są wyrażane z jednego wektora) lub polipeptydu w odpowiedniej komórce, po czym zasadniczo następuje odzyskiwanie i/lub izolacja pożądanego przeciwciała lub polipeptydów. [0057] Przeciwciało lub polipeptydy antagonistyczne anty-cgrp i polinukleotydy kodujące przeciwciała i polipeptydy według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia, zapobiegania, łagodzenia, kontrolowania lub zmniejszania częstości chorób powiązanych z nieprawidłowym funkcjonowaniem CGRP, takich jak ból głowy (np. migrena, klasterowy ból głowy, przewlekły ból głowy i napięciowy ból głowy) i inne stany, które można leczyć lub im zapobiegać przez antagonizowanie aktywności CGRP. [0058] W innym aspekcie, wynalazek zapewnia zestaw i kompozycje obejmujące dowolną jedną lub więcej z opisanych tu kompozycji. Zestawy te, zasadniczo w odpowiednim opakowaniu i dostarczone z odpowiednimi instrukcjami, są przydatne w dowolnym z opisanych tu sposobów. Opis figur rysunku [0059] Figura 1 to tabela przedstawiająca powinowactwa wiązania 12 mysich przeciwciał dla różnych fragmentów ludzkiego α-cgrp podstawianych alaniną. Powinowactwa wiązania mierzono w 25 C stosując Biacore, przepuszczając Fab nad CGRP na chipie. Wartości w ramkach odzwierciedlają utratę powinowactwa dla mutantów alaninowych względem fragmentu rodzicielskiego, 25-37 (kursywą), poza K35A, który pochodził od rodzica 19-37. a wskazuje, że powinowactwa dla fragmentów 19-37 i 25-37 są średnią ± odchylenie standardowe z dwóch niezależnych pomiarów na różnych chipach sensorowych. b wskazuje oddziaływania, które odbiegały od prostego modelu oddziaływania dwucząsteczkowego z powodu dwufazowej dysocjacji, a ich powinowactwo ustalono więc stosując model zmiany konformacji. Klucz do skali szarości: biały (1,0) wskazuje powinowactwo rodzicielskie; jasno-szary (mniej niż 0,5) wskazuje na wyższe powinowactwo niż dla rodzica; ciemnoszary (więcej niż 2) wskazuje na niższe powinowactwo niż dla rodzica; a czarny wskazuje, że nie wykryto wiązania. Figury 2A i 2B przedstawiają wpływ podawania CGRP 8-37 (400 nmol/kg), przeciwciała 4901 (25 mg/kg) i przeciwciała 7D11 (25 mg/kg) na przepływ krwi w skórze, mierzony jako przepływ krwinek po stymulacji pulsem elektrycznym przez 30 sekund. CGRP 8-37 podawano dożylnie (iv) 3-5 min. przed stymulacją pulsem elektrycznym. Przeciwciała podawano dootrzewnowo (IP) 72 godziny przed stymulacją pulsem elektrycznym. Każdy punkt na wykresach przedstawia AUC jednego szczura traktowanego w warunkach jak wskazane. Każda linia na wykresach przedstawia średnie AUC szczurów traktowanych w warunkach jak wskazane. AUC (pole pod krzywą, ang. Area Under the Curve) równa się Δprzepływ x Δczas. Δprzepływ przedstawia zmianę jednostek przepływu po stymulacji pulsem elektrycznym; a Δczas przedstawia okres czasu potrzebny dla poziomu przepływu krwinek do powrotu do poziomu przed stymulacją pulsem elektrycznym. Figura 3 przedstawia wpływ podawania różnych dawek przeciwciała 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg lub 1 mg/kg) na przepływ krwi w skórze, mierzony jako przepływ krwinek po stymulacji pulsem elektrycznym przez 30 sekund. Przeciwciała podawano dożylnie (IV) 24 godziny przed stymulacją pulsem elektrycznym. Każdy punkt na wykresie przedstawia AUC jednego szczura traktowanego w
PZ/2199/AGR 11 EP 1 957 106 B1 warunkach jak wskazane. Linia na wykresie przedstawia średnie AUC szczurów traktowanych w warunkach jak wskazane. Figury 4A i 4B przedstawiają wpływ podawania przeciwciała 4901 (1 mg/kg lub 10 mg/kg i.v.), przeciwciała 7E9 (10 mg/kg, i.v.) oraz przeciwciała 8B6 (10 mg.kg, i.v.) na przepływ krwi w skórze, mierzony jako przepływ krwinek po stymulacji pulsem elektrycznym przez 30 sekund. Przeciwciała podawano dożylnie (i.v.), a następnie stymulowano pulsem elektrycznym w 30 min., 60 min., 90 min. i 120 min. po podaniu przeciwciała. Oś Y przedstawia procent AUC w porównaniu do poziomu AUC gdy nie podano przeciwciała (czas 0). Oś X przedstawia okres czasu (minuty) między podaniem przeciwciał a stymulacją pulsem elektrycznym. * oznacza P < 0,05, a ** oznacza P<0,01, w porównaniu do czasu 0. Dane analizowano stosując jednostronną analizę wariancji ANOVA z testem porównań wielokrotnych Dunnetta. Figura 5 przedstawia sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO: 1) i regionu zmiennego łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 2) przeciwciała G1. CDR wg Kabata są pogrubione, a CDR wg Chothii są podkreślone. Reszty aminokwasowe dla regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego ponumerowano kolejno. Figura 6 przedstawia mapowanie epitopu dla przeciwciała G1 testem współzawodnictwa peptydów z zastosowaniem Biacore. N-biotynylowany ludzki α-cgrp wychwytywano na chipie sensorowym SA. Fab z G1 (50 nm) przy nieobecności peptydu współzawodniczącego lub wcześniej inkubowane przez 1 godz. z 10 um peptydu współzawodniczącego przepuszczano przez chip. Mierzono wiązanie Fab z G1 z ludzkim α-cgrp na chipie. Oś Y przedstawia procent wiązania zablokowanego przez obecność peptydu współzawodniczącego w porównaniu do wiązania przy nieobecności peptydu współzawodniczącego. Figura 7 przedstawia wpływ podawania przeciwciała G1 (1 mg/kg lub 10 mg/kg, i.v.) lub nośnika (PBS, 0,01% Tween-20) na przepływ krwi, mierzony jako przepływ krwinek po stymulacji pulsem elektrycznym przez 30 sekund. Przeciwciało G1 lub nośnik podawano dożylnie (i.v.), a następnie stymulowano nerwy pulsem elektrycznym w 30 min., 60 min. 90 min. i 120 min. po podaniu przeciwciała. Oś Y przedstawia procent AUC w porównaniu do poziomu AUC gdy nie podano przeciwciała lub nośnika (określonego jako 100%) (czas 0). Oś X przedstawia okres czasu (minuty) między podaniem przeciwciał a stymulacją pulsem elektrycznym. * oznacza P < 0,05, a ** oznacza P<0,01, w porównaniu do nośnika. Dane analizowano stosując dwustronną analizę wariancji ANOVA z testami post hoc Bonferroniego. Figura 8A przedstawia wpływ podawania przeciwciała G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg lub 10 mg/kg, i.v.) lub nośnika (PBS, 0,01% Tween-20) na przepływ krwi, mierzony jako przepływ krwinek po stymulacji pulsem elektrycznym przez 30 sekund 24 godziny po podaniu. Przeciwciało G1 lub nośnik podawano dożylnie (i.v.) 24 godziny przed stymulacją nerwów pulsem elektrycznym. Oś Y przedstawia całkowite pole pod krzywą (zmiana w przepływie krwinek mnożona przez zmianę w czasie od stymulacji do powrotu przepływu do wartości bazowej, AUC). Oś X przedstawia różne dawki przeciwciała G1. * oznacza P < 0,05, a ** oznacza P<0,01, w porównaniu do nośnika. Dane
PZ/2199/AGR 12 EP 1 957 106 B1 analizowano stosując jednostronną analizę wariancji ANOVA z testem porównań wielokrotnych Dunna. Figura 8B przedstawia wpływ podawania przeciwciała G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg lub 10 mg/kg, i.v.) lub nośnika (PBS, 0,01% Tween-20) na przepływ krwi, mierzony jako przepływ krwinek po stymulacji pulsem elektrycznym przez 30 sekund 7 dni po podaniu. Przeciwciało G1 lub nośnik podawano dożylnie (i.v.) 7 dni przed stymulacją nerwów pulsem elektrycznym. Oś Y przedstawia całkowite AUC. Oś X przedstawia różne dawki przeciwciała G1. ** oznacza P<0,01, a *** oznacza P<0,001, w porównaniu do nośnika. Dane analizowano stosując jednostronną analizę wariancji ANOVA z testem porównań wielokrotnych Dunna. Figura 8C to analiza dopasowywania krzywych dla danych z figur 8A i 8B. Przeciwciało G1 lub nośnik podawano dożylnie (i.v.) 24 godziny lub 7 dni po stymulacji nerwów pulsem elektrycznym. Oś Y przedstawia całkowite AUC. Oś X przedstawia różne dawki przeciwciała G1 w mg/kg na skali logarytmicznej, w celu ustalenia EC 50. Figura 9 przedstawia wpływ przeciwciała mu7e9 (10 mg/kg), BIBN4096BS lub nośnika (PBS, 0,01% Tween-20) na zmianę średnicy tętnicy oponowej środkowej po stymulacji polem elektrycznym. Przeciwciało mu7e9, BIBN4096BS lub nośnik podawano dożylnie (i.v.) w punkcie czasowym 0 minut po ustaleniu odpowiedzi bazowej na stymulację elektryczną. Oś Y przedstawia zmianę średnicy tętnicy oponowej środkowej po stymulacji polem elektrycznym. Średnica spoczynkowa odpowiada 0%. Oś X przedstawia czas (minuty) stymulacji pulsem elektrycznym. * oznacza P < 0,05, a ** oznacza P<0,01, w porównaniu do nośnika. Dane analizowano stosując jednostronną analizę wariancji ANOVA i test porównań wielokrotnych Dunnetta. Figura 10 przedstawia wpływ różnych dawek przeciwciała G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg lub 10 mg/kg, i.v.) lub nośnika (PBS, 0,01% Tween-20) na zmianę średnicy tętnicy oponowej środkowej po stymulacji polem elektrycznym. Przeciwciało G1 lub nośnik podawano dożylnie (i.v.) 7 dni przed stymulacją polem elektrycznym. Oś Y przedstawia zmianę średnicy tętnicy oponowej środkowej. Średnica spoczynkowa odpowiada 0%. Oś X przedstawia napięcie stymulacji. * oznacza P < 0,05, ** oznacza P<0,01, a *** oznacza P < 0,001, w porównaniu do nośnika. Dane analizowano stosując dwustronną analizę wariancji ANOVA z testami post hoc Bonferroniego. Figura 11A przedstawia wpływ przeciwciała mu4901 (10 mg/kg) lub nośnika (PBS, 0,01% Tween- 20), podawanych dożylnie (i.v.) 24 godziny wcześniej, na spadek temperatury wewnętrznej indukowany podskórnym podaniem naloksonu (1 mg/kg) u szczurów uzależnionych od morfiny. Oś Y przedstawia różnicę temperatury w stosunku do wartości bazowej. Oś X przedstawia czas mierzony od punktu podania naloksonu. Figura 11B przedstawia wpływ przeciwciała mu4901 (10 mg/kg) lub nośnika (PBS, 0,01% Tween- 20), podawanych dożylnie (i.v.) 24 godziny wcześniej, na wzrost temperatury powierzchni ogona indukowany podskórnym podaniem naloksonu (1 mg/kg) u szczurów uzależnionych od morfiny. Oś Y przedstawia różnicę temperatury w stosunku do wartości bazowej. Oś X przedstawia czas mierzony od punktu podania naloksonu.
PZ/2199/AGR 13 EP 1 957 106 B1 Szczegółowy opis wynalazku [0060] Ujawniony tu wynalazek zapewnia przeciwciało anty-cgrp, jak tu opisano, do stosowania w sposobach leczenia i/lub zapobiegania objawom naczynioruchowym takim jak ból głowy (np. migrena, klasterowy ból głowy, przewlekły ból głowy i napięciowy ból głowy) lub uderzeniom gorąca u osobnika przez podawanie osobnikowi terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała antagonistycznego anty- CGRP według wynalazku. [0061] Ujawnienie zapewnia także przeciwciała i polipeptydy antagonistyczne anty-cgrp pochodzące od G1 i jego wariantów przedstawionych w Tabeli 6. Ujawnienie zapewnia także sposoby wytwarzania i stosowania tych przeciwciał i polipeptydów. Techniki ogólne [0062] Praktyczne wykonanie niniejszego wynalazku będzie wykorzystywać, o ile nie wskazano inaczej, konwencjonalne techniki biologii molekularnej (w tym techniki rekombinacji), mikrobiologii, biologii komórki, biochemii i immunologii, które są znane w dziedzinie. Takie techniki wyjaśnione są w pełni w literaturze, takiej jak Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wydanie (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, red., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, red., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, red., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather i P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, i D.G. Newell, red., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir i C.C. Blackwell, red.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller i M.P. Calos, red., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., red., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., red., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., red., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway i P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., red., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd i C. Dean, red., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow i D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti i J.D. Capra, red., Harwood Academic Publishers, 1995). Definicje [0063] Przeciwciało to cząsteczka immunoglobuliny zdolna do swoistego wiązania z celem, takim jak węglowodan, polinukleotyd, lipid, polipeptyd itp. poprzez przynajmniej jedno miejsce rozpoznające antygen, zlokalizowane w regionie zmiennym cząsteczki immunoglobuliny. Stosowany tutaj termin obejmuje nienaruszone przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne. Przeciwciało obejmuje przeciwciało dowolnej klasy, takie jak IgG, IgA czy IgM (lub ich podklasy), a przeciwciało nie musi należeć do żadnej konkretnej klasy. W zależności od sekwencji aminokwasowej domeny stałej łańcuchów ciężkich przeciwciała, immunoglobuliny można przyporządkować do różnych klas. Jest pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Regiony stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają różnym
PZ/2199/AGR 14 EP 1 957 106 B1 klasom immunoglobulin, są nazywane, odpowiednio, alfa, delta, epsilon, gamma i mu. Struktura podjednostek i konfiguracje trójwymiarowe różnych klas immunoglobulin są dobrze znane. [0064] Stosowane tutaj przeciwciało monoklonalne odnosi się do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste, skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w odróżnieniu od preparatów z przeciwciał poliklonalnych, które zwykle zawierają różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Określenie monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała, które jest otrzymywane z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie powinno być interpretowane jako wymóg wytwarzania przeciwciała jakimkolwiek konkretnym sposobem. Na przykład, przeciwciała monoklonalne do stosowania według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane metodą hybrydomy, opisaną początkowo przez Kohler i Milstein 1975, Nature, 256: 495, lub mogą być wytwarzane sposobami rekombinacji DNA, takimi jak opisane w Pat. US nr 4, 816, 567. Przeciwciała monoklonalne mogą być także izolowane z bibliotek fagowych, wytworzonych z zastosowaniem technik opisanych, na przykład, w McCafferty et al., 1990, Nature, 348: 552-554. [0065] Stosowane tu przeciwciała humanizowane odnoszą się do postaci przeciwciał nie-ludzkich (np. mysich), które są swoistymi chimerycznymi immunoglobulinami, łańcuchami immunoglobulin lub ich fragmentami (takimi jak Fv, Fab, Fab, F(ab ) 2 lub inne pod-sekwencje przeciwciał wiążące antygen), które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą od immunoglobuliny nie-ludzkiej. W większości, przeciwciała humanizowane są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało biorca), w których reszty z regionu determinującego dopasowanie (CDR) biorcy są zastąpione resztami z CDR gatunku nie będącego człowiekiem (przeciwciało dawca) takiego jak mysz, szczur lub królik, mającymi pożądaną swoistość, powinowactwo i aktywność biologiczną. W niektórych przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR, ang. framework region) Fv z ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione odpowiadającymi resztami nie-ludzkimi. Ponadto, przeciwciało humanizowane może obejmować reszty, które nie występują ani w przeciwciele dawcy ani we wprowadzanych sekwencjach CDR lub zrębowych, ale są włączane żeby jeszcze udoskonalić i zoptymalizować wydajność przeciwciała. Ogółem, przeciwciało humanizowane będzie obejmować zasadniczo całość z przynajmniej jednej, a zwykle dwóch, domen zmiennych, w której całe lub zasadniczo całe regiony CDR odpowiadają tym z nie-ludzkiej immunoglobuliny, a całe lub zasadniczo całe regiony FR mają sekwencję konsensusu ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciało humanizowane optymalnie będzie także obejmować przynajmniej część regionu lub domeny stałej (Fc) immunoglobuliny, zwykle z ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciała mogą mieć zmodyfikowane regiony Fc, jak opisano w WO 99/58572. Inne postacie przeciwciał humanizowanych mają jeden lub więcej CDR (jeden, dwa, trzy, cztery, pięć, sześć), które są zmienione w stosunku do pierwotnego przeciwciała, co także określane jest jako jeden lub więcej CDR pochodzący od jednego lub więcej CDR z pierwotnego przeciwciała. [0066] Stosowane tutaj ludzkie przeciwciało oznacza przeciwciało mające sekwencję aminokwasową odpowiadającą tej z przeciwciała wytwarzanego przez człowieka i/lub wytworzonego z zastosowaniem dowolnej z technik wytwarzania ludzkich przeciwciał znanych w dziedzinie lub tu ujawnionych. Ta
PZ/2199/AGR 15 EP 1 957 106 B1 definicja ludzkiego przeciwciała obejmuje przeciwciała obejmujące przynajmniej jeden polipeptyd ludzkiego łańcucha ciężkiego lub przynajmniej jeden polipeptyd ludzkiego łańcucha lekkiego. Jednym z przykładów jest przeciwciało obejmujące polipeptydy mysiego łańcucha lekkiego i ludzkiego łańcucha ciężkiego. Ludzkie przeciwciała można wytwarzać stosując różne techniki znane w dziedzinie. W jednym z przykładów wykonania, ludzkie przeciwciało jest wybrane z biblioteki fagowej, przy czym ta biblioteka fagowa wyraża ludzkie przeciwciała (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom i Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Ludzkie przeciwciała można także wytwarzać przez wprowadzanie loci ludzkich immunoglobulin do zwierząt transgenicznych, np. myszy, u których endogenne geny immunoglobulin zostały częściowo lub w całości inaktywowane. To podejście jest opisane w Patentach US nr 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 i 5,661,016. Alternatywnie, ludzkie przeciwciało można otrzymać przez immortalizację ludzkich limfocytów B, które wytwarzają przeciwciało skierowane przeciw antygenowi docelowemu (takie limfocyty B można pozyskać od osobnika lub mogą być one immunizowane in vitro). Patrz, np. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95 i Patent US nr. 5,750,373. [0067] Stosowany tutaj termin peptyd związany z genem kalcytoniny i CGRP odnosi się do dowolnej postaci peptydu związanego z genem kalcytoniny i jego wariantów, które zachowują przynajmniej część aktywności CGRP. Na przykład, CGRP może być α-cgrp lub β-cgrp. Stosowany tutaj, CGRP obejmuje natywne sekwencje CGRP wszystkich gatunków ssaków, np. ludzką, psią, kocią, końską i bydlęcą. [0068] Stosowane tu przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp (zamiennie określane jako przeciwciało anty-cgrp ) odnosi się do przeciwciała, które jest zdolne do wiązania CGRP i hamowania aktywności biologicznej CGRP i/lub dalszego szlaku/-ów, w których pośredniczy sygnalizacja CGRP. Przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp obejmuje przeciwciała, które blokują, są antagonistami dla, tłumią lub zmniejszają (w tym istotnie) aktywność biologiczną CGRP, w tym dalsze szlaki, w których pośredniczy sygnalizacja CGRP, takie jak wiązanie z receptorem i/lub wywoływanie odpowiedzi komórkowej na CGRP. Dla celów niniejszego wynalazku, należy jednoznacznie rozumieć termin przeciwciało antagonistyczne anty-cgrp jako obejmujący wszystkie wcześniej zidentyfikowane terminy, nazwy oraz stany czynnościowe i właściwości, dzięki którym sam CGRP, aktywność biologiczna CGRP (w tym, ale bez ograniczenia, jego zdolność do pośredniczenia w jakimkolwiek aspekcie bólu głowy) lub konsekwencje aktywności biologicznej, są zasadniczo znoszone, zmniejszane lub neutralizowane w jakimkolwiek znaczącym stopniu. W pewnym przykładzie wykonania, przeciwciało antagonistyczne anty- CGRP wiąże CGRP i zapobiega wiązaniu CGRP z receptorem CGRP. W innych przykładach wykonania, przeciwciało anty-cgrp wiąże CGRP i zapobiega aktywacji receptora CGRP. Przedstawiono tutaj przykłady przeciwciał antagonistycznych anty-cgrp. [0069] Stosowane tu terminy G1 i przeciwciało G1 są stosowane zamiennie w odniesieniu do przeciwciała wytwarzanego przez wektory ekspresyjne mające numery depozytu ATCC PTA-6867 i ATCC PTA-6866. Sekwencję aminokwasową regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przedstawiono na Figurze 5. Części CDR przeciwciała G1 (w tym CDR wg Chothii i Kabata)