(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 47863 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 08.06.07 0774494.2 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 31.07.13 Europejski Biuletyn Patentowy 13/31 EP 47863 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 4/00 (06.01) A61K 39/39 (06.01) A61P 1/04 (06.01) A61P 1/16 (06.01) A61P 11/06 (06.01) A61P 17/02 (06.01) A61P 19/02 (06.01) A61P 21/04 (06.01) A61P 29/00 (06.01) A61P 37/00 (06.01) A61P 37/08 (06.01) C07K 16/28 (06.01) C12N 1/02 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Zapobieganie lub leczenie chorób zapalnych () Pierwszeństwo: 08.06.06 JP 06160096 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 1.04.09 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/16 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.01.14 Wiadomości Urzędu Patentowego 14/01 (73) Uprawniony z patentu: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, Tokyo, JP (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 47863 T3 MASAKAZU HASEGAWA, Gotenba, JP HIDETOMO KITAMURA, Gotenba, JP HIDEKI ADACHI, Gotenba, JP KEIKO KASUTANI, Gotenba, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska 73 00-712 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

1 2 14/P364PL00 EP 2 047 863 B1 Opis Dziedzina techniki [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowych środków do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych, które zawierają jako składniki czynne antagonistów NR. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobów zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych z wykorzystaniem antagonistów NR. Stan techniki [0002] Wiele cytokin znanych jest jako czynniki humoralne zaangażowane we wzrost i różnicowanie rozmaitych typów komórek lub w aktywowanie zróżnicowanych funkcji dojrzałych komórek. Komórki stymulowane cytokinami wytwarzają różne typy cytokin, tworząc przez to sieć wielorakich cytokin w ustroju. Homeostaza biologiczna utrzymywana jest dzięki kruchej równowadze wzajemnej regulacji pomiędzy cytokinami w tej sieci. Uważa się, że wiele chorób zapalnych jest wynikiem zakłócenia tej sieci cytokin. Dlatego właśnie tak wiele uwagi przyciąga terapia antycytokinowa oparta na przeciwciałach monoklonalnych. Wykazano na przykład, że przeciwciała anty-tnf i przeciwciała przeciwko receptorowi anty-il-6 wykazują dużą skuteczność kliniczną. Z drugiej strony znanych jest wiele przykładów niepowodzeń, kiedy to nie uzyskano efektów terapeutycznych poprzez zablokowanie jednej tylko cytokiny, takiej jak IL-4 z powodu aktywacji szlaków kompensacyjnych w przebiegu realnych stanów patologicznych.

2 1 2 [0003] Twórcom niniejszego wynalazku udało się wyizolować nowy receptor cytokinowy NR, wykazujący znaczną homologię z gp1 - receptorem przekazywania sygnałów IL-6 (dokument patentowy 1). NR tworzy heterodimer z receptorem onkostatyny M (OSMR) i działa jako receptor IL-31 (dokument niepatentowy 1). Firma Zymogenetics, Inc. doniosła, że u transgenicznych myszy z nadmierną ekspresją IL-31 rozwijało się samoistnie świądowe zapalenie skóry (dokument patentowy 2). [0004] Nie można jednak utrzymywać, że to właśnie wymuszona ekspresja cytokiny u myszy lub wysoki poziom cytokiny we krwi w patologicznym modelu mysim jest przyczyną choroby. Nie ma danych na temat tego, czy zablokowanie sygnału przez przeciwciało powoduje jakiekolwiek efekty terapeutyczne. Świądowe zapalenie skóry rozwija się na przykład u myszy transgenicznych, u których dochodzi do nadmiernej ekspresji IL-18 w keratynocytach. Ponadto w modelu mysim NC/Nga samoistnego atopowego zapalenia skóry w miarę postępu choroby podwyższa się stężenie IL-18 we krwi. Na podstawie powyższych obserwacji sądzono, że nadmierna ekspresja IL-18 jest przyczyną choroby. W rzeczywistości jednak podawanie przeciwciał neutralizujących nie spowodowało efektów terapeutycznych (dokument niepatentowy 2). [000] Jak opisano powyżej, zahamowanie funkcji cytokiny niekoniecznie powoduje efekty terapeutyczne w chorobach, w których poziom ekspresji cytokiny jest podwyższony. Trudne jest zatem przewidywanie na podstawie poziomu ekspresji cytokiny, w których chorobach możliwe będzie uzyskanie efektów

3 1 2 terapeutycznych. Istotne jest więc wykazanie chorób, w których zahamowanie przekazywania sygnału cytokiny docelowej rzeczywiście zapewnia efekty terapeutyczne. [0006] Poniżej przedstawiono dokumenty opisujące stan techniki w odniesieniu do niniejszego wynalazku. Dokument patentowy 1: WO 00/7314 Dokument patentowy 2: WO 03/060090 Dokument niepatentowy 1: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis, J Allergy Clin Immunol. 06 Feb; 117(2): 418-2 Dokument niepatentowy 2: Administration of antiinterleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga, British Journal of Dermatology 149: 39-4, 03 Ujawnienie wynalazku [Problemy, które wynalazek ma rozwiązać] [0007] Niniejszy wynalazek uzyskano w warunkach opisanych wyżej. Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie opartej na antagonistach receptora cytokinowego terapii antycytokinowej chorób zapalnych. Konkretniej, celem niniejszego wynalazku jest odkrycie chorób zapalnych, w których można uzyskać efekt terapeutyczny poprzez zastosowanie przeciwciał neutralizujących anty-nr i zapewnienie nowych sposobów leczenia takich chorób. Innym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie przeciwciał neutralizujących przeciwko ludzkiemu NR, nadających się do zastosowania klinicznego u ludzi. [Środki rozwiązania problemów]

4 1 2 [0008] Twórcy niniejszego wynalazku przeprowadzili specjalne badania, żeby rozwiązać wyżej opisane problemy. Twórcy dążyli do oceny skuteczności leczniczej przeciwciał neutralizujących skierowanych przeciwko mysiemu NR w modelach mysich w różnych stanach patologicznych. Wyniki wykazały, że przeciwciała neutralizujące powodowały efekt wyraźnego zahamowania objawów w modelu atopowego zapalenia skóry u myszy NC/Nga i w modelu mysim przewlekłego zapalenia skóry, które były rozwjane się wskutek wielokrotnego stosowania chlorku pikrylu. Dowodzi to, że przeciwciała neutralizujące były w istocie użyteczne jako środek terapeutyczny. Oprócz tego wykazano, że przeciwciała powodują efekt zahamowania objawów w kolagenowym zapaleniu stawów, modelu reumatyzmu i w kolagenazowym zapaleniu stawów, który jest modelem choroby zwyrodnieniowej stawów. Wyniki te sugerują, że przeciwciało neutralizujące NR według niniejszego wynalazku można stosować do zapobiegania lub leczenia przewlekłego zapalenia. Twórcom wynalazku udało się również uzyskać ludzkie przeciwciała neutralizujące NR. Konkretnie, przedmiotem niniejszego wynalazku są: [1] Przeciwciało anty-nr/il-31ra wykazujące aktywność neutralizowania NR/IL-31RA do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zapalnej, przy czym chorobą zapalną jest (a) atopowe zapalenie skóry, przy czym przeciwciało hamuje co najmniej jeden z objawów atopowego zapalenia skóry dobrany z grupy składającej się z (1) świądu (2) zaczerwienienia i krwawienia (3) obrzęku (4) urazu i

1 2 uszkodzenia tkanki i () inkrustacji (tworzenie się złogów) i suchości; (b) reumatyzm; (c) lub choroba zwyrodnieniowa stawów. [2] Środek do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu choroby zapalnej, przy czym środek zawiera jako składnik czynny przeciwciało według [1] i przy czym chorobą zapalną jest (a) atopowe zapalenie skóry, przy czym przeciwciało hamuje co najmniej jeden z objawów atopowego zapalenia skóry dobrany z grupy składającej się z (1) świądu (2) zaczerwienienia i krwawienia (3) obrzęku (4) urazu i uszkodzenia tkanki i () inkrustacji (tworzenie się złogów) i suchości; (b) reumatyzm (c) lub choroba zwyrodnieniowa stawów. [3] Przeciwciało do zastosowania według [1] lub środek do zastosowania według [2], przy czym przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. [4] Przeciwciało do zastosowania według [1] lub [3] albo środek do zastosowania według [2] lub [3], przy czym RA NR/IL-31 jest ludzkim RA NR/IL-31. [] Przeciwciało do zastosowania według dowolnego z punktów [1], [3] lub [4] albo środek do zastosowania według dowolnego z punktów od [2] do [4], przy czym przeciwciało jest przeciwciałem rekombinowanym. [6] Przeciwciało lub środek do zastosowania według [], przy czym przeciwciało rekombinowane jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim.

6 1 2 [7] Fragment i(lub) zmodyfikowany chemicznie fragment przeciwciała według dowolnego z punktów od [1] lub [3] do [6] do zastosowania według dowolnego z punktów od [1] lub [3] do [6], przy czym tym fragmentem jest fragment Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv. [8] Środek zawierający fragment do zastosowania według [7]. Krótki opis rysunków [0009] Fig. 1 stanowi wykres ukazujący wynik uzyskany poprzez obserwację efektu hamowania wzrostu komórek przez BM09 dodawany do układu testowego wzrostu komórek wykorzystującego IL-31-zależne komórki Ba/F3. Oś pozioma oznacza szacowane stężenie mil-31 w układzie testowym, a oś pionowa oznacza liczbę komórek (OD40 (absorbancja przy 40 nm)). W legendzie podano ilość dodawanych BM09 (jednostki: ng/ml). Obserwowano efekt hamowania wzrostu komórek zależny od ilości dodanego BM09. Fig. 2 stanowi wykres ukazujący efekt terapeutyczny uzyskany poprzez podawanie przeciwciał anty-nr w mysim modelu atopowego zapalenia skóry. W grupie A, otrzymującej przeciwciało anty-nr, obserwowano efekt znamiennego hamowania zapalenia w porównaniu z grupą kontroli ujemnej (otrzymującą zaróbkę). Fig. 3 stanowi wykres ukazujący sekwencyjne zmiany masy ciała po podaniu przeciwciał anty-nr w mysim modelu atopowego zapalenia skóry. W grupie otrzymującej znany środek przeciwzapalny obserwowano efekt zmniejszenia masy ciała. W grupie otrzymującej przeciwciało anty-nr nie obserwowano natomiast zmian w zakresie masy

7 1 2 ciała. Dowiedziono zatem, że przeciwciało anty-nr jest bezpieczne. Fig. 4 stanowi wykres ukazujący efekt terapeutyczny uzyskany poprzez podawanie przeciwciał anty-nr w mysim modelu przewlekłego zapalenia skóry. W grupie otrzymującej przeciwciało anty-nr wykazano znamienny efekt zmniejszania obrzęku płatków usznych. Fig. jest to zdjęcie ukazujące barwienie immunohistochemiczne płatka usznego modelu mysiego przewlekłego zapalenia skóry. Podobnie jak w przypadku ludzi, wykazano zwiększenie ekspresji mysiego NR w pogrubiałym naskórku. Fig. 6 stanowi wykres ukazujący efekt hamujący zapalenie stawów uzyskiwany poprzez podawanie przeciwciał anty-nr w mysim modelu indukowanego kolagenem zapalenia stawów. Fig. 7 stanowi wykres ukazujący związek między polem pod krzywą (AUC) a stężeniem BM09 podawanego w modelu indukowanego kolagenazą zapalenia stawów (choroba zwyrodnieniowa stawów). AUC oznacza pole pod krzywą przejścia różnicy między szerokością stawu kolana prawego i lewego, zdefiniowaną jako wartość odpowiadającą obrzękowi prawego stawu kolanowego. Fig. 8 stanowi wykres ukazujący korelację między stężeniem ludzkiego przeciwciała neutralizującego NR (przeciwciało oczyszczone) a aktywnością hamowania wzrostu komórek w obecności IL-31. Przeciwciała 1, 2 i 3 wykazywały silną aktywność neutralizowania NR. Fig. 9 stanowi wykres ukazujący korelację między stężeniem chimerowego przeciwciała NA633 przeciwko ludzkiemu NR a aktywnością hamowania wzrostu komórek

8 1 2 w obecności IL-31. NA633 wykazywało silną aktywność neutralizowania NR. Fig. stanowi wykres, porównujący sekwencje aminokwasowe NR ludzkiego i NR makaka. Sekwencja podkreślona linią podwójną oznacza region przezbłonowy. Fig. 11 stanowi wykres ukazujący aktywność hamowania wzrostu komórek chimerowego przeciwciała NA633 w ludzkiej linii komórek Il-31 stymulowanej NR makaka/ OSMR człowieka/baf. NA633 wykazywał także aktywność neutralizowania NR makaka. Fig. 12 stanowi wykres ukazujący modyfikację zmiany procentowej masy ciała myszy w modelu zapalenia jelita grubego DSS. Fig. 13 stanowi wykres ukazujący modyfikację zmiany grubości płatka usznego w modelu ostrego kontaktowego zapalenia skóry z zastosowaniem chlorku pikrylu. Najlepszy sposób wykonania wynalazku [00] Przedmiotem niniejszego wynalazku są środki do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych, które zawierają jako składniki aktywne antagonistów NR. Według wynalazku antagonista NR jest to przeciwciało anty-nr/il-31ra. Niniejszy wynalazek opiera się na odkryciu przez autorów, że antagoniści NR (na przykład przeciwciała neutralizujące anty-nr ) znamiennie hamują objawy w mysim modelu atopowego zapalenia skóry, przewlekłego zapalenia skóry, reumatyzmu, choroby zwyrodnieniowej stawów lub innych podobnych chorób. Przeciwciało według niniejszego wynalazku wykazuje aktywność neutralizującą NR/IL- 31RA.

9 1 2 [0011] NR jest to białko, które tworzy heterodimer z receptorem onkostatyny M (OSMR) i działa jako receptor IL-31. NR znany jest również pod innymi nazwami, takimi jak glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6,02), GPL (J Biol Chem 278, 4980-9, 03) i IL-31RA (Nat Immunol, 72-60, 04). Termin NR według niniejszego wynalazku obejmuje białka określane takimi nazwami. Termin NR według niniejszego wynalazku obejmuje również NR pochodzące od ludzi, myszy i innych ssaków. Korzystny NR obejmuje NR pochodzące od człowieka i myszy, ale nie jest do nich ograniczony. Znanych jest wiele wariantów splicingowych NR pochodzenia ludzkiego (WO 00/07314). Spośród wyżej opisanych wariantów splicingowych, NR.1 składa się z 662 aminokwasów i zawiera domenę przezbłonową. NR.2 jest rozpuszczalnym białkiem o budowie podobnej do receptora, składającym się z 22 aminokwasów, bez domeny przezbłonowej. Do znanych wariantów splicingowych NR, działających jako białka receptora przezbłonowego, należą NR.3 i IL-31RAv3. Ludzki NR według niniejszego wynalazku nie jest szczególnie ograniczony, pod warunkiem, że tworzy heterodimer z receptorem onkostatyny M (OSMR) i działa jako receptor IL-31. Do korzystnych NR należą NR.3 (określany również jako ILRAv4 (Nat Immunol, 72-60, 04)) i IL-31RAv3. NR.3 (IL-31RAv4) składa się z 662 aminokwasów (WO 00/07314; Nat Immunol, 72-60, 04), a IL-31RAv3 składa się z 732 aminokwasów (nr akcesyjny GenBank NM_139017). Sekwencję aminokwasową IL-31RAv4 ukazano w NR ID. SEKW. 6, a sekwencję aminokwasową IL-31RAv3 ukazano w NR ID. SEKW. 7. NR

1 2 pochodzenia mysiego obejmuje natomiast białka zawierające sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.. [0012] Określenie antagoniści NR według niniejszego wynalazku odnosi się do substancji, które wiążą się z NR i blokują wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnału zależne od aktywacji NR, powodując w ten sposób całkowite lub częściowe zahamowanie aktywności fizjologicznej komórek. Według niniejszego wynalazku określenie aktywność fizjologiczna obejmuje na przykład między innymi aktywność indukowania lub hamowania wytwarzania substancji fizjologicznie czynnych (na przykład chemokin i cytokin zapalnych), aktywność wzmagania lub hamowania wydzielania substancji, aktywność wzrostu, aktywność indukowania wzrostu, aktywność przeżycia, aktywność różnicowania, aktywność indukowania różnicowania, aktywność transkrypcyjną, aktywność transportu błonowego, aktywność wiązania, aktywność proteolityczną, aktywność fosforylacji/defosforylacji, aktywność utleniania i redukcji, aktywność przenoszenia, aktywność nukleolityczną, aktywność odwadniania, aktywność indukowania śmierci komórek i aktywność indukowania apoptozy. [0013] Obecność aktywności antagonistycznej można określić sposobami znanymi specjalistom. Kontaktuje się na przykład związki badane z NR wyrażanym na powierzchni komórek w obecności ligandu i ocenia się, czy jest generowana czy też nie transdukcja sygnału która jest wskaźnikiem aktywacji NR. Takie oznaczanie można przeprowadzić na przykład sposobem opisanym w dokumencie Dillon SR i wsp., Interleukin 31,

11 1 2 a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 04 Jul; (7):72-60. Uważa się, że związki, które hamują wewnątrzkomórkową transdukcję sygnału w odpowiedzi na stymulację ligandem, odgrywają rolę antagonistów NR. [0014] Antagoniści według niniejszego wynalazku mogą to być związki naturalne lub sztuczne. Jako antagoniści według niniejszego wynalazku mogą być stosowane związki znane. Można także stosować związki nowe, co do których potwierdzi się opisanymi wyżej metodami, że wykazują aktywność antagonistyczną. [001] Według niniejszego wynalazku, antagoniści NR są to przeciwciała posiadające aktywność neutralizowania NR IL-31RA. Określenie przeciwciała posiadające aktywność neutralizowania NR według niniejszego wynalazku odnosi się do przeciwciał posiadających aktywność hamowania opartej na NR aktywności fizjologicznej. Przeciwciałami posiadającymi aktywność neutralizowania NR według niniejszego wynalazku mogą być przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne; i w korzystnym przykładzie wykonania, określenie to obejmuje przeciwciała monoklonalne. [0016] Takie przeciwciała monoklonalne, posiadające aktywność neutralizowania NR, można uzyskać na przykład w następującej procedurze: przeciwciała monoklonalne anty-nr wytwarza się znanymi metodami, stosując jako antygen NR lub jego fragment pochodzący od ssaka, takiego jak człowiek lub mysz, po czym z tak uzyskanych przeciwciał monoklonalnych anty- NR selekcjonuje się przeciwciała posiadające

12 1 2 aktywność neutralizowania NR. Konkretnie, immunizację osiąga się konwencjonalnymi metodami immunizacji, stosując jako antygen uczulający pożądany antygen lub komórki z ekspresją pożądanego antygenu. Przeciwciała monoklonalne anty-nr można wytwarzać przez fuzję uzyskanych komórek immunologicznych ze znanymi komórkami rodzicielskimi z wykorzystaniem konwencjonalnych metod fuzji komórek i ich badanie przesiewowe pod kątem wytwarzających przeciwciała monoklonalne (hybrydom) konwencjonalnymi metodami badania przesiewowego. Do zwierząt, które poddaje się immunizacji, należą na przykład ssaki, takie jak myszy, szczury, króliki, owce, małpy, kozy, osły, krowy, konie i świnie. Antygen można wytwarzać z wykorzystaniem znanej sekwencji genowej NR znanymi metodami, na przykład metodami z wykorzystaniem bakulowirusa (zob. na przykład WO 98/46777). Jak opisano w poniższych przykładach, przeciwciała wykazujące aktywność neutralizowania NR można selekcjonować na przykład przez badanie efektu hamowania wzrostu zależnej od IL- 31 linii komórkowej po dodaniu przeciwciała kandydata do zależnej od IL-31 linii komórkowej. Przeciwciała, które hamują wzrost zależnej od IL-31 linii komórkowej w sposobie opisanym powyżej, uznaje się za przeciwciała wykazujące aktywność neutralizowania NR. [0017] Hybrydomy można wytwarzać na przykład sposobem Milsteina i wsp. (Kohler, G. i Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) lub innymi podobnymi sposobami. Gdy immunogenność antygenu jest mała, immunizację można przeprowadzić po sprzężeniu antygenu

13 1 2 z makrocząsteczką wykazującą immunogenność, taką jak albumina. [0018] W korzystnym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku do przeciwciał wykazujących aktywność neutralizowania NR należą przeciwciała monoklonalne z aktywnością neutralizowania ludzkiego NR. Nie ma szczególnych ograniczeń co do immunogenu przy wytwarzaniu przeciwciał monoklonalnych wykazujących aktywność neutralizowania ludzkiego NR, pod warunkiem, że umożliwia on wytwarzanie przeciwciał wykazujących aktywność neutralizowania ludzkiego NR. Wiadomo na przykład, że istnieje wiele wariantów ludzkiego NR. Każdy z tych wariantów można zastosować jako immunogen, jeżeli tylko umożliwia on wytwarzanie przeciwciał wykazujących aktywność neutralizowania ludzkiego NR. Zamiast tego jako immunogenu można użyć fragmentu peptydowego NR lub naturalnej sekwencji NR wprowadzanej do mutacji sztucznych, w tych samych warunkach. Korzystnym immunogenem do wytwarzania przeciwciał według niniejszego wynalazku, wykazujących aktywność neutralizowania NR, jest ludzki NR.3. [0019] Według niniejszego wynalazku wyżej opisane przeciwciała nie są szczególnie ograniczone, pod warunkiem, że wykazują aktywność neutralizowania NR. Do przeciwciał należą również przeciwciała rekombinowane, takie jak przeciwciała chimerowe, przeciwciała humanizowane i przeciwciała ludzkie. Przeciwciała chimerowe zawierają na przykład regiony stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała ludzkiego oraz regiony zmienne łańcucha ciężkiego i

14 1 2 lekkiego ssaka innego niż człowiek, takiego jak mysz. Przeciwciała chimerowe można wytwarzać znanymi metodami. Przeciwciała można wytwarzać na przykład poprzez klonowanie genu przeciwciała z hybrydom, wprowadzanie go do odpowiedniego wektora i wprowadzanie tego konstruktu do organizmu gospodarza (zob. na przykład Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTOBODIES; opublikowano w Wielkiej Brytanii - MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Konkretnie, cdna regionów zmiennych przeciwciała (regionów V) syntetyzuje się z mrna hybrydom, stosując odwrotną transkryptazę. Po uzyskaniu DNA kodujących regiony V przeciwciała stanowiącego przedmiot zainteresowania sprzęga się je z DNA kodującymi regiony stałe (regiony C) pożądanego przeciwciała ludzkiego. Uzyskane konstrukty wprowadza się do wektorów ekspresyjnych. Zamiast tego DNA kodujące regiony przeciwciał można wprowadzać do wektorów ekspresyjnych, zawierających DNA kodujące regiony C przeciwciała ludzkiego. DNA wprowadza się do wektorów ekspresyjnych, tak że ulegają one ekspresji w sposób regulowany przez regiony regulacji ekspresji, na przykład przez wzmacniacze i promotory. W kolejnym etapie komórki gospodarza można transformować z użyciem wektorów ekspresyjnych, żeby umożliwić ekspresję przeciwciał chimerowych. [00] Przeciwciało humanizowane, zwane także przeciwciałem ludzkim o zmienionym kształcie, uzyskuje się przez zamianę regionu determinującego komplementarność (CDR) przeciwciała ssaka innego niż człowiek, takiego jak mysz, na CDR przeciwciała

1 1 2 ludzkiego. Znane są również konwencjonalne techniki rekombinacji genetycznej do wytwarzania takich przeciwciał. Konkretnie, metodą PCR syntetyzuje się sekwencję DNA, przeznaczoną do ligacji CDR przeciwciała mysiego z regionami zrębowymi (FR) przeciwciała ludzkiego, z użyciem kilku oligonukleotydów skonstruowanych tak, że zawierają na końcach częściowo nakładające się odcinki. Przeciwciało humanizowane można uzyskać przez (1) ligację uzyskanego DNA do DNA kodującego region stały przeciwciała ludzkiego; (2) włączenie tego konstruktu do wektora ekspresyjnego; (3) transfekowanie wektora do gospodarza celem wytworzenia przeciwciała (zob. europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 239,400 i międzynarodowa publikacja zgłoszenia patentowego nr WO 96/0276). Wybiera się FR przeciwciała ludzkiego do ligacji poprzez CDR w miejscu, gdzie CDR tworzy korzystne miejsce wiązania antygenu. Jeżeli jest to konieczne, można dokonać substytucji aminokwasów w regionie zrębowym regionu zmiennego przeciwciała, tak aby CDR przeciwciała ludzkiego o zmienionym kształcie tworzył odpowiednie miejsce wiązania antygenu (Sato, K. i wsp., Cancer Res. (1993) 3, 81-86). [0021] Znane są także sposoby otrzymywania przeciwciał ludzkich. Pożądane przeciwciała ludzkie, wykazujące aktywność wiązania antygenu, można na przykład uzyskać przez (1) uwrażliwianie limfocytów ludzkich antygenami stanowiącymi przedmiot zainteresowania lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenów stanowiących przedmiot zainteresowania in vitro; (2) i fuzję uwrażliwionych limfocytów z ludzkimi komórkami szpiczaka, takimi jak

16 1 2 U266 (zob. japońska publikacja zgłoszenia patentowego Kokoku nr (JP-B) H01-9878 (poddane ocenie, zatwierdzone japońskie zgłoszenie patentowe opublikowanie do zgłaszania sprzeciwu)). Zamiast tego pożądane przeciwciało ludzkie można również wytwarzać, stosując pożądany antygen do immunizacji zwierzęcia transgenicznego, które posiada cały repertuar genów przeciwciał ludzkich (zob. publikacje międzynarodowych zgłoszeń patentowych WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/28, WO 96/34096 i WO 96/3373). [0022] Znane są ponadto sposoby wytwarzania przeciwciał ludzkich przez panning z biblioteką fagową przeciwciał ludzkich. Uzyskuje się na przykład ekspresję regionu zmiennego przeciwciała ludzkiego jako przeciwciała jednołańcuchowego (scfv) na powierzchni faga, stosując metodę prezentacji na fagu, i można selekcjonować fagi, które wiążą się z antygenem. Przez analizowanie genów wyselekcjonowanych fagów można określić sekwencje DNA kodujące regiony zmienne przeciwciał ludzkich, wiążące się z antygenem. Jeżeli zidentyfikuje się sekwencje DNA scfv, które wiążą się z antygenem, można skonstruować odpowiednie wektory ekspresyjne, zawierające te sekwencje, i w ten sposób uzyskać przeciwciała ludzkie. Takie metody są dobrze znane (zob. WO 92/047, WO 92/791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 9/01438 i WO 9/1388). [0023] Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego może być sekwencją aminokwasową z substytucją, delecją, addycją i(lub) insercją jednego lub więcej niż jednego aminokwasu w sekwencji aminokwasowej regionu

17 1 2 zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała, co do której potwierdzono aktywność neutralizowania NR, jeżeli tylko aktywność neutralizowania NR jest zachowana. Do dobrze znanych specjalistom metod wytwarzania sekwencji aminokwasowych regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała posiadającego aktywność neutralizowania NR, obejmujących substytucję, delecję, addycję i(lub) insercję jednego lub więcej niż jednego aminokwasu w sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego, należą znane metody wprowadzania mutacji do białek. Specjaliści mogą na przykład wytwarzać mutanty równoważne regionowi zmiennemu łańcucha ciężkiego lub regionowi zmiennemu łańcucha lekkiego przeciwciała posiadającego aktywność neutralizowania NR przez wprowadzenie odpowiednich mutacji do sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała wykazującego aktywność neutralizowania NR z użyciem metody mutagenezy ukierunkowanej na miejsce (Hashimoto- Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y i Nakagawa, M. (199) An oligodeoxiribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 12, 271-27, Zoller, MJ i Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 0, 468-00, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M i Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic

18 1 2 Acids Res. 12, 9441-946, Kramer W i Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 14, -367, Kunkel, TA (198) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) lub innych podobnych metod. I tak region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmiennym łańcucha lekkiego według niniejszego wynalazku obejmuje także regiony zmienne łańcucha ciężkiego lub regiony zmienne łańcucha lekkiego, które zawierają mutacje jednego lub więcej niż jednego aminokwasu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała wykazującego aktywność neutralizowania NR. [0024] Gdy reszta aminokwasowa jest zmieniona, aminokwas korzystnie ulega mutacji do innego aminokwasu (lub aminokwasów), zachowującego właściwości aminokwasowego łańcucha bocznego. Przykładami właściwości łańcucha bocznego aminokwasów są: aminokwasy hydrofobowe (A, I, L, M, F, P, W, Y i V), aminokwasy hydrofilowe (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S i T), aminokwasy zawierające alifatyczne łańcuchy boczne (G, A, V, L, I i P), aminokwasy zawierające łańcuchy boczne z grupą hydroksylową (S, T i Y), aminokwasy zawierające łańcuchy boczne zawierające siarkę (C i M), aminokwasy zawierające łańcuchy boczne zawierające grupy karboksylowe i amidowe (D, N, E i Q), aminokwasy zawierające zasadowe łańcuchy boczne (R, K i H) i aminokwasy zawierające aromatyczne łańcuchy boczne (H, F, Y i W) (aminokwasy zapisano w nawiasach kodami jednoliterowymi). Substytucje aminokwasów w obrębie

19 1 2 poszczególnych grup określa się jako substytucje konserwatywne. Wiadomo, że polipeptyd zawierający zmodyfikowaną sekwencję aminokwasową, w której jedną lub więcej niż jedną resztę aminokwasową w danej sekwencji aminokwasowej poddano delecji, addycji i(lub) substytucji innymi aminokwasami, może zachowywać swą pierwotną aktywność biologiczną (Mark, D. F. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81:662-6; Zoller, M. J. i Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) :6487-00; Wang, A. i wsp., Science (1984) 224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409-13). Takie mutanty zawierają sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 70% identyczna z sekwencją aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego według niniejszego wynalazku, korzystniej co najmniej 7%, jeszcze korzystniej co najmniej 80%, jeszcze bardziej korzystnie co najmniej 8%, lecz korzystniej w co najmniej 90% i najkorzystniej w co najmniej 9% identyczna. Według niniejszego wynalazku, tożsamość sekwencji definiuje się jako odsetek reszt identycznych z resztami wyjściowej sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego, ustalonej po dopasowaniu sekwencji i wprowadzeniu odpowiednich przerw w celu zmaksymalizowania tożsamości sekwencji, jeżeli jest to konieczne. Tożsamość sekwencji aminokwasowych można określić sposobem opisanym powyżej. [002] Zamiast tego, sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego

1 2 łańcucha lekkiego, która zawiera substytucję, delecję, addycję i(lub) insercję jednego lub więcej niż jednego aminokwasu w sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego i zachowuje aktywność neutralizowania NR, można uzyskać z kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje w rygorystycznych warunkach do kwasu nukleinowego, zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego. Do rygorystycznych warunków hybrydyzacji do izolowania kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje w rygorystycznych warunkach do kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego, należą na przykład warunki: 6M mocznik, 0,4% SDS, 0,x SSC i temperatura 37 C, lub warunki hybrydyzacji o równoważnej rygorystyczności. W warunkach bardziej rygorystycznych, na przykład warunkach: 6M mocznik, 0,4% SDS, 0,1x SSC i temperatura 42 C, można oczekiwać izolowania kwasów nukleinowych o znacznie większej homologii. Sekwencję izolowanych kwasów nukleinowych można określić znanymi sposobami, opisanymi poniżej. Całkowita homologia sekwencji nukleotydowych izolowanego kwasu nukleinowego wynosi co najmniej 0% lub więcej tożsamości sekwencji, korzystnie 70% lub więcej, korzystniej 90% lub więcej (na przykład 9%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej). [0026] Kwas nukleinowy, który hybrydyzuje w rygorystycznych warunkach do kwasu nukleinowego, zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję

21 1 2 aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego, można również izolować, stosując zamiast wyżej opisanych metod z wykorzystaniem techniki hybrydyzacji, metody powielania genów z zastosowaniem primerów zsyntetyzowanych na podstawie informacji o sekwencji nukleotydowej, kodującej sekwencję aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego, na przykład w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). [0027] Konkretnie, tożsamość pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi lub dwiema sekwencjami aminokwasowymi można określić z użyciem algorytmu BLAST Karlina i Altschula (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 873-7). Na podstawie tego algorytmu opracowano programy takie, jak BLASTN i BLASTX (Altschul i wsp., J. Mol. Biol. (1990) 21, 403-). Przy analizie sekwencji nukleotydowych metodą BLASTN opartą na BLAST parametry ustawia się na przykład następująco: wynik = 0 i długość słowa = 12. Z drugiej strony, do parametrów stosowanych do analizy sekwencji aminokwasowych metodą BLASTX opartą na BLAST należą na przykład wynik = 0 i długość słowa = 3. Przy stosowaniu programów BLAST i Gapped BLAST stosuje się parametry domyślne dla każdego z tych programów. Konkretna technika takich analiz jest znana w stanie techniki (zob. stronę internetową National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov). [0028] Zamiast tego, przeciwciała według niniejszego wynalazku można wytwarzać jako miniciała (minibodies).

22 1 2 Do takich miniciał według niniejszego wynalazku należą fragmenty przeciwciał pozbawione pewnych części całych przeciwciał (takich jak na przykład całe IgG) i nie są one szczególnie ograniczone, pod warunkiem, że zachowują aktywność neutralizowania NR. Miniciała według niniejszego wynalazku nie są szczególnie ograniczone, pod warunkiem, że stanowią części całych przeciwciał. Miniciała korzystnie zawierają region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) lub region zmienny łańcucha lekkiego (VL). Szczególnie korzystne miniciała zawierają zarówno VH, jak i VL. [0029] Masa cząsteczkowa miniciał według niniejszego wynalazku jest korzystnie mniejsza, niż całych przeciwciał. Miniciała mogą jednak tworzyć multimery, na przykład dimery, trimery lub tetramery, i wtedy ich masa cząsteczkowa może być większa, niż masa cząsteczkowa całych przeciwciał. [00] Do miniciał według niniejszego wynalazku należą na przykład przeciwciała scfv. Przeciwciała scfv są to jednołańcuchowe polipeptydy, utworzone przez sprzężenie regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ([VH]) i regionu zmiennego łańcucha lekkiego ([VL]) poprzez łącznik lub podobną strukturę (Huston, J. S. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 8, 879-883; Plickthun The Pharmacology of Monoclonal Antibodies t. 113, (red.), Resenburg i Moore, Springer Verlag, New York, str. 269-31, (1994)). Kolejność regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i regionu zmiennego łańcucha lekkiego, które są sprzęgane, nie jest szczególnie ograniczona mogą one być ustawione w dowolnym porządku. Przykłady ustawienia wymieniono poniżej.

23 1 2 [VH] łącznik [VL] [VL] łącznik [VH] [0031] Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego może zawierać substytucję, delecję, addycję i(lub) insercję. Ponadto, region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego mogą także być pozbawione pewnych części lub mogą zawierać dodatek innych polipeptydów, pod warunkiem, że przy sprzężeniu razem wykazują zdolność wiązania antygenu. Zamiast tego regiony zmienne mogą być chimeryzowane lub humanizowane. [0032] Według niniejszego wynalazku, łączniki, które wiążą region zmienny przeciwciała, zawierają dowolnie ustanowione łączniki peptydowe, które można wprowadzać z użyciem metod inżynierii genetycznej, lub łączniki syntetyczne (na przykład łączniki ujawnione w Protein Engineering, 9(3), 299-, 1996). [0033] Łącznikami korzystnymi według niniejszego wynalazku są łączniki peptydowe. Długość łączników peptydowych nie jest szczególnie ograniczona i specjaliści mogą odpowiednio dobierać długość, w zależności od celu. Typowo długość wynosi od 1 do 0 aminokwasów, korzystnie od 3 do 0 aminokwasów, korzystniej od do aminokwasów, szczególnie korzystnie od 12 do 18 aminokwasów (na przykład, 1 aminokwasów). [0034] Sekwencje aminokwasowe takich łączników peptydowych zawierają na przykład: Ser Gly Ser

24 Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser (NR ID. SEKW. 8) Ser Gly Gly Gly (NR ID. SEKW. 9) Gly Gly Gly Gly Ser (NR ID. SEKW. ) Ser Gly Gly Gly Gly (NR ID. SEKW. 11) Gly Gly Gly Gly Gly Ser (NR ID. SEKW. 12) Ser Gly Gly Gly Gly Gly (NR ID. SEKW. 13) Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (NR ID. SEKW. 14) Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (NR ID. SEKW. 1) (Gly Gly Gly Gly Ser (NR ID. SEKW. ))n 1 2 (Ser Gly Gly Gly Gly (NR ID. SEKW. 11))n Przy czym n jest to liczba całkowita wynosząca 1 lub więcej. [003] Do łączników syntetycznych (chemicznych środków sieciujących) należą środki sieciujące rutynowo stosowane do sieciowania peptydów, na przykład N- hydroksysukcynoimid (NHS), suberynian disukcynoimidylu (DSS), suberynian bis(sulfosukcynoimidylu) (BS 3 ), ditiobis(sukcynoimidylopropionian) (DSP), ditiobis(sulfosukcynoimidylopropionian) (DTSSP), bis(sukcynoimidylobursztynian) glikolu etylenowego (EGS), bis(sulfosukcynoimidylobursztynian) (sulfo-egs) glikolu etylenowego, winian disukcynoimidylowy (DST), winian disulfosukcynoimidylowy (sulfo-dst), bis[2- (sukcynoimidoksykarbonyloksy)etylo]sulfon (BSOCOES) i bis[2-(sulfosukcynoimidoksykarbonyloksy)etylo]sulfon (sulfo-bsocoes). Te środki sieciujące są dostępne w handlu.

2 1 2 [0036] Do przeciwciał według niniejszego wynalazku należą przeciwciała, w których do sekwencji aminokwasowej przeciwciała według niniejszego wynalazku dodano dwie lub więcej niż dwie reszty aminokwasowe. Wynalazek obejmuje także białka fuzyjne, powstałe wskutek fuzji między jednym z powyższych przeciwciał a drugim peptydem lub białkiem. Białka fuzyjne można wytwarzać przez ligację polinukleotydu kodującego przeciwciało według niniejszego wynalazku i polinukleotydu kodującego drugi peptyd lub polipeptyd w ramce, wprowadzenie tego konstruktu do wektora ekspresyjnego i ekspresję tego konstruktu fuzyjnego u gospodarza. W tym celu dostępnych jest kilka technik znanych specjalistom. Partnerowym peptydem lub polipeptydem, który poddaje się fuzji z przeciwciałem według niniejszego wynalazku, może być znany peptyd, na przykład FLAG (Hopp, T. P. i wsp., BioTechnology 6, 14-12 (1988)), 6x His złożony z sześciu reszt His (histydynowych), x His, hemaglutynina grypy (HA), ludzki fragment c-myc, fragment VSV-GP, fragment p18hiv, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragment antygenu SV40 T, tag lck, fragment -tubuliny, B-tag, fragment białka C. Do innych partnerowych polipeptydów, które można poddawać fuzji z przeciwciałami według niniejszego wynalazku, należą na przykład GST (glutationo-stransferaza), HA (hemaglutynina grypy), region stały immunoglobuliny, -galaktozydaza i MBP (białko wiążące maltozę). Polinukleotyd kodujący jeden z tych dostępnych na rynku peptydów lub polipeptydów można poddawać fuzji z polinukleotydem kodującym przeciwciało

26 1 2 według niniejszego wynalazku. Polipeptyd fuzyjny można wytwarzać przez ekspresję konstruktu fuzyjnego. [0037] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą różnić się sekwencją aminokwasową, masą cząsteczkową, punktem izoelektrycznym, obecnością/nieobecnością łańcuchów cukrowych i konformacją, w zależności od komórki lub gospodarza wytwarzającego przeciwciało lub od sposobu oczyszczania. Powstałe przeciwciało jest jednak objęte zakresem niniejszego wynalazku, jeżeli tylko jest równoważne funkcjonalnie przeciwciału według niniejszego wynalazku. Gdy na przykład przeciwciało według niniejszego wynalazku ulega ekspresji w komórkach prokariotycznych, na przykład w E. coli, do końca N sekwencji aminokwasowej przeciwciała wyjściowego dodaje się resztę metioninową. Takie przeciwciała są objęte zakresem niniejszego wynalazku. [0038] Przeciwciało według niniejszego wynalazku można wytwarzać sposobami znanymi specjalistom. Przeciwciało można wytwarzać na przykład znanymi specjalistom technikami rekombinacji genetycznej na podstawie sekwencji przeciwciała, które rozpoznaje NR. Konkretnie, takie przeciwciało można wytwarzać przez konstruowanie polinukleotydu kodującego przeciwciało na podstawie sekwencji przeciwciała, które rozpoznaje NR, wprowadzanie konstruktu do wektora ekspresyjnego i na przykład uzyskiwanie jego ekspresji w odpowiednich komórkach gospodarza (zob. na przykład, Co, M. S. i wsp., J. Immunol. (1994) 12, 2968-2976; Better, M. i Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. i Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-1; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121,

27 1 2 62-663; Rousseaux, J. i wsp., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. i Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). [0039] Do wektorów należą wektory M13, wektory puc, pbr322, pbluescript i pcr-script. Zamiast tego, jeżeli chodzi o subklonowanie i wycinanie cdna, oprócz wektorów opisanych powyżej jako wektorów można używać na przykład pgem-t, pdirect i pt7. Wektory ekspresyjne są szczególnie użyteczne przy stosowaniu wektorów do wytwarzania przeciwciał według niniejszego wynalazku. Jeżeli dąży się na przykład do ekspresji w E. coli (na przykład JM9, DHa, HB1 i XL1-Blue), wektory ekspresyjne nie tylko wykazują opisaną powyżej charakterystykę umożliwiającą powielanie wektora w E. coli, lecz muszą także zawierać promotor pozwalający na skuteczną ekspresję w E. coli, na przykład promotor lacz (Ward i wsp., Nature (1989) 341, 44-46; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor arab (Better i wsp., Science (1988) 240, 41-43), promotor T7 lub inne podobne. Oprócz wektorów opisanych powyżej, do takich wektorów należy pgex-x-1 (Pharmacia), system QIAexpress (Quiagen), pegfp lub pet (w tym przypadku gospodarzem jest korzystnie BL21, wykazujący ekspresję polimerazy RNA T7). [0040] Wektory mogą zawierać sekwencje sygnałowe do wydzielania przeciwciał. Jako sekwencję sygnałową do wydzielania przeciwciał można wykorzystywać sekwencję sygnałową pelb (Lei, S. P. i wsp J. Bacteriol. (1987) 169, 4379), gdy białko jest wydzielane do peryplazmy E. coli. Wektor można wprowadzać do komórek gospodarza na

28 1 2 przykład metodą z użyciem chlorku wapnia lub metodą elektroporacji. [0041] Oprócz wektorów do użycia w E. coli, do wektorów do wytwarzania przeciwciał według niniejszego wynalazku należą na przykład wektory ekspresyjne pochodzące od ssaków (na przykład pcdna3 (Invitrogen), pef-bos (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p322), pef i pcdm8), wektory ekspresyjne pochodzące od owadów (na przykład układ ekspresji w bakulowirusie Bac-to-BAC (Gibco-BRL) i pbacpak8), wektory ekspresyjne pochodzące z roślin (na przykład pmh1 i pmh2), wektory ekspresyjne pochodzące od zwierząt (na przykład phsv, pmv i padexlcw), retrowirusowe wektory ekspresyjne (na przykład pzipneo), drożdżowe wektory ekspresyjne (na przykład Pichia Expression Kit (Invitrogen), pnv11 i SP-Q01) i wektory ekspresyjne Bacillus subtilis (na przykład ppl608 i pkth0). [0042] Gdy dąży się do ekspresji w komórkach zwierzęcych, takich jak komórki CHO, COS i NIH3T3, wektory muszą zawierać promotor o zasadniczym znaczeniu dla ekspresji w komórkach, na przykład promotor SV40 (Mulligan i wsp., Nature (1979) 277, 8), promotor MMLV-LTR, promotor EF I (Mizushima i wsp., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 322) i promotor CMV; korzystniej zawierają one gen do selekcji transformowanych komórek (na przykład gen oporności na lek, umożliwiający ocenę z użyciem określonego środka (neomycyna, G418 lub inne podobne środki). Do wektorów o takiej charakterystyce należą na przykład pmam, pdr2, pbk-rsv, pbk-cmv, poprsv i pop 13.

29 1 2 [0043] Oprócz tego do uzyskiwania stabilnej ekspresji genów i powielania genów w komórkach można stosować następujące metody: komórki CHO z deficytem szlaku syntezy kwasu nukleinowego wprowadza się z użyciem wektora (na przykład psv2-dhfr (Molecular Cloning, wydanie 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)), zawierającego gen DHFR, kompensujący ten deficyt i wektor powiela się, stosując metotreksat (MTX). Zamiast tego do przemijającej ekspresji genu można stosować następującą metodę: komórki COS z genem wykazującym na swym chromosomie ekspresję antygenu SV40 T poddaje się transformacji wektorem (pcd itp.) z użyciem początku replikacji SV40. Można także stosować początki replikacji pochodzące od wirusa polioma, adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawczaka (ang. bovine papilloma virus - BPV) i innych podobnych. Celem umożliwienia powielenia liczby kopii genów w komórkach gospodarza, wektory ekspresyjne mogą ponadto zawierać markery selekcyjne, takie jak gen transferazy aminoglikozydowej (APH), gen kinazy tymidyny (TK), gen fosforybozylotransferazy ksantynowo-guaninowej (Ecogpt) E. coli i gen reduktazy dihydrofolianu (dhfr). [0044] Pożądane przeciwciała uzyskane sposobami opisanymi powyżej można izolować z wnętrza komórek gospodarza lub ze środowiska poza komórkami (na przykład z pożywki) i oczyszczać do homogenności. Przeciwciała można izolować i oczyszczać sposobami rutynowo wykorzystywanymi do izolowania i oczyszczania przeciwciał; typ metody nie jest ograniczony. Przeciwciała można na przykład izolować i oczyszczać przez odpowiedni dobór i kojarzenie metod takich, jak

1 2 na przykład chromatografia kolumnowa, filtracja, ultrafiltracja, wysalanie, wytrącanie rozpuszczalnikiem, ekstrakcja rozpuszczalnikiem, destylacja, immunoprecypitacja, elektroforeza na żelu SDS-poliakrylamidowym, izoelektroogniskowanie, dializa i rekrystalizacja. [004] Do metod chromatograficznych należą metody takie, jak na przykład chromatografia powinowactwa, chromatografia jonowymienna, chromatografia hydrofobowa, filtracja żelowa, chromatografia z odwróceniem faz i chromatografia adsorpcyjna (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Red. Daniel R. Marshak i wsp., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Opisane wyżej procedury chromatograficzne można przeprowadzać z wykorzystaniem chromatografii cieczowej, na przykład HPLC i FPLC. Do kolumn, które można stosować do chromatografii powinowactwa, należą kolumny białka A i kolumny białka G. Do kolumn, w których wykorzystuje się białko A, należą na przykład Hyper D, POROS i Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). Przedmiotem niniejszego wynalazku są wysoko oczyszczone przeciwciała przy użyciu tych metod oczyszczania. [0046] Przedmiotem niniejszego wynalazku są również środki do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych, które zawierają jako składniki czynne fragmenty i(lub) produkty modyfikacji przeciwciała według niniejszego wynalazku. Do fragmentów i(lub) produktów modyfikacji przeciwciała według niniejszego wynalazku należą fragmenty przeciwciał pozbawione niektórych części

31 1 2 przeciwciała według niniejszego wynalazku, całe przeciwciała (na przykład całe IgG), przeciwciała rekombinowane (na przykład przeciwciała chimerowe, przeciwciała humanizowane i przeciwciała ludzkie) i miniciała (na przykład przeciwciała scfv)); nie są one szczególnie ograniczone, jeżeli tylko zachowują zdolność do wiązania się ze swymi antygenami. Fragmenty przeciwciał według niniejszego wynalazku nie są szczególnie ograniczone, pod warunkiem, że są częściami całych przeciwciał. Fragmenty korzystnie zawierają region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) i(lub) region zmienny łańcucha lekkiego (VL). Sekwencja aminokwasowa VH lub VL może zawierać substytucje, delecje, addycje i(lub) insercje. VH i(lub) VL mogą być pozbawione pewnych swoich części, o ile tylko zachowują zdolność do wiązania się z antygenem. Region zmienny może być ponadto chimeryzowany lub humanizowany. Konkretnie, do fragmentów przeciwciał należą na przykład Fab, Fab', F(ab')2 i Fv. Takie fragmenty przeciwciał można uzyskać przez skonstruowanie genów kodujących fragmenty przeciwciał, wprowadzenie ich do wektorów ekspresyjnych i następnie uzyskiwanie ich ekspresji w odpowiednich komórkach gospodarza (zob. na przykład Co, M. S. i wsp., J. Immunol. (1994) 12, 2968-2976; Better, M. i Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. i Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-1; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 62-663; Rousseaux, J. i wsp., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. i Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

32 1 2 [0047] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą także być przeciwciałami sprzężonymi z rozmaitymi cząsteczkami, takimi jak glikol polietylenowy (PEG), substancje radioaktywne, substancje fluorescencyjne, substancje luminescencyjne, enzymy i toksyny. Takie sprzężone przeciwciała można uzyskać przez modyfikację chemiczną uzyskanych przeciwciał. W stanie techniki znane są sposoby modyfikowania przeciwciał (zob. na przykład US 07313 i US 16840). Określenie przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmuje również takie przeciwciała sprzężone. [0048] Aktywność wiązania przeciwciała z NR można określić sposobami znanymi specjalistom. Do sposobów określania aktywności wiązania przeciwciała należą na przykład ELISA (test immunoenzymosorpcyjny), EIA (test immunoenzymatyczny), RIA (test radioimmunologiczny) i metoda z przeciwciałami fluorescencyjnymi. Kiedy na przykład stosuje się test immunoenzymatyczny, próbki zawierające przeciwciało, takie jak oczyszczone przeciwciała i nadsącz z hodowli komórek wytwarzających przeciwciała, dodaje się do płytek powlekanych antygenem. Dodaje się przeciwciało drugorzędowe, wyznakowane enzymem, takim jak fosfataza zasadowa, i płytki inkubuje się. Po przepłukaniu dodaje się substrat enzymatyczny, taki jak fosforan p- nitrofenylowy, i mierzy się absorbancję, żeby określić aktywność wiązania przeciwciała. [0049] Aktywność neutralizowania NR przeciwciała można także określić na przykład sposobem opisanym w przykładach, obejmującym testowanie efektu hamowania wzrostu zależnej od IL-31 linii komórkowej.

33 1 2 [000] Antagonistów NR lub przeciwciała wykazujące aktywność neutralizowania NR według niniejszego wynalazku można stosować w środkach do profilaktyki lub leczenia chorób zapalnych. Twórcy wynalazku udowodnili, że podawanie przeciwciał neutralizujących mysi NR zapewnia wyraźne efekty terapeutyczne w modelach zwierzęcych różnych chorób zapalnych. Donoszono także o nasileniu ekspresji ludzkiego NR w pogrubiałym naskórku pacjentów z atopowym zapaleniem skóry (dokument niepatentowy 1). Twórcy wynalazku potwierdzili w barwieniu immunohistochemicznym, że, podobnie jak w przypadku ludzi, w wyżej opisanym modelu przewlekłego zapalenia skóry u myszy dochodzi do zwiększenia ekspresji mysiego NR w pogrubiałym naskórku płatków usznych (przykład ). Te wyniki sugerują, że NR odgrywa podobną rolę w chorobach zapalnych u wszystkich gatunków zwierząt i że, podobnie jak przeciwciała neutralizujące mysi NR, przeciwciała neutralizujące ludzki NR są skuteczne w profilaktyce i leczeniu różnych chorób zapalnych. Ponadto, podobnie jak w przypadku obserwacji opisanych w tym przykładzie, oczekuje się, że antagoniści NR inni niż przeciwciała będą również wykazywać efekty terapeutyczne w różnych chorobach zapalnych. [001] W niniejszym wynalazku, określenie choroba zapalna odnosi się do chorób z cechami patologicznymi udziału w reakcjach cytologicznych i histologicznych, zachodzących w zajętych naczyniach krwionośnych i tkankach przyległych w odpowiedzi na uszkodzenie lub nieprawidłową stymulację przez środki fizyczne, chemiczne lub biologiczne (Stedman's Medical

34 1 2 Dictionary, wyd.., MEDICAL VIEW CO., 0). Ogólnie do chorób zapalnych należą: zapalenie skóry (atopowe zapalenie skóry, przewlekłe zapalenie skóry itp.), zapalne choroby jelit (zapalenie jelita grubego itp.), astma, zapalenie stawów (reumatoidalne zapalenie stawów, choroba zwyrodnieniowa stawów itp.), zapalenie oskrzeli, choroby autoimmunologiczne związane z Th2, ogólnoustrojowy toczeń trzewny, miastenia, przewlekła GVHD (choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi, choroba Crohna, choroba zwyrodnieniowa kręgosłupa, bóle krzyża, dna moczanowa, stany zapalne po zabiegach operacyjnych lub urazach, obrzęk, nerwoból, zapalenie krtani i gardła, zapalenie pęcherza moczowego, zapalenie wątroby (niealkoholowe tłuszczowe zapalenie wątroby, alkoholowe zapalenie wątroby itp.), zapalenie wątroby typu B, zapalenie wątroby typu C i miażdżyca. [002] Chorobami zapalnymi, które są celami niniejszego wynalazku, są atopowe zapalenie skóry, reumatyzm i choroba zwyrodnieniowa stawów. [003] Twórcy wynalazku odkryli, że przeciwciała antagonistyczne wobec NR wykazują efekty terapeutyczne przeciwko atopowemu zapaleniu skóry, reumatyzmowi i chorobie zwyrodnieniowej stawów. Z drugiej strony odkryto, że przeciwciała antagonistyczne wobec NR nie powodują efektów terapeutycznych w modelu ostrego kontaktowego zapalenia skóry ani modelu ostrego zapalenia jelit DSS. [004] Środki do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych według niniejszego wynalazku zawierają jako składnik czynny opisane wyżej: antagonistę NR lub przeciwciało wykazujące aktywność neutralizowania NR.

3 1 2 Zwrot zawierać jako składnik czynny antagonistę NR oznacza, że dany środek zawiera antagonistę NR co najmniej jako jeden ze składników czynnych; zwrot ten nie ogranicza zawartości tego środka. Oprócz tego, środki do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych według niniejszego wynalazku mogą również zawierać, w skojarzeniu z antagonistą NR, inne składniki, nasilające działanie profilaktyczne lub lecznicze wobec choroby zapalnej. [00] Antagonista NR według niniejszego wynalazku możne być opracowywany standardowymi sposobami (zob. na przykład, Remington's Pharmaceutical Science, ostatnie wydanie, Mack Publishing Company, Easton, USA). Mogą one ponadto, jeżeli jest to potrzebne, zawierać farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i(lub) środki dodatkowe. Mogą one na przykład zawierać środki powierzchniowo czynne (na przykład PEG i Tween), zaróbki, środki przeciwutleniające (na przykład kwas askorbinowy), środki barwiące, środki poprawiające smak i zapach, środki konserwujące, środki stabilizujące, środki buforujące (na przykład kwas fosforowy, kwas cytrynowy i inne kwasy organiczne), środki chelatujące (na przykład EDTA), środki zawieszające, środki nadające izotoniczność, środki wiążące, środki rozsadzające, środki poślizgowe, środki zwiększające płynność i środki korygujące smak. Nośniki, które mogą wchodzić w skład środków do profilaktyki lub leczenia chorób zapalnych według niniejszego wynalazku nie są jednak ograniczone do tej listy. W istocie, w skład środków mogą wchodzić inne powszechnie stosowane nośniki, takie jak lekki bezwodny kwas krzemowy,

36 1 2 laktoza, celuloza krystaliczna, mannitol, skrobia, sól wapniowa karmelozy, sól sodowa karmelozy, hydroksypropyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, poliwinyloacetalodietyloaminooctan, poliwinylopirolidon, żelatyna, trójgliceryd kwasu tłuszczowego o średniej długości łańcucha, polioksyetylenowany uwodorniony olej rącznikowy 60, sacharoza, karboksymetyloceluloza, skrobia kukurydziana, sól nieorganiczna i tak dalej. Kompozycje mogą również zawierać inne polipeptydy o małej masie cząsteczkowej, białka, takie jak albuminę surowicy, żelatynę i immunoglobulinę oraz aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina i lizyna. Gdy kompozycję wytwarza się w postaci wodnego roztworu do wstrzyknięć, antagonistów NR można rozpuszczać w roztworze izotonicznym, zawierającym na przykład sól fizjologiczną, dekstrozę i inne adiuwanty. Adiuwanty mogą obejmować na przykład D-sorbitol, D-mannozę, D- mannitol i chlorek sodu. Oprócz tego można równolegle stosować odpowiednie środki zwiększające rozpuszczalność, takie jak na przykład alkohole (na przykład etanol), polialkohole (na przykład glikole propylenowe i PEG) i detergenty niejonowe (polisorbat 80 i HCO-0). [006] Jeżeli jest to niezbędne, antagonistów NR można zamykać do mikrokapsułek (mikrokapsułki wytwarzane z hydroksycelulozy, żelatyny, polimetylometakrylanu i tym podobnych) i wytwarzać z nich składniki koloidalnych układów dostarczania leków (takich jak liposomy, mikrosfery albuminowe, mikroemulsje, nanocząstki i nanokapsułki) (zob. na

37 1 2 przykład Remington's Pharmaceutical Science, wyd. 16, Oslo (red.) (1980)). Znane są ponadto sposoby wytwarzania leków o przedłużonym uwalnianiu: sposoby te można zastosować w odniesieniu do antagonistów NR (Langer i wsp., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 1, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-; patent Stanów Zjednoczonych nr 3,773,919; europejskie zgłoszenie patentowe (EP) nr 8,481; Sidman i wsp., Biopolymers (1983) 22, 47-6; EP 133,988). [007] Środki do profilaktyki lub leczenia chorób zapalnych według niniejszego wynalazku można podawać doustnie lub pozajelitowo, lecz korzystnie podaje się je pozajelitowo. Konkretnie, środki podaje się pacjentom przez wstrzyknięcie przezskórnie. Wstrzyknięcia obejmują na przykład wstrzyknięcia dożylne, wstrzyknięcia domięśniowe i wstrzyknięcia podskórne, z podawaniem ogólnym lub miejscowym. Środki można podawać do okolic, w których konieczne jest zahamowanie zapalenia, lub do okolic sąsiednich, przez wlew miejscowy, korzystnie przez wstrzyknięcie domięśniowe. Sposoby podawania można odpowiednio dobierać w zależności od wieku i schorzenia pacjenta. Dawkę podawaną jednorazowo można dobierać na przykład z zakresu od 0,0001 do 0 mg składnika czynnego na kg masy ciała. Zamiast tego, gdy środki podaje się ludziom, dawkę składnika czynnego można wybierać z zakresu od 0,001 do 1 000 mg/kg masy ciała. Pojedyncza dawka korzystnie zawiera na przykład antagonistę NR w ilości od około 0,01 do 0 mg/kg masy ciała. Dawka środka do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych

38 1 2 według niniejszego wynalazku nie jest jednak ograniczona do tych przykładów. [008] Przedmiotem niniejszego wynalazku są również przeciwciała wykazujące aktywność neutralizowania NR (w tym fragmenty przeciwciał wykazujące aktywność neutralizowania NR i(lub) produkty ich modyfikacji; tę samą definicję stosuje się w całym poniższym opisie). Przeciwciała wykazujące aktywność neutralizowania NR według niniejszego wynalazku są użyteczne jako składniki czynne w wyżej opisanych środkach do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych. Przeciwciała wykazujące aktywność neutralizowania NR według niniejszego wynalazku mogą być przeciwciałami poliklonalnymi lub monoklonalnymi, lecz korzystnie są to przeciwciała monoklonalne. Takie przeciwciała monoklonalne wykazujące aktywność neutralizowania NR można uzyskać sposobami opisanymi wyżej. Przeciwciała monoklonalne według niniejszego wynalazku wykazują aktywność neutralizowania pochodzącego od ssaków NR lub jego fragmentów, korzystnie wykazują aktywność pochodzącego od ludzi lub myszy neutralizowania NR, albo jego fragmentów, korzystniej aktywność neutralizowania pochodzącego od ludzi NR albo jego fragmentów. Ludzki NR lub jego fragment peptydowy może być stosowany jako immunogen do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych wykazujących aktywność neutralizowania ludzkiego NR. Zamiast tego przeciwciała wykazujące aktywność neutralizowania NR według niniejszego wynalazku mogą być przeciwciałami rekombinowanymi. Do przeciwciał rekombinowanych wykazujących aktywność neutralizowania NR według

39 1 2 niniejszego wynalazku należą między innymi przeciwciała chimerowe, przeciwciała humanizowane, przeciwciała ludzkie i miniciała. [009] Według niniejszego wynalazku do przeciwciał wykazujących aktywność neutralizowania NR należą na przykład przeciwciała antymysie NR, zawierające region zmienny łańcucha ciężkiego, w skład którego wchodzi sekwencja aminokwasowa o NR ID. SEKW. 1 i region zmienny łańcucha lekkiego, w skład którego wchodzi sekwencja aminokwasowa o NR ID. SEKW. 3. [0060] Niniejszy wynalazek obejmuje również przeciwciała monoklonalne, wykazujące aktywność neutralizowania ludzkiego NR. Przeciwciała monoklonalne wykazujące aktywność neutralizowania ludzkiego NR według niniejszego wynalazku można uzyskać przez wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych z zastosowaniem jako immunogenu ludzkiego NR lub jego fragmentu peptydowego i następnie selekcję przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiemu NR, wykazujących aktywność neutralizowania ludzkiego NR, na podstawie wyników uzyskanych z użyciem wyżej opisanego układu testowego, w którym wykorzystuje się IL-31-zależną linię komórkową. [0061] Według niniejszego wynalazku do przeciwciał wykazujących aktywność neutralizowania ludzkiego NR należą przeciwciała opisane w dowolnym z poniższych punktów: (a) przeciwciała, których region zmienny łańcucha ciężkiego zawiera CDR1, CDR2 i CDR3, składające się, odpowiednio, z sekwencji aminokwasowych o NR ID. SEKW. 18, 19 i ;

40 1 2 (b) przeciwciała, których region zmienny łańcucha lekkiego zawiera CDR1, CDR2 i CDR3, składające się, odpowiednio, z sekwencji aminokwasowych o NR ID. SEKW. 21, 22 i 23; (c) przeciwciała zawierające region zmienny łańcucha ciężkiego z punktu (a) i region zmienny łańcucha lekkiego z punktu (b); (d) i przeciwciała, które rozpoznają ten sam epitop, który jest rozpoznawany przez przeciwciała według dowolnego z punktów od (a) do (c). [0062] To, czy przeciwciało rozpoznaje ten sam epitop, który jest rozpoznawany przez inne przeciwciało, można potwierdzić w teście kompetycji między oboma przeciwciałami w ich działaniu przeciwko epitopowi. Kompetycję między przeciwciałami można oceniać w testach wiązania kompetycyjnego z zastosowaniem takich metod, jak ELISA, metoda przenoszenia energii fluorescencyjnej (ang. fluorescence energy transfer method - FRET) i technika mikroobjętościowego testu fluorometrycznego (ang. fluorometric microvolume assay technology (FMAT ). Ilość przeciwciał związanych z antygenem pośrednio koreluje ze zdolnością wiązania przeciwciała, które uważa się za potencjalne przeciwciało kompetycyjne (przeciwciało badane), które wiąże się kompetycyjnie z tym samym epitopem. Innymi słowy, gdy ilość przeciwciał badanych lub powinowactwo przeciwciał badanych względem tego samego epitopu zwiększa się, ilość przeciwciał związanych z antygenem zmniejsza się, a ilość przeciwciał badanych związanych z antygenem zwiększa się. Konkretnie, odpowiednio wyznakowane przeciwciała i przeciwciała, które mają

41 1 2 zostać poddane ocenie, dodaje się jednocześnie do antygenów i związane w taki sposób przeciwciała wykrywa się, stosując znacznik. Ilość przeciwciał związanych z antygenem można łatwo oznaczyć, jeżeli wcześniej przeciwciała wyznakuje się. Taki znacznik nie jest szczególnie ograniczony, a sposób znakowania dobiera się w zależności od stosowanej metody badania. Do metod znakowania należą znakowanie fluorescencyjne, użycie znaczników radioaktywnych, znakowanie enzymatyczne itp. [0063] Przeciwciała wyznakowane fluorescencyjnie i przeciwciała niewyznakowane (badane) dodaje się na przykład jednocześnie do komórek zwierzęcych, z ekspresją NR, i wyznakowane przeciwciała wykrywa się techniką mikroobjętościowego testu fluorometrycznego. [0064] IC 0 jest to stężenie, w którym ilość wyznakowanych przeciwciał związanych z epitopem jest zmniejszona o 0% poprzez wiązanie przeciwciał niewyznakowanych. Według niniejszego wynalazku, przeciwciałami, które rozpoznają ten sam epitop, są przeciwciała, które mogą zmniejszyć ilość wyznakowanych przeciwciał związanych z epitopem o co najmniej 0%, gdy stężenie przeciwciał badanych jest dziesięciokrotnie wyższe, niż IC 0 przeciwciał niewyznakowanych. [006] Przeciwciała posiadające aktywność neutralizowania ludzkiego NR, stosowane według niniejszego wynalazku, korzystnie wykazują również aktywność wiązania z NR makaka, korzystniej, wykazują aktywność neutralizowania NR makaka. W pomiarach aktywności neutralizowania lub wiązania z NR

42 1 2 makaka można stosować NR makaka zawierającą sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW. 24. [0066] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również opisane poniżej zastosowanie terapeutyczne. Interpretacja pojęć: NR, antagoniści, przeciwciała monoklonalne, przeciwciała rekombinowane, choroby zapalne i innych w odniesieniu do tych sposobów jest taka, jak opisano powyżej. [1] Przeciwciało anty-nr/il-31ra posiadające aktywność neutralizowania NR/IL-31RA do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zapalnej, przy czym chorobą zapalną jest (a) atopowe zapalenie skóry, przy czym przeciwciało hamuje co najmniej jeden z objawów atopowego zapalenia skóry dobrany z grupy obejmującej (1) świąd (2) zaczerwienienie i krwawienie (3) obrzęk (4) uraz i uszkodzenie tkanki i () inkrustację i suchość; (b) reumatyzm; (c) lub choroba zwyrodnieniowa stawów. [2] Środek do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zapalnej, przy czym środek zawiera jako składnik czynny przeciwciało według [1] i przy czym chorobą zapalną jest (a) atopowe zapalenie skóry, przy czym przeciwciało hamuje co najmniej jeden z objawów atopowego zapalenia skóry dobrany z grupy obejmującej (1) świąd (2) zaczerwienienie i krwawienie (3) obrzęk (4) uraz i uszkodzenie tkanki i () inkrustację i suchość; (b) reumatyzm (c) lub choroba zwyrodnieniowa stawów.

43 1 2 [3] Przeciwciało do zastosowania według [1] lub środek do zastosowania według [2], przy czym przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. [4] Przeciwciało do zastosowania według [1] lub [3] lub środek do zastosowania według [2] lub [3], przy czym NR/IL-31RA jest to ludzki NR/IL-31RA. [] Przeciwciało do zastosowania według dowolnego z punktów od [1], [3] lub [4] albo środek do zastosowania według dowolnego z punktów od [2] do [4], przy czym przeciwciało jest przeciwciałem rekombinowanym. [6] Przeciwciało lub środek do zastosowania według [], przy czym przeciwciało rekombinowane jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim. [7] Fragment i(lub) zmodyfikowany chemicznie fragment przeciwciała według dowolnego z punktów od [1] lub [3] do [6] do zastosowania według dowolnego z punktów od [1] lub [3] do [6], przy czym tym fragmentem jest fragment Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv. [8] Środek zawierający fragment do zastosowania według [7]. Przykłady [0067] Poniżej niniejszy wynalazek zostanie konkretnie opisany w odniesieniu do przykładów. [Przykład 1] Otrzymywanie linii komórkowej Ba/F3, wykazującej ekspresję NR i OSMR [0068] Ludzki cdna NR (NR ID. SEKW. 1 z WO 007314) wprowadzano do wektora ekspresyjnego pcos1 (Biochem Biophys Res Commun. 228, p838-4, 1996), aby uzyskać pcosnr.3. Z ludzkiej biblioteki łożyskowej izolowano metodą PCR cdna receptora onkostatyny M (OSMR, nr

44 1 2 akcesyjny GenBank NM003999), po czym w podobny sposób konstruowano wektor ekspresyjny pcos1-hosmr. Do komórek linii komórkowej Ba/F3, pochodzącej z mysich IL-3- zależnych komórek pro-b (BioRad Gene Pulser; 960 F i 0,33 kv) wprowadzano jednocześnie przez elektroporację g każdego z tych wektorów. Po wprowadzeniu dodawano ludzką IL-31 i komórki hodowano. W ten sposób uzyskiwano linię komórkową, która proliferowała w sposób zależny od IL-31. Podobnie wytwarzano linię komórkową zależną od mysiej IL-31 z komórek Ba/F3, którym nadano zdolność ekspresji genów mysiego NR i OSMR. [0069] Stwierdzono, że w obu liniach komórkowych wartość ED 0 była rzędu kilku ng/ml. Uzyskano zatem dobrze proliferujące linie komórkowe. Linia komórkowa zależna od ludzkiej IL-31 nie wykazywała odpowiedzi na ludzką IL-31, a jej wzrost ulegał zahamowaniu po dodaniu ludzkiego białka NR (domena pozakomórkowa). Linia komórkowa zależna od mysiej IL-31 nie wykazywała odpowiedzi na ludzką IL-31, a jej wzrost nie ulegał zahamowaniu po dodaniu mysiego białka NR (domena pozakomórkowa). [Przykład 2] Wytwarzanie białka NR (domena pozakomórkowa) [0070] Powielono samą domenę pozakomórkową metodą PCR, stosując jako matrycę cdna NR ; do końca C przyłączono sekwencję tagową FLAG i całość wprowadzono do wektora ekspresyjnego pcxnd3 (WO 0/00636) (pcxnd3-nr -flag). g tego liniowego wektora wprowadzono do komórek jajnika chomika chińskiego - linia komórkowa DG44 - przez elektroporację (BioRad

4 1 2 Gene PulserII; 2 F i 1, kv). Uzyskano linię komórkową o dużej ekspresji. Z nadsączu prowadzonej na dużą skalę hodowli linii komórkowej oczyszczono próbkę, stosując kolumnę z przeciwciałem anty-flag (SIGMA) i filtrację żelową, i użyto jej w doświadczeniach opisanych poniżej. Podobnie uzyskano mysi NR (domena pozakomórkowa) z sekwencją tagową FLAG przyłączoną do końca C. [Przykład 3] Izolowanie scfv wykazujących aktywność neutralizowania mysiego NR i wytwarzanie BM09 jako chimeryzowanej IgG [0071] Konkretnie, twórcy niniejszego wynalazku usiłowali zawęzić grupę potencjalnych klonów z ludzkiej biblioteki fagowej przeciwciał metodą panningu, stosując biotynylowane mysie białko NR (domena pozakomórkowa). Z klonów oczyszczono scfv wydzielnicze i dodawano je do układu badania wzrostu komórek, stosując IL-31-zależne komórki Ba/F3, opisane w przykładzie 1. W wyniku tego uzyskano klon BM09, wykazujący silną aktywność hamowania wzrostu. [0072] Sekwencję regionu zmiennego ludzkiego łańcucha H (VH) BM09 sprzężono metodą PCR z regionem stałym IgG2a (za CH1), a ludzką sekwencję regionu zmiennego łańcucha L (VL) BM09 sprzężono z mysim regionem stałym łańcucha λ, konstruując wektor ekspresyjny. Sekwencję aminokwasową VH ukazano w NR ID. SEKW. 1, a sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową ukazano w NR ID. SEKW. 2. Sekwencję aminokwasową VL ukazano w NR ID. SEKW. 3, a sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową ukazano w NR ID. SEKW. 4. Jednocześnie odpowiednie liniowe wektory ekspresyjne

46 1 2 wprowadzono do linii komórkowej DG44, po czym wybrano linię komórkową wykazującą ekspresję chimeryzowanej IgG na wysokim poziomie. Z nadsączu hodowli na dużą skalę tej linii komórkowej uzyskano oczyszczoną próbkę, stosując chromatografię z kolumną z białkiem A (rprotein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences) i z kolumną kationowymienną (SP-TOYOPEARL 60M, TOSOH). Następnie usuwano pirogen, stosując żywicę ActiClean Etox (Sterogen), żeby obniżyć stężenie poniżej granicy wykrywania. Próbkę zastosowano w opisanych poniżej doświadczeniach na zwierzętach. Wynik uzyskany poprzez dodanie BM09 do opisanego powyżej układu testowego ukazano na Fig. 1. [Przykład 4] Ocena skuteczności leku w modelu atopowego zapalenia skóry z wykorzystaniem myszy NC/Nga [0073] Uzyskano model zapalenia skóry przez wielokrotne stosowanie chlorku pikrylu (PiCl) w odstępach tygodniowych. Konkretnie, 4 dni po uwrażliwieniu % PiCl ( l) na brzuchu i poduszeczce łapy uzyskano indukcję zapalenia skóry przez wielokrotne nakładanie 0,8% PiCl ( l) na grzbiet i płatek uszny w odstępach tygodniowych. Uzyskane objawy obserwowano dwa razy w tygodniu przez okres od tygodnia trzeciego do szóstego i niezależnie oceniano pięć objawów ((1) świąd (2) zaczerwienienie i krwawienie (3) obrzęk (4) uraz i uszkodzenie tkanki oraz () inkrustację i suchość) w skali od 0 do 3. Przeciwciało podawano w dawce mg/kg do jamy otrzewnowej w dniu przed uwrażliwieniem i przy każdorazowej indukcji w sumie 6 razy (grupa BM09) lub w dniu przed każdą indukcją po trzecim tygodniu w sumie trzy razy (grupa V/B). W grupie kontroli

47 1 2 dodatniej podawano dojelitowo 1 mg/kg deksametazonu codziennie po tygodniu trzecim (grupa DEX). Każda grupa liczyła samców myszy NC/Nga. [0074] Jak ukazano na Fig. 2, w grupie otrzymującej przeciwciało odnotowano znamienny efekt hamowania w porównaniu z grupą otrzymującą zaróbkę (rozpuszczalnik). Oprócz tego, jak widać na Fig. 2, podczas gdy w grupie DEX zaobserwowano znamienne zmniejszenie masy ciała, w grupie otrzymującej przeciwciało nie stwierdzono zmian masy ciała. Sugeruje to, że przeciwciało jest środkiem bardzo bezpiecznym. [Przykład ] Ocena skuteczności leku z wykorzystaniem modelu przewlekłego zapalenia skóry, uzyskanego przez wielokrotne podawanie chlorku pikrylu [007] Samice myszy BALB/c w wieku 6 tygodni uwrażliwiano, nakładając każdej z nich na prawe ucho l 0,% chlorku pikrylu (aceton/oliwa z oliwek (roztwór w stosunku objętościowym 1:4). Indukcję uzyskiwano przez wielokrotne nakładanie l 0,2% chlorku pikrylu (aceton/oliwa z oliwek (w stosunku objętościowym 1:4)) na prawe ucho co dwa dni od ósmego dnia po uwrażliwieniu. Podawano mg/kg BM09 do jamy otrzewnowej jeden raz w tygodniu od dnia przed uwrażliwieniem w grupie, w której oceniano efekt zapobiegawczy BM09, lub od. dnia od początku indukcji w grupie, w której oceniano efekt terapeutyczny BM09. Oceniano obrzęk płatka usznego przez kolejne pomiary grubości prawego ucha z zastosowaniem grubościomierza z tarczą. [0076] W wyniku tego zaobserwowano znamienny efekt hamowania w grupie otrzymującej przeciwciało, co widać

48 1 2 na Fig. 4. Uprzednio donoszono o zwiększeniu ekspresji ludzkiego NR w pogrubiałym naskórku u pacjentów z atopowym zapaleniem skóry (dokument niepatentowy 1). Płatki uszne myszy stanowiących wyżej opisany model przewlekłego zapalenia skóry barwiono immunohistochemicznie. Podobnie jak w przypadku ludzi, obserwowano zwiększenie ekspresji mysiego NR w pogrubiałym naskórku (Fig. ; BM09, w którym region stały zastąpiono regionem pochodzącym z ludzkiej IgG zob. przykład 3 - i wykorzystano w barwieniu immunohistochemicznym. Części zabarwione na brązowo są miejscami ekspresji NR ). Ta obserwacja sugeruje, że NR odgrywa podobną rolę w chorobach zapalnych u ludzi i u myszy. [Przykład 6] Ocena skuteczności leku z wykorzystaniem modelu indukowanego kolagenem zapalenia stawów (reumatyzmu) [0077] Przygotowanie stanowiących model myszy i ocenę skuteczności leku przeprowadzono w sposób opisany poniżej. [0078] 140 l żelu kolagenowego, uzyskanego przez połączenie równych ilości kompletnego adiuwantu H37Ra i 0,3% kolagenu typu II pochodzącego ze stawu bydlęcego, podawano śródskórnie 9-tygodniowym samicom myszy DBA/1JN w czubek ogona (dzień 0; uwrażliwienie). Po trzech tygodniach żel kolagenowy wytworzony w ten sam sposób podawano śródskórnie w grzbiet, żeby indukować początek zapalenia stawów (dzień 21; indukcja). Na 2 dni przed uwrażliwieniem (dzień -2) 16 myszy podzielono, w zależności od masy ciała, na dwie grupy po 8 myszy jedna miała otrzymywać medium, a druga -

49 1 2 BM09. Jako medium stosowano mmol/l bufor octanowy (ph,) (0 mmol/l NaCl) rozcieńczony 6-krotnie PBS; substancję badaną - BM09 - podawano dożylnie 8 myszom z grupy otrzymującej BM09 w dawce mg/kg masy ciała na dzień przed uwrażliwieniem (dzień -1). W tym samym czasie taką samą objętość medium na jednostkę masy ciała podawano 8 myszom z grupy otrzymującej medium (kontrola) w dniu -1. Obserwowano obrzęk czterech kończyn i oceniano go w punktach (w skali od 0 do 4 w odniesieniu do każdej kończyny: wynik całkowity - 16) od dnia poprzedzającego indukcję (dzień ) co 2-3 dni. [0079] W wyniku tego stwierdzono obniżanie się punktowego wyniku oceny obrzęku czterech kończyn po dniu w grupie otrzymującej BM09, jak widać na Fig. 6. Sugeruje to, że BM09 wykazuje efekt hamowania wystąpienia zapalenia stawów. [Przykład 7] Ocena skuteczności leku z wykorzystaniem modelu zapalenia stawów indukowanego kolagenazą (choroba zwyrodnieniowa stawów) [0080] Przygotowanie stanowiących model myszy i ocenę skuteczności leku przeprowadzono w sposób opisany poniżej. [0081] Stanowiące kontrolę medium ( mmol/l bufor octanowy (ph,) rozcieńczony 6-krotnie PBS, 0 mmol/l NaCl (n=)), 2 mg/kg BM09 (n=) i mg/kg BM09 (n=6) podawano ( ml/kg) dożylnie do żyły ogonowej samcom myszy C7BL/6J Jcl w wieku 8 tygodni (CLEA Japan Inc.). Następnie do jamy prawego stawu kolanowego podawano 6 l 1,% roztworu kolagenazy (typ II; Sigma) przefiltrowanego przez 0,4- m filtr

0 1 2 (MILLIPORE) w znieczuleniu wziewnym 3% izofluranem (Am J Pathol 1989; 13(6):01-14). [0082] Za pomocą cyrkla (Mitsutoyo CO.) mierzono szerokość prawego i lewego stawu kolanowego bezpośrednio przed podaniem kolagenazy i 3, 7 i 14 dni po podaniu kolagenazy, celem obliczenia różnicy między stawem prawym a lewym. Różnicę definiowano jako wartość odpowiadającą obrzękowi prawego stawu kolanowego. Pole pod krzywą (AUC) przejścia tej różnicy określano na podstawie wzoru trapezów i definiowano jako wskaźnik skuteczności leku. Przeprowadzono test t Studenta w odniesieniu do AUC w grupie kontrolnej otrzymującej medium i w grupie otrzymującej BM09, z wykorzystaniem oprogramowania do analizy statystycznej (SAS Institute Inc.) (różnicę uznaje się za znamienną, gdy p<0,0). W wyniku tego AUC w grupie otrzymującej BM09 było znamiennie mniejsze (w każdej dawce), niż w grupie kontrolnej, otrzymującej substancję nieczynną, jak widać na Fig. 7. Wynik ten dowodzi, że BM09 hamuje zapalenie stawów w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów. [Przykład 8] Wytwarzanie przeciwciał neutralizujących przeciwko ludzkiemu NR [0083] Myszy immunizowano ludzkim białkiem NR (domena pozakomórkowa) (jak opisano w przykładzie 2} i konwencjonalnymi sposobami wytworzono hybrydomy. W nadsączach z hodowli hybrydom przeprowadzono testy aktywności neutralizującej, stosując linię komórkową zależną od ludzkiej IL-31 (komórki hnr /hosmr/baf3), opisane w przykładzie 1. Uzyskano wiele klonów,

1 1 2 wykazujących silną aktywność neutralizowania NR (Fig. 8). [Przykład 9] Wytwarzanie ludzkich przeciwciał chimerowych [0084] Sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego NA633, wykazującą najsilniejszą aktywność wśród przeciwciał neutralizujących, ukazano w NR ID. SEKW. 16, a sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego ukazano w NR ID. SEKW. 17. Oprócz tego, sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego NA633 ukazano, odpowiednio, w NR ID. SEKW. 18, 19 i ; sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego ukazano, odpowiednio, w NR ID. SEKW. 21, 22 i 23. [008] Wytworzono ponadto konwencjonalnym sposobem przeciwciało chimerowe, zawierające wyżej opisany mysi region zmienny i ludzki region stały (łańcuch H typu IgG1; łańcuch L typu K) i określano aktywność neutralizującą. Jak ukazano na Fig. 9, przeciwciało chimerowe NA633 wykazywało silną aktywność neutralizującą w małym stężeniu. [Przykład ] Izolowanie NR makaka [0086] Twórcy wynalazku usiłowali wyizolować gen NR makaka, ponieważ uznano, że reaktywność krzyżowa i aktywność neutralizowania NR makaka będą istotne w ocenie bezpieczeństwa na etapie przedklinicznym. Primery opracowano na podstawie ujawnionej informacji genomowej rezusa i powielono je, jak również powielono gen NR, z narządów makaka metodą PCR. Na Fig. ukazano dopasowanie sekwencji aminokwasowych ludzkiego

2 1 2 NR i izolowany NR makaka. Sekwencję aminokwasową NR makaka ukazano w NR ID. SEKW. 24. Uzyskano linię komórkową, proliferującą w sposób zależny od ludzkiej IL-31, przez wprowadzenie genu NR makaka wraz z ludzkim genem OSMR do komórek Ba/F3, jak opisano w przykładzie 1. Z użyciem tej linii komórkowej badano aktywność neutralizującą chimerowego przeciwciała NA633 opisanego w przykładzie 9. Wynik dowiódł, że przeciwciało wykazywało również silną aktywność neutralizującą u makaka (Fig. 11). [Przykład referencyjny 1] Skuteczność leku BM09 w zapaleniu jelita grubego indukowanego siarczanem sodowym dekstranu (DSS) [0087] Uzyskano model indukowanego DSS zapalenia jelita grubego (J Immunol (03) 171:07-13), o którym donoszono, że jest modelem patologicznym nieswoistego zapalenia jelit (IBD), do oceny efektu BM09 przeciwciała neutralizującego mysi NR. Z użyciem wody destylowanej, przefiltrowanej i wyjałowionej przez filtr 0,22 m (Millipore), wytworzono wodny roztwór % (masa/obj.) soli sodowej siarczanu dekstranu (Wako Pure Chemical Industries). Samcom myszy Balb/cAnN Crj w wieku 6 tygodni (CHARLES RIVER LABORATORIES, Japonia) pozwalano swobodnie pić roztwór z butelek na wodę przez 7 dni. Zwierzęta ważono; procentową zmianę masy ciała w stosunku do masy w pierwszym dniu podawania DSS stosowano jako wskaźnik skuteczności leku. [0088] Wykorzystując ten model, przeciwciało anty-mysie neutralizujące mysi NR - BM09 podawano dożylnie w dawce mg/kg na dzień przed podaniem DSS i oceniano uzyskane w ten sposób zmniejszenie masy ciała (n=),

3 1 2 żeby ocenić, na ile stan patologiczny uległ poprawie poprzez przekazywanie sygnałów neutralizujących IL-31. Jako grupę kontrolną zastosowano grupę (grupa zaróbki; n=), w której podawano zaróbkę (mieszaninę buforu octanowego [ mmol/l octanu sodu i mmol/l chlorku sodu] i sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanem [PBS; GIBCO], zmieszane w stosunku objętościowym 1:) podawano dożylnie na dzień przed podaniem DSS. Badano ponadto przebieg procentowej zmiany masy u myszy Balb/cAnN Crj tej samej płci i wieku (n=1), co w grupie otrzymującej DSS, żeby określić przebieg w czasie procentowej zmiany masy u myszy zdrowych. [0089] Przebieg zmian masy w czasie ukazano na Fig. 12. Podawanie DSS zmniejszyło procentową zmianę masy ciała w grupie otrzymującej zaróbkę. Przebieg w czasie procentowej zmiany masy w grupie otrzymującej BM09 był podobny, jak w grupie otrzymującej zaróbkę. Jednakże w 4 i dni po podaniu DSS w grupie BM09 obserwowano znamienną zmianę procentowej masy ciała w porównaniu z grupą otrzymującą zaróbkę. Wyniki te wykazały, że podawanie BM09 nie dawało efektu terapeutycznego wobec zapalenia jelit grubego w tym modelu. [0090] Opisywano, że w tym modelu ekspresja IL-31RA jest nasilona (WO 04/003140). Opisane powyżej wyniki doświadczalne dowodzą, że przeciwciała neutralizujące cząsteczkę nie powodowały efektu terapeutycznego wobec zapalenia jelita grubego w tym modelu. [Przykład referencyjny 2] Skuteczność leku BM09 w modelu ostrego kontaktowego zapalenia skóry indukowanego chlorkiem pikrylu

4 1 2 [0091] W celu oceny efektu anty-mysiego neutralizującego NR przeciwciała BM09 uzyskano zapalenie skóry w postaci opisywanego modelu ostrego kontaktowego zapalenia skóry (Clin Immunol (03) 8: 27-262). Takie zapalenie skóry jest skutkiem reakcji nadwrażliwości opóźnionej z powodu uwrażliwienia i indukcji przez nakładanie chlorku pikrylu. 0 l roztworu 7% chlorku pikrylu (nacalai tesque, Inc.; etanol:aceton = 3:1 (stosunek objętościowy)) nakładano na skórę brzucha w celu uwrażliwienia samic myszy Balb/cAnN Crj w wieku 8 tygodni (CHARLES RIVER LABORATORIES, Japonia) i po dniach na skórę prawego płatka usznego nakładano l 1% roztworu chlorku pikrylu (aceton:oliwa = 1:4 (stosunek objętościowy)), żeby wywołać kontaktowe zapalenie skóry (indukcja). Na skórę lewego płatka usznego tych samych myszy nakładano l zaróbki (aceton:oliwa = 1:4 (stosunek objętościowy)) była to próba kontrolna, służąca do oceny efektu zaróbki na grubość płatka usznego (grupa dodatnia; n=6). Grubość ucha prawego i lewego mierzono, stosując grubościomierz z tarczą (OZAKI MFG.) bezpośrednio przed indukcją i 24, 48 i 72 godziny po indukcji; zmianę grubości płatka usznego w stosunku do grubości bezpośrednio przed indukcją wykorzystywano jako wskaźnik skuteczności leku. [0092] Jako grupę kontrolną do oceny powstawania stanu patologicznego wykorzystywano grupę (grupa ujemna; n=6), w której na skórę brzucha nakładano mieszaninę etanol-aceton (3:1 (stosunek objętościowy)) bez chlorku pikrylu w momencie uwrażliwienia oraz po dniach na skórę prawego płatka usznego nakładano l 1%

roztworu chlorku pikrylu, a na skórę lewego płatka 1 2 usznego - l zaróbki (aceton:oliwa = 1:4 (stosunek objętościowy)). [0093] Do oceny efektu podawania przeciwciała przeciwko mysiemu NR na stany patologiczne w układzie modelu wykorzystywano grupę (grupa BM09; n=6), w której indukowano ostre kontaktowe zapalenie skóry taką samą metodą, jak w wyżej opisanej grupie dodatniej, po czym podawano dożylnie BM09 podawano w dawce mg/kg w dniach przed uwrażliwieniem i indukcją i grupę (grupa zaróbki; n=), w której w tych samych punktach czasowych podawano zaróbkę (bufor octanowy [ mmol/l octanu sodu i mmol/l chlorku sodu] i sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanem [PBS; GIBCO], które kojarzono w stosunku objętościowym 1:) podawano. [0094] Zmiany grubości płatka usznego do 72 godzin po indukcji ukazano na Fig. 13. Stwierdzono, że płatek uszny był znamiennie pogrubiały w grupie dodatniej w każdym punkcie czasowym 24, 48 i 72 godziny po indukcji w porównaniu z grupą ujemną, co sugeruje początek stanu patologicznego. Zmiana grubości płatka usznego w grupie BM09 była podobna, jak w grupie otrzymującej zaróbkę, nie stwierdzono więc znamiennego hamowania. [009] Wyżej opisane wyniki dowodzą, że podawanie BM09 nie zapewniało efektu terapeutycznego w ostrym kontaktowym zapaleniu skóry obserwowanym w tym modelu. Zastosowanie w przemyśle [0096] Przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe środki do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych. Środki do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych dostarczane w niniejszym wynalazku zawierają jako

6 1 składnik czynny przeciwciało anty-nr/il-31ra, konkretniej przeciwciało posiadające aktywność neutralizującą NR/IL-31RA. [0097] Terapia antycytokinowa oparta na zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych przyciąga w ostatnich latach dużą uwagę. W wielu rzeczywistych stanach patologicznych trudno jest jednak uzyskać efekty terapeutyczne przez zablokowanie jednej cytokiny, gdyż aktywacji ulegają szlaki kompensacyjne. Trudno jest także oszacować, w którym typie chorób można byłoby uzyskać efekty terapeutyczne przez blokowanie cytokiny docelowej. W opisanych powyżej warunkach twórcy niniejszego wynalazku odkryli, że przeciwciała neutralizujące anty-nr mogą znamiennie hamować objawy atopowego zapaleniem skóry w mysim modelu przewlekłego zapaleniem skóry, reumatyzmu, choroby zwyrodnieniowej stawów itp. [0098] Twórcom niniejszego wynalazku udało się również wytworzyć przeciwciała neutralizujące ludzki NR. Środki do zapobiegania lub leczenia chorób zapalnych, które zawierają jako składnik czynny przeciwciała neutralizujące ludzki NR, są wysoce użyteczne do zastosowania klinicznego u ludzi. 2 3 WYKAZ SEKWENCJI [0099] <1> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <1> KOMPOZYCJA FARMACEUTYCZNA DO ZAPOBIEGANIA LUB LECZENIA CHORÓB ZAPALNYCH <1> C1-A0606P <> JP 06-160096 <11> 06-06-08 <160> 24 <170> PatentIn wersja 3.3 <2> 1

7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 <2> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 1 <2> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

8 <2> 4 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 <2> <211> 716 <212> PRT <213> Mus musculus <400>

9

60

61 <2> 6 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

62

63

64 <2> 7 <211> 732 <212> PRT <213> Homo sapiens <2> <221> SIGNAL <222> (1)..() <2> <221> TRANSMEM <222> ()..(43) <400> 7

6

66

67 <2> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> 8 1 <2> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> 9 2 <2> <211> <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> <2> 11 <211> <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> 11 3 40 <2> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> 12

68 <2> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> 13 1 <2> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> 14 <2> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczne <2> <223> Sztucznie zsyntetyzowana sekwencja peptydowa <400> 1 2 <2> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16

69 <2> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17

70 <2> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 <2> 19 <211> 1 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 1 <2> <211> <212> PRT <213> Mus musculus <400> <2> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 2 <2> 22 <211> 7

71 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 <2> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 <2> 24 <211> 73 <212> PRT <213> Cynomolgus <400> 24 1

72

73

74

7 1 2 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało anty-nr/il-31ra posiadające aktywność neutralizowania NR/IL-31RA do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu choroby zapalnej, przy czym chorobą zapalną jest (a) atopowe zapalenie skóry, przy czym przeciwciało hamuje co najmniej jeden z objawów atopowego zapalenia skóry dobrany z grupy składającej się z (1) świądu (2) zaczerwienienia i krwawienia (3) obrzęku (4) urazu i uszkodzenia tkanki i () inkrustacji i suchości (b) reumatyzm lub (c) choroba zwyrodnieniowa stawów. 2. Środek do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zapalnej, przy czym środek zawiera jako składnik aktywny przeciwciało według zastrz. 1 i przy czym chorobą zapalną jest (a) atopowe zapalenie skóry, przy czym przeciwciało hamuje co najmniej jeden z objawów atopowego zapalenia skóry dobrany z grupy składającej się z (1) świądu (2) zaczerwienienia i krwawienia (3) obrzęku (4) urazu i uszkodzenia tkanki i () inkrustacji i suchości; (b) reumatyzm (c) lub choroba zwyrodnieniowa stawów. 3. Przeciwciało do zastosowania według zastrz. 1 lub środek do zastosowania według zastrz. 2, przy czym przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. 4. Przeciwciało do zastosowania według zastrz. 1 lub 3 lub środek do zastosowania według zastrz. 2 lub 3, przy czym NR/IL-31RA jest to ludzki NR/IL-3RA.. Przeciwciało do zastosowania według dowolnego z zastrz. 1, 3 lub 4 lub środek do zastosowania według

76 1 dowolnego z zastrz. 2-4, przy czym przeciwciało jest przeciwciałem rekombinowanym. 6. Przeciwciało lub środek do zastosowania według zastrz., przy czym przeciwciałem rekombinowanym jest przeciwciało chimerowe, przeciwciało humanizowane lub przeciwciało ludzkie. 7. Fragment i(lub) zmodyfikowany chemicznie fragment przeciwciała, zdefiniowany w dowolnym z zastrz. 1 lub 3-6 do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu choroby zapalnej, przy czym chorobą zapalną jest (a) atopowe zapalenie skóry, przy czym przeciwciało hamuje co najmniej jeden z objawów atopowego zapalenia skóry dobrany z grupy składającej się z (1) świądu (2) zaczerwienienia i krwawienia (3) obrzęku (4) urazu i uszkodzenia tkanki i () inkrustacji i suchości; (b) reumatyzm lub (c) choroba zwyrodnieniowa stawów, przy czym fragmentem jest fragment Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv. 8. Środek zawierający fragment do zastosowania według zastrz. 7. 2 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Zastępca:

77

78

79

80

81

82

83

84

8

86