Zakład Bakteriologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie. 2

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 39-46 Wady i zalety mikrobiologicznych metod diagnostycznych stosowanych w rozpoznaniu zakażenia wywołanego przez Mycoplasma pneumoniae na przykładzie wybranej sytuacji klinicznej Advantages and disadvantages of microbiological methods used in the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections in selected clinical situation Katarzyna Piekarska 1, Waldemar Rastawicki 1, Agata Michalak 3, Magdalena Rzeczkowska 1, Teresa Kamińska 4, Grzegorz Wojtas 3, Iwona Paradowska-Stankiewicz 2 1 Zakład Bakteriologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie. 2 Zakład Epidemiologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie 3 Oddział V - Chorób Płuc i Gruźlicy, Mazowieckie Centrum Leczenia Chorób Płuc i Gruźlicy w Otwocku. 4 Laboratorium Mikrobiologiczne, Mazowieckie Centrum Leczenia Chorób Płuc i Gruźlicy w Otwocku. Mycoplasma pneumoniae jest jednym z najpowszechniejszych bakteryjnych czynników zapalenia płuc u dzieci i dorosłych. Ze względu na brak swoistych objawów klinicznych tylko właściwie przeprowadzona laboratoryjna diagnostyka umożliwia szybką identyfikację czynnika etiologicznego i zastosowanie odpowiedniego leczenia. Ze względu na powolny wzrost M. pneumoniae w laboratoryjnej diagnostyce mykoplazmozy wykorzystuje się zazwyczaj badania molekularne i serologiczne. W prezentowanej pracy omówiono zalety i wady poszczególnych metod mikrobiologicznych stosowanych w diagnostyce zakażeń M. pneumoniae na przykładzie konkretnego przypadku chorobowego. Słowa kluczowe: Mycoplasma pneumoniae, zapalenie płuc, metody diagnostyczne, PCR, ELISA ABSTRACT Mycoplasma pneumoniae is one of the most common causes of community-acquired pneumonia in children and adults. Correct and rapid laboratory diagnosis of M. pneumo-

40 K. Piekarska i inni Nr 1 niae infections is important to introduce appropriate antibiotic treatment. Diagnosis for M. pneumoniae usually relies on serological tests and/or molecular investigations. Both methods have some advantages but also limitations. This paper presents advantages and disadvantages of microbiological methods used in M. pneumoniae infection an example of case of patient with mycoplasmosis. Key words: Mycoplasma pneumoniae, pneumonia, diagnostic methods, PCR, ELISA WSTĘP Mycoplasma pneumoniae należy do grupy wolno żyjących drobnoustrojów, całkowicie pozbawionych ściany komórkowej i niewrażliwych na antybiotyki β-laktamowe. Ten zaliczany do grupy najmniejszych drobnoustrojów patogen jest jednym z najpowszechniejszych bakteryjnych czynników chorobotwórczych układu oddechowego człowieka (1, 17, 18, 23). Zakażenia wywołane przez M. pneumoniae występują na całym świecie. Podkreślić należy, że w ostatnich latach (2010-2012) w kilku krajach Europy odnotowano wyraźny wzrost liczby przypadków zakażeń tym patogenem (3, 4, 6, 9, 15, 22). Zakażenia M. pneumoniae szerzą się drogą kropelkową lub przez bezpośredni kontakt z osobą zakażoną. Mogą one występować przez cały rok, u osób w różnym wieku. Jednak najczęściej zakażenia te występują w okresie jesienno-zimowym i dotyczą dzieci oraz młodzieży w wieku od 3 do 16 lat (17, 18). Typowe zakażenie rozwija się dość wolno, tj. nawet do 3 tygodni, a objawy choroby narastają stopniowo (1). Wśród najczęściej zgłaszanych objawów towarzyszących zakażeniu M. pneumoniae należy wymienić: ból gardła, chrypkę, gorączkę, początkowo nieproduktywny kaszel, ból głowy, dreszcze, katar, ból mięśni, ból ucha oraz ogólne złe samopoczucie (1, 23). Klinicznie, zakażenie M. pneumoniae najczęściej przebiega pod postacią zapalenia gardła, krtani, tchawicy, ostrego zapalenia oskrzeli i oskrzelików. Rzadziej, bo w przypadku 3-10% chorych rozwija się zapalenie płuc, o dość łagodnym przebiegu (23). Jednak w niektórych przypadkach przebieg choroby jest na tyle ciężki, że pacjent wymaga hospitalizacji. Odsetek osób hospitalizowanych waha się w zależności od źródła od 1% do 95,5% (11, 12). Szacuje się, że M. pneumoniae może być odpowiedzialna nawet za 40% wszystkich przypadków pozaszpitalnych zapaleń płuc (CAP community-acquired pneumonia) (1, 12, 23). U 75-84% chorych z mykoplazmowym zapaleniem płuc występują zmiany osłuchowe i opukowe w płucach (10). W obrazie radiologicznym, podobnym do obserwowanego w wirusowym zapaleniu płuc, przeważają zmiany jednostronne, najczęściej w dolnych płatach często z oznakami odczynu opłucnowego (10). W mikrobiologicznej diagnostyce zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae można wykorzystywać różne metody (5, 14). Hodowla drobnoustroju, uznawana za złoty standard w przypadku diagnostyki wielu bakteryjnych chorób, nie jest powszechnie stosowana w diagnostyce mykoplazmozy. Jest to spowodowane zarówno wysokimi wymaganiami drobnoustroju co do składu pożywek, bardzo długim oczekiwaniem na wynik hodowli, jak i niską czułością metody. W rutynowej diagnostyce mykoplazmozy, ze względu na prostotę i szybkość wykonania, a także niewysokie koszty, najczęściej poszukuje się odczynami

Nr 1 Mikrobiologiczne metody w diagnostyce zakażenia M. pneumoniae 41 serologicznymi swoistych przeciwciał dla M. pneumoniae w surowicy osób chorych (5, 14). W ostatnich latach coraz powszechniej stosowane są również techniki molekularne. Te niezwykle czułe i specyficzne metody pozwalają na uzyskanie wyniku już we wczesnej fazie choroby, kiedy w surowicy brak jest jeszcze swoistych przeciwciał, co umożliwia wdrożenie odpowiedniego leczenia (5, 14). W terapii pozaszpitalnego zapalenia płuc o etiologii M. pneumoniae najczęściej stosowane są makrolidy (klarytromycyna i azytromycyna), alternatywnie tetracykliny (doksycyklina) oraz fluorochinolony (moksifloksacyna i ciprofloksacyna). Należy zaznaczyć, iż na świecie pojawiły się doniesienia o oporności na makrolidy M. pneumoniae (7, 13, 16). Aktualnie w Polsce, zgodnie z ustawą o zapobieganiu oraz zwalczaniu zakażeń i chorób zakaźnych u ludzi (z dn. 5 grudnia 2008 r.) oraz Rozporządzeniem Ministra Zdrowia w sprawie biologicznych czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu, wzorów formularzy zgłoszeń dodatnich wyników badań w kierunku biologicznych czynników chorobotwórczych oraz okoliczności dokonywania zgłoszeń (z dn. 25 marca 2014 r.) zachorowania wywołane przez M. pneumoniae nie podlegają obowiązkowi zgłaszania. Celem niniejszej pracy było omówienie wad i zalet mikrobiologicznych metod diagnostycznych stosowanych w rozpoznawaniu zakażenia wywołanego przez Mycoplasma pneumoniae na przykładzie wybranej sytuacji klinicznej. OPIS PRZYPADKU 29 letnia kobieta, niepaląca, z objawami zapalenia płuc została przyjęta na oddział V Chorób Płuc i Gruźlicy Mazowieckiego Centrum Leczenia Chorób Płuc i Gruźlicy w Otwocku. W wywiadzie przeprowadzonym podczas badania lekarskiego ustalono, że dotychczas chora nie była leczona z powodu jakiejkolwiek przewlekłej choroby, nie przyjmowała też długoterminowo żadnych leków. Ponadto ustalono także, iż od około tygodnia u pacjentki pojawił się nagle suchy, męczący kaszel. Kaszlowi towarzyszyła gorączka powyżej 38 C. Nie ustalono kontaktu pacjentki z osobą kaszlącą, jak również istnienia czynników ryzyka predysponujących do nabycia zakażenia układu oddechowego. W związku z trwającym zakażeniem dróg oddechowych chora była leczona ambulatoryjnie amoksycykliną z kwasem klawulanowym, bez uzyskania efektu terapeutycznego. W dniu przyjęcia do szpitala stan chorej był średni, pacjentka była osłabiona, z gorączką. W badaniu przedmiotowym stwierdzono trzeszczenia u podstawy obu płuc, przy czym najwięcej zmian zlokalizowano poniżej kąta łopatki prawej. W badaniu radiologicznym (RTG) klatki piersiowej uwidoczniono rozległe zagęszczenia zapalne w segmentach dolnych płata prawego, bez płynu w jamie opłucnej. W wykonanych badaniach laboratoryjnych stwierdzono podwyższony poziom białka CRP (C - reactive protein), którego wartość wynosiła 71,1 mg/l. W morfologii krwi obwodowej nie stwierdzono odchyleń innych parametrów (hemoglobina 13,4 g/dl; hematokryt 38,8%; MCV 82,4 fl; MCH 28,5 pg; MCHC 34,5 g/dl; erytrocyty 4,71 mln/μl; leukocyty 7,2 tys./μl; limfocyty 18,1%; neutrofile 71,4%, płytki 411 tys./μl). U chorej wykonano bronchoskopię, podczas której stwierdzono zmiany zapalne z odczynem obrzękowym ostróg międzysegmentarnych w oskrzelach płuca prawego. Z wydzieliny oskrzelowej pobranej do badania bakteriologicznego wyhodowano florę fizjologiczną

42 K. Piekarska i inni Nr 1 górnych dróg oddechowych, nie stwierdzono zaś obecności potencjalnych, typowych czynników etiologicznych zakażenia. W badaniu bezpośrednim nie stwierdzono także występowania prątków kwasoopornych. Z uwagi na to, że nie udało się ustalić przyczyny zakażenia oraz jego kliniczny przebieg, zlecono badania w kierunku diagnostyki atypowych czynników powodujących zakażenie dróg oddechowych. W tym celu do Laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH przesłano wcześniej zabezpieczoną wydzielinę oskrzelową i próbkę surowicy. W badanej próbce popłuczyn oskrzelowych wykazano badaniami molekularnymi obecność DNA M. pneumoniae. Na podstawie uzyskanego wyniku, do leczenia włączono klarytromycynę (w dawce 500 mg co 12 godz.). Zastosowano także leczenie objawowe: chora otrzymywała początkowo leki przeciwkaszlowe a następnie rozrzedzające wydzielinę dróg oddechowych. Zastosowane leczenie poprawiło stan kliniczny pacjentki, tj. ustąpiła gorączka, zmniejszyła się intensywność kaszlu oraz nastąpiła radiologicznie potwierdzona, częściowa regresja zmian zapalnych. Nadal utrzymywały się zmiany osłuchowe nad prawym płucem. Po 7 dniach hospitalizacji chorą wypisano ze szpitala z zaleceniem kontroli lekarskiej i kontynuacji leczenia przez 5 dni. Bezpośrednio po wypisaniu pacjentki ze szpitala, z Laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH nadesłane zostały wyniki badań serologicznych. Odczynem ELISA wykryto diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał klasy IgA 32,5, IgG 19,6 i IgM 15,2, potwierdzający zakażenie M. pneumoniae (wynik dodatni >12). Po 4 tygodniach od wypisania ze szpitala pacjentka zgłosiła się na badanie kontrolne, podczas którego nie stwierdzono u niej żadnych dolegliwości oraz zmian osłuchowych nad płucami. W celu wykazania dynamiki przeciwciał, od pacjentki uzyskano drugą próbkę surowicy. Stwierdzono znaczący spadek poziomu przeciwciał w klasie IgA (17,6) oraz nieznaczny w klasie IgG (16,2). Poziom przeciwciał klasy IgM był podobny jak w pierwszej próbce i wynosił 15,3. DYSKUSJA Bakteriologiczne rozpoznanie zakażenia wywołanego przez M. pneumoniae metodą hodowli stosowane jest jedynie przez nieliczne na świecie, specjalistyczne laboratoria. Związane jest to z tym, że M. pneumoniae to bakterie o wysokich wymaganiach wzrostowych i do ich wyhodowania niezbędne jest zastosowanie specjalnych, wzbogaconych pożywek (2, 5, 14). Co więcej, hodowla M. pneumoniae to metoda bardzo żmudna i czasochłonna, a czas inkubacji może wynosić nawet kilka tygodni. Tak więc, z klinicznego punktu widzenia, hodowla jest metodą mało wartościową, gdyż nie ma większego wpływu na proces leczenia (2, 5, 14). Ponadto, czułość tej metody nie przekracza 60% (23). W laboratoryjnej diagnostyce zakażeń wywołanych przez M. pneumoniae powszechnie stosowane są metody serologiczne. Dominująca rola tych metod w rutynowej diagnostyce wynika między innymi z łatwości uzyskania materiału do badań (surowicy), jak również bogatej oferty testów komercyjnych dostępnych na rynku. Najbardziej swoistym antygenem mającym zastosowanie w odczynach serologicznych jest rekombinowane białko P1 M. pneumoniae (19). Czułość komercyjnych testów serologicznych waha się od 71 do 92% (8) i uzależniona jest m. in. od wieku pacjenta bądź czasu uzyskania pierwszej próbki surowicy do badania. Najlepszym potwierdzeniem aktualnego zakażenia jest wykazanie znamiennej dynamiki swoistych przeciwciał dla M. pneumoniae. W tym celu pierwsza próbka surowicy

Nr 1 Mikrobiologiczne metody w diagnostyce zakażenia M. pneumoniae 43 powinna być uzyskana we wczesnej fazie choroby, tzn. w ciągu 7 14 dni od wystąpienia objawów klinicznych, druga zaś po upływie 2-3 tygodni od uzyskania pierwszej próbki (10, 14). Za diagnostycznie znamienny przyjmuje się co najmniej dwukrotny wzrost poziomu przeciwciał w odczynie ELISA. Niestety, jak pokazuje praktyka, najczęściej badana jest tylko jedna próbka surowicy, lub też pierwsza próbka surowicy jest uzyskiwana w późnym okresie choroby, co uniemożliwia zaobserwowanie dynamiki przeciwciał w kolejnych próbkach. Badania serologiczne, przy niewątpliwie wielu swoich zaletach, mogą mieć czasami ograniczoną przydatność w diagnostyce mykoplazmozy. W próbkach surowicy uzyskanych w bardzo wczesnym okresie choroby może nie być jeszcze przeciwciał dla antygenów M. pneumoniae. Związane jest to z czasem pojawiania się przeciwciał w przebiegu zakażenia. Swoiste przeciwciała klasy IgM pojawiają się jako pierwsze, już około 7 dnia i osiągają najwyższy poziom między 10 a 30 dniem choroby, aby następnie powoli opadać. Czasami jednak ich podwyższony poziom może być stwierdzany w krwi nawet do kilku miesięcy po przebytym zakażeniu mykoplazmowym (5). Tak więc, obecność w surowicy swoistych przeciwciał klasy IgM nie zawsze wskazuje na aktualne zakażenie. Częstość występowania przeciwciał klasy IgM jest największa u osób młodych, dlatego też ich poziom powinien być zawsze oznaczany u dzieci i młodzieży podejrzanych o mykoplazmozę (5, 10, 18, 20). Wraz z wiekiem, częstość występowania przeciwciał klasy IgM spada, tak więc niewykrycie swoistych przeciwciał tej klasy immunoglobulin u osób starszych nie wyklucza ostrej infekcji o etiologii M. pneumoniae (5). U osób dorosłych dominującą rolę odgrywają za to swoiste przeciwciała klasy IgG (10). Ich poziom wzrasta powoli w trakcie trwania choroby, osiągając najwyższą wartość po 5 tygodniach od wystąpienia klinicznych objawów choroby (5). Z reguły, przeciwciała klasy IgG utrzymują się na diagnostycznie znamiennym poziomie przez kilka-kilkanaście miesięcy po przebytej mykoplazmozie i z tego powodu nie mogą być wyznacznikiem ostrej fazy choroby (5, 18, 20). Tylko wykazanie serokonwersji tj. diagnostycznie znamiennego przyrostu poziomu przeciwciał klasy IgG może wskazywać na aktualne zakażenie mykoplazmowe. Natomiast, poziom przeciwciał klasy IgA dla antygenów M. pneumoniae gwałtownie rośnie w pierwszych 3 tygodniach, aby następnie szybko obniżać się w ciągu drugiego miesiąca od wystąpienia objawów chorobowych. Z tego powodu uważa się, że podwyższony poziom swoistych przeciwciał w klasie IgA jest dobrym wskaźnikiem aktualnego zakażenia (14, 20). Najlepszym tego przykładem jest opisany w prezentowanej pracy przypadek kliniczny, w przebiegu którego stwierdzono spadek poziomu przeciwciał tej klasy z 32,5 do 17,6 jednostek. Przy zastosowaniu niektórych komercyjnych testów ELI- SA powinno zwracać się uwagę na możliwość wystąpienia fałszywie dodatnich wyników. Dotyczy to szczególnie sytuacji, w których punkt odcięcia dla przeciwciał klasy IgG został wyznaczony na zbyt niskim poziomie. Od ponad 20 lat, do rutynowej diagnostyki M. pneumoniae coraz śmielej wkraczają metody molekularne, cechujące się dużą czułością i szybkością uzyskania wyników, co ma przełożenie na rozpoznanie choroby i podjęcie decyzji o etiotropowym leczeniu (2). Za pomocą tych metod możliwe jest wykrycie charakterystycznych dla M. pneumoniae fragmentów DNA bezpośrednio w próbkach materiału klinicznego pochodzącego z dróg oddechowych. Metody molekularne oparte są głównie na technice PCR (polymerase chain reaction) i jej modyfikacjach (real-time PCR, multipleks PCR, nested PCR, etc.). Obecnie na rynku istnieją komercyjne zestawy umożliwiające poszukiwanie różnych sekwencji docelowych, głównie konserwatywnego regionu genu 16S rrna i/lub genu kodującego

44 K. Piekarska i inni Nr 1 białko P1 (23). Wykorzystanie przynajmniej dwóch takich sekwencji znacznie zwiększa szanse wykrycia M. pneumoniae w próbkach materiału klinicznego. Przy użyciu metod molekularnych możliwe jest potwierdzenie mykoplazmowej etiologii choroby, w przypadku kiedy w surowicy nieobecne są jeszcze swoiste przeciwciała. Pozwala to na szybkie wdrożenie odpowiednich antybiotyków, zastępujących nieskuteczne dla M. pneumoniae antybiotyki β-laktamowe, rutynowo stosowane w leczeniu wielu infekcji dróg oddechowych. Jak pokazała opisana sytuacja kliniczna, poprawna i szybka identyfikacja czynnika etiologicznego odegrała zasadniczą rolę w doborze właściwej antybiotykoterapii. Istotny jest również fakt, że metody genetyczne umożliwiają potwierdzenie zakażenia M. pneumoniae u osób w immunosupresji, u których farmakologicznie hamowany jest proces wytwarzania przeciwciał oraz u osób starszych, u których może wystąpić naturalne, związane z procesem starzenia, obniżenie sprawności układu odpornościowego (23). Pomimo korzyści wynikających ze stosowania metody PCR i jej modyfikacji, na otrzymanie wiarygodnego wyniku wpływa wiele czynników. Po pierwsze, właściwy dobór materiału do badań i jego transport do laboratorium. Z przeglądu piśmiennictwa wynika, że wciąż brak jest zgody co do tego jaki materiał jest najbardziej przydatny do molekularnych badań w kierunku zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae (14, 23). Dotychczas materiał do badań stanowiły próbki plwociny, wymazy lub aspiraty z gardła lub nosogardzieli, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe i płyn z opłucnej. Uważa się, że to łatwo dostępna plwocina, której uzyskanie nie wymaga zastosowania inwazyjnych procedur, może być właściwym materiałem przeznaczonym do badań molekularnych (14, 23). Większość komercyjnych zestawów PCR zostało tak zwalidowanych, aby DNA M. pneumoniae można było izolować z różnych próbek, takich jak: plwocina, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe i wymazy z gardła. Bez względu na rodzaj materiału, należy zadbać o to, by pobrana próbka możliwie jak najszybciej została przekazana do laboratorium, a transport (plwociny, popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych) odbywał się w temperaturze 4ºC. Dopuszczalne jest również umieszczenie badanej próbki w specjalnym podłożu przeznaczonym do transportu i przechowywania materiału klinicznego, którego zadaniem jest m. in. zapewnienie stabilności materiału genetycznego M. pneumoniae. Na wiarygodność wyniku wpływ ma również obecność w badanym materiale klinicznym substancji inhibujących reakcję PCR. Jak wykazały badania przeprowadzone przez Reznikov i wsp. (21) zdecydowanie więcej takich substancji obecnych jest w aspiracie z nosogardzieli niż wymazie z gardła. Aktualnie na rynku dostępne są przeznaczone do stosowania w diagnostyce komercyjne zestawy do izolacji DNA eliminujące substancje inhibujące, co pozwala uniknąć fałszywie ujemnego wyniku. Wysoka czułość (78-92%) i swoistość (92 100%) metod genetycznych powoduje, że mogą one stanowić przydatne narzędzie pomocne w rozpoznaniu zakażenia. Jak pokazał opisany przypadek, najbardziej pożądane w rozpoznaniu zakażeń M. pneumoniae i zarazem pomocne w eliminacji błędów, byłoby zastosowanie zarówno metod molekularnych, jak i serologicznych. PODSUMOWANIE Pomimo, że u większości chorych zapalenie płuc wywołane przez M. pneumoniae przebiega dość łagodnie, to w niektórych przypadkach chory wymaga hospitalizacji.

Nr 1 Mikrobiologiczne metody w diagnostyce zakażenia M. pneumoniae 45 Toczącemu się zakażeniu nie towarzyszą swoiste objawy kliniczne, umożliwiające odróżnienie zakażenia wywołanego przez M. pneumoniae od zakażenia wywołanego przez inny patogen dróg oddechowych człowieka. Dlatego też, w rozpoznawaniu etiologii zakażenia szczególną rolę odgrywają badania mikrobiologiczne. Właściwie przeprowadzona diagnostyka laboratoryjna umożliwia szybką identyfikację czynnika etiologicznego i zastosowanie odpowiedniego leczenia. Jest to niezwykle istotne, biorąc pod uwagę przypisywany zakażeniom M. pneumoniae wpływ na rozwój alergii, astmy czy zaburzenia odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Praca została wykonana w ramach zadania statutowego NIZP-PZH (nr 6/EM/2013). PIŚMIENNICTWO 1. Atkinson TP, Balish MF, Waites KB. Epidemiology, clinical manifestations, pathogenesis and laboratory detection of Mycoplasma pneumoniae infections. FEMS Microbiol. Rev 2008; 32: 956-73. 2. Bernet C, Garret M, De Berbeyrac B i inni. Detection of Mycoplasma pneumoniae by using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1989; 27: 2492-6. 3. Blystad H, Ånestad G, Vestrheim DF i inni. Increased incidence of Mycoplasma pneumoniae infection in Norway 2011. Euro Surveill. 2012; 17(5):pii=20074. Available online: http://www. eurosuveillance.org/view Article.aspx?Articleted=20074. 4. Chalker VJ, Stocki T, Litt D i inni. Increased detection of Mycoplasma pneumoniae infection in children in England and Wales, October 2011 to January 2012. Euro Surveill. 2012; 17(6):pii=20081. Available online: http://www.eurosuveillance.org/view Article.aspx?Articleted=20081. 5. Daxboeck F, Krause R, Wenisch C. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. Clin Microbiol Infect 2003; 9: 263-3. 6. Eibach D, Casalegno S, Escurent V i inni. Increased detection of Mycoplasma pneumoniae infection in children, Lyon, France, 2010 to 2011. Euro Surveill. 2012; 17(8):pii=20094. Available online: http://www.eurosuveillance.org/view Article.aspx?Articleted=20094 7. Eshaghi A, Memari N, Tang P i inni. Macrolide resistant Mycoplasma pneumoniae in humans, Ontario, Kanada, 2010-2011. Emmerg Infect Dis 2013; 19: 1525-7. 8. Ferwerda A, Moll HA, de Groot R. Respiratory tract infections by Mycoplasma pneumoniae in children: a review of diagnostic and therapeutic measures. Eur J Pediatr 2001; 160: 483-91. 9. Kałużewski S, Rastawicki W. Występowanie zakażeń Mycoplasma pneumoniae w Polsce w latach 2008 2013 na podstawie wyników badań serologicznych. Med Dośw Mikrobiol 2014; 66: 105-14. 10. Kałużewski S. Zakażenia wywołane przez Mycoplasma pneumoniae w: Choroby zakaźne i pasożytnicze-epidemiologia i profilaktyka. wyd. VII, Alfa-medica Press, Bielsko-Biała 2014, 539-44. 11. Kałużewski S, Rastawicki W. Serologiczna diagnostyka objawowa zakażeń wywoływanych w latach 1970-2010 przez Mycoplasma pneumoniae. Med Dośw Mikrobiol 2014; 66: 105-14. 12. Lenglet A, Herrador Z, Magiorakos AP i inni. Working Group on Mycoplasma pneumoniae surveillance. Surveillance status and recent data for Mycoplasma pneumoniae infections in the European Union and European Economic Area, January 2012. Euro Surveill. 2012; 17(5):pii=20075. Available online: http://www.eurosuveillance.org/view Article.aspx?Articleted=20075. 13. Liu Y, Ye X, Hang H i inni. Antimicrobial susceptibility of Mycoplasma pneumoniae isolates and molecular analysis of macrolide-resistant strains from Shanghai, China. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53: 2160-2.

46 K. Piekarska i inni Nr 1 14. Loens K, Goossens H, Ieven M. Acute respiratory infection due to Mycoplasma pneumoniae:current status of diagnostic methods. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2010; 29: 1055-69. 15. Polkowska A, Harjunpää A, Toikkanen M i inni. Increased incidence of Mycoplasma pneumoniae infection in Finland, 2010-2011. Euro Surveill. 2012; 17(5):pii=20072. Available online: http:// www.eurosuveillance.org/view Article.aspx?Articleted=20072. 16. Pereyre S, Charon A, Renaudin H i inni. First report of macrolide-resistant strains and description of a novel nucleotyde sequence variation In the P1 adhesin gene In Mycoplasma pneumoniae clinical strains isolated in France over 12 years. J Clin Microbiol 2007; 45: 3534-9. 17. Rastawicki W, Jagielski M. Mycoplasma pneumoniae. I. Charakterystyka drobnoustroju, mechanizmy patogenności oraz immunologiczna odpowiedź człowieka na zakażenie wywołane przez M. pneumoniae. Post Mikrobiol 1998; 37: 261-71. 18. Rastawicki W, Jagielski M. Mycoplasma pneumoniae. II. Klinika, epidemiologia i diagnostyka zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae. Post Mikrobiol 1998; 37: 273-88. 19. Rastawicki W, Rokosz N, Jagielski M. Ocena przydatności wybranych antygenów Mycoplasma pneumoniae w serodiagnostyce mykoplazmozy. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61: 175-2. 20. Rastawicki W. Ocena odczynami tradycyjnymi i nowej generacji odpowiedzi humoralnej na antygeny Mycoplasma pneumoniae w przebiegu naturalnego zakażenia u ludzi.ii. Występowanie i poziom mykoplazmowych przeciwciał u osób z zakażeniami układu oddechowego. Med Dośw Mikrobiol 1995; 47: 55-76. 21. Reznicov M, Blackmore TK, Finlay-Jones JJ, Gordon DL. Comparision of nasopharyngeal aspirates and throat swab speciments in a polymerase chain reaction-based test for Mycoplasma pneumoniae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1995; 14: 58-61. 22. Uldum SA, Bangsborg JM, Gahrn-Hansen B i inni. Epidemic of Mycoplasma pneumoniae infection in Denmark, 2010-2011. Euro Surveill. 2012; 17(5):pii=20073. Available online: http://www. eurosuveillance.org/view Article.aspx?Articleted=20073. 23. Waites KB, Talkington DF. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen. Clin Microbiol Rev 2004; 17: 697-728. Otrzymano: 9 III 2015 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego-Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie