Wpływ poliestrowych protez naczyniowych na syntezę TNF-α, IFN-γ oraz NO przez ludzkie leukocyty krwi obwodowej - in vitro Bogusława śywicka*, Anna Czarny**, Ewa Zaczyńska**, Stanisław Pielka*, Leszek Solski* *Zakład Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów Akademia Medyczna we Wrocławiu ** Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu Streszczenie Poliestrowe protezy naczyniowe znalazły szerokie zastosowanie w chirurgii naczyniowej. W celu podniesienia ich biofunkcjonalności, wprowadzane są specjalne technologie m.in. podwójne dzianie lub własności hydrofilne powierzchni. Modyfikacje te mogą lokalnie aktywować leukocyty do wytwarzania mediatorów procesu zapalnego, który prowadzić moŝe do hiperplazji neointimy lub innych komplikacji. Badano dwa rodzaje poliestrowych protez naczyniowych: podwójnie welurowaną, dzianą, hydrofilową protezę Dallon H i kontrolną standardową, podwójnie welurowaną, dzianą protezę Dallon. Celem badań było ocena porównawacza poziomu cytokin TNF-α, interferon (IFN) i tlenku azotu (NO) w nadsączach hodowli ludzkich leukocytów, po stymulacji in vitro badanymi protezami naczyniowymi. Testowane materiały Dallon H i Dallon nie wpływały na syntezę TNF-α, IFN-γ, NO przez leukocyty ludzkie. Otrzymane wyniki pozwalają na wstępną i precyzyjniejszą selekcję biomateriałów przed badaniami in vivo. Słowa kluczowe: protezy naczyniowe, Dallon H, TNF-α, IFN-γ, NO, leukocyty ludzkiej krwi obwodowej 1
Effect of polyester vascular prostheses on synthesis TNF-α, IFN-g and NO by human peripheral blood leukocytes - in vitro Summary Vascular prostheses produced on the basis of polyester are today commonly used in vascular surgery. To improve their biofuncionality special technologies are used, among them double knit and hydrophile feature enrichment. These modifications could cause the local activation of leukocytes to produce the mediators of inflammatory reaction, which in turn leads to hyperplasia of endothelium and other dangerous complications. In our study we used two kinds of polyester prostheses : double velour knitted hydrophilic Dallon H and standard double velour knitted prosthesis Dallon as control. The aim of this work was to compare in vitro the levels of cytokines TNF-α, interferon (IFN) and nitric oxide (NO) found in the supernatants of human blood leukocyte cultures after stimulation by both these above-mentioned vascular prostheses materials which are designed for use in direct blood contact. Tested implant materials Dallon H had no influence on synthesis of production of IFN, TNF-α and NO by human blood leukocytes.these results allow to made the initial selection of biomaterials before their in vivo evaluation. Key words: vascular prostheses, Dallon H, TNF-α, IFN-γ, NO, human peripheral blood leukocytes WPROWADZENIE Szczególne miejsce wśród wszczepów stosowanych w chirurgii naczyniowej, zajmują poliestrowe dziane protezy naczyniowe. Wywołują one minimalny odczyn tkankowy i spełniają podstawowe warunki, którym powinny odpowiadać wszczepy, wymagają jednak śródoperacyjnego uszczelnienia krwią pacjenta (preclottingu) [1-4]. W celu 2
maksymalnego skrócenia czasu oraz ilości krwi niezbędnej do preclottingu, wprowadzone zostały modyfikacje własności fizykochemicznych protez. Poprawę cech wszczepów upatruje się między innymi w modyfikacji powierzchni, poprzez podniesienie stopnia hydrofilności. Protezy naczyniowe Dallon H o powierzchni hydrofilowej, charakteryzuje 5-krotnie mniejsze zapotrzebowanie na krew dla uzyskania szczelności sródoperacyjnej, w porównaniu do standardowych dzianych protez o niemodyfikowanej powierzchni [5]. Zastosowane modyfikacje mogą wywoływać szereg niekorzystnych zmian, związanych z indukcją między innymi immunologicznych mediatorów zapalenia. Materiały implantacyjne o wysokim stopniu biozgodności i produkty ich biodegradacji, nie powinny indukować reakcji zapalnych. Pobudzenie układu immunologicznego moŝe bowiem nasilać procesy zapalne prowadzące do aseptycznego obluzowania implantu, reakcji alergicznych lub hiperplazji w miejscu wszczepienia. PoniewaŜ sama implantacja u człowieka wywołuje wzrost poziomu wielu cytokin prozaplanych w pierwszych godzinach po implantacji, waŝne jest by zastosowana modyfikacja wnosząc korzyści pozostawała obojętna immunologicznie lub wzmagała procesy ułatwiające wgajanie i funkcjonowanie wszczepu w okresie odległym. Badania wykazały, Ŝe niektóre biomateriały lub ich składowe komponenty mogą wywierać działanie immunomodulacyjne [6-7]. Jednym z waŝniejszych mediatorów reakcji zapalnej, jest czynnik martwicy nowotworów (TNF-α) oraz interferon (IFN-γ) uczestniczące m.in. w aktywacji makrofagów i fagocytozie. Aktywność cytokin związana jest ze wzrostem poziomu NO, który w wysokim stęŝeniu wywiera działania cytotoksyczne na komórki [8-11]. W ocenie biozgodnośći materiałów implantacyjnych, ciągle istnieje zapotrzebowanie na skuteczne i czułe metody oceny potencjalnego działania zapalnego, które pozwalałyby ograniczyć ilość eksperymentów na zwierzętach i jednocześnie słuŝyć do skutecznej selekcji biomateriałów [13]. CEL BADAŃ Celem pracy było oznaczenie TNF-α, IFN-γ oraz NO w nadsączach leukocytów ludzkiej krwi obwodowej, po stymulacji in vitro protezami naczyniowymi: hydrofilową Dallon H i standardową Dallon. 3
MATERIAŁ I METODY Badanym biomateriałem była poliestrowa, dziana, podwójnie welurowana proteza naczyniowa Dallon H o modyfikowanej hydrofilowej powierzchni, którą porównywano ze standardową, dzianą, obustronnie welurowaną protezą naczyniową Dallon. Obie protezy przygotowane zostały przez firmę TRICOMED w Łodzi. Do badań uŝyto próbek o wadze 10 mg. Ciągłe linie komórkowe Do badań uŝyto linii komórkowych: L 929 i A 549. L 929 - linia komórek fibroblastopodobnych otrzymanych z podskórnej tkanki tłuszczowej myszy C3H, (ATCC CCL 1). Hodowlę komórek L 929 prowadzono w płynie hodowlanym Eagle'a (MEM) z dodatkiem 10% inaktywowanej (30min., 56 0 C) surowicy cielęcej (CS), 100 j/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny i 2 mm L-glutaminy. Komórki przeszczepiano co 48 godz. A 549 linia komórek nabłonkopodobnych raka płuc, ( ATCC CCL-185). Hodowle pasaŝowano w płynie hodowlanym Dulbecco ( DMEM), wzbogaconym L-glutaminą (2mM) i 10% surowicą inaktywowaną w temp. 56 0 C przez 30 min. oraz 100µg/ml streptomycyny. Wirus Wirus EMCV (encephalomyocarditis virus) naleŝy do RNA wirusów z rodziny Picornaviridae, rodzaju Cardiovirus (szczep Columbia MM-ColMM). Wirus ten otrzymano z Instytutu Karolinska w Sztokholmie. Izolacja ludzkich leukocytów krwi obwodowej oraz indukcja cytokin Leukocyty izolowano z pełnej ludzkiej krwi obwodowej, pobranej na heparynę (1ml heparyny/9ml pełnej krwi Ŝylnej). 5ml krwi nawarstwiano na 3ml Gradisolu G (o gęstości 1,115g/cm 3 ).Następnie całość wirowano (2000rpm/30min) w celu oddzielenia plazmy i erytrocytów. Zbierano leukocyty osadzone na granicy faz i płukano trzykrotnie w płynie hodowlanym RPMI z dodatkiem 2% surowicy cielęcej. Na 24 dołkową płytkę firmy Costar nanoszono po 1 ml zawiesiny leukocytów o gęstości 2x10 6 kom/ml oraz jałowe próbki badanych biomateriałów o wadze 10 mg, następnie całość inkubowano w temp. 37 0 C w wilgotnej atmosferze z 5% CO 2. Supernatant znad komórek i biomateriałów zbierano po 24 i 72 godzinach inkubacji w celu oznaczenia poziomu cytokin i NO 4
Oznaczanie aktywności interferonu (IFN ) Poziom interferonu oznaczano testem zahamowania replikacji wirusa EMCV w komórkach linii A 549. Miareczkowanie interferonu wykonywano na 96 dołkowych płaskodennych płytkach plastikowych. Na płytce zakładano hodowlę A 549 o gęstości 2x10 5 /ml i inkubowano 24h ( 37 0 C, 5% CO 2 ). Na pomocniczej płytce przygotowano odpowiednie rozcieńczenia badanego materiału w 2% sc DMEM z dodatkami. Następnie płyn znad hodowli A 549 usuwano i nanoszono przygotowane rozcieńczenia badanego materiału. Po 24h inkubacji (37 0 C, 5% CO 2 ), hodowlę zakaŝano EMCV o koncentracji 100 TCID 50 /ml. Zawiesinę wirusa przygotowano w płynie hodowlanym DMEM z 2% surowicy cielęcej. Na płytce pozostawiono kontrolę wirusa i kontrolę hodowli A 549. Po 24h inkubacji odczytywano efekt cytopatyczny w mikroskopie odwróconym. W przypadku obecności interferonu w badanych materiałach, obserwowano ochronę komórek przed cytopatycznym działaniem wirusa. Rozcieńczenie interferonu, przy którym obserwowano ochronę przed efektem cytopatycznym w 50% komórek, przyjmowano za 1jednostkę IFN w badanej próbce. Oznaczanie aktywności czynnika martwicy nowotworów (TNF) Miano TNF-α oznaczano metoda biologiczną na plastikowych płytkach 96 dołkowych. Na płytce zakładano hodowlę komórek L 929 o gęstości 2x 10 6 /ml i inkubowano przez 24h ( 37 0 C, 5% CO 2 ). Na osobnej płytce przygotowano odpowiednie rozcieńczenia badanego materiału w MEM z 10% surowicą cielęca i aktynomycyną D (o stęŝeniu końcowym 2,5µg/ml). Następnie płyn znad hodowli L 929 usuwano i nanoszono przygotowane rozcieńczenia. Po 24h inkubacji (37 0 C, 5% CO 2 ), obserwowano degenerację komórek wywołaną przez TNFα. Jednocześnie pozostawiono kontrolę hodowli komórek L 929 (bez aktynomycyny) z aktynomycyną. Rozcieńczenie, w którym efekt cytotoksyczny wystąpił w 50% komórek, odpowiada 1 jednostce TNF-α. Oznaczanie poziomu tlenku azotu (NO) SteŜenie NO 2 w nadsączach znad hodowli leukocytów, mierzono wykorzystując metodę kolorymetryczną wg Dinga i współp. [14]. Na plastikową płytkę 96 dołkową (Nunc) nanoszono badane supernatanty w ilości 100 µl/dołek, następnie dodawano po 100µl odczynnika Griessa (0,1% dichlorowodorek naftylenodiaminy w H 2 0 i 1% sulfanilamidu w 5
5% H 3 PO 4 w stosunku 1:1). Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 12min. Po tym czasie oznaczano absorbancje na czytniku Stat Fax 2100 (Awarenes, Technology inc.) przy długości 540 nm. StęŜenie N0 2 obliczano korzystając z krzywej standardowej NaNO 2 sporzadzonej w steŝeniach do 1 do 100 µμ/ml. WYNIKI Badania poziomu IFN, TNF i tlenku azotu w nadsączach hodowli ludzkich leukocytów po stymulacji in vitro protezą Dallon H i Dallon przez okres 24 i 72h, nie wykazały indukcji ocenianych mediatorów. Ilości IFN, TNF i tlenku azotu stwierdzane po kontakcie z protezą Dallon H, były niŝsze niŝ po stymulacji niemodyfikowaną protezą Dallon, róŝnice te nie były statystycznie znamienne (ryc.1-3) OMÓWIENIE W celu poprawy szczelności śródoperacyjnej podwójnie welurowanej, poliestrowej protezy naczyniowej, wprowadzono modyfikacje powierzchni nadając jej własności hydrofilowe. Dzięki zwiększonej zwilŝalności protezy Dallon H, uzyskano natychmiastowa pełną szczelność śródoperacyjną oraz korzystną w początkowym okresie po wszczepieniu aktywację kładu krzepnięcia i fibrynolizy [4]. W badaniach in vitro stwierdzono, Ŝe zmodyfikowana hydrofilowa dzianina protezy wpływała na zmniejszenie liczby leukocytów [13]. Na postawie doświadczalnego modelu wszczepienia w układ tętniczy łaty poliestrowej, wykazano znaczący udział komórek zapalanych w tworzeniu neointimy oraz jej hiperplazji [15]. W procesach wgajania się wszczepów uczestniczy wiele czynników. Badania licznych autorów wskazują, Ŝe biomateriały mogą pobudzać komórki do syntezy niektórych mediatorów odpowiedzi immunologicznej, takich jak TNF-α, IL-1, Il-6, Il-8, czynniki wzrostu - plateled-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor beta1(tgfbeta) oraz NO [16,17]. Zdolność ta zaleŝy od własności fizykochemicznych uŝytego materiału, w tym rozpuszczalności, masy cząsteczkowej i rodzaju powierzchni, co moŝe prowadzić do indukcji róŝnych cytokin [12,16-18]. Wysoki poziom cytokin prozaplnych TNF-α, Il-6 czy NO niekorzystnie wpływa na organizm biorcy, dlatego waŝne jest 6
wprowadzanie takich materiałów i ich modyfikacji, które nie stymulują komórek do produkcji duŝych ilości tych czynników. Wykazano zaleŝność proliferacji komórek endotelialnych i fibrolastycznych od obecności cytokin i czynników wzrostu, wytwarzanych przez te komórki pod wpływem biomateriałów [16,17]. W przeprowadzonych badaniach własnych na ludzkich leukocytach krwi obwodowej in vitro, stymulowanych 24 i 72 godziny poliestrowymi protezami o hydrofilowej i standardowej, niemodyfikowanej powierzchni, nie stwierdzono istotnych róŝnic poziomów TNF-α, IFN-γ i NO. Ilości badanych mediatorów w nadsączach znad leukocytów hodowanych w obecności dzianiny protezy Dallon H były nieznacznie obniŝone, w porównaniu do poziomu tych czynników produkowanych przez kontrolne leukocyty nie stymulowane biomateriałami, jak i po kontakcie z niemodyfikowaną protezą Dallon. RóŜnice te nie były znamienne statystycznie. Uzyskane wyniki wskazują, Ŝe zmodyfikowana hydrofilowa proteza naczyniowa, nie indukuje wytwarzania cytokin prozapalnych przez ludzkie leukocyty. WNIOSKI 1. Protezy naczyniowe Dallon H i Dallon nie wpływają na zwiększoną produkcję TNF-α, IFN-γ oraz tlenku azotu przez ludzkie leukocyty krwi obwodowej 2. Wyniki badań indukcji TNF-α, IFN-γ i NO wykazały, Ŝe proteza Dallon H ma wysoką biozgodność, porównywalną z niemodyfikowaną protezą Dallon 3. Ocena indukcji in vitro TNF, IFN oraz NO, moŝe udzielić odpowiedzi o potencjalnej reakcji zapalnej i posłuŝyć do bardzo precyzyjnego określenia biozgodności tych biomateriałów 7
LITERATURA [1] Milewski A., Staniszewska-Kuś J., Rutowski R., Solski L., Pielka S.: Odczyn tkanek po implantacji hydrofilowej protezy naczyniowej DALLON H w ubytek aorty piersiowej. Badania doświadczalne. Olim. Ed.(2002),32, 1-2, 23-40. [2] Szyber P.: Własne obserwacje i doświadczenia w stosowaniu protez Dallon H w zabiegach naczyniowych. Polim.Med.(.2003), XXXIII, 1-2, 35-40. [3]Chinn J.A., Sauter J.A., Phillips R.E. Jr., Kao W. J., Anderson J. M., Hanson S. R., Ashton-TR.: Blood and tissue compatibility of modified polyester: thrombosis, inflammation, and healing. J. Biomed. Mater. Res.(1998), 39, 1, 130-40 [4] Paluch D., Szymonowicz M., Pielka S., Rutowski R. : Badania śródoperacyjne i badania zmian wybranych parametrów krzepnięcia i fibrynolizy, po implantacji protez poliestrowych Dallon H o zwiększonej zwilŝalności powierzchni. Polim. Med. (2002), 32, 1-2, 65-80. [5] Struszczyk M.H., Bednarek P., Raczyński K.: Poliestrowe protezy naczyniowe. Polim. Med. (2002), XXXII, 1-2, 13-23. [6] Zaczyńska E., Pielka S., Staniszewska Kuś J., Czarny A., śywicka B., Paluch D., Dawidowicz A.: Badania porównawcze indukcji TNF-alfa in vitro i miejscowej reakcji tkanek po implantacji HAP i HAP/TCP. Polim. Med. (2003), XXXIII, 1-2, 15-24. [7] Czarny A., Pielka S., śywicka B., Zaczyńska E., Solski L., Szymonowicz M., Paluch D., Staniszewska-Kuś J., BłaŜewicz J.: TNF, IFN and NO after in vitro stimulation of human blood leukocytes by carbon implants. Immunobiology. (2003), 208, 1-3. 129. M.6, 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology. Berlin (Germany), September 24-27. 2003. [8] Dinarello C.A.: Role of interleukin 1 and TNF in systemic responoses to infection and inflammation. Inflam.Basic Principles and Clinic. Correlat. Raven.Press. Ltd. New York (1992), 211-237 [9] Bauer H., Jung T., Strichtentoth D.O., Neuman C.: Nitric Oxide inhibits the secretion of T-Helper-1 and T-helper 2-associated cytokines in activated human T cells. Immun.(1997), 90, 205-211. 8
[10] Fiers W., Beyaert., Boone E., Cornelis S., Declercq W., Decoster E., Denecker G., Depuydyt Penning L., Plaisance S., Vancomperonolle K., van Criekinge W., Vandenabeele P., Vanden Berghe W., van de Craen M., Vandevoore V., Vercamen D.: TNF- induce intracellular signaling leading to gene induction or cytotoxcity by necrosis or by apoptosis J. Inflamm. 1996), 47, 67-75. [11] Winrow V., Winyard P.G., Morris C. Blake D.R.: Free radicals in inflammation: second messengers and mediators of tissue destruction. Br. Med. (1993), 49, 506-522 [12] Robak T.: Biologia i farmakologia cytokin. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa-Łódź. (1995), 58-72, 122-133. [13] Paluch D., Szymonowicz M., Pielka S., Rutowski R. : Badania in vivo wpływu materiałów poliestrowych o róŝnym stopniu zwilŝalności powierzchni na parametry hematologiczne krwi oraz na parametry układu krzepnięcia. Polim. Med. (2002), 32, 1-2, 41-65. [14] Ding A. H., Nathan C.F., Stuehr D. J.: Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages. Comparison of activating cytokines and evidence for independent. J. Immunol. (1988), 14, 2407-2412. [15 Janczak D., Skóra J., Chudoba P., Stępiński P., Ptak W., Szyber P.: Monitorowanie odpowiedzi humoralnej i komórkowej organizmu po wszczepieniu łaty z protezy naczyniowej w układ tętniczy w badaniach doświadczalnych. Chir. Pol. (1999), 1, 3/4, 217-222. [16] Mori T., Okumara M.,.Matsura M., Ueno K., Tokura S., Okamato Y., Minami S., Fujinaga T.: Effects of chitin and its derivatives on the proliferation and cytokine production of fibroblasts in vito. Biomaterials (1997), 18, 947-951. [17] Mori T., Nishimura S. I., Tokura S., Matsura M., Okumara M., Kadosawa T., Fujinaga T.: Endothelial cell responses to chitin and its derivatives. J. Biomed. Mater Res. (1998), 43, 469-472. [18] Suska F., Esposito M., Gretzer M., Ktorp M., Tengvall., Thomsen.: IL-1α, IL-1β secretion during in vivo cellular interactions with titanum and copper. Biomaterials. (2003), Vol. 24, 3, 461-468. 9
Praca została wykonana w ramach badań własnych Akademii Medycznej we Wrocławiu nr Grantu 552 Adres autorów Zakład Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów Akademii Medycznej ul. Poniatowskiego 2, 50-326 Wrocław e-mail: implant@cheksp.am.wroc.pl 10
Ryc.1 Poziom IFN w nadsączach hodowli ludzkich leukocytów po stymulacji in vitro protezą Dalon H i Dallon Fig.1. The IFN level in the supernatant of the human blood cells culture after stimulation by the prosthesis Dallon H I Dallon, in vitro 1A) po 24h/after 24h 14 Poziom IFN [j/ml]/ Level of IFN [U/ml] 12 10 8 6 4 2 0 kontrola Dallon H Dallon 11
1B) po 72h/after 72h 14 Poziom IFN [j/ml]/ Level of IFN [U/ml] 12 10 8 6 4 2 0 kontrola Dallon H Dallon 12
Ryc.2. Poziom TNF w nadsączach hodowli ludzkich leukocytów po stymulacji in vitro protezą Dalon H i Dallon Fig.2. The TNF level in the supernatant of the human blood cells culture after stimulation by the prosthesis Dallon H I Dallon, in vitro 2A) po 24h/after 24h 60 50 Poziom TNF[j/ml]/Level TNF [u/ml] 40 30 20 10 0 kontrola Dallon H Dallon 2B) po 72h/after 72h 60 Poziom TNF[j/ml]/Level of TNF[u/m 50 40 30 20 10 0 kontrola Dallon H Dallon 13
Ryc.3 Poziom NO w nadsączach hodowli ludzkich leukocytów po stymulacji in vitro protezą Dalon H i Dallon Fig.3. The NO level in the supernatant of the human blood cells culture after stimulation by the prosthesis Dallon H I Dallon, in vitro 3A) po 24h/after 24h 2,5 Poziom NO2/NO3 [um]/ level of NO2/NO3 [um] 2 1,5 1 0,5 0 kontrol Dallon Dallo 14
3B) po 72/after 72h 2,5 Poziom TNF[j/ml]/Level of TNF[u/ml] 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol Dallon Dallon 15