Rozdzielanie lipidów prenylowych 1 ĆWICZENIE 12 OZNACZANIE SPEKTROFOTOMETRYCZNE ZWIĄZKÓW BARWNYCH W MATERIALE ROŚLINNYM 1. LIPIDY PRENYLOWE Nazwa lipidy prenylowe pochodzi od izoprenu (2-metylobuta-1,3-dienu), który jest podstawową jednostką budulcową tej grupy związków. Szkielety węglowe lipidów prenylowych (zwanych także izoprenoidowymi lub terpenoidowymi) powstają przez dołączanie pięciowęglowych reszt izoprenylowych (rysunek 13.1). i z o p r e n O P ~ P d i f o s f o r a n i z o p e n t e n y l u Rys. 13.1. Struktura chemiczna izoprenu i difosforanu izopentenylu Pirofosforan izopentenylu jest podstawową jednostką izoprenową, z której zbudowane są wszystkie lipidy prenylowe. Przechodzi on z łatwością w swój izomer pirofosforan dimetyloallilu. Oba izomery kondensują ze sobą tworząc monoterpen. Dalsze reakcje kondensacji prowadzą do seskwi-, di-, tri- oraz tetraterpenów itd.: Zależnie od stopnia polimeryzacji n wyróżniamy: Hemiterpeny pochodzą od pojedynczej jednostki izoprenylowej Monoterpeny dwie jednostki izoprenylowe; C10H16; n = 2 Seskwiterpeny trzy jednostki izoprenylowe;c15h24; n =3 Diterpeny - cztery jednostki izoprenylowe; C20H32; n= 4 Triterpeny sześć jednostek izoprenylowych; C30H48 Tetraterpeny osiem jednostek izoprenylowych; C40H64 Politerpeny więcej niż osiem jednostek izoprenylowych; n > 8 Terpenoidy to pochodne terpenów czyli węglowodorów, które zawierają w cząsteczce dodatkowe podstawniki niewęglowodorowe np. grupy hydroksylowe, karbonylowe, karboksylowe i inne. Izoprenoidy to pojęcie szersze niż terpeny i terpenoidy. Są to oligomery izoprenu ale ich cząsteczki niekoniecznie spełniają regułę (C5H8)n. Do grupy izoprenoidów zaliczamy: terpenoidy, steroidy, karotenoidy, kauczuk. Izoprenoidy są związkami nierozpuszczalnymi w wodzie, rozpuszczalnymi w tłuszczach i rozpuszczalnikach organicznych.
Rozdzielanie lipidów prenylowych 2 Terpenoidy są związkami bardzo rozpowszechnionymi w przyrodzie zwłaszcza w świecie roślinnym. Znanych jest ponad 1700 roślin wytwarzających lotne, przeważnie przyjemnie pachnące mieszaniny zwane olejkami eterycznymi. Głównymi składnikami olejków eterycznych oraz żywic drzew iglastych są terpeny i terpenoidy. W olejkach eterycznych poza tym występuje szereg innych pachnących związków organicznych (estry, alkohole, aldehydy, ketony, fenole, etery). Terpenoidy są też wytwarzane przez organizmy morskie. Natomiast zwierzęta wytwarzają terpenoidy sporadycznie i w małych ilościach są to głównie feromony i repelenty. 1.1. Monoterpeny i seskwiterpeny (C10 i C15) Do tej grupy związków zalicza się głównie olejki eteryczne. Spotykane są w kwiatach, liściach, owocach, nasionach, a także korze lub nawet drewnie niektórych roślin. Są lotne i mają swoisty zapach. Należą do nich między innymi: mentol występujący w liściach mięty, karwon (w nasionach kminku), cytronelol i geraniol (w kwiatach róży i bodziszka), pinen (w drewnie oraz w szpilkach drzew iglastych). Przykładem monoterpenoidu jest także limonen występujący w olejku pomarańczowym, cytrynowym, kminkowym, selerowym [enancjomer (+)], olejku świerkowym, jodłowym [enancjomer (-)] oraz olejku kamforowym i bergamotowym (racemat). α-tujen występuje w olejku cyprysowym i eukaliptusowym. Natomiast jego pochodna z grupą karbonylową α-tujon występuje w olejku tujowym i w wyciągu z piołunu. α-tujon jest neurotoksyną, w małych dawkach powoduje pobudzenie kory mózgowej i niepokój ruchowy, w większych dawkach powoduje drżenie mięśni, drgawki i drażliwość psychiczną. Popularny w południowej Europie absynt (nalewka na piołunie) oraz wina typu wermut zawierające wyciągi z piołunu powodują oprócz zwykłego upojenia alkoholowego dodatkowe pobudzenie wywołane działaniem tujonu. 1.2. Diterpeny (C20) Razem z olejkami eterycznymi występują często diterpeny (C20) o konsystencji
Rozdzielanie lipidów prenylowych 3 półstałej, obdarzone podobnie silnym zapachem jak olejki. Nazywa się je żywicami lub balsamami. Do ważniejszych zalicza się kalafonię uzyskiwaną przy destylacji drewna sosnowego. Do diterpenów należy także fitol 20-węglowy alkohol estrowo połączony z cyklicznym układem porfirynowym chlorofili. Hydrofobowy ogon fitylowy pozwala na zakotwiczenie się cząsteczki chlorofilu w błonie tylakoidu chloroplastów. W roślinach naczyniowych występują dwie odmiany chlorofilu - chlorofil a i chlorofil b. Chlorofile należą one do grupy metaloporfiryn, w których cztery pierścienie pirolowe połączone są mostkami metinowymi. Położony centralnie kation magnezowy łączy się z atomami azotu pierścieni pirolowych. W chloroplastach roślin wyższych oraz niektórych glonów występuje chlorofil a i chlorofil b, w komórkach wielu glonów występują odmiany różniące się szczegółami budowy (różnice w podstawnikach przy węglach 3,7,8, obecność lub brak estru z fitolem, obecność lub brak wiązania podwójnego między węglami 17 i 18), w bakteriach występują bakteriochlorofile. W tkankach roślinnych chlorofile są związane z białkami i fosfolipidami. Po wyekstrahowaniu z materiału roślinnego barwniki te stosunkowo łatwo rozkładają się. Degradację powodują i przyspieszają: podwyższona temperatura, światło tlen z powietrza enzymy, rozpuszczalniki organiczne kwasowe i zasadowe ph roztworów wodnych
Rozdzielanie lipidów prenylowych 4 W środowisku kwasowym kation magnezu jest zastępowany przez dwa protony powstaje oliwkowozielona feofityna, w przypadku bardzo niskiego ph (roztwór silnie kwaśny) następuje też hydroliza wiązań estrowych. Odszczepienie fitolu daje brunatną feoforbidynę. W środowisku zasadowym następuje hydroliza grup estrowych z zachowaniem jonu magnezu. Kation magnezowy łatwo ulega wymianie na dwuwartościowe kationy innych metali: Fe 2+, Cu 2+, Zn 2+. Chlorofile i ich pochodne bardzo silnie absorbują promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie światła widzialnego. Widma elektronowe tych związków, podobnie jak widma wolnych porfiryn, składają się z dwóch wyraźnie wykształconych pasm. Pierwsze pasmo nazwane pasmem Soreta (od nazwiska francuskiego fizyka Charlesa Soreta) występuje w zakresie 400 500 nm i odznacza się bardzo dużym molowym współczynnikiem absorpcji (ε 10 5 10 6 ), drugie pasmo o mniejszej intensywności występuje w zakresie 500 700 nm.
Rozdzielanie lipidów prenylowych 5 1.3. Triterpeny (C30) Skwalen jest związkiem zbliżonym budową do triterpenów zawierających sześć jednostek izoprenylowych (C 30 ). Chociaż formalnie struktura odpowiada triterpenom, zaliczymy go do terpenoidów (rys. 6.15). Jest związkiem rozpowszechnionym w przyrodzie zwłaszcza w świecie zwierzęcym, ponieważ jest półproduktem w biosyntezie steroli. Występuje w tłuszczu zwierząt morskich, ale także w tłuszczu ludzkim. Skwalen Istotną klasę lipidów zaliczanych do izoprenoidów stanowią steroidy będące pochodnymi steranu czteropierścieniowego układu cyklopentanoperhydrofenantrenu. Najbardziej znanym związkiem tej klasy lipidów jest cholesterol. Wchodzi on w skład błon komórkowych (stanowi około 50% lipidów błon komórkowych erytrocytów ssaków) i osłonek mielinowych nerwów. Związek ten jest prekursorem m. in. hormonów sterydowych (hormonów płciowych i kory nadnerczy) oraz kwasów żółciowych. Cholesterol testosteron Kwas deoksycholowy 1.4. Tetraterpeny (C40) Do tetraterpenów zalicza się karotenoidy: żółtopomarańczowe karoteny zbudowane z długich węglowodorowych łańcuchów oraz ich pochodne złocistożółte ksantofile.
Rozdzielanie lipidów prenylowych 6 β-karoten Oba rodzaje barwników występują najczęściej z chlorofilem pełniąc pomocniczą rolę w fotosyntezie (absorbują światło o innej długości fali niż chlorofil) oraz działają ochronnie, jako antyutleniacze. Mogą występować również w organach i tkankach nie mających chloroplastów, np. w płatkach kwiatów. Karoteny i ksantofile są pojęciami zbiorowymi. W roślinach wyższych występują np. α- i β-karoteny oraz różne ksantofile. Jednym z ksantofili jest luteina, zawierająca dwie grupy OH podstawione w pierścieniach w pozycji para do długiego łańcucha węglowodorowego. W widmo elektronowym β-karotenu występuje bardzo silne pasmo absorpcji w zakresie 350-500 nm z maksimum ok. 450 nm. 2. WYKONANIE ĆWICZENIA 2.1. Odczynniki 1. Aceton cz.d.a 2. Eter dietylowy cz.d.a. 3. Heksan (frakcja z nafty) cz. 4. Chlorek metylenu 5. Żel krzemionkowy (Kiselgel 60; 0,063 0,200 mm)
Rozdzielanie lipidów prenylowych 7 6. Układy rozwijające do chromatografii kolumnowej: heksan : eter dietylowy 95:5 i heksan eter dietylowy 1:1(v/v) 2.2. Materiał roślinny Brokuły, szpinak, natka pietruszki 2.3. Aparatura i sprzęt laboratoryjny 1. Homogenizator 2. Spektrofotometr; kuwety szklane 3. Wyparka 4. Moździerz porcelanowy 1 szt. 5. Lejek mały, lejek duży 6. Sączki karbowane 7. Odbieralnik gruszkowy na 100 ml 2 szt. 8. Cylinder miarowy 50 ml, 100 ml 9. Rozdzielacz 100 ml 1 szt. 10. Bagietka, łopatka, łyżeczka 11. Pipety Pasteura 12. Kolumna szklana 30 x 1cm 13. Zlewka 50 ml 2 sztuki 14. Zlewka 100 ml 2 sztuki 15. Kolbka miarowa 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml 16. Probówki 17. Nóż, nożyczki 2.4. Przygotowanie ekstraktów 2.4.1a. Brokuły rozcieranie w moździerzu 20 g brokułów (wybrać zielone części warzywa, pomijając w miarę możliwości twarde łodygi) pokroić nożem na małe kawałki, podzielić na dwie porcje. Każdą porcję rozetrzeć w moździerzu z dodatkiem 1 łyżeczki żelu krzemionkowego i 20 ml acetonu. Rozcieranie powinno trwać ok. 5 minut, aceton powinien zabarwić się na zielono. Połączone zawiesiny acetonowe przenieść ostrożnie na lejek z sączkiem karbowanym i odsączyć rozpuszczalnik do odbieralnika, pozostałość na lejku przemyć świeżą porcją acetonu (10 ml) w sumie należy zużyć ok. 50 ml acetonu. Aceton odparować na wyparce próżniowej uważając aby temperatura łaźni wodnej nie przekroczyła 30 35 0 C. Uważać na możliwość przerzucenia odparowywanej cieczy. Pozostałość zawierającą wyekstrahowane acetonem związki organiczne i wodę ekstrahować 3 x 10 ml heksanu starannie oddzielając w rozdzielaczu fazę wodną (dolną) od fazy organicznej (górnej). Połączone fazy organiczne zatężyć na
Rozdzielanie lipidów prenylowych 8 wyparce do objętości 1,5 2 ml. Resztkę wody z warstwy organicznej można usunąć dodając pod koniec odparowywania kilka mililitrów chlorku metylenu. 2.4.1b. Brokuły rozdrabnianie w mikserze 20 g brokułów (wybrać zielone części warzywa, pomijając w miarę możliwości twarde łodygi) pokroić nożem na małe kawałki, umieścić w pojemniku miksera, dodać 40 ml schłodzonego w zamrażalniku acetonu i miksować 1 minutę. Zawartość pojemnika przenieść ostrożnie na lejek z sączkiem karbowanym i odsączyć rozpuszczalnik do odbieralnika, pozostałość na lejku przemyć świeżą porcją acetonu (10 ml) w sumie należy zużyć ok. 50 ml acetonu. Aceton odparować na wyparce próżniowej uważając aby temperatura łaźni wodnej nie przekroczyła 30 35 0 C. Uważać na możliwość przerzucenia odparowywanej cieczy. Pozostałość ekstrahować 3 x 10 ml heksanu starannie oddzielając w rozdzielaczu fazę wodną (dolną) od fazy organicznej (górnej). Połączone fazy organiczne zatężyć na wyparce do objętości 1,5 2 ml. Resztkę wody z warstwy organicznej można usunąć dodając pod koniec odparowywania kilka mililitrów chlorku metylenu. 2.4.2a. Szpinak rozcieranie w moździerzu 2,5 g szpinaku pokroić nożem lub nożyczkami na małe kawałeczki, podzielić na dwie porcje. Każdą porcję rozetrzeć w moździerzu z dodatkiem 1 łyżeczki żelu krzemionkowego i 20 ml acetonu. Rozcieranie powinno trwać ok. 5 minut, aceton powinien zabarwić się na zielono. Połączone zawiesiny acetonowe przenieść ostrożnie na lejek z sączkiem karbowanym i odsączyć rozpuszczalnik do odbieralnika, pozostałość na lejku przemyć świeżą porcją acetonu (10 ml) w sumie należy zużyć ok. 50 ml acetonu. Aceton odparować na wyparce próżniowej uważając aby temperatura łaźni wodnej nie przekroczyła 30 35 0 C. Uważać na możliwość przerzucenia odparowywanej cieczy. Pozostałość ekstrahować 3x 10 ml heksanu starannie oddzielając w rozdzielaczu fazę wodną (dolną) od fazy organicznej (górnej). Połączone fazy organiczne ponownie odparować na wyparce do objętości 1,5 2 ml. Resztkę wody z warstwy organicznej można usunąć dodając pod koniec odparowywania kilka mililitrów chlorku metylenu. 2.4.2b. Szpinak rozdrabnianie w mikserze 2,5 g szpinaku pokroić nożem lub nożyczkami na małe kawałki, umieścić w pojemniku miksera, dodać 40 ml schłodzonego w zamrażalniku acetonu i miksować 1 minutę. Zawartość pojemnika przenieść ostrożnie na lejek z sączkiem karbowanym i odsączyć rozpuszczalnik do odbieralnika, pozostałość na lejku przemyć świeżą porcją acetonu (10 ml) w sumie należy zużyć ok. 50 ml acetonu. Aceton odparować na wyparce próżniowej uważając aby temperatura łaźni wodnej nie przekroczyła 30 35 0 C. Uważać na możliwość przerzucenia odparowywanej cieczy. Pozostałość ekstrahować 3x 10 ml heksanu starannie oddzielając w rozdzielaczu fazę wodną (dolną) od fazy organicznej (górnej). Połączone fazy organiczne zatężyć na wyparce do objętości 1,5 2 ml. Resztkę
Rozdzielanie lipidów prenylowych 9 wody z warstwy organicznej można usunąć dodając pod koniec odparowywania kilka mililitrów chlorku metylenu. 2.4.3b. Natka pietruszki rozcieranie w moździerzu 2 g natki pokroić nożem lub nożyczkami na małe kawałki, podzielić na dwie porcje. Każdą porcję rozetrzeć w moździerzu z dodatkiem 1 łyżeczki żelu krzemionkowego i 20 ml acetonu. Rozcieranie powinno trwać ok. 5 minut, aceton powinien zabarwić się na zielono a materiał roślinny prawie odbarwić. Połączone zawiesiny acetonowe przenieść ostrożnie na lejek z sączkiem karbowanym i odsączyć rozpuszczalnik do odbieralnika, pozostałość na lejku przemyć świeżą porcją acetonu (10 ml) w sumie należy zużyć ok. 50 ml acetonu. Aceton odparować na wyparce próżniowej uważając aby temperatura łaźni wodnej nie przekroczyła 30 35 0 C. Uważać na możliwość przerzucenia odparowywanej cieczy. Pozostałość ekstrahować 3x10 ml heksanu starannie oddzielając w rozdzielaczu fazę wodną (dolną) od fazy organicznej (górnej). Połączone fazy organiczne zatężyć na wyparce do objętości 1,5 2 ml. Resztkę wody z warstwy organicznej można usunąć dodając pod koniec odparowywania kilka mililitrów chlorku metylenu. 2.4.3b. Natka pietruszki rozdrabnianie w mikserze 2 g natki pokroić nożem lub nożyczkami na małe kawałki, umieścić w pojemniku miksera, dodać 40 ml schłodzonego w zamrażalniku acetonu i miksować 1 minutę. Zawartość pojemnika przenieść ostrożnie na lejek z sączkiem karbowanym i odsączyć rozpuszczalnik do odbieralnika, pozostałość na lejku przemyć świeżą porcją acetonu (10 ml) w sumie należy zużyć ok. 50 ml acetonu. Aceton odparować na wyparce próżniowej uważając aby temperatura łaźni wodnej nie przekroczyła 30 35 0 C. Uważać na możliwość przerzucenia odparowywanej cieczy. Pozostałość ekstrahować 3 x 10 ml heksanu starannie oddzielając w rozdzielaczu fazę wodną (dolną) od fazy organicznej (górnej). Połączone fazy organiczne zatężyć na wyparce do objętości 1,5 2 ml. 2.5. Rozdział na kolumnie chromatograficznej Do kolumny chromatograficznej nalać ok. 5 ml heksanu i przy zamkniętym kraniku doprowadzić do usunięcia większości powietrza ze spieku i z dna kolumny, na spieku umieścić kłaczek waty ubijając go bagietką, usunąć resztę powietrza. Kolumnę umocować pionowo w statywie. Przygotować zawiesinę 6 g żelu krzemionkowego w 20 ml heksanu i napełnić nią kolumnę korzystając z lejka. Zawiesinę należy dodawać porcjami, pomagając sobie bagietką tak, aby w słupie żelu nie powstały szczeliny i pęcherzyki powietrza. Nadmiar rozpuszczalnika spuszczać stopniowo do podstawionej zlewki. Po prawidłowym napełnieniu kolumny poziom cieczy powinien znajdować się tuż nad powierzchnią żelu, powierzchnia żelu na szczycie kolumny powinna być równa, pozioma. Ekstrakt heksanowy barwników ostrożnie wprowadzić na szczyt słupa żelu przy pomocy pipetki Pasteura starając się nie zwilżać nim ścianek kolumny i nie zniszczyć równej powierzchni żelu.
Rozdzielanie lipidów prenylowych 10 Otworzyć kranik i poczekać aż wprowadzony roztwór znajdzie się w całości w żelu, wprowadzić pipetką na szczyt kolumny kilka ml czystego heksanu i powtórzyć operację. Po wprowadzeniu całości rozdzielanej próbki na żel można napełnić wolną przestrzeń u góry kolumny heksanem, następnie przepuścić przez kolumnę 10 20 ml heksanu obserwując zachowanie wprowadzonej mieszaniny. Najczęściej obserwuje się wędrówkę mniej lub bardziej zabarwionych lipofilowych składników mieszaniny wraz z czołem rozpuszczalnika. Wprowadzić na szczyt kolumny roztwór heksan : eter dietylowy 95:5. Bardziej polarny eluent powinien spowodować szybszą wędrówkę barwników w dół kolumny jako pierwszy powinien wędrować pomarańczowy karoten. Zebrać karoten do probówki. Do zmycia karotenu z kolumny potrzeba przeciętnie 25 ml mieszaniny heksan : eter 95:5. Następnie zmienić mieszaninę rozpuszczalników na roztwór heksan: eter dietylowy 1:1 i zebrać do probówki/probówek mieszaninę chlorofilu a i b. Oba związki różniące się podstawnikiem przy węglu 7 schodzą z kolumny nie rozdzielając się całkowicie w warunkach doświadczenia. Uwaga! W czasie przygotowywania kolumny i rozdziału chromatograficznego poziom rozpuszczalnika musi być zawsze nad powierzchnią żelu. 2.6. Oznaczanie zawartości karotenu, chlorofilu a i chlorofilu b w badanych próbkach 2.6.1. Brokuły Zebraną do probówki frakcję karotenu przenieść ilościowo do kolbki miarowej 10 ml dopełniając do kreski eterem dietylowym (roztwór, w którym jest rozpuszczony karoten powinien mieć w przybliżeniu skład heksan : eter dietylowy 1:1). Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję otrzymanego roztworu przy długości fali 449 nm. Korzystając z prawa Lamberta Beera i danych w pkt. 2.7. obliczyć: stężenie molowe roztworu karotenu, zawartość karotenu w badanych brokułach (mg/kg) Zebraną do probówek frakcję chorofilu a i b przenieść ilościowo do kolbki miarowej 50 ml, dopełnić do kreski roztworem heksan : eter dietylowy 1:1 i wymieszać. Zmierzyć absorbancję roztworu w dwóch punktach przy długości fali 643 nm i przy długości fali 667 nm. Korzystając z prawa addytywności absorpcji i wykorzystując dane pkt. 2.7. ułożyć układ dwóch równań i obliczyć: stężenie molowe obu chlorofili w badanej próbce zawartość tych związków brokułach (mg/kg) 2.6.2. Szpinak i natka pietruszki Frakcję karotenu przenieść ilościowo do kolbki miarowej 25 ml i dopełnić do kreski roztworem heksan : eter dietylowy 1:1. Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję otrzymanego roztworu przy długości fali 449 nm. W przypadku absorpcji zdecydowanie
Rozdzielanie lipidów prenylowych 11 przekraczającej wartość 1 rozcieńczyć próbkę 10 razy (pobrać 1 ml roztworu do kolbki miarowej 10 ml i dopełnić do kreski mieszaniną rozpuszczalników heksan : eter dietylowy 1 : 1). Korzystając z prawa Lamberta Beera i danych w pkt. 2.7. obliczyć: stężenie molowe otrzymanego roztworu karotenu, zawartość karotenu w badanych roślinach (mg/kg) Frakcję chlorofili a i b przenieść ilościowo do kolbki miarowej 100ml i dopełnić do kreski roztworem heksan : eter dietylowy 1:1 i wymieszać. Zmierzyć absorbancję roztworu w dwóch punktach przy długości fali 643 nm i przy długości fali 667 nm. Korzystając z prawa addytywności absorpcji i wykorzystując dane pkt. 2.7. ułożyć układ dwóch równań i obliczyć: stężenie molowe obu chlorofili w badanej próbce zawartość tych związków brokułach (mg/kg) 2.7. Dane spektroskopowe barwników roślinnych 2.7.1. Molowe współczynniki absorpcji w roztworze heksan : eter dietylowy 1:1 Lp Nazwa związku Długość fali [nm] ε [dm 3 mol -1 cm-1 ] 1. β-karoten 449 152021 2. chlorofil a 643 16600 3 chlorofil a 667 50800 4. chlorofil b 643 36268 5. chlorofil b 667 1071 2.7.2. Masy molowe barwników Mkaroten = 536,88 g/mol Mchlorofil a = 893,5 g/mol Mchlorofil b = 907,48 g/mol 3. PYTANIA I ZADANIA 1. Scharakteryzuj lipidy prenylowe i przedstaw drogi ich biosyntezy. 2. Podaj przykłady związków należących do mono-, di-, tri- i tetraterpenów. 3. Opisz budowę chlorofili oraz wyjaśnij różnice pomiędzy chlorofilem a i b. 4. Omów budowę karotenoidów, podaj przykłady wybranych związków oraz omów ich rolę w procesie fotosyntezy. 5. Opisz technikę chromatografii kolumnowej i cienkowarstwowej, podaj różnice. 6. Wyjaśnij, od czego zależy skuteczność rozdziału mieszaniny związków metodą chromatografii adsorpcyjnej.