Polipeptyd, sekwencja, bakulowirus, sposób wytwarzania glikoproteiny, zastosowanie sekwencji, zastosowanie bakulowirusa, zastosowanie polipeptydu

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201132 (21) Numer zgłoszenia: 359912 (22) Data zgłoszenia: 29.04.2003 (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 14/005 (2006.01) C07K 14/185 (2006.01) C12N 15/40 (2006.01) C12N 15/866 (2006.01) (54) Polipeptyd, sekwencja, bakulowirus, sposób wytwarzania glikoproteiny, zastosowanie sekwencji, zastosowanie bakulowirusa, zastosowanie polipeptydu (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.11.2004 BUP 22/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.2009 WUP 03/09 (73) Uprawniony z patentu: Uniwersytet Gdański,Gdańsk,PL Instytut Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu, Poznań,PL Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Warszawa,PL Kucharczyk Krzysztof Techniki Elektroforetyczne Sp. z o.o.,warszawa,pl (72) Twórca(y) wynalazku: Bogusław Szewczyk,Gdańsk,PL Beata Adamiak,Gdynia,PL Krystyna Bieńkowska-Szewczyk,Gdańsk,PL Jolanta Ficińska,Gdańsk,PL Andrzej Płucienniczak,Warszawa,PL Anna Porębska,Warszawa,PL Andrzej B. Legocki,Poznań,PL Katarzyna Miedzińska,Rawicz,PL Krzysztof Kucharczyk,Warszawa,PL (74) Pełnomocnik: Aleksandra Twardowska, JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY, Biuro Patentów i Znaków Towarowych (57) 1. Polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, przy czym sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny. PL 201132 B1

2 PL 201 132 B1 Opis wynalazku Przedmiotami wynalazku są polipeptyd, sekwencja, bakulowirus, sposób otrzymywania glikoproteiny, zastosowanie sekwencji, zastosowanie bakulowirusa, zastosowanie polipeptydu służące do produkcji szczepionki przeciwko CSFV. Ogólnie wynalazek dotyczy otrzymywania glikoproteiny E2, głównego antygenu wirusa klasycznego pomoru świń (Classical Swine Fever Virus CSFV), z podłoża wzrostowego komórek owadzich zakażonych wirusami zrekombinowanymi należącymi do rodziny Baculoviridae posiadającymi rekombinowane sekwencje wyprowadzające białka na zewnątrz komórek. Przedmioty wynalazku służą do stosowania takiego podłoża jako czynnika immunizującego. Niektóre wirusy zwierzęce mogą być stosowane jako wektory do ekspresji obcych genów. Bakulowirusy są jedną z najczęściej stosowanych grup wirusów stosowanych w tym celu. Najczęściej stosowanym gatunkiem bakulowirusa do ekspresji obcych genów jest wirus jądrowej polihedrozy Autographa californica (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) oznaczany skrótem AcNPV. Dwuniciowa kolista cząsteczka DNA tego wirusa ma wielkość około 128 tysięcy par zasad. DNA wirusowe jest związane z małym zasadowym białkiem o masie cząsteczkowej około 7 kda. Genom otoczony jest białkowym kapsydem, na powierzchni którego znajdują się białka otoczkowe. W przypadku formy okluzyjnej wirusa, cząstki wirusów otoczone są grubą warstwą białka polihedryny. W cyklu rozwojowym AcNPV występują dwie formy wirionów: forma okluzyjna (OV) i forma pączkująca (BV zwana również EV). Formy te różnią się pomiędzy sobą morfologią oraz rolą w zakażaniu komórek. Forma OV tworzy ciała okluzyjne w jądrach zakażonych komórek. Po śmierci żywiciela forma ta służy do zakażania kolejnych gąsienic. Głównym białkiem formy OV jest polihedryna chroniąca wirusa przed niekorzystnym wpływem środowiska zewnętrznego. W zasadowym środowisku jelita gąsienic następuje uwolnienie wirusów z powłoki polihedrynowej. Zakażają one komórki jelita, gdzie zachodzi pierwotny rozwój wirusa i tworzenie form potomnych BV. Formy te nie zawierają polihedryny. Mogą one zakażać kolejne komórki w obrębie całego ciała gąsienic (lub kolejne komórki w hodowli tkankowej). Ekspresja genów bakulowirusa AcNPV zachodzi w kilku kolejnych fazach: wczesnej (dzielonej często na fazę bardzo wczesną i wczesną opóźnioną), późnej i bardzo późnej. Faza późna (6-18 godzin po infekcji) charakteryzuje się ekspresją genów, których produkty uczestniczą w tworzeniu formy BV. W tej fazie syntetyzowane są strukturalne białka kapsydu i rdzenia. Syntetyzowana jest również glikoproteina o masie cząsteczkowej 67 kda odgrywająca istotną rolę w zakażeniu wtórnym, międzykomórkowym przez formę BV. Faza bardzo późna (okluzyjna) trwa od około 18 godzin do około 80 godzin po infekcji. W fazie tej następuje intensywna synteza polihedryny (masa cząsteczkowa około 30 kda), która może stanowić do 50% masy wszystkich białek w komórce. Bakulowirus AcNPV produkuje około 70 cząstek OV w jednym jądrze komórkowym i każda cząstka OV zawiera liczne kapsydy wirusowe. Drugim bardzo późnym białkiem jest białko p10. Jego rola jest dużo słabiej poznana. Białko p10 tworzy struktury cytoszkieletowe w komórce oraz uczestniczy w uwalnianiu cząstek OV z komórek. Drugim gatunkiem bakulowirusa często stosowanym do ekspresji obcych genów jest wirus jądrowej polihedrozy jedwabnika morwowego (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) oznaczony skrótem BmNPV. Jest on w około 90% identyczny na poziomie sekwencji nukleotydowej z AcNPV. Podobieństwo sekwencji nukleotydowej powoduje, że skład białkowy obydwu wirusów jest bardzo podobny, jednak nie mają one żadnego wspólnego gospodarza. Rozwój obydwu wirusów przebiega prawie tak samo; jedyną zauważalną różnicą jest ilość upakowanych cząstek wirusowych w okluzjach polihedrynowych. AcNPV zaliczany jest do grupy oznaczonej jako MNPV (multiple nuclear polyhedrosis viruses) ponieważ upakowanych jest wiele cząstek wirusowych w jedną okluzję polihedrynową, BmNPV natomiast należy do grupy oznaczonej SNPV (single nuclear polyhedrosis virus) ponieważ uważa się, że cząstki wirusowe pakowane są pojedynczo w osłony polihedrynowe. BmNPV jest najczęściej stosowany jako system ekspresyjny, wtedy gdy planuje się uzyskanie obcych białek w gąsienicach, a nie w hodowli tkankowej komórek owadzich. Wynika to między innymi z wielkości gąsienic jedwabnika (około 10 razy większe wagowo od gąsienic gospodarzy AcNPV), prostoty hodowli i braku kanibalistycznych skłonności gąsienic jedwabnika. Genom bakulowirusa jest bardzo duży, dlatego też bezpośrednie wprowadzenie do niego obcego genu w ściśle określone miejsce nie jest proste. Najczęściej do wprowadzania genu do genomu bakulowirusa stosuje się odpowiednie wektory transferowe. Zawierają one replikon bakteryjnego plazmidu wielokopiowego, marker selekcyjny, rejon promotorowy i terminatorowy pochodzące z genomu bakulowirusa wraz z sekwencjami flankującymi te rejony oraz miejsce wielokrotnego klonowania (lub pojedyncze miejsce restrykcyjne) między promotorem a terminatorem gdzie wprowadzany jest obcy gen. W celu uzyskania ekspresji obcego genu, komórki owadzie zakaża się najczęściej mieszaniną wirusowego DNA

PL 201 132 B1 3 i wektorem transferowym zawierającym obcy gen. W komórkach owadzich zachodzi rekombinacja między homologicznymi sekwencjami plazmidu i genomu wirusa co prowadzi do wbudowania obcego genu do genomu wirusa z jednoczesnym usunięciem odpowiedniego genu bakulowirusa. Najczęściej obce geny wprowadza się w miejsce genu polihedryny lub genu p10. Oba te geny posiadają bardzo silne promotory, transkrypcja ich jest zatem bardzo wydajna. Synteza obu białek następuje w fazie okluzyjnej, nie są więc one potrzebne do formowania cząstek BV. Rekombinanty bakulowirusowe nie zawierające genu polihedryny można namnażać w hodowli tkankowej, gdzie zakażenie jest przeprowadzane przez formę BV. Namnożenie rekombinanta w gąsienicach jest możliwe przez mikroiniekcję do ciała gąsienicy lub przez zakażenie rekombinantem opłaszczonym polihedryną uzyskanym wcześniej przez mieszaną infekcję szczepem dzikim i rekombinantem w określonych proporcjach. W przypadku rekombinantów niezawierających genu p10 namnożenie jest jeszcze prostsze. Można je namnażać zarówno w hodowli tkankowej jak i poprzez podanie gąsienicom zakażonego pokarmu. Poza bardzo wysokim poziomem ekspresji obcych genów w systemie bakulowirusowym (masa obcego białka może stanowić do 50% masy wszystkich białek komórkowych) jest kilka innych czynników, które czynią ten system wyjątkowo atrakcyjnym. Do genomu bakulowirusa można wprowadzić bardzo duży odcinek obcego DNA. Między innymi uzyskiwano ekspresję cdna będącego pełną kopią genomu RNA wirusa zwierzęcego o wielkości kilkunastu tysięcy zasad. Modyfikacja potranslacyjna jest bardzo podobna w komórkach owadzich i ssaczych. Wyjątkiem jest tu N-glikozylacja, która jest prymitywniejsza w komórkach owadzich, co powoduje że glikoproteiny kręgowców uzyskane w systemie bakulowirusowym mają masę cząsteczkową nieco mniejszą niż ich naturalne odpowiedniki. Komórki owadzie są szczególnie łatwe do hodowli in vitro. Większość linii komórkowych może być hodowana zarówno w hodowlach jednowarstwowych jak i w zawiesinie. Optymalna temperatura hodowli wynosi 27ºC co w praktyce oznacza, że możliwa jest hodowla w temperaturze pokojowej. Do hodowli nie jest również konieczna atmosfera dwutlenku węgla, a więc hodowla komórek owadzich może być prowadzona w wytrząsarkach powietrznych lub wodnych identycznych jak stosowane do hodowli bakterii w standardowym laboratorium mikrobiologicznym (Bieńkowska-Szewczyk K., Szewczyk B., Acta Bioch. Polon., 1999, 46, 325-339). W klasycznej metodzie Summersa i Smitha (Summers i Smith, Texas Agricult. Exp. Station Bull., 1987; 1555, 1-57) obcy gen był wprowadzany w miejsce genu polihedryny i rekombinanty rozróżniano na podstawie morfologii łysinek. Zrekombinowane wirusy nie produkują polihedryny, a zatem nie tworzą się ciała okluzyjne w jądrach zakażonych komórek. Jest to zauważalne pod mikroskopem, a nawet bezpośrednio wzrokowo. Jednak jest to metoda żmudna i zawodna. Stopniowe upraszczanie poszczególnych etapów otrzymywania rekombinantów doprowadziło do skrócenia czasu ich otrzymywania do kilku tygodni. Pierwszym usprawnieniem było zwiększenie wydajności transfekcji po dodaniu plazmidu i genomowego DNA do zawiesiny komórek owadzich. Metody oparte na wytrącaniu DNA w obecności fosforanu wapnia zostały zastąpione metodami gdzie transfekcja zachodzi w obecności kationowych lipidów. Kolejnym ułatwieniem w izolacji rekombinantów było zastosowanie wektorów transferowych pozwalających na wprowadzenie genów reporterowych razem z klonowanym genem do genomu bakulowirusa. Gen reporterowy, najczęściej lacz, znajdował się w orientacji przeciwnej do orientacji klonowanego genu i był pod kontrolą innego niż polihedrynowy (najczęściej słabego) promotora bakulowirusowego. Ponieważ gen reporterowy był wprowadzany razem z obcym genem, dodanie do podłoża wzrostowego substratu typu X-gal dla β-galaktozydazy, powodowało zabarwienie łysinek rekombinanta (ale nie szczepu dzikiego) na kolor niebieski. Izolacja takich rekombinantów była znacznie łatwiejsza i czas potrzebny do otrzymania rekombinantów bakulowirusowych został znacznie skrócony. Kolejna metoda polegała na wprowadzeniu w miejsce genu polihedryny linkera zawierającego sekwencję dla enzymu restrykcyjnego, który nie ma innego naturalnego miejsca cięcia w genomie. Umożliwia to uzyskanie liniowego genomowego DNA przeciętego w genie polihedryny. Transfekcja takim liniowym genomem i wektorem transferowym zmniejsza wprawdzie znacznie wydajność transfekcji ale około 30% łysinek to łysinki rekombinanta. Dalsze zmiany konstrukcyjne w takim liniowym bakulowirusie spowodowały, że praktycznie 100% łysinek wirusowych pochodziło od rekombinantów. Rekombinacja homologiczna zachodząca w komórkach owadzich in vivo między wektorem transferowym a genomem bakulowirusowym jest procesem mało wydajnym. W związku z tym opracowano kilka metod, w których wprowadzenie obcego genu do genomu bakulowirusa odbywa się poza komórkami owadzimi. Najbardziej rozpowszechniona metoda polega na miejscowo specyficznej transpozycji kasety ekspresyjnej do wektora wahadłowego zawierającego genom bakulowirusowy (tzw. bakmidu), który może replikować się w bakteriach Escherichia coli (Luckow i in., J.Virol., 1993; 67, 4566-4579). Bakmid zawiera niskokopiowy replikon mini-f, marker oporności na kanamycynę i segment DNA kodu-

4 PL 201 132 B1 jący peptyd lacz pochodzący z plazmidu serii puc. Na N-końcu genu lacz znajduje się krótki odcinek zawierający miejsce przyłączania transpozonu Tn7 (mini-atttn7). Wektor wahadłowy występuje w Escherichia coli DH10B jako wielki plazmid, który koduje oporność na kanamycynę i jest odpowiedzialny za komplementację delecji lacz znajdującej się na chromosomie bakteryjnym (objawiającej się tworzeniem niebieskich kolonii w obecności substratu X-gal i IPTG). Wektor wahadłowy może przyjąć obcy gen z wektora transferowego na drodze transpozycji mini-tn7 do miejsca mini-atttn7 pod warunkiem obecności białek transpozycyjnych kodowanych na plazmidzie pomocniczym, który posiada poza tym marker oporności na tetracyklinę. Mini-Tn7 zawiera marker oporności na gentamycynę, promotor bakulowirusowy, obcy gen i sygnał terminacji transkrypcji z wirusa SV40. Transpozycja mini-tn7 do bakmidu zaburza ekspresję lacz, co powoduje że kolonie bakteryjne zawierające zmodyfikowany bakmid są białe, a nie niebieskie na odpowiednim podłożu selekcyjnym. Pozwala to na łatwą izolację zmodyfikowanych bakmidów. Oczyszczony zmodyfikowany bakmid może zostać użyty do transfekcji; nie ma więc selekcji rekombinantów w komórkach owadzich. Metoda, mimo że ma skomplikowane podłoże teoretyczne jest prosta w stosowaniu i pozwala na szybkie uzyskanie rekombinantów bakulowirusowych. Czas potrzebny do otrzymania rekombinanta jest bardzo krótki, przeważnie wynosi około dwóch tygodni. Mimo niewątpliwych zalet takich jak niski koszt produkcji i wysoka wydajność syntezy rekombinowanych białek, hodowle gąsienic do uzyskiwania produktów obcych genów w systemie bakulowirusowym są dość rzadko stosowane. Hodowle in vitro są stosowane znacznie częściej (co najmniej 90% zastosowań systemu bakulowirusowego), prawdopodobnie ze względu na większą powtarzalność i łatwiejszą kontrolę warunków doświadczeń. Znanych jest ponad 400 linii komórek owadzich, jednak tylko kilka linii ma bardzo szerokie zastosowanie jako gospodarz bakulowirusów. AcNPV jest najczęściej namnażany na liniach komórkowych wywodzących się ze Spodoptera frugiperda lub Trichoplusia ni. Znanych jest kilka podłoży podstawowych do hodowli in vitro komórek owadzich, w których namnaża się bakulowirusa. Są to między innymi podłoże Grace'a, IPL-41 i TC-100, które są dostępne w formie stałej lub płynnej. Przed użyciem dodaje się do nich płodową surowicę bydlęcą do stężenia 10%. Kilka lat temu pojawiły się podłoża nie wymagające dodatku surowicy bydlęcej, które są niezastąpione w wielu wypadkach jak np. izolacja białek eksportowanych do podłoża wzrostowego. Są to między innymi: ExCell 400 i ExCell 401 (J.R.H. Biosciences), HyQ-CCM-3 (HyClone), Sf900 i Sf900-II (GIBCO/BRL), SFM1 i SFM2 (Sigma). Wirus klasycznego pomoru świń (CSFV), nazywany też często wirusem cholery świńskiej (HCV), którego gen E2 był klonowany do bakulowirusa, należy do rodzaju Pestivirus, rodziny Flaviviridae. Wirus ten powoduje jedną z najgroźniejszych chorób zwierząt hodowlanych klasyczny pomór świń, która bardzo często kończy się śmiercią zakażonych zwierząt. Objawy chorobowe to przede wszystkim bardzo wysoka gorączka, leukopenia i wylewy podskórne. W przeszłości wirus CSF powodował wiele epidemii na kontynencie europejskim. Ostatnia epidemia w 1997 roku spowodowała śmierć kilku milionów świń w Holandii i w Niemczech. Stada zakażone wirusem były wybijane aby zapobiec rozprzestrzenianiu się wirusa. Wybijanie zwierząt jest jednak trudne do uzasadnienia zarówno z ekonomicznego jak i humanitarnego punktu widzenia. Szczepienia masowe są więc prawdopodobnie najbardziej racjonalną metodą eliminacji wirusa z populacji zwierząt w danym kraju. Wirion wirusa pomoru świńskiego jest kształtu sferycznego; w jego skład wchodzi heksagonalny kapsyd zawierający genom o wielkości ok. 12,5 kb. Genom wirusa stanowi pojedyncza nić RNA o polarności dodatniej. cdna dwóch szczepów CSFV: Brescia (Moormann i in., Virology, 1990; 177: 184-198) i Alfort (Meyers i in., Virology, 1989; 171: 555-567) zostało w pełni zsekwencjonowane. Stwierdzono obecność pojedynczej, otwartej ramy odczytu (ORF) kodującej białko o wielkości ok. 4000 aminokwasów. ORF otoczona jest dwoma rejonami niekodującymi, które biorą udział w replikacji oraz translacji genomu. Rejon niekodujący od strony 5' o długości ok. 400 nukleotydów zawiera kodon AUG będący miejscem wiązania rybosomu. Rejon ten jest istotny w inicjacji translacji genomu wirusa CSFV. Wiadomo jednak, że nie występuje tu struktura typu cap (tzw. czapeczki) charakterystyczna dla mrna eukariotycznego. Rejon niekodujący od strony 3' o długości ok. 200 nukleotydów nie zawiera na końcu sekwencji poli-a również charakterystycznej dla mrna eukariotycznego. Niekodujący koniec 5' ma złożoną strukturę drugorzędową przypominającą strukturę drugorzędową analogicznego rejonu u pikornawirusów (Brown i in., Nucleic Acids Res. 1992; 20: 5041-5045; Deng i Brock, Nucleic Acids Res. 1993; 21: 1949-1957). Obecność wielu trójek nukleotydowych AUG powyżej kodonu startowego sugeruje, że translacja genomu CSFV może rozpoczynać się od wewnętrznego wiązania rybosomów niezależnego od struktury cap (Poole i in., Virology, 1995; 206: 750-754).

PL 201 132 B1 5 Białkowy prekursor wirusa pomoru świńskiego o wielkości około 4000 aminokwasów podlega szeregowi ściśle kontrolowanych modyfikacji kotranslacyjnych i potranslacyjnych. W modyfikacjach tych biorą udział proteazy komórkowe i wirusowe (Stark i in., J. Virol. 1993; 67: 7088-7095). Rezultatem pierwszych przekształceń białkowego prekursora jest uwolnienie od strony N-terminalnej proteazy N pro (p23), kapsydowego białka C (p14) oraz trzech białek strukturalnych wchodzących w skład otoczki wirusowej. Są to białka: 1. E0 (nazywane również E ms ) - dawna nazwa to E2 lub gp44-48 charakteryzująca masę cząsteczkową; 2. E1 - dawna nazwa E3 lub gp31; 3. E2 - dawna nazwa E1lub gp51-54; Wszystkie trzy wymienione białka są glikozylowane. Ich ułożenie w białkowym prekursorze jest następujące E0, E1, E2. Glikoproteiny tworzą między sobą struktury wyższego rzędu, połączone między sobą mostkami dwusiarczkowymi. E0 (gp44-48) i E2 (gp51-54) są eksponowane na powierzchni komórek, natomiast E1 (gp31) jest skierowane do wnętrza wirionu (Thiel i in., J. Virol. 1991; 65: 4705-4712; van Rijn i m., J. Virol. 1994; 68: 3934-3942). Dalszy segment genomu koduje białka niestrukturalne. Są to białka NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Meyers i in., Virology 1992; 191: 368-386). Analogi NS3 u innych flawirusów wykazują aktywności proteazy serynowej, NTPazy i helikazy. NS5B jest prawdopodobnie wirusową RNA-zależną RNA polimerazą. Zwierzęta zainfekowane wirusem pomoru świńskiego wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko białkom E0, E2 i NS3 (Wensvoort i in., Vet. Microbiol. 1988; 17: 129-140). Jednak jedynie przeciwciała anty-e2 mają silnie neutralizujące działanie w stosunku do wirusa pomoru. Przeciwciała anty-e0 oraz anty- -NS3 mają natomiast bardzo znikome działanie neutralizujące (Wensvoort, J. Gen. Virol. 1989; 70: 352-358; Weiland i in., J. Virol. 1990; 64: 3563-3569). Do niedawna jedną z szeroko stosowanych szczepionek przeciwko CSF była szczepionka oparta na żywym, atenuowanym szczepie wirusa pomoru. Szczepionkowy szczep C (Chinese strain) skutecznie chronił zwierzęta przed CSF, lecz niemożliwe było serologiczne rozróżnienie zwierząt szczepionych od zwierząt zainfekowanych wirusem typu dzikiego. Obecnie opracowanych jest szereg szczepionek przeciwko CSF, wciąż udoskonalanych. Aktualnie stosowane szczepionki muszą spełniać kilka wymogów: powinny być genetycznie bezpieczne, skutecznie immunizować zwierzęta oraz pozwalać na odróżnienie zwierząt szczepionych od zwierząt zainfekowanych wirusem typu dzikiego przy użyciu stosunkowo prostych testów. Opracowywane w ostatnich latach szczepionki przeciwko CSF można podzielić na cztery grupy: 1. szczepionki podjednostkowe konstruowane w oparciu o wektory bakulowirusowe; 2. szczepionki podjednostkowe konstruowane w oparciu o wektory herpeswirusowe; 3. szczepionki będące żywymi atenuowanymi szczepami wirusa pomoru świńskiego, które mają wprowadzone odpowiednie markery genetyczne metodami miejscowo specyficznej mutagenezy; 4. szczepionki DNA. Potencjalna szczepionka podjednostkowa uzyskana w systemie bakulowirusowym opierała się na ekspresji genu E2 w komórkach owadzich (Hulst i in., J. Virol. 1993; 67: 5435-5442). Dawki od 20 do 100 μg oczyszczonego produktu genu E2 (gp51-54) wystarczały do uzyskania wysokiego poziomu przeciwciał neutralizujących. W tym samym laboratorium skonstruowano rekombinanta bakulowirusowego, który zawierał gen E2 z delecją odpowiedzialną za brak jednej z determinant antygenowych. Taki rekombinant produkował glikoproteinę E2, która w dalszym ciągu indukowała powstawanie przeciwciał neutralizujących (van Rijn i in., J. Gen. Virol. 1996; 77: 2737-2745). Potencjalnie szczepionka i diagnostyczny test różnicujący zwierzęta zakażone i szczepione może w tym układzie być skonstruowany tylko w oparciu o glikoproteinę E2 jeśli w teście diagnostycznym zostanie użyta brakująca determinanta antygenowa. Wektorem herpeswirusowym stosowanym do wprowadzania genów CSFV jest atenuowany wirus wścieklizny rzekomej. Również w tym przypadku wprowadzano gen E2 (van Zijl i in., J. Virol. 1991; 65: 2761-2765). Zwierzęta zaszczepione takim zrekombinowanym herpeswirusem wytwarzały oporność na CSFV i wirusa wścieklizny rzekomej. W celu zredukowania ryzyka przeniesienia rekombinanta ze zwierząt szczepionych na zwierzęta nieszczepione, Peeters i in. (J. Gen. Virol. 1997; 78: 3311-3314) skonstruowali rekombinanta, który mógł rozprzestrzeniać się tylko drogą połączeń międzykomórkowych, natomiast dojrzałe cząstki wirusowe były nieinfekcyjne. Markerowe szczepionki oparte o szczep C wirusa konstruowane są w dość skomplikowany sposób. Najpierw uzyskuje się pełną kopię DNA genomu wirusa (Moormann i in., J. Virol. 1996; 70: 763-770). Do takiej

6 PL 201 132 B1 kopii wprowadza się mutacje np. delecje lub insercje, które będą podstawą testu diagnostycznego. Następnie przeprowadza się transkrypcję in vitro i wprowadzenie infekcyjnego RNA do komórki. Opis patentowy US4745051 (opublikowany 1988.05.17) opisuje rozwiązanie dotyczące sposobu otrzymywania rekombinowanego ekspresyjnego wektora bakulowirusowego służącego do ekspresji wybranego genu w komórce gospodarza. W preferowanym rozwiązaniu stosowana jest metoda przecięcia DNA bakulowirusa w celu wytworzenia fragmentu DNA zawierającego gen polihedryny, bądź jego część obejmującą promotor polihedryny. Rekombinowany wahadłowy wektor jest otrzymywany poprzez wprowadzenie wspomnianego fragmentu DNA do układu klonowania, a następnie poprzez wprowadzenie wybranego genu do tak zmodyfikowanego wektora, pod transkrypcyjną kontrolą promotora polihedryny. Rekombinowany wektor oddziałuje z DNA bakulowirusowym w taki sposób aby nastąpiła rekombinacja i włączenie wybranego genu do genomu bakulowirusa. Opisy patentowe US5925360 (opublikowany 1999.07.20), EP1087014 (opublikowany 2001.03.28), US5935582 (opublikowany 1999.08.10), EP0389034 (opublikowany 1999.07.14), US5811103 (opublikowany 1998.09.22), EP0614979 (opublikowany 1996.06.05), EP0713915 (opublikowany 1996.05.29), EP0389034 (opublikowany 1994.09.14), opisują rozwiązania dotyczące szczepionki przeciwko wirusowi klasycznego pomoru świń (Classical Swine Fever Virus CSFV dawniej Hog cholera virus). Przedstawiona jest szczepionka zawierająca polipeptyd klasycznego pomoru świń. Ponadto przedstawiono szczepionki wektorowe, które zdolne są do ekspresji sekwencji nukleotydowej kodującej taki polipeptyd. Omówione sekwencje polipeptydu oraz nukleotydowe mogą być też zastosowane do detekcji klasycznego pomoru świń. W opisie patentowym WO0220048 (opublikowany 2002.03.14) przedstawiono rozwiązanie dotyczące szczepionki epitopowej przeciwko klasycznemu pomorowi świń, zawierającej przynajmniej jeden peptyd epitopu, skoniugowany z białkiem transportowym tworzącym koniugaty, przy czym każdy z koniugatów posiada przynajmniej jedno powtórzenie mono-epitopowe bądź multi-epitopowe powtórzone przynajmniej raz. Omówiony(-e) epitop(-y) wybrany(-e) jest(są) z neutralizującego epitopu białka otoczkowego E2 wirusa klasycznego pomoru świń oraz zmutowanego epitopu. Sposób przygotowania szczepionki obejmuje następujące etapy: (1) zsyntetyzowanie przynajmniej jednego peptydu, każdy posiadający neutralizujący mono-epitop lub multi-epitopy bądź zmutowany epitop, przy czym epitop otrzymany jest z białka otoczkowego E2 wirusa klasycznego pomoru świń, powtarzającego się przynajmniej raz; (2) przyłączenie do nośnika tworzącego odpowiednio koniugaty; (3) tworzenie wspomnianych koniugatów z tworzoną szczepionką. Opis patentowy EP0924298 (opublikowany 1999.06.23) opisuje rozwiązanie dotyczące ekspresji genów w systemach bakulowirusowych. Wynalazek ten odnosi się do sposobu mającego na celu podwyższenie syntezy białka w bakulowirusowych systemach ekspresyjnych. W wynalazku przedstawiony jest sposób wytwarzania rekombinowanego białka w hodowli komórek owadzich, zakażonych rekombinantem bakulowirusowym niosącym gen kodujący wspomniane białko. W hodowli komórki owadzie znajdują się w podłożu wzrostowym o objętości co najmniej 2 litry i są zakażane inokulum zawierającym przynajmniej jednego bakulowirusa w warunkach gdy gęstość komórek wynosi 1 x 10 5 do 5 x 10 6 komórek/ml a m.o.i jest <0,01. Ponadto wynalazek opisuje sposób otrzymania białek pestiwirusowych E2 lub Erns lub ich fragmentów w hodowli komórek owadzich charakteryzującej się tym, że stężenie końcowe wspomnianego białka (fragmentów) w pożywce wzrostowej przy zbieraniu wynosi co najmniej 100 μg/ml. Ponadto wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania hormonu folikulinowego, jednostek α i/lub β oraz ich kompleksów bądź ich fragmentów, o stężeniu w pożywce przynajmniej na poziomie 15 μg/ml. W opisach patentowych EP1203813 (opublikowanym 2002.05.08) oraz EP0003642 (opublikowanym 1999.12.16) i EP0965639 (opublikowanym 1999.12.22) zostały przedstawione rozwiązania dotyczące konstrukcji atenuowanych pestiwirusów. Opisane rozwiązania dotyczą atenuowanych pestiwirusów charakteryzujących się tym, że ich aktywność enzymatyczna, obecna w glikoproteinie E ms zostaje usunięta, a także przedstawione zostały sposoby wytwarzania, zastosowania i detekcji atenuowanych pestiwirusów. Opis patentowy US5750383 (opublikowany 1998.05.12) opisuje rozwiązanie dotyczące klonowania w bakulowirusie. System klonowania opiera się na odzyskiwaniu markera przy wykorzystaniu niezbędnego do rozwoju genu gp64. W układzie tym gen niezbędny do replikacji wirusa, wzrostu i rozmnażania w hodowli komórkowej jest usuwany lub inaktywowany w genomie wirusa. Po wytworzeniu bakulowirusa pozbawionego tego genu, wirus jest namnażany w komórkach gospodarza, w których następuje ekspresja niezbędnego do rozwoju białka bądź jego homologu funkcjonalnego. W celu klonowania obcego genu do bakulowirusa zawierającego mutację, wirus zakaża dzikie komórki gospodarza

PL 201 132 B1 7 i te same komórki zostają transfekowane plazmidem zawierającym niezbędny do rozwoju gen lub jego funkcjonalny homolog, przyłączony do obcego genu, pod kontrolą wybranego promotora. Bakulowirus jest odzyskiwany dzięki niezbędnemu genowi przyłączonemu do obcego genu i jest zdolny do normalnego namnażania i ekspresji obcego genu. Rekombinowany odzyskany bakulowirus może być wykorzystany do ekspresji genu, kontroli biologicznej lub prezentacji obcego białka na powierzchni wirusa do wytwarzania szczepionek i przeciwciał. Opis patentowy US6461863 (opublikowany 2002.10.08) dotyczy szlaków modyfikacji glikozylacji komórek owadzich przy zastosowaniu wektorów bakulowirusowych. W rozwiązaniu tym przedstawione są różne wektory rekombinowanego bakulowirusa i owadzie komórki gospodarza, które zawierają przynajmniej jeden gen kodujący enzym biorący udział w procesach przekształcania oligosacharydów. Wektory i komórki mogą zawierać inne heterologiczne geny strukturalne, uwzględniając enzymy przekształcające białko. Przedstawione zostały sposoby wytwarzania i zastosowania rekombinowanych bakulowirusów i wektorów, uwzględniając ich zastosowanie w wytwarzaniu rekombinowanych białek oraz insektycydów. W opisie patentowym US6355240 (opublikowanym 2002.03.12) przedstawione jest rozwiązanie dotyczące wzmocnienia własności owadobójczych wirusa owadziego poprzez ekspresję heterologicznych białek z wczesnymi promotorami. Wynalazek ten odnosi się do rekombinowanych wirusów owadzich, takich jak bakulowirusy, czy też wirusy granuloz stosowanych jako insektycydy, oraz wektorów stosowanych wspólnie z wirusami wykorzystywanymi do ekspresji heterologicznych genów bądź ich fragmentów (korzystnie kodujących substancję kontrolującą lub substancję modyfikującą owady, taką jak toksynę owadzią) przyłączonych do wczesnego promotora. Opis patentowy US5965134 (opublikowany 1999.10.12) oraz EP0772632 (opublikowany 2001.10.04) opisują rozwiązania dotyczące immunogennej kompozycji przeciwko pestiwirusom, szczególnie CSFV, zwłaszcza niestrukturalnego białka p10, dokładniej epitopów rozpoznawanych przez komórki T z tego białka i cząsteczek kwasu nukleinowego kodującego te polipeptydy, szczepionek oraz zastosowania tych polipeptydów oraz cząsteczek kwasów nukleinowych w diagnostyce. Opisane powyżej badania znacznie poszerzyły wiedzę na temat CSFV i metod zapobiegania wywoływanym przez tego wirusa chorobom. W dalszym ciągu nie ma jednak preparatu, który mógłby być użyty do immunizacji przeciwko CSFV, a charakteryzowałby się bardzo dobrą zdolnością do wygenerowania ochronnej odpowiedzi immunologicznej i jednocześnie niską ceną pozwalającą na masowe szczepienia. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do wydajnej produkcji glikoproteiny E2 służącej do produkcji szczepionki przeciwko CSFV, a w szczególności przy wytwarzaniu podłoża wzrostowego komórek owadzich zakażonych rekombinantem bakulowirusowym eksprymującym glikoproteinę E2 wirusa klasycznego pomoru świń. Nieoczekiwanie realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z białkami powstającymi w komórkach na bazie egzogennego DNA zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, charakteryzujący się tym, że sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, charakteryzująca się tym, że sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny. Korzystnie, gdy sekwencja według wynalazku zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji przedstawionych na fig. 4 - fig. 9. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest bakulowirus zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, charakteryzujący się tym, że sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, charakteryzujący się tym, że sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji

8 PL 201 132 B1 sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny, do wytwarzania glikoproteiny E2 lub jej fragmentu. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania glikoproteiny E2, głównego antygenu wirusa klasycznego pomoru świń, charakteryzujący się tym, że komórki owadzie zakaża się rekombinantem bakulowirusowym AcNPV zawierającym gen wirusa klasycznego pomoru świń pod kontrolą promotora polihedryny, hoduje się zakażone komórki owadzie, usuwa się komórki przez wirowanie i wytrąca się glikoproteinę E2 z podłoża wzrostowego odczynnikami do wytrącania glikoprotein. Korzystnie, gdy sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że odczynnikiem do wytrącania glikoprotein jest siarczan amonu. Korzystnie, gdy sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że hodowlę komórek owadzich prowadzi się przez okres do 10 dni. Korzystnie, gdy gen kodujący glikoproteinę E2 zawiera sekwencje sygnałowe gp67 bakulowirusa, gg lub gd wirusa pseudowścieklizny pozwalające na eksport glikoproteiny do podłoża wzrostowego. Korzystnie, gdy gen kodujący glikoproteinę E2 został pozbawiony sekwencji kotwiczącej glikoproteinę w błonach komórkowych. Korzystnie, gdy komórki owadzie hodowane są na podłożu syntetycznym pozbawionym płodowej surowicy cielęcej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bakulowirusa zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, charakteryzujący się tym, że sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny do wytwarzania glikoproteiny E2 lub jej fragmentu. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu składającego się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, charakteryzujące się tym, że sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny, do wytwarzania szczepionki przeciwko CSFV. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu otrzymywanego sposobem wytwarzania glikoproteiny E2, głównego antygenu wirusa klasycznego pomoru świń, gdzie komórki owadzie zakaża się rekombinantem bakulowirusowym AcNPV zawierającym gen wirusa klasycznego pomoru świń pod kontrolą promotora polihedryny, hoduje się zakażone komórki owadzie, usuwa się komórki przez wirowanie i wytrąca się glikoproteinę E2 z podłoża wzrostowego odczynnikami do wytrącania glikoprotein do wytwarzania szczepionki przeciwko CSFV. Korzystnie, gdy zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że odczynnikiem do wytrącania glikoprotein jest siarczan amonu. Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku. Figura 1 przedstawia schemat plazmidu transferowego służący do klonowania genu E2. Figura 2 przedstawia analizę produkcji glikoproteiny E2 w hodowli komórek owadzich metodą Western blotting. Zdjęcie przedstawia błonę nitrocelulozową będącą repliką 10% żelu poliakrylamidowego, na który naniesiono: 1. całe komórki owadzie zakażone rekombinantem bakulowirusowym niosącym skrócony gen kodujący glikoproteinę E2; 2. frakcję cytoplazmatyczną tych samych komórek; 3. podłoże wzrostowe na którym hodowano komórki owadzie zakażone rekombinantem bakulowirusowym niosącym skrócony gen kodujący glikoproteinę E2; 4. całe komórki owadzie zakażone dzikim bakulowirusem. Western blotting przeprowadzono przy użyciu przeciwciał monoklonalnych reagujących z liniowym epitopem E2. Po stronie prawej umieszczone są masy cząsteczkowe wzorców barwnych służących do określania masy cząsteczkowej glikoproteiny E2. Figura 3 przedstawia reakcję antygenu E2 z surowicami poliklonalnymi uzyskanymi poprzez szczepienie zwierząt oczyszczonymi preparatami glikoproteiny E2 z odciętą sekwencją transmembranową. Zdjęcie przedstawia błonę nitrocelulozową będącą repliką 10% żelu poliakrylamidowego na który naniesiono komórki owadzie zakażone rekombinantem bakulowirusowym niosącym skrócony gen kodujący glikoproteinę E2 zebrane jak pokazano na górze rysunku 2, 3, 4, 5 dni od zakażenia rekombinantem. Lewy panel - rekombinant z sekwencją sygnałową gg, prawy panel - bez sekwencji sygna-

PL 201 132 B1 9 łowej. Na zewnętrznej prawej ścieżce preparat użyty do immunizacji zwierząt. Western blotting przeprowadzono przy użyciu monospecyficznej surowicy poliklonalnej. Figura 4 przedstawia sekwencję nukleotydową genu E2 z sekwencją wyprowadzającą i odpowiadającą im sekwencją aminokwasową, oznaczona GP67E2TM obejmuje skróconą formę E2 z sekwencją gp67. Figura 5 przedstawia sekwencję nukleotydową genu E2 z sekwencją wyprowadzającą i odpowiadającą im sekwencją aminokwasową, oznaczona GP67E2 obejmuje pełną formę E2 z sekwencją gp67. Figura 6 przedstawia sekwencję nukleotydową genu E2 z sekwencją wyprowadzającą i odpowiadającą im sekwencją aminokwasową, oznaczona GGE2TM obejmuje skróconą formę E2 z sekwencją gg. Figura 7 przedstawia sekwencję nukleotydową genu E2 z sekwencją wyprowadzającą i odpowiadającą im sekwencją aminokwasową, oznaczona GGE2 obejmuje pełną formę E2 z sekwencją gg. Figura 8 przedstawia sekwencję nukleotydową genu E2 z sekwencją wyprowadzającą i odpowiadającą im sekwencją aminokwasową, oznaczona GDE2TM obejmuje skróconą formę E2 z sekwencją gd. Figura 9 przedstawia sekwencję nukleotydową genu E2 z sekwencją wyprowadzającą i odpowiadającą im sekwencją aminokwasową, oznaczona GDE2 obejmuje pełną formę E2 z sekwencją gd. Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku. P r z y k ł a d 1 Produkcja rekombinowanej glikoproteiny E2. a) konstrukcja wektorów transferowych z sekwencjami sygnałowymi W celu zwiększenia ilości glikoproteiny E2 eksportowanej poza komórkę do podłoża wzrostowego, skonstruowano specjalne wektory transferowe, pochodne plazmidu pfastbac, gdzie od końca 5' miejsca wielokrotnego klonowania wprowadzono specjalne sekwencje sygnałowe. Sekwencje te oznaczone symbolami gg, gd i gp67 zostały wybrane na podstawie ich roli w wyprowadzaniu niektórych białek wirusowych poza komórkę naturalnego gospodarza. Poniżej podane są sekwencje nukleotydowe sekwencji sygnałowych i ich skład zasad DNA. Sekwencja sygnałowa gd: CTC AGA TCT AAA ATG CTG CTC GCA GCG CTA TTG GCG GCG CTG GTC GCC CGG ACG ACG CTC GGT GCG GAC GTG GAG GAT CCG TG Liczba zasad 83; skład 13A; 24C; 30G; 16T Sekwencja sygnałowa gg: GGC AGA TCT CAA CAA TGA AGT GGG CAA CGT GGA TTC TCG CCC TCG GGC TCC TCG TGG TCC GCA CCG TCG TGG CCG GAT CCG AGG Liczba zasad 84; skład 14A; 26C; 28G; 16T Sekwencja sygnałowa gp67: CGC AGA TCT CAA TGC TAC TAG TAA ATC AGT CAC ACC AAG GCT TCA ATA AGG AAC ACA CAA GCA AGA TGG TAA GCG CTA TTG TTT TAT ATG TGC TTT TGG CGG CGG CGG CGC ATT CTG CCT TTG CGG CGG AGC ACT GCA ACG CGC AAA TGA AGA CGG ATC CTG C Liczba zasad 163; skład 44A; 40C; 42G; 37T Sekwencje te zostały otrzymane w reakcji PCR przy zastosowaniu odpowiednich komplementarnych starterów (po 12 komplementarnych zasad od końca 5' i 3') i DNA organizmu zawierającego geny z sekwencjami sygnałowymi. Startery dodatkowo oprócz sekwencji komplementarnych zawierały sekwencje rozpoznawane przez wybrane enzymy restrykcyjne: sekwencje dla Bglll na starterze 5' i sekwencje dla BamHI na starterze 3'. Po przeprowadzeniu reakcji PCR, produkty reakcji były analizowane metodą elektroforezy agarozowej, prążki po wybarwieniu bromkiem etydyny były oświetlane promieniowaniem nadfioletowym w zakresie około 360 nm i analizowane wizualnie na transiluminatorze. Prążki odpowiadające właściwej masie cząsteczkowej były izolowane z żelu agarozowego i trawione enzymami restrykcyjnymi, które rozpoznawały sekwencje nukleotydowe wprowadzone na końcach 3' i 5'. Fragmenty trawione enzymami restrykcyjnymi były ponownie oczyszczane w celu usunięcia reagentów. Oczyszczone fragmenty były dodawane do mieszaniny ligacyjnej zawierającej, oprócz ligazy bakteriofaga T4 i odpowiedniego buforu reakcyjnego z ATP, również wektor transferowy pfastbac przecięty w miejscu wielokrotnego klonowania, tymi samymi enzymami restrykcyjnymi co klonowane fragmenty. Po całonocnej ligacji mieszaninę reakcyjną użyto do transformacji komórek bakterii Escherichia coli, korzystnie Escherichia coli DH5. Jako czynnik selekcyjny stosowano ampicylinę. Oporne na ampicylinę kolonie bakteryjne namnażano w hodowli płynnej z dodatkiem ampicyliny i izolowano DNA

10 PL 201 132 B1 plazmidowe z hodowli pochodzącej od każdej kolonii opornej na ampicylinę. Każdy z plazmidów poddawano dokładnej analizie restrykcyjnej. Plazmidy zawierające wklonowane fragmenty i niezmieniony plazmid wyjściowy były w końcowym etapie sekwencjonowane w celu potwierdzenia, że plazmid transferowy z sekwencją sygnałową posiada sekwencję nukleotydową całkowicie zgodną z przewidywaniami teoretycznymi. Schemat otrzymanych plazmidów transferowych z sekwencjami sygnałowymi pokazany jest na figurze 1, natomiast schematy sekwencji nukleotydowych genu E2 z sekwencjami wyprowadzającymi i odpowiadającymi im sekwencjami aminokwasowymi przedstawione są na figurach 4-9. b) konstrukcja rekombinanta bakulowirusowego niosącego gen E2 wirusa klasycznego pomoru świń Gen E2 (gp51-54) o pełnej długości został uzyskany metodą RT-PCR przy zastosowaniu genomu wirusa CSF jako matrycy. Został on wklonowany następnie do plazmidu wielokopiowego puc19. Aby otrzymać plazmid transferowy z wklonowanym genem E2, plazmid wielokopiowy zawierający pełen gen o wielkości 1500 par zasad został najpierw przecięty enzymem SalI w miejscu wielokrotnego klonowania i lepkie końce zostały wypełnione przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA Escherichia coli. Fragment kodujący gen E2 został wycięty z wektora plazmidowego poprzez przecięcie plazmidu enzymem KpnI w miejscu wielokrotnego klonowania po przeciwnej stronie insertu E2. Gen E2 wklonowano następnie do plazmidu transferowego. Fragment genu E2 o długości 1083 par zasad pozbawiony sekwencji kodującej C-terminalną część glikoproteiny został wycięty z plazmidu wielokopiowego enzymami KpnI i Scal. i wklonowany do plazmidu transferowego w ten sam sposób jak gen o pełnej długości. Po ligacji plazmid pfastbac1 z wklonowanym skróconym genem E2 został użyty do konstrukcji rekombinanta bakulowirusowego metodą stosowaną w systemie Bac-to-Bac. W tym celu do 100 μl komórek kompetentnych Escherichia coli DH10Bac dodawano 5 μl oczyszczonego DNA plazmidu transferowego z wklonowanym obcym genem. Po inkubacji w lodzie przez 30 min, przeprowadzono szok termiczny, dodano 1 ml świeżej pożywki wzrostowej i hodowano bakterie przez 2 godz. Następnie komórki transformowane wysiano na podłoże selekcyjne zawierające kanamycynę, gentamycynę, tetracyklinę oraz substrat dla galaktozydazy X-gal i IPTG. Po inkubacji przez noc wyizolowano białe kolonie i hodowano bakterie na podłożu z kanamycyną i gentamycyną. Z bakterii wyizolowano DNA bakmidowe zawierające gen E2 po transpozycji i użyto je do transfekcji komórek owadzich Spodoptera frugiperda Sf21 przy użyciu lipofektyny. Transfekowane komórki owadzie hodowano przez 72 godz., a następnie izolowano rekombinanta. W celu stwierdzenia produkcji glikoproteiny E2 w komórkach owadzich w pierwszych etapach po transfekcji, przeprowadzano reakcję IPMA (immunoperoxidase monolayer assay). Reakcja ta jest podobna do reakcji immunoblottingu, jednak kolejne etapy reakcji IPMA są prowadzone in situ w zakażonych komórkach. Hodowle jednowarstwowe zakażone odpowiednim rekombinantem utrwalano zimnym metanolem. Po usunięciu metanolu komórki przemyto buforem PBS a następnie inkubowano je z przeciwciałami monoklonalnymi anty-e2 sprzężonymi z peroksydazą chrzanową. Nadmiar przeciwciał odpłukano i dodano substraty dla peroksydazy: nadtlenek wodoru i 3-amino-9-etylokarbazol. Komórki w których następowała synteza antygenu barwią się na czerwono. W kolejnym etapie sprawdzano lokalizację glikoproteiny E2 podczas hodowli komórek owadzich zakażonych rekombinantami bakulowirusowymi. Komórki owadzie Spodoptera frugiperda linii Sf21 hodowano na podłożu z dodatkiem bydlęcej surowicy płodowej lub na podłożu całkowicie syntetycznym. Komórki owadzie zakażano odpowiednim rekombinantem przy wielokrotności zakażenia około 10. Po 3-5 dniach od zakażenia odwirowywano komórki owadzie i frakcjonowano na frakcję błonową i cytoplazmatyczną, oraz izolowano również glikoproteinę E2 z syntetycznego podłoża wzrostowego. Białka frakcji błonowych i cytoplazmatycznych, oraz podłoże wzrostowe uzyskane po zakażeniu rekombinantami bakulowirusowymi analizowano na 10% żelach poliakryloamidowych w obecności siarczanu dodecylu. Elektroforezę prowadzono według metody Laemmli (Laemmli, U.K., Nature; 1970; 227; 680-685) i barwiono je błękitem Coomassie. Analizę antygenów metodą Western blotting prowadzono według Towbina i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1979; 76, 4350-4354. Transfer białek wykonywano na błony nitrocelulozowe lub błony z fluorku poliwinylidenu. Do detekcji stosowano przeciwciała związane z alkaliczną fosfatazą. Uzyskane glikoproteiny na żelach poliakryloamidowych dawały dość rozmyte prążki co jest charakterystyczne dla glikoprotein występujących więcej niż w jednej glikoformie. Masa cząsteczkowa głównego prążka glikoproteiny o pełnej długości syntetyzowanej w komórkach owadzich wynosi ponad 50 kd i jest zbliżona do masy cząsteczkowej natywnej glikoproteiny syntetyzowanej w komórkach

PL 201 132 B1 11 ssaczych (51-54 kd). Glikoproteina E2 pełnej długości gromadzi się w komórkach owadzich głównie w strukturach błonowych komórki i nie jest transportowana na zewnątrz do podłoża wzrostowego. Pełnej długości białko syntetyzowane przez rekombinanta BacE2(TM + ) zostało wykorzystane do otrzymania monospecyficznej, poliklonalnej surowicy przeciwko glikoproteinie E2. Do uzyskania wysoce oczyszczonego białka, potrzebnego do immunizacji królika zastosowano metodę elucji z repliki żelu poliakrylamidowego na błonie PVDF (Szewczyk, B., Summers, D.F., Anal.Biochem., 1988; 168; 48-53). Uzyskano surowicę poliklonalną anty-e2 dobrze reagującą z bakulowirusowym produktem genu E2 i z natywną glikoproteiną E2. Drugi rekombinant BacE2(TM ) zawiera skróconą formę genu (1100 pz). Usunięty rejon odpowiada C-terminalnej części glikoproteiny E2, która nie posiada żadnej determinanty antygenowej. Celem modyfikacji polegającej na dodaniu sekwencji sygnałowych i usunięciu części C-terminalnej było uzyskanie produktu białkowego efektywnie transportowanego z komórki do pożywki. Transport do podłoża wzrostowego czyni produkt łatwiej dostępnym do ewentualnych izolacji. Ilość syntetyzowanego, skróconego białka E2 blisko trzykrotnie przekroczyła ilość eksprymowanego białka E2 pełnej długości. Skrócona glikoproteina E2 tworzy homodimery co świadczy o właściwym fałdowaniu glikoprotein. Masa cząsteczkowa skróconej formy białka E2 wynosi 45-47 kd. Jest ono efektywnie transportowane do podłoża wzrostowego (fig. 2). P r z y k ł a d 2 Własności immunogenne skróconej glikoproteiny E2. Pełnej długości białko E2 syntetyzowane po zakażeniu komórek owadzich przez rekombinanta BacE2(TM + ) i skrócone białko E2 syntetyzowane po zakażeniu rekombinantem BacE2(TM ) zostało wykorzystane do otrzymania monospecyficznych, poliklonalnych surowic przeciwko glikoproteinie E2. Do uzyskania wysoce oczyszczonego białka, potrzebnego do immunizacji królika zastosowano metodę elucji z repliki żelu poliakrylamidowego na błonie z fluorku poliwinylidenu - PVDF (Szewczyk, B., Summers, D.F., Anal.Biochem., 1988; 168; 48-53). W tym celu komórki owadzie Spodoptera frugiperda linii Sf21 hodowano na podłożu całkowicie syntetycznym. Zakażano je odpowiednim rekombinantem przy wielokrotności zakażenia około 10. Po 4 dniach od zakażenia odwirowywano komórki owadzie i frakcjonowano na frakcję błonową i cytoplazmatyczną, oraz izolowano również glikoproteinę E2 z syntetycznego podłoża wzrostowego. Frakcję błonową w przypadku rekombinanta pełnej długości BacE2(TM + ) lub podłoże wzrostowe po hodowli komórek owadzich zakażonych rekombinantem Bac- E2(TM ) nanoszono na 10% żel poliakryloamidowy. Po zakończeniu rozdziału elektroforetycznego wykonano replikę żelu na błonie z fluorku poliwinylidenu (PVDF) stosując aparat do transferu mokrego i prowadząc transfer przez noc w temperaturze pokojowej przy 30V. Błonę po transferze barwiono odwracalnie czerwienią Ponceau i ołówkiem zaznaczano pozycję glikoproteiny E2 pełnej lub skróconej. Prążki glikoproteiny E2 wycinano precyzyjnie małymi nożyczkami nie dopuszczając do wysuszenia błony. Wycięte prążki umieszczano w probówce Eppendorfa i zalewano je małą ilością roztworu eluującego (2% siarczan dodecylu/1% Triton X-100 w buforze o ph 7,0). Po kilkunastu minutach wytrząsania odwirowano błonę i zebrano roztwór eluujący. Procedurę elucji powtórzono jeszcze raz i do połączonych eluatów dodano 4 objętości acetonu. Po 12 godzinach w -20 C osad odwirowano. Ilość czystego białka w osadzie oszacowano wobec wzorca białkowego (albuminy krwi bydlęcej) nanosząc małą część osadu pobranego z jednorodnej zawiesiny w wodzie na 10% żel poliakryloamidowy i przeprowadzeniu elektroforezy w obecności siarczanu dodecylu. Żel barwiono błękitem Coomassie. Pozostała część osadu została użyta jako antygen do szczepienia królików. Immunizację królików przeprowadzono poprzez dwukrotne szczepienie antygenem w ilości około 100 μg. Pierwsze szczepienie wykonane było śródskórnie emulsją antygenu i pełnego adjuwantu Freunda. Emulsję otrzymano przez krótką 30-sekundową sonifikację mieszaniny antygenu (0,5 ml w wodzie) i adjuwantu (0,5 ml). Po 4 tygodniach wykonano ponowne szczepienie emulsją otrzymaną z zawiesiny antygenu (100 μg w 0,5 ml wody) i niepełnego adjuwantu Freunda. Szczepienie to zostało wykonane podskórnie. Po kolejnych 4 tygodniach pobrano krew zwierzęcia i wyizolowano surowicę. Uzyskane w ten sposób surowice poliklonalne anty-e2 dobrze reagowały z bakulowirusowym produktem genu E2 i z natywną glikoproteiną E2 zarówno w reakcji IPMA jak i Western blotting (fig. 3). Nie stwierdzono różnic w reaktywności surowic niezależnie od tego czy użyty był pełny antygen E2 czy też skrócony produkt, który zawierał sekwencje wyprowadzające glikoproteinę E2 do podłoża wzrostowego.

12 PL 201 132 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, przy czym sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny. 2. Sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, przy czym sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny. 3. Sekwencja według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji przedstawionych na fig. 4 - fig. 9. 4. Bakulowirus zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, przy czym sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny. 5. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, przy czym sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny, do wytwarzania glikoproteiny E2 lub jej fragmentu. 6. Sposób wytwarzania glikoproteiny E2, głównego antygenu wirusa klasycznego pomoru świń znamienny tym, że komórki owadzie zakaża się rekombinantem bakulowirusowym AcNPV zawierającym gen wirusa klasycznego pomoru świń jak określono w zastrz. 2 pod kontrolą promotora polihedryny, hoduje się zakażone komórki owadzie, usuwa się komórki przez wirowanie i wytrąca się glikoproteinę E2 z podłoża wzrostowego odczynnikami do wytrącania glikoprotein. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że odczynnikiem do wytrącania glikoprotein jest siarczan amonu. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hodowlę komórek owadzich prowadzi się przez okres do 10 dni. 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że gen kodujący glikoproteinę E2 zawiera sekwencje sygnałowe gp67 bakulowirusa, gg lub gd wirusa pseudowścieklizny pozwalające na eksport glikoproteiny do podłoża wzrostowego. 10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że gen kodujący glikoproteinę E2 został pozbawiony sekwencji kotwiczącej glikoproteinę w błonach komórkowych. 11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że komórki owadzie hodowane są na podłożu syntetycznym pozbawionym płodowej surowicy cielęcej. 12. Zastosowanie bakulowirusa zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd składający się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, przy czym sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny do wytwarzania glikoproteiny E2 lub jej fragmentu. 13. Zastosowanie polipeptydu składającego się z sekwencji sygnałowej oraz sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 lub jej fragmentu, przy czym sekwencja sygnałowa została wybrana spośród sekwencji sygnałowej gp67 bakulowirusa, sekwencji sygnałowej gg lub gd wirusa pseudowścieklizny, do wytwarzania szczepionki przeciwko CSFV. 14. Zastosowanie polipeptydu otrzymywanego sposobem wytwarzania glikoproteiny E2, głównego antygenu wirusa klasycznego pomoru świń jak określono w zastrz. 2, gdzie komorki owadzie zakaża się rekombinantem bakulowirusowym AcNPV zawierającym gen wirusa klasycznego pomoru świń pod kontrolą promotora polihedryny, hoduje się zakażone komórki owadzie, usuwa się komórki przez wirowanie i wytrąca się glikoproteinę E2 z podłoża wzrostowego odczynnikami do wytrącania glikoprotein do wytwarzania szczepionki przeciwko CSFV. 15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienny tym, że odczynnikiem do wytrącania glikoprotein jest siarczan amonu.