Ćwiczenie 1. Izolacja białek cytoplazmatycznych i jądrowych. Oznaczanie białka metodą Bradforda. Wymagane zagadnienia teoretyczne: Naturalne peptydy, ich funkcje biologiczne Poziomy uporządkowania przestrzennego białek fibrylarnych i globularnych; Charakterystyka wiązań stabilizujących struktury przestrzenne białek Kryteria podziału białek Przedstawiciele białek fibrylarnych i globularnych MATERIAŁ DO BADAŃ Jako materiał do badań wykorzystano następujące typy komórek nowotworowych (A549 niedrobnokomórkowy rak płuc, RK33 rak krtani, TE671 rdzeniak) 1.1. IZOLACJA BIAŁEK CYTOPLAZMATYCZNYCH I JĄDROWYCH Pellet komórek nowotworowych zawiesić w 70 l buforu lizującego RIPA. W celu uzyskania jednorodnego homogenatu zawiesinę komórkową mieszać przy użyciu worteksu przez minimum 20 sekund a następnie odstawić na 5 minut do łaźni lodowej. Czynność tą powtórzyć pięciokrotnie. Liza komórek w łaźni lodowej zapobiega degradacji białek. Uzyskany lizat komórkowy wirować 8000xg 10min 4 o C. Po zakończeniu wirowania pobrać 2,5 l supernatantu i przenieść go do nowego eppendorfa (B) w celu oznaczenia białka metodą Bradforda (patrz punkt 1.2). Pozostałość po wirowaniu (jądra i cytoplazma) użyć do ćwiczenia 2. W tym celu dodać do eppendorfa 17 l buforu próbkowego (Buforu Laemmli) i dobrze wymieszać przy użyciu worteksu. Zawartość zebrać na dnie eppendorfa poprzez krótkie wirowanie i zamrozić. 1.2. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA METODĄ BRADFORDA Do eppendorfa (B) zawierającego 2,5 l badanego supernatantu dodać wodę destylowaną do objętości 800 l. Następnie dodać 200 l odczynnika Bradford a, zworteksować i inkubować 10 min w lodzie. Pomiar białka wykonać przy długości fali λ=595nm wobec próby kontrolnej (zawierającej 800 l wody destylowanej + 200 l odczynnika Bradford a). Uzyskany wynik odnieść do krzywej wzorcowej uwzględniając przy obliczeniach rozcieńczenie próbki. Wyjaśnienie W metodzie Bradforda wykorzystywana jest zdolność wiązania się barwnika zwanego błękitem kumazyny (ang. Coomassie Brilliant Blue G-250) z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem reagują głownie reszty argininy, a w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, proliny, tryptofanu i tyrozyny. W środowisku kwaśnym (w roztworze kwasu H 3 PO 4 ) błękit kumazyny przyjmuje zabarwienie brunatne. Dodanie błękitu kumazyny do roztworu białka powoduje powstawanie kompleksu o intensywnie niebieskim zabarwieniu i przesunięcie maksimum absorbancji barwnika z 465nm do 595nm. Kompleks barwnik-białko jest trwały i nie agreguje w roztworze przez stosunkowo długi czas (do 60 minut). Natężenie barwy niebieskiej jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. Zaletami metody są prostota i szybkość wykonania, oraz jej czułość (białko może być wykryte przy jego stężeniu w granicach
2-8 mg/ml). Oznaczenie można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, wersenianu sodu (EDTA), jonów magnezu, sacharozy, glikolu i związków tiolowych. Wadą metody jest rożne wiązanie barwnika przez rożne białka, a ponadto fakt, że aceton, siarczan dodecylu sodu (SDS) i Triton X-100 dają w połączeniu z barwnikiem dodatkowy interferujący kolor, co zwiększa natężenie barwy niebieskiej i przeszkadza w uzyskaniu wiarygodnych wyników. Ćwiczenie 2. Elektroforeza SDS-PAGE białek i Western blotting. Wymagane zagadnienia teoretyczne: Właściwości fizyko-chemiczne białek. Metody stosowane do izolowania, frakcjonowania i oznaczania masy cząsteczkowej białek. Elektroforeza jest to ruch naładowanych cząstek w polu elektrycznym do przeciwnie naładowanych elektrod. Białka obdarzone ładunkiem przemieszczają się w polu elektrycznym w kierunku elektrody przeciwnie naładowanej. Elektroforezę można przeprowadzić na dwa sposoby. Wyróżniamy: elektroforezę swobodną i na stałych nośnikach nasyconych buforem. Ten drugi typ elektroforezy jest bardziej popularny. Jako nośniki mogą być wykorzystywane paski bibuły, naturalne żele skrobiowe i agarozowe lub z żele syntetyczne np.: żel poliakrylamidowy o dużej sile rozdzielczej. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym wykorzystuje wielkość ładunków elektrycznych cząsteczek białka przy jednoczesnym działaniu nośnika jako sita molekularnego. Rozdzielone elektroforetycznie białka przenosi się na membranę wiążącą białka np. nitrocelulozową lub z fluorku poliwinylidenu (PVDF). Technikę tą określa się mianem Western-blotting. Transfer ma na celu lepszą identyfikację cząsteczek technikami immunodetekcji oraz ułatwienie pracy ponieważ membrana jest bardziej odporna na uszkodzenia mechaniczne niż żel. Elektrotransfer polega na przeniesieniu ujemnie naładowanych białek z żelu na membranę, pod wpływem przyłożonego napięcia prądu. Białka migrują w kierunku dodatniej elektrody i zostają zatrzymane na membranie umieszczonej za żelem. Białka, w postaci rozdzielonych prążków na różnych poziomach, są precyzyjnie przeniesione na membranę dając lustrzany obraz rozdzielonych w żelu białek. Membranę z przeniesionymi na nią białkami należy wysycić w celu zablokowania miejsc niespecyficznego wiązania przeciwciał. Najczęściej stosowanym roztworem wysycającym jest 5% odtłuszczone mleko w odpowiednim roztworze (np. TBS lub PBS z dodatkiem detergentu Tween-20). Innym roztworem jest alkohol poliwinylowy lub gotowe odczynniki oferowane przez firmy biotechnologiczne. Wysycaną w ten sposób membranę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym mającym wysokie powinowactwo do badanego białka. Po odpłukaniu nadmiaru przeciwciał membranę inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym, mającym powinowactwo do globuliny zwierzęcia z którego pochodzi przeciwciało pierwszorzędowe. Przeciwciało drugorzędowe związane jest z enzymem (HRP, AP), który po dodaniu odpowiedniego substratu przekształca go w barwny produkt. W efekcie na membranie, w miejscu gdzie znajduje się badane białko, pojawia się barwny prążek. 2.1 PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ELEKTROFOREZY Badaną próbkę zawierającą wyizolowane białka zawieszone w buforze próbkowym (patrz ćwiczenie 1) zdenaturować przez ogrzanie w termobloku (10 min, temp. 95 o C).
Wyjaśnienie Odpowiednie przygotowanie próbek jest równie ważne jak sama polimeryzacja żeli poliakrylamidowych. Najistotniejszymi składnikami buforu próbkowego Laemli są detergent SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu) i β-merkaptoetanol. Ten ostatni denaturuje białka poprzez redukcję reszt tiolowych, co prowadzi do rozerwania mostków disulfidowe stabilizujących strukturę trzeciorzędową białka. Następnie SDS wiąże się do hydrofobowych regionów zdenaturowanego białka, maskuje ich ładunek i nadaje im swój. Powstające micele białkowe mają ujemny ładunek elektrostatyczny, proporcjonalny do ich masy cząsteczkowej. Umożliwia to rozdział białek zgodnie z ich masami cząsteczkowymi. Zastosowany w buforze próbkowym glicerol obciąża próbkę, dzięki czemu łatwo ją wprowadzić do studzienek żelu. Dodatkowo zastosowanie w buforze błekitu bromofenolowego zabarwia próbkę dzięki czemu można ją obserwować podczas nanoszenie na żel. Eliminuje to możliwość pomyłkowego naniesienia dwóch lub więcej próbek na tę samą ścieżkę rozdziału. Jednocześnie barwnik może informować o właściwej wartości ph w próbce. 2.2 PRZYGOTOWANIE ŻELI POLIAKRYLAMIDOWYCH Przygotowanie żelu poliakrylamidowego polega na polimeryzacji monomerów akrylamidu z tworzącym wiązania krzyżowe N,N metylenobisakrylamidem zmieszanych ze sobą w odpowiednich proporcjach w obecności nadsiarczanu amonu i czterymetyloetylodwuaminy (TEMED) jako katalizatorów w buforze o odpowiednim ph. 2.3 ELEKTROFOREZA SDS-PAGE W celu przeprowadzenia elektroforezy aparat do elektroforezy należy wypełnić buforem elektrodowym (Tris glicyna ph 8,3) i umieścić w nim płytki z żelem. Do studzienki żelu wprowadzić ostrożnie 20 l badanej próby. Dodatkowo na jeden slot nałożyć 5-7ul wzorca. Elektroforezę należy prowadzić przy napięciu stałym 160V przez 40 minut. Po dojściu barwnika do końca żelu wyłączyć zasilanie prostownika i wyjąć płytki z aparatu Barwienie żelu: 1. Żel umieścić w porcelanowej kuwecie, zalać wodą destylowaną (około 150-200ml) 2. Podgrzać w mikrofalówce do wrzenia, mieszać na kołysce 1-2min, płyn odlać 3. Zalać żel barwnikiem (page blue protein stain), podgrzać w mikrofalówce do wrzenia, mieszać na kołysce 5min, barwnik zlać do naczynia celem ponownego wykorzystania (max 3 razy) 4. Zalać kuwetę wodą i postępować jak w p. 1. Czynność powtórzyć jeżeli tło żelu nie odbarwiło się. 2.4 WESTERN-BLOTTING - PRZYGOTOWANIE ŻELU I MEMBRANY
Po zakończonej elektroforezie drugi żel umieścić w buforze Semi-dry i inkubować minimum 5 minut. Buffor Semi-dry przygotować bezpośrednio przed użyciem przez dodanie 1/5 objętości metanolu (200ml buforu + 50ml metanolu). W tym czasie przygotować membranę PVDF. Przygotowanie polega na inkubacji membrany w trzech kolejno wymienionych roztworach: 1. Metanol 20 sekund 2. Woda destylowana 2 minuty 3. Bufor Semi dry minimum 5 min 2.5 WESTERN- BLOTTING W celu przeprowadzenia elektrotransferu żel wraz z przyciętą membraną PVDF i bibułą filtracyjną umieścić w aparacie do transferu wg schematu (rys 1). Transfer prowadzić przy stałym napięciu 24V przez 40min. Po zakończonym transferze membranę wybarwić czerwienią Ponceau S (maksymalny czas barwienia 5min) w celu identyfikacji przejścia białek z żelu na membranę. Barwnik Ponceau nadaje się do powtórnego użycia, nie wylewać! Odpłukać nadmiar barwnika z membrany poprzez 2-3 szybkie zmiany wody destylowanej. Na koniec membranę płukać w roztworze TBS a następnie zawinąć w folię spożywczą i zamrozić. Rys 1. Schemat transferu wykonanego techniką półsuchą Ćwiczenie 3. Immunodetekcja białek na membranie Wymagane zagadnienia teoretyczne: Cechy charakteryzujące enzymy jako biokatalizatory Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych 3.1 REAKCJA Z PRZECIWCIAŁEM I RZĘDOWYM Otrzymaną (wyblokowaną wcześniej w roztworze TBS z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka oraz detergentu Tween- 20) membranę PVDF płukać w roztworze TBST (TBS z dodatkiem Tween-20) trzy razy po 5 minut (naczynie z tworzywa sztucznego). Następnie membranę inkubować 40 minut w roztworze 5% mleka/tbst zawierającym przeciwciało I rzędowe skierowane przeciwko β-aktynie.
3.2 REAKCJA Z PRZECIWCIAŁEM II RZĘDOWYM Odpłukać nadmiar przeciwciała I rzędowego poprzez 3 krotną kąpiel membrany w roztworze TBST (3 razy po 5 minut) (naczynie z tworzywa sztucznego). Następnie inkubować 40 minut membranę w roztworze 5% mleka/tbst zawierającym antymysie przeciwciało II rzędowe specyficzne dla użytego wcześniej p-ciała I rzędowego. Ponownie 3-krotnie przepłukać membranę w roztworze TBST i przystąpić do etapu detekcji na membranie (punkt 3.3) Przeciwciało II rzędowe znakowane jest enzymem (sprzężone z peroksydazą chrzanową) i w miejscu jego przyłączenia się do membrany pojawia się barwny produkt reakcji enzymu z chromogenem (DAB). 3.3 DETEKCJA NA MEMBRANIE PRZY UŻYCIU DIAMINOBENZYDYNY (DAB) Membranę umieścić w szklanej szalce Petriego. Do 20ml przygotowanego roztworu DAB dodać na świeżo 5 l 30% H 2 O 2. W roztworze tym inkubować membranę do momentu pojawienia się brązowych prążków, max 30min. Gdy reakcja barwna nie zachodzi w ciągu pierwszych minut dodać koleje 5μl perhydrolu. Następnie zatrzymać reakcję enzymatyczną poprzez kilkukrotne przepłukanie membrany w wodzie destylowanej. Ćwiczenie 3a Oddzielenie hemoglobiny od błękitu metylenowego na sicie molekularnym typu Sephadex G-25. Metoda sączenia molekularnego (Filtracja żelowa) pozwala na rozdział białek na podstawie wielkości ich cząsteczek. Rozdział przeprowadza się na kolumnach wypełnionych porowatymi, silnie uwodnionymi ziarnami żelu dekstranowego (np. Sephadex) lub żelu poliakrylamidowego o określonych rozmiarach porowatości (tzw. sita molekularne). Stan żelu i rozmiary określa tzw. indeks retencji wody podający ilość wody zaadsorbowanej przez 1 g. żelu. Wyższa wartość tego indeksu wskazuje, że żel zatrzymuje większe cząsteczki. Małe cząsteczki wnikają w pory w ziarnach żelu i znajdują się w płynie o większej objętości, natomiast duże cząsteczki wędrują pomiędzy ziarnami i wypływają z kolumny szybciej. Sączenie molekularne można wykorzystać (po wykalibrowaniu kolumny) do oceny masy cząsteczkowej nieznanych białek lub do usuwania z roztworów białek związków drobnocząsteczkowych. Cel ćwiczenia: Zastosowanie sączenia molekularnego do rozdziału białek od innych związków. Wykonanie: Kolumny o średnicy 1,5 cm i długości 30 cm wypełnia się zawiesiną Sephadex G 25 w 0,05 M. NaCl tak, aby poziom płynu nie obniżył się poniżej osiadającego żelu. Kolumnę napełnia się do wysokości około 25cm. Studenci otrzymują przygotowane kolumny. Przygotowanie mieszaniny błękitu metylenowego z hemoglobiną: Pipetą Pasteura pobrać do probówki 2 krople hemoglobiny i 2 krople błękitu metylenowego. Dokładnie wymieszać.
Po otwarciu wypływu kolumny, kiedy poziom płynu zrówna się z krążkiem bibuły (nie pozwolić aby powietrze dostawało się pod krążek) na krążek bibuły nanieść pipetą Pasteura 1 kroplę uprzednio przygotowanej mieszaniny błękitu metylenowego z hemoglobiną. Kiedy nałożona mieszanina wsiąknie w bibułę kroplami ostrożnie dodawać roztwór 0,05 M NaCl aby ilość płynu nad krążkiem bibuły wynosiła około 2.0 cm. Następnie prowadzić elucję wprowadzając na kolumnę roztwór 0,05 M NaCl porcjami po 2-3 ml aż do całkowitego wypływu obu naniesionych związków. Wyjaśnienie: Rozdzielenie nałożonych substancji obserwuje się w miarę ich przepływu przez kolumnę. W odróżnieniu od wielkocząsteczkowej hemoglobiny związek o niskim ciężarze cząsteczkowym błękit metylenowy wnika w małe pory ziaren Sephadexu i dlatego jego przepływ przez kolumnę jest znacznie wolniejszy niż hemoglobiny.