Oddział Gastroenterologii i Hematologii Szpitala Wojewódzkiego w Opolu 2

PRACE ORYGINALNE Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 37 43 ISSN 1230 025X MARCIN WÓJTOWICZ 1, LIDIA CISZAK 2, DARIUSZ WOŁOWIEC 3, IRENA FRYDECKA 2, 3, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI 1 Znaczenie rokownicze ekspresji p27 Kip1 oraz spontanicznej apoptozy limfocytów przewlekłej białaczki limfocytowej B komórkowej w niskim i pośrednim stadium zaawansowania klinicznego Prognostic significance of expression of p27 Kip1 and spontaneous apoptosis of lymphocytes of patients with B cell chronic lymphocytic leukemia on low and intermediate Rai stage 1 Oddział Gastroenterologii i Hematologii Szpitala Wojewódzkiego w Opolu 2 Laboratorium Immunopatologii Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu 3 Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu Streszczenie Wprowadzenie. Do istotnych cech biologii limfocytów przewlekłej białaczki limfocytowej B komórkowej (CLL) należy wysoka wewnątrzkomórkowa ekspresja białka inhibitorowego cyklu komórkowego p27 Kip1 oraz spontanicz na apoptoza in vitro. Znaczenie rokownicze tych zjawisk, szczególnie u pacjentów z chorobą w niskim i pośrednim stadium zaawansowania klinicznego, nie jest jednak wciąż wyjaśnione. Cel pracy. Ocena wartości rokowniczej wewnątrzkomórkowej ekspresji p27 Kip1 w limfocytach krwi obwodowej CLL pacjentów z chorobą na niskim i pośrednim stadium zaawansowania klinicznego, ich spontanicznej apopto zy w 72 godzinnej hodowli oraz ekspresji markera powierzchniowego CD38. Materiał i metody. Zbadano 52 pacjentów z nieleczoną CLL w stadium zaawansowania klinicznego 0, I i II we dług Rai. Ekspresję białka p27 Kip1 oraz antygenu CD38 na limfocytach krwi obwodowej oznaczono cytofluorome trycznie, a ich apoptozę spontaniczną po 72 godzinnej hodowli metodą TUNNEL. Wyniki. Podczas średnio 22,9 miesięcznej obserwacji stwierdzono większą częstość zmiany stadium klinicznego i statystycznie nieznamiennie podwojenie się limfocytozy krwi obwodowej u pacjentów wykazujących wysoką ekspresję p27 Kip1 lub ekspresję antygenu CD38 na limfocytach krwi obwodowej. Nie wykazano związku tych wskaźników z danymi klinicznymi i hematologicznymi pacjentów podczas badania ani też znaczenia rokownicze go odsetka limfocytów ulegających spontanicznej apoptozie. Wnioski. Zarówno wysoka wewnątrzkomórkowa zawartość p27 Kip1, jak i ekspresja CD38 na limfocytach krwi ob wodowej pacjentów z CLL w niskim i pośrednim stopniu zaawansowania klinicznego wykazuje związek z więk szą dynamiką choroby ocenianą prawdopodobieństwem ewolucji do wyższego stadium zaawansowania kliniczne go i prawdopodobnie też szybkością zwiększania się limfocytozy krwi obwodowej (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 37 43). Słowa kluczowe: przewlekła białaczka limfocytowa, p27 Kip1, apoptoza, CD38, czynniki rokownicze. Abstract Introduction. Previous studies showed that peripheral blood lymphocytes of B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) displayed a high intracellular level of cell cycle inhibitory protein p27 Kip1 and a spontaneuos apoptosis in vi tro, but prognostic significance of those biologic features, especially in patients with low and intermediate CLL stage has not been fully determined. Praca została wykonana w ramach grantu KBN nr 4P05B 073 16.

38 M. WÓJTOWICZ et al. Objectives. The aim of the study was to evaluate a prognostic value of intracellular expression of p27 Kip1 in peri pheral blood lymphocytes of low and intermediate stage CLL patients, their spontaneous apoptosis in 72 hours cul ture as well as the expression of surface marker CD38. Material and methods. 52 patients with previously untreated CLL in 0, I and II Rai stage were included in the stu dy. Expression of p27 Kip1 and CD38 was determined by flow cytometry, and spontaneous apoptosis in 72 hours cul ture by TUNNEL method. Results. During an observation period of in average 22,9 months we have found higher prevalence of Rai stage progression, and, in statistically non significant manner, of doubling of peripheral lymphocyte count, in patients with high cellular content of p27 Kip1 or with CD38 positivity. We could not find relationship between those para meters and initial clinical or biological parameters, nor we stated prognostic significance of the percentage of lym phocytes undergoing spontaneous apoptosis. Conclusions. Both high intracellular expression of p27 Kip1 and CD38 expression in peripheral blood lymphocytes in CLL patients with low or intermediate grade may be related to higher clinical agresiveness of the disease as as sessed by the probability of progression to higher Rai stage and probably also by the higher increase of peripheral lymphocyte number (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 37 43). Key words: chronic lymphocytic leukemia, p27 Kip1, apoptosis, CD38, prognostic factors. Przewlekła białaczka limfocytowa B komór kowa (B cell chronic lymphocytic leukemia CLL) jest chorobą, w której, w następstwie zaha mowania apoptozy, dochodzi do akumulacji ko mórek o morfologii przypominającej małe dojrza łe limfocyty wykazujące charakterystyczny immu nofenotyp CD5 + /CD19 + oraz CD23 + [1, 2]. U znacznej części pacjentów, będących w począt kowych stadiach choroby (0 II według Rai), cho roba ma przebieg skąpo lub bezobjawowy i sta bilny oraz nie wymaga leczenia cytostatycznego. Niekiedy ma jednak przebieg progresywny wyma gający rozpoczęcia chemioterapii. Do najważniej szych czynników rokowniczych w tej chorobie na leży stadium zaawansowania według klasyfikacji Rai lub Bineta, czas podwajania się populacji lim focytów krwi obwodowej, typ nacieczenia szpiku kostnego, surowicze stężenie β 2 mikrobuliny i roz puszczalnego antygenu CD23 oraz aktywność ki nazy tymidylowej [3, 4]. Do nowszych czynników rokowniczych nale ży ekspresja antygenu powierzchniowego CD38 oraz obecność i rodzaj mutacji somatycznej w ge nie regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immu noglobuliny [5 9]. W poszukiwaniu czynników prognostycznych pozwalających przewidywać przebieg CLL zwrócono ostatnio uwagę na białko wewnątrzkomórkowe p27 Kip1 należące do rodziny inhibitorów kinaz cyklinozależnych (cdk). Kinazy te odgrywają kluczową rolę w regulacji aktywno ści podziałowej komórek, gdyż aktywowane na różnych etapach cyklu mitotycznego fosforylują różnorodne białka wewnątrzkomórkowe zaanga żowane w aktywności proliferacyjnej i warunkują tym samym prawidłowy przebieg poszczególnych faz cyklu mitotycznego. Białko p27 Kip1, będąc in hibitorem aktywnych kompleksów cdk z ich pod jednostkami regulacyjnymi zwanymi cyklinami, ma własności antyproliferacyjne, a ponadto ucze stniczy, w wyniku działania niewyjaśnionych me chanizmów, w regulacji apoptozy [10 16]. Obni żoną ekspresję p27 Kip1, wynikającą ze wzmożonej proteolizy, wykazano w licznych nowotworach na rządowych [10, 17]. W komórkach CLL ekspresja p27 Kip1 jest natomiast wysoka, a opublikowane do tychczas nieliczne badania sugerują, że podwyż szona zawartość komórkowa p27 Kip1 ma w tej cho robie niekorzystne znaczenie rokownicze co do długości przeżycia [18]. Biorąc pod uwagę zna czenie zaburzeń regulacji aktywności podziałowej i apoptozy komórek CLL w kształtowaniu obrazu klinicznego i niejasne znaczenie rokownicze tych zaburzeń, za cel niniejszej pracy postawiono oce nę znaczenia rokowniczego żywotności i apoptozy komórek CLL w 72 godzinnej hodowli, we wnątrzkomórkowej ekspresji p27 Kip1 i ekspresji antygenu powierzchniowego CD38 u nieleczo nych chorych na B CLL w niskim stadium zaa wansowania choroby. Materiał i metody Pacjenci Badanie przeprowadzono na jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (peripheral blood mo nonuclear cells PBMC) 52 nieleczonych chorych na CLL w wieku 32 80 lat (średnia 64,0+10,3). Rozpoznanie zostało ustalone na podstawie kryte riów klinicznych i morfologicznych i potwierdzone stwierdzeniem koekspresji antygenów CD5 i CD19 oraz występowania antygenu CD23 na powierzchni limfocytów krwi obwodowej. Na limfocytach 44 chorych oznaczono ponadto cytofluorometrycznie ekspresję markera powierzchniowego CD38. Sta dium zaawansowania choroby określono jako 0 we dług klasyfikacji Rai [3] u 37 chorych, I u 10 i II u 5 pacjentów. Liczba leukocytów krwi obwodowej wynosiła 11,4 173 G/l (śr. 34,7±31,4), liczba limfo

Ekspresja p27 Kip1 i apoptoza limfocytów w przewlekłej białaczce limfocytowej B komórkowej 39 cytów 5,8 156 G/l (śr. 28,6±30,5), wartość hemo globiny (Hb) 11,7 15,9 (śr. 14,2±1,18), liczba pły tek krwi 104 309 G/l (śr. 180,9±54,3). U każdego chorego określano czas od wyko nania wymienionych niżej oznaczeń do zmiany stadium zaawansowania klinicznego według Rai oraz obserwowano, czy występuje podwojenie się limfocytozy krwi obwodowej. Czas obserwacji pacjentów wynosił 4 29 miesięcy (śr. 22,9). Pod czas obserwacji rozpoczęto leczenie cytostatyczne u 15 chorych. Cytofluorometryczna ocena ekspresji białka p27 Kip1 PBMC z krwi obwodowej chorych na CLL po branej w wyniku nakłucia żyły były izolowane me todą wirowania w gradiencie gęstości z użyciem Gradisolu L (AQUA MEDICA, Polska) i płukane w roztworze soli zbuforowanym fosforanami (pho sphate buffered saline, PBS). Komórki były inkubo wane przez 30 minut w temperaturze 4 o C z 2% roz tworem surowicy AB i z przeciwciałem anty CD5 i anty CD19 sprzężonym odpowiednio z PE i PerCP (Becton Dickonson, Becton Dickinson Company, USA). Komórki były następnie trzykrotnie płukane w PBS zawierającym 1% roztwór albuminy z suro wicy wołowej (bovine serum albumin, BSA, Sigma, Niemcy). Komórki były utrwalane i permeabilizo wane według metody opisanej przez Farahat et al. [19], Anderson et al. [20] oraz Frydecką et al. [21] oraz dwukrotnie płukane w PBS zawierającym 0,5% Tween 20 (Sigma) i inkubowane przez 1,5 godz. w temperaturze +4 o C w PBS zawierającym 1% roz twór BSA i przeciwciało monoklonalne przeciw p27 Kip1 (Pharmingen, Becton Dickonson, Becton Dickinson Company). W dalszym etapie komórki były dwukrotnie płukane w PBS zawierającym 0,5% Tween 20 i inkubowane przez 30 minut w temperaturze +4 o w PBS zawierającym 1% BSA i immunoglobuliny królicze skierowane przeciw im munoglobulinom mysim sprzężone z FITC (Dako, Dania). Po wypłukaniu i zawieszeniu w PBS komór ki były analizowane za pomocą cytometru przepły wowego FACScalibur (Becton Dickinson). Kontrolą negatywną były komórki, w których do znakowania użyto zamiast swoistego przeciw ciała immunoglobulin mysich tego samego izoty pu sprzężonych z PerCP, PE lub FITC. Analiza cy tofluorometryczna każdej populacji komórkowej była przeprowadzana na podstawie fluorescencji uzyskanej co najmniej z 10 000 komórek za pomo cą oprogramowania Cell Quest. Dla każdej popu lacji obliczano odsetek komórek CD5 + /CD19 + wy kazujących ekspresję p27 Kip1 oraz średnie natęże nie fluorescencji zależnej od p27 Kip1 (mean intensi ty of fluorescence MIF) stwierdzanej w tych ko mórkach i wyrażonej w jednostkach umownych (JU), jako półilościową miarę komórkowej zawar tości badanego białka. Wszystkie pomiary były wykonywane dwukrotnie i do dalszej analizy uży wano średniej wartości tych dwóch pomiarów. Żywotność i spontaniczna apoptoza limfocytów CLL Wskaźniki te były oceniane przed i po 72 go dzinnej hodowli komórek w RPMI 1640 w ilości 10 6 komórek/1 ml hodowli z dodatkiem 10% roztwo ru surowicy płodowej cielęcej, 2 mm glutaminy i 0,16 mg/ml gentamycyny. Żywotność komórek by ła szacowana za pomocą błękitu trypanu. Apoptozę badano immunocytochemicznie z użyciem zestawu Boehringer Mannheim (Niemcy). W tym celu ko mórki były utrwalane przez 15 minut w temperatu rze pokojowej za pomocą 4% roztworu formaldehy du (Fluka, Niemcy), po czym wykonywano prepara ty cytologiczne metodą cytospinu. Preparaty te były inkubowane. w etanolu w temperaturze 20 o C przez 5 minut, następnie w 0,25% roztworze Tritonu X w TBS w temperaturze pokojowej przez następne 5 minut i poddane działaniu odczynnika TUNNEL (in situ cell death detection kit, Boehringer Mannhe im) zgodnie z instrukcją producenta. Po ujawnieniu reakcji metodą fosfatazy zasadowej (NBT/BCIP re ady to use tablets, Roche, Niemcy) badano mikro skopowo odsetek komórek apoptotycznych na pod stawie oceny reakcji w 500 komórkach. Wyniki Ekspresja p27 Kip1 w limfocytach CLL Jak wykazano wcześniej [22], ekspresja p27 Kip1 występowała w ponad 90% komórek wszystkich ba danych populacji komórkowych. Międzyosobnicza intensywność ekspresji wykazywała dużą zmien ność, gdyż MIF wynosił 57,9 896 JU (śr. 267,0+172,7). Nie wykazano związku między MIF a liczbą leukocytów, limfocytów, płytek lub stęże niem Hb. Stwierdzono natomiast ujemną korelację między MIF zależnym od p27 Kip1 a wiekiem pacjen tów (współczynnik r Pearsona = 0.45, p=0.001) Ekspresja CD38 na limfocytach CLL Przyjęto, że ekspresja CD38 w danej populacji komórkowej jest dodatnia, gdy odsetek limfocy

40 M. WÓJTOWICZ et al. tów CD19 + wykazujących ten antygen przekraczał 20%. Dodatnią jego ekspresję wykazano u 10 pa cjentów, ujemną u 34 chorych. Żywotność i spontaniczna apoptoza komórek CLL Po zakończeniu 72 godzinnej hodowli żywot ność komórek określona za pomocą błękitu trypanu wynosiła 18 90% (śr. 30±17,0), a odsetek komórek z cechami apoptozy 19 97% (śr. 51,1±22,2), przy czym wykazano ujemną korelację między tymi zmiennymi (p = 0,0003, test Spearmana). Nie stwierdzono natomiast związku między żywotno ścią i apoptozą komórek a obrazem krwi obwodowej pacjentów lub ekspresją p27 Kip1. Związek między ekspresją CD38, p27 Kip1, żywotnością limfocytów i apoptozą a przebiegiem CLL W celu oceny związku między komórkową za wartością p27 Kip1 a ewolucją choroby podzielono badaną grupę pacjentów na chorych z niską i wy soką zawartością p27 Kip1 ocenianą jako MIF. Wy kazano, że największą różnicę w częstości zmiany stadium stwierdza się przy przyjęciu wartości gra nicznej MIF 220 JU, która dzieli badaną populację na grupy o liczebności odpowiednio 23 i 29 cho rych. Po wyłączeniu z analizy trzech pacjentów, u których w czasie obserwacji rozpoczęto leczenie z powodu niezmieniającego stadium klinicznego szybkiego zwiększania się limfocytozy, zmianę stadium klinicznego wykazano u 3 spośród 22 pa cjentów z niską i aż u 11 spośród 27 chorych z wy soką zawartością p27 Kip1. Różnica w częstości zmiany stadium między tymi dwiema grupami by ła statystycznie istotna (χ 2 = 4,4; p < 0,05). Ponad to 52 chorych oceniono pod względem wystąpie nia podwojenia się liczby limfocytów. U 24 spo śród nich z niską zawartością p27 Kip1 podwojenie to stwierdzono u 3 (12,5%), a spośród 28 z wyso ką ekspresją tego białka u 8, tj. 28,6% pacjen tów. Różnica ta jednak nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej (tab. 1). Wykazano też związek między ekspresją CD38 a przebiegiem choroby. Po wyłączeniu z analizy dwóch chorych, u których w czasie ob serwacji rozpoczęto leczenie z powodu niezmie niającego stadium klinicznego szybkiego zwięk szania się limfocytozy, spośród 10 chorych z do datnią ekspresją CD38 doszło podczas obserwacji do zmiany stadium klinicznego u 6 pacjentów. Ta ką zmianę wykazano tylko u 4 spośród 32 (12,5%) chorych niewykazujących ekspresji CD38. Różni ca jest statystycznie znamienna (χ 2 = 9,3, p < < 0,01). Ponadto wykazano zdwojenie się liczby limfocytów u 6 spośród 33 (18,2%) chorych bez ekspresji CD38 i u 4 spośród 11 (36,4%) pacjen tów z ekspresją tego markera. Różnica ta była jed nak statystycznie nieznamienna (tab. 2). Średni czas obserwacji nie różnił się istotnie między grupami chorych wykazujących i niewy kazujących ekspresji CD38, jak również między grupami o niskiej i wysokiej komórkowej zawar tości p27 Kip1 (odpowiednio 24,0 i 22,7 oraz 21,5 i 23,6 miesiąca). Nie wykazano związku pomiędzy przebie giem klinicznym choroby a leukocytozą, limfocy tozą, liczbą płytek, stężeniem Hb ani też żywotno ścią limfocytów w hodowli i ich spontaniczną apoptozą. Omówienie W patogenezie CLL, w której występują za równo zaburzenia regulacji aktywności podziało wej komórek, jak i zahamowanie ich apoptozy, szczególną rolę odgrywa białko inhibitorowe cy klu komórkowego p27 Kip1. Hamuje ono aktywność większości znanych kompleksów cdk cykliny, nie Tabela 1. Wystąpienie zmiany stadium klinicznego oraz podwojenia się liczby limfocytów krwi obwodowej u pacjentów chorych na CLL w zależności od komórkowej zawartości p27 Kip1 w limfocytach krwi obwodowej Table 1. Incidence of evolution to higher clinical stage and doubling of peripheral lymphocyte count in CLL patients accor ding go cellular p27 Kip1 content in peripheral blood lymphocytes Komórkowa zawartość p27 Kip1 Zmiana stadium klinicznego Podwojenie się liczby limfocytów (Cellular p27 Kip1 content) (Evolution to higher clinical stage) (Doubling of lymphocyte count) Tak Nie Tak Nie (yes) (no) (yes) (no) Niska 3 (13,6%) 19 (86,4%) 3 (12,5%) 21 (87,5%) (Low) Wysoka 11 (40,7%) 16 (59,3%) 8 (28,6%) 20 (71,4%) (High)

Ekspresja p27 Kip1 i apoptoza limfocytów w przewlekłej białaczce limfocytowej B komórkowej 41 Tabela 2. Wystąpienie zmiany stadium klinicznego oraz podwojenia się liczby limfocytów krwi obwodowej u pacjentów chorych na CLL w zależności od ekspresji markera powierzchniowego CD38 na limfocytach krwi obwodowej Table 2. Incidence of evolution to higher clinical stage and doubling of peripheral lymphocyte count in CLL patients accor ding to CD38 expression on peripheral blood lymphocytes Ekspresja CD38 Zmiana stadium klinicznego Podwojenie się liczby limfocytów (Expression of CD38) (Evolution to higher clinical stage) (Doubling of lymphocyte count) Tak Nie Tak Nie (yes) (no) (yes) (no) Ujemna 4 (12,5%) 28 (87,5%) 6 (18,2%) 27 (81,2%) (Negative) Dodatnia 6 (60%) 4 (40%) 4 (36,4%) 7 (63,6%) (Positive) zbędnych do realizacji przez komórkę kolejnych faz cyklu mitotycznego, utrzymuje komórki spo czynkowe w fazie G0 oraz odgrywa nie do końca wyjaśnioną rolę w regulacji apoptozy [10 16]. Je go obniżoną ekspresję wynikającą ze wzmożonej proteolizy i wiążącą się z niekorzystnym rokowa niem wykazano w wielu nowotworach narządo wych [10, 17]. Niewiele badań poświęcono eks presji tego białka w przebiegu CLL, ale wykazano, że w limfocytach białaczkowych krążących we krwi obwodowej jest ona wysoka i większa niż w prawidłowych limfocytach CD5 + /CD19 + krwi obwodowej [18, 22]; stwierdza się ją też w więk szości komórek białaczkowych w szpiku kostnym [23]. Wykazano ją natomiast tylko w stosunkowo niewielkim odsetku komórek węzłów chłonnych pacjentów chorych na to schorzenie [24]. Nie którzy autorzy wykazali też, że wysoka zawartość p27 Kip1 jest związana z niskim odsetkiem komórek ulegających spontanicznej apoptozie w 5 dniowej hodowli [18]. Stwierdzono również, że wysoka ekspresja tego białka była związana z krótkim cza sem podwojenia liczby limfocytów i krótszym cał kowitym czasem przeżycia. Zwiększona zawar tość komórkowa p27 Kip1 miałaby więc, w odróż nieniu od nowotworów narządowych, niekorzyst ne znaczenie rokownicze w CLL; autorzy pracy nie podali jednak stadium klinicznego pacjentów objętych analizą [18]. Przedstawione wyżej badania, wykonane w odróżnieniu od cytowanej pracy Vrhovaca et al. metodą cytometrii przepływowej umożliwiającej półilościową ocenę zawartości analizowanego białka na poziomie pojedynczej komórki, były ograniczone tylko do chorych w stadiach niskiego i umiarkowanego ryzyka, tzn. 0, I i II według Rai. Wykazano, że chorzy z wyższą zawartością p27 Kip1 wykazują przy porównywalnym czasie obserwacji częstszą progresję choroby do wyższego stadium zaawansowania niż pacjenci z mniejszą ekspresją tego białka. Stwierdzono tym samym niekorzystne znaczenie rokownicze co do dynamiki choroby wysokiej ekspresji p27 Kip1 w limfocytach CLL w grupie chorych w niskim i pośrednim stadium zaawansowania. Przytoczone wyżej wyniki wska zują na możliwość istnienia związku również mię dzy zawartością komórkową p27 Kip1 a podwoje niem się limfocytozy krwi obwodowej, co zostało też wykazane przez Vrhovaca et al. [18], ale, prawdopodobnie ze względu na małą liczebność grupy i stabilny przebieg choroby u większości pa cjentów, wynikający z niskiego stadium zaawan sowania oraz na stosunkowo krótki czas ich obser wacji, zaobserwowane różnice w częstości wystą pienia podwojenia się liczby limfocytów nie osią gnęły progu istotności statystycznej. Z uwagi na postulowany wpływ ekspresji p27 Kip1 na przeżywalność limfocytów CLL in vi tro [18] zbadano związek pomiędzy żywotnością limfocytów i ich spontaniczną apoptozą w 72 go dzinnej hodowli a ewolucją choroby ocenianą ja ko zmiana stadium i wystąpienie podwojenia się liczby limfocytów. Związku takiego nie stwier dzono, co może też wynikać z tego, że sponta niczna apoptoza limfocytów CLL jest zjawiskiem obserwowanym in vitro i nie odzwierciedla wła ściwości biologicznych tych komórek in vivo, gdzie obserwuje się jej zahamowanie i przedłuże nie czasu przeżycia komórek białaczkowych krą żących we krwi obwodowej. Nie zaobserwowano wykazanej w badaniu Vrhovaca zależności po między apoptozą komórek a ekspresją p27 Kip1, być może ze względu na inne warunki doświadczalne (np. dłuższy, 5 dniowy czas hodowli stosowany w tych badaniach). Zgodnie z oczekiwaniem wykazano natomiast niekorzystne znaczenie rokownicze ekspresji CD38 odnośnie do ryzyka zmiany stadium klinicz nego. Ekspresja CD38, podobnie jak p27 Kip1, wy kazywała też nieznamienny statystyczne związek podwojenia się liczby limfocytów. Brak istotności jest prawdopodobnie wynikiem małej liczebności grupy i krótkiego czasu obserwacji pacjentów. Jest to zgodne z danymi piśmiennictwa, w którym wy kazano, że obecność CD38 na limfocytach CLL jest związana z dużą masą nowotworu [6, 7], niż

42 M. WÓJTOWICZ et al. szym czasem przeżycia całkowitym i wolnym od progresji [5 9] oraz gorszą odpowiedzią na lecze nie [5, 7]. Podsumowując, przedstawione wyżej obserwa cje dotyczące wartości rokowniczej p27 Kip1 u cho rych na CLL na niskim stopniu zaawansowania na leży traktować jako wstępne z uwagi na stosunko wo krótki czas ich obserwacji. Wskazują jednak, że oznaczona metodą cytometrii przepływowej we wnątrzkomórkowa zawartość tego białka ma nieko rzystne znaczenie prognostyczne w stadiach kli nicznych niskiego i pośredniego ryzyka i może za powiadać szybką progresję choroby. Piśmiennictwo [1] Kipps T. J.: Chronic lymphocytic leukemia. Curr. Opin. Hematol. 2000, 7, 223 234. [2] Gottardi D., Alfarano A., De Leo A. M., Stacchini A., Bergui L., Caligaris Cappio F.: Defective apoptosis due to Bcl 2 overexpression may explain why B CLL cells accumulate in G0. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995, 194, 307 312. [3] Rai K. R., Sawitsky A., Cronkite E. P.: Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975, 46, 219 234. [4] Zwiebel J., Cheson B. D.: Prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia. Semin. Oncol. 1998, 25, 42 59. [5] Damle R. N., Wasil T., Fais F., Ghiotto F., Valetto A., Allen S. L., Buchbinder A., Budman D., Dittmar K., Koliltz J., Lichtman S. M., Schulman P., Vinciguerra V. P., Rai K. R., Ferrarini M., Chiorazzi N.: Ig V ge ne mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999, 94, 1840 1847. [6] Ibrahim S., Keating M., Do K. A., O Brien S., Huh Y. O., Jilani I., Lerner S., Kantarjian H. M., Albitar M.: CD38 expression as an important prognostic factor in B cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2001, 98, 181 186. [7] Del Poeta G., Maurillo L., Venditti A., Buccisano F., Epiceno A. M., Capelli G., Tamburini A., Suppo G., Battaglia A., Del Principe M. I., Del Moro B., Masi M., Amadori S.: Clinical significance of CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002, 98, 2633 2639. [8] Jelinek D. F., Tschumper R. C., Geyer S. M., Bone N. D., Dewald G. W., Hanson C. A., Stenson M. J., Wit zig T. E., Tefferi A., Kay N. E.: Analysis of clonal B cell CD38 and immunoglobulin variable region sequence status in relation to clinical outcome for B chronic lymphocytic leukaemia. Br. J. Haematol. 2001, 115, 854 861. [9] Chevallier P., Penther D., Avet Loiseau H., Robillard N., Ifrah N., Mahé B., Hamidou M., Maisonneuve H., Moreau P., Jardel H.: CD38 expression and secondary 17p deletion are important prognostic factors in chronic lymphocytic leukaemia. Br. J. Haematol. 2002, 116, 142 150. [10] Ciszak L., Wołowiec D., Kosmaczewska A., Boćko D., Frydecka I.: Białko p27: budowa, funkcje biologiczne oraz udział w patomechanizmie procesów rozrostowych. Post. Biol. Kom. 2000, 27, 481 503. [11] Vidal A., Koff A: Cell cycle inhibitors: three families united by a common cause. Gene 2000, 247, 1 15. [12] Wang X. T., Gorospe M., Huang Y., Holbrook N. J.: p27 Kip1 overexpression causes apoptotic death of mamma lian cells. Oncogene 1997, 15, 2991 2998. [13] Katayose Y., Kim M., Rakkar A. N. S., Li Z. W., Cowan K. H., Seth P.: Promoting apoptosis: a novel activity associated with the cyclin dependent kinase inhibitor p27. Cancer Res. 1997, 57, 5441 5445. [14] Eymin B., Haugg M., Droin N., Sordet O., Dimanche Boitrel M. T., Solary E.: p27 Kip1 induces drug resistan ce by preventing apoptosis upstream of cytochrome c release and procaspase 3 activation in leukemic cells. Onco gene 1999, 18, 14111418. [15] Eymin B., Sordet O., Droin N., Munsch B., Haugg M., VandeCraen M., Vandenabeele P., Solary E.: Caspa se induced proteolysis of the cyclin dependent kinase inhibitor p27 Kip1 mediates its anti apoptotic activity. Onco gene 1999, 18, 4839 4847. [16] Hiromura K., Pippin J. W., Fero M. L., Roberts J. M., Shankland S. J.: Modulation of apoptosis by the cyc lin dependent kinase inhibitor p27 Kip1.: J. Clin. Invest. 1999, 103, 597 604. [17] Tsihlias J., Kapusta L., Slingerland J.: The prognostic significance of altered cyclin dependent kinase inhibitors in human cancer. Annu. Rev. Med. 1999, 50, 401 423. [18] Vrhovac R., Delmer A., Tang R., Marie J. P., Zittoun R., Ajchenbaum Cymbalista F.: Prognostic significan ce of the cell cycle inhibitor p27 Kip1 in chronic B cell lymphocytic leukemia. Blood 1998, 91, 4694 4700. [19] Farahat N., van der Plas D., Praxedes M., Morilla R., Matutes E., Catovsky D.: Demonstration of cytopla smic and nuclear antigens in acute leukemia using flow cytometry. J. Clin. Pathol. 1994, 47, 843 849. [20] Anderson P., Blue M. L., O Brien C., Schlossman S. F.: Monoclonal antibodies reactive with T cell receptor ze ta chain: production and characterization using a new method. J. Immunol. 1989, 143, 1899 1904. [21] Frydecka I., Kaczmarek P., Boćko D., Kosmaczewska A., Morilla R., Catovsky D.: Expression of signal transducing zeta chain in peripheral blood T cells and natural killer cells in patients with Hodgkin s disease in dif ferent phases of the disease. Leuk. Lymphoma 1999, 35, 545 554. [22] Wołowiec D., Ciszak L., Kosmaczewska A., Boćko D., Teodorowska R., Frydecka I., Kuliczkowski K.: Cell cyc le regulatory proteins and apoptosis in B cell chronic lymphocytic leukemia. Haematologica 2001, 86, 1249 1257.

Ekspresja p27 Kip1 i apoptoza limfocytów w przewlekłej białaczce limfocytowej B komórkowej 43 [23] Kremer M., Dirnhofer S., Nickl A., Hoefler H., Quintanilla Martinez L., Fend F.: p27 p27 Kip1 immunostaining for the differential diagnosis of small B cell neoplasms in trephine bone marrow biopsies. Mod. Pathol. 2110, 14, 1022 1029. [24] Erlanson M., Portin C., Linderholm B., Lindh J., Roos G., Landberg G.: Expression of cyclin E and the cyc lin dependent kinase inhibitor p27 in malignant lymphomas prognostic implications. Blood 1998, 92, 770 777. Adres do korespondencji: Dariusz Wołowiec Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM Wybrzeże L. Pasteura 4 50 367 Wrocław Praca wpłynęła do Redakcji: 22.07.2002 r. Po recenzji: 4.10.2002 r. Zaakceptowano do druku: 4.10.2002 r. Received: 22.07.2002 Revised: 4.10.2002 Accepted: 4.10.2002