Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie Wydział Technologii Żywności

Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie Wydział Technologii Żywności Instytut Chemii Zakład Chemii Biopolimerów dr Anna Konieczna-Molenda ZAŁĄCZNIK 2 AUTOREFERAT W JĘZYKU POLSKIM Nowe metody aktywacji fizykochemicznej enzymów przemysłowych do przetwórstwa polisacharydów 1. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe...2 2. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu...3 3. Wskazanie osiągnięcia naukowego...4 4. Pozostałe osiągnięcia naukowe...48 5. Tabelaryczne zestawienie dorobku naukowego...55

1. POSIADANE DYPLOMY, STOPNIE NAUKOWE Z PODANIEM NAZWY, MIEJSCA I ROKU ICH UZYSKANIA ORAZ TYTUŁU ROZPRAWY DOKTORESKIEJ. Praca doktorska: 2003 r. Uniwersytet Jagielloński, Wydział Chemii pt. Kinetyka degradacji celulozy w zakresie podwyższonych temperatur Promotor: Prof. dr hab. Andrzej Barański Praca wyróżniona przez Radę Wydziału Chemii UJ Praca magisterska: 1998 r. Uniwersytet Jagielloński, Wydział Chemii, Zakład Technologii Chemicznej, pt. Superabsorbery polimerowe. Otrzymywanie nowych środków sieciujących i ich charakterystyka (wynik bardzo dobry) Promotor: Prof. dr hab. Edgar Bortel Studia podyplomowe: 2011 r. Studia podyplomowe Dydaktyka na uczelni wyższej Politechnika Krakowska im. T. Kościuszki w Krakowie 2

2. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH. 07.2003 05.2004 umowa o dzieło w ramach Wieloletniego Projektu Rządowego pt. Kwaśny papier finansowanego przez MEN, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński, 02.2005 02.2006 asystent naukowo-dydaktyczny, Katedra Chemii, Wydział Rolniczo - Ekonomiczny, Uniwersytet Rolniczy (Akademia Rolnicza) im. H. Kołłątaja w Krakowie, 02.2006 01.2016 adiunkt naukowo-dydaktyczny, Zakład Chemii Biopolimerów, Instytut Chemii, Wydział Rolniczo-Ekonomiczny, Uniwersytet Rolniczy (Akademia Rolnicza) im. H. Kołłątaja w Krakowie, 02.2016 obecnie adiunkt naukowo-dydaktyczny, Zakład Chemii Biopolimerów, Instytut Chemii, Wydział Technologii Żywności, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie. 3

3. WSKAZANIE OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO. WSKAZANIE OSIĄGNIĘCIA WYNIKAJĄCEGO Z ART. 16 UST. 2 USTAWY Z DNIA 14 MARCA 2003 ROKU O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ. U. 2016 R. POZ. 882 ZE ZM. W DZ. U. Z 2016 R. POZ. 1311.): A) TYTUŁ OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO/ARTYSTYCZNEGO, Cykl dziesięciu monotematycznych publikacji pod wspólnym tytułem: Nowe metody aktywacji fizykochemicznej enzymów przemysłowych do przetwórstwa polisacharydów B) (AUTOR/AUTORZY, TYTUŁ/TYTUŁY PUBLIKACJI, ROK WYDANIA, NAZWA WYDAWNICTWA, RECENZENCI WYDAWNICZY) B1. A. Konieczna-Molenda; (2012) Effect of illumionation of cellulose with the visible linearly polarized light upon digestion of cellulose, Recent. Devel. Carbohydrate Res, 3, 1-10 B2. A. Tata, K. Sokołowska, J. Świder, A. Konieczna-Molenda, E. Proniewicz, E. Witek, (2015) Study of cellulolytic enzyme immobilization on copolymers of N-vinylformamide, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 149, 494 504 IF = 2,653 B3. A. Para and Anna Konieczna Molenda; (2010) Starch dialdehyde from potato starch illuminated with linearly polarized white light; Carbohydrate Polymers, 79, (2) 445-448 IF = 3,463 4

B4. K. Sokołowska, A. Konieczna-Molenda, E. Witek, (2016) Hydroliza odpadów celulozowych katalizowana enzymami celulolitycznymi immobilizowanymi na nośniku polimerowym, Polimery, 9, 633-641 IF = 0,778 B5. M. Fiedorowicz, G. Khachatryan, A. Konieczna- Molenda, P. Tomasik, (2009) Formation of cyclodextrin with cyclodextringlucosyltransferase stimulated with polarized light, Biotechnoogy Progress, 25, (1), 147-150 IF = 2,398 B6. A. Konieczna- Molenda, V. M. F. Lai, M. Fiedorowicz, G. Khachatryan, P. Tomasik; (2008) Polarized Light-stimulated Enzymatic Hydrolysis of Xylan Biotechnology Progress, 24, 385-388 IF = 2,108 B7. A. Konieczna-Molenda, M. Fiedorowicz, P. J. Tomasik, (2010) Stimulation of Glucose Oxidase with White Linearly Polarized Light, Biotechnology Progress, 26(1) 393-396 IF = 2,178 B8. A. Konieczna-Molenda, M. Fiedorowicz, W. Zhong, P. Tomasik, (2008) Polarized light-stimulated enzymatic hydrolysis of chitin and chitosan; Carbohydr. Res., 343, 3117-3119 IF = 1,960 B9. M. Fiedorowicz, A. Konieczna-Molenda, G. Khachatryan, P. Tomasik; Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów (PL 379950) patent przyznany w 2010r. B10. A. Konieczna-Molenda, Sposób określenia szybkości degradacji polisacharydów w produktach leczniczych, zwłaszcza w syropach ziołoleczniczych (PL 379152) patent przyznany w 2011r. 5

Całkowity IF z roku opublikowania prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego: 15,538. Liczba punktów MNiSW za cykl publikacji: 285 pkt. Oświadczenia współautorów prac określające wkład w powstanie publikacji zamieszczono w załączniku 5. C) OMÓWIENIE CELU NAUKOWEGO WW. PRAC I OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW WRAZ Z OMÓWIENIEM ICH EWENTUALNEGO WYKORZYSTANIA. 4. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO - BADAWCZYCH Wstęp W krajach wysokorozwiniętych coraz więcej produktów otrzymywanych jest w procesach technologicznych z udziałem biokatalizatorów. W produkcji i przetwórstwie żywność na coraz większą skalę stosuje się enzymy jako katalizatory reakcji. Posiadają one wiele cech decydujących o atrakcyjności ich zastosowania, takich jak łatwość kontrolowania i regulacji katalizowanej reakcji, specyficzność, łagodność warunków działania (co w konsekwencji ogranicza straty cennych składników odżywczych), a także bezpieczeństwo stosowania wynikające z naturalnego pochodzenia i działania w niskich stężeniach. Enzymy odpowiedzialne są za przebieg wszystkich reakcji w żywych organizmach, bez ich udziału przebiegałyby one zbyt wolno. Katalizatory te przyspieszają zachodzenie reakcji chemicznych, poprzez obniżenie energii aktywacji. Powodują one zmniejszenie różnicy energii między reagentami, a stanem przejściowym [1]. Analogicznie, jak inne katalizatory enzymy nie zużywają się podczas reakcji, ani też nie wpływają na jej równowagę. W sposób ilościowy kinetykę reakcji enzymatycznych opisuje prawo Michaelisa-Menten [2]. Enzymy charakteryzują się specyficznością tzn. katalizują wyłącznie jeden określony rodzaj reakcji, wykazują specyficzność wobec określonej grupy funkcyjnej, substratu lub wiązania chemicznego. Za działanie katalityczne odpowiadają tylko miejsca aktywne enzymu, z tego powodu ich aktywność katalityczna uzależniona jest od ich trójwymiarowej struktury [3]. Funkcje katalityczne enzymów, ich swoistość, selektywność, zdolność do działania w łagodnych warunkach spowodowały duże zainteresowanie ze strony przemysłu. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu są one powszechnie stosowane jako alternatywa dla 6

tradycyjnych chemicznych technologii. Badania dotyczące światowej sprzedaży enzymów wskazują że 31% to enzymy do celów spożywczych (głównie przetwórstwo skrobi i piekarnictwo), 6% enzymy paszowe, a pozostałe to enzymy techniczne (produkcja detergentów, tekstyliów, biopaliw) [4]. Kontrolowane reakcje z zastosowaniem enzymów lub grupy enzymów stanowią podstawę wielu procesów przetwórczych (np. hydrolizaty skrobiowe, białkowe) oraz operacji technologicznych. Obecnie z udziałem enzymów występujących w różnych mikroorganizmach wytwarza się wiele produktów spożywczych (pieczywo, napoje alkoholowe, soki, sery, jogurty, słodycze i inne) [5]. Dzięki biotechnologii i zastosowaniu enzymów przemysł spożywczy wprowadza nowe produkty, obniża ich koszty i poprawia ich jakość, usprawnia już istniejące procesy produkcyjne i przetwórcze [6]. Wykorzystanie coraz to nowych enzymów przekłada się na zwiększenie funkcjonalności artykułów spożywczych, poprawę wartości odżywczych, własności sensorycznych, takich jak tekstura czy smak produktów. Pozwala także, na obniżenie kosztów i ulepszenie procesów przetwarzania żywności oraz utylizacji odpadów w przemyśle spożywczym. Zastąpienie tradycyjnych chemicznych technologii reakcjami enzymatycznymi przynosi korzyści w zakresie ochrony środowiska, ze względu na biodegradowalność i obniżenie zużycia energii [7]. Niestety, enzymy oprócz doskonałych właściwości, posiadają cechy które, nie są pożądane w przemyśle, takie jak: wysoka rozpuszczalność, brak stabilności i podatność na inhibicję, hamowanie przez substraty lub produkty reakcji, wysoka cena spowodowana skomplikowaną izolacją i oczyszczeniem. Wdrożenie enzymów, jako katalizatorów przemysłowych, jest zadaniem interdyscyplinarnym i wymaga wyselekcjonowania enzymów o odpowiednich właściwościach, ulepszenia ich za pomocą technik biomolekularnych i fizykochemicznych oraz dostosowania reaktorów przemysłowych do ich stosowania [8,9]. Enzymy używane w przemyśle pozyskiwane są z tkanek roślinnych, zwierzęcych lub z drobnoustrojów. Obecnie najczęściej, stosowane są enzymy pochodzenia mikrobiologicznego, otrzymywane z kultur bakterii, grzybów pleśniowych lub drożdży. 7

Tabela 1. Wykorzystanie przykładowych enzymów w przemyśle spożywczym [10]. Enzym Sposób działania Zastosowanie w przemyśle spożywczym α-amylaza hydroliza skrobi - fermentacyjnym, (wiązań α-1,4- - piwowarskim (słodowanie), glikozydowych) - piekarskim, - wytwarzanie cukrów β-amylaza hydroliza skrobi (wiązań α- - wytwarzanie syropu słodowego 1,6-glikozydowych) glukoamylaza hydroliza dekstryn - scukrzanie skrobi, skrobiowych do glukozy - produkcja piwa (wiązań α-1,4 oraz α-1,6- glikozydowych) celulaza hydroliza celulozy - upłynnianie owoców podczas produkcji soków - w piekarnictwie - w przemyśle gorzelniczym glukozyltransferaza hydroliza skrobi i produkcja - produkcja cyklodekstryn cyklodekstynowa cyklodekstryn chitynaza hydroliza chityny - otrzymywanie glukozaminy chitozanaza hydroliza chitozanu - otrzymywanie N-acetylo glukozaminy hemicelulaza i hydroliza hemiceluloz - hydroliza nie skrobiowych polisacharydów w mące, ksylanaza - poprawa jakości pieczywa - warzenie piwa β-galaktozydaza hydroliza laktozy - produkcja nabiału bez laktozy, (laktaza) - dosładzanie produktów mlecznych β-glukanaza hydroliza β-glukanów - produkcja piwa oksydaza glukozowa utlenianie glukozy do kwasu - usuwanie tlenu z opakowań spożywczych, glukonowego - eliminacja glukozy z białka jaj pektynaza hydroliza pektyn - klarowanie soków pullanaza hydroliza wiązań α-1,6- - scukrzanie skrobi, glikozydowych - zwiększenie wydajności hydrolizy skrobi asparaginaza hydroliza grupy amidowej w - redukcja zawartości akryloamidu w produktach łańcuchu bocznym spożywczych poddawanych obróbce cieplnej asparaginy lipaza hydroliza tłuszczu - przyspieszanie dojrzewania sera, - modyfikacja struktury tłuszczów mlecznych, - sery modyfikowane enzymatycznie pepsyna hydroliza kazeiny koagulacja mleka przy wytwarzaniu serów 8

trypsyna hydroliza białek - hydroliza białek spożywczych, - wytwarzanie hydrolizatu do przyprawiania żywności Bogate źródło różnorodnych produktów, stanowią najbardziej dostępne i rozpowszechnione w przyrodzie polisacharydy: skrobia, celuloza, ksylan oraz chityna. Budowa tych polisacharydów determinuje ich stosunkowo wysoką odporność na degradację, a ich hydroliza wymaga zastosowania środków chemicznych lub kompleksu enzymów. Skrobia będąca związkiem zapasowym roślin jest powszechnie występującym surowcem odnawialnym. Rośliny zawierające skrobię (takie jak pszenica, ryż, ziemniaki, kukurydza, tapioka, sago i inne) są na szeroką skalę wykorzystywane przez człowieka. Od ponad 40 lat do przetwarzania skrobi na skalę przemysłową wykorzystuje się enzymy. Enzymy działające na skrobię można zasadniczo podzielić na: 1) hydrolazy egzo- i endo-, które rozkładają wiązania α-1,4- i α-1,6-glikozydowe, 2) glukotransferazy działające na wiązania α-1,4- i α-1,6-glikozydowe, 3) oksydoreduktazy katalizujące utlenianie i redukcję poszczególnych grup [11]. Celuloza jest składnikiem budulcowym ściany komórkowej roślin wyższych oraz niektórych glonów, grzybów i bakterii. To nierozgałęziony biopolimer, zbudowany z 3000 14000 cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi [12]. Hydroliza celulozy wymaga współdziałania kilku enzymów. W zależności od typu katalizowanej reakcji można wyróżnić pięć podstawowych rodzajów celulaz: 1) endo-(1,4) β-d-glukanazy (EC 3.2.21.4) hydrolizują wewnętrzne wiązania, niszcząc strukturę krystaliczną celulozy i odsłaniają pojedyncze łańcuchy, 2) egzo-(1,4) β-d-glukanazy (EC 3.2.21.91) katalizują odrywanie krótkich fragmentów (2-4 reszt glukozowych) od końców odsłoniętych łańcuchów, 3) celobiazy (β-glukozydaza; EC 3.2.21.91) rozkładają do pojedynczych jednostek glukozowych produkty uwolnione przez endo- i egzocelulazy, 4) celulazy utleniające, degradują celulozę w reakcjach rodnikowych, 5) fosfataza celulozy, depolimeryzuje celulozę z nie wody lecz fosforanu. Ksylan to jeden z najobficiej występujących na ziemi polisacharydów, należy do hemiceluloz, które wraz z ligniną i celulozą wchodzą w skład kompleksu ligninocelulozowego w ścianach komórkowych roślin. Ksylan stanowi ważny surowiec do wykorzystania na drodze biokonwersji, bowiem powstające w wyniku jego hydrolizy enzymatycznej produkty stanowią punkt wyjścia do produkcji żywności, pasz, paliw i 9

chemikaliów. Ksylan zbudowany jest z reszt β-d-ksylopiranozy połączonych wiązaniami glikozydowymi między 1 i 4 atomami węgla. Całkowita hydroliza ksylanu wymaga zastosowania kilku enzymów: 1) endo-β-1,4- ksylanazy (EC 3.2.1.8) hydrolizują liniowe wiązania β-1,4-glikozydowe. Efektem ich działania są podstawione lub nie oligomery, ksylobioza lub ksyloza, 2) egzo-β-1,4-dksylozydazy (ksylanohydrolaza β-1,4-d-ksylanu; EC 3.2.1.37) odszczepiają reszty D-ksylozy z nieredukujących końców ksylooligosacharydów, hydrolizuje liniowe wiązania, 3) α-dglukuronidazy (EC 3.2.1) hydrolizują wiązania uwalniając kwas D-glukuronowy lub kwas 4- O-metylo-α-D-glukuronowy, 4) α-l-arabinofuranozydazy (EC 3.2.1.55) z nieredukujących końców odszczepią reszty L-arabinofuranozowe, hydrolizują zarówno wiązania α-1,3- jak α- 1,5-arabinoruranozowe, 5) esterazy octanowej lub acetyloksylanoesterazy usuwają grupy acetylowe, co zwiększa podatność na endo-β-1,4-ksylanaz. Chityna jest liniowym biopolimeren naturalnym zbudowanym z reszt N-acetylo-Dglukozo-2-aminowych połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi. W przyrodzie występuje jako materiał budulcowy szkieletów zewnętrznych stawonogów, a także u ramienionogów, mszywiołów i mięczaków, a ponadto w ścianach komórkowych niektórych grzybów, wodorostów i bakterii. Głównym zastosowaniem chityny jest otrzymywanie glukozaminy w wyniku hydrolizy oraz chitozanu na drodze częściowej deacetylacji. W przeciwieństwie do chityny, chitozan pojawia się w przyrodzie bardzo rzadko. Najbardziej popularną metodą przetwarzania chityny i chitozanu jest ich hydroliza enzymatyczna z zastosowaniem odpowiednio chitynaz i chitozanaz. Wybór enzymów do przemysłowego przetwarzania polisacharydów ukierunkowany jest na uzyskanie jak najkorzystniejszych osiągnięć w ich zastosowaniu, a wymagania stawiane enzymom do celów przemysłowych są stosunkowo wysokie [13]. Głównymi problemami wykorzystywania enzymów w przemyśle jest ich wysoki koszt oraz często trudna dostępność katalizatorów o ściśle sprecyzowanych właściwościach. Enzymy działają tylko na niektóre substraty, w określonych warunkach (ph, temperatura, obecność inhibitorów), mogą posiadać niską aktywność, niską rozpoznawalność substratu (wysokie wartości K M ). W takiej sytuacji należy poszukiwać nowych katalizatorów lub już dostępne poddawać modyfikacjom. W celu otrzymania nowych katalizatorów stosuje się wiele technik pozyskiwania materiału, modyfikacje genetyczne, inżynierię białek (np. rekombinację DNA). Organizmy transgeniczne i inżynieria białek, mimo wykorzystywania na całym świecie podlegają ściśle określonym regułom prawnym i budzą wiele wątpliwości. Dodatkowo, strategia pozyskiwania 10

nowych katalizatorów enzymatycznych jest często bardzo żmudna i kosztowna. Stosunkowo prostsze i mniej kosztowne są modyfikacje fizykochemiczne enzymów już stosowanych w przemyśle. Zastosowanie takich modyfikowanych fizykochemicznie katalizatorów nie wymaga konieczności zmiany technologii, infrastruktury przemysłowej czy wprowadzania nowych procesów produkcyjnych. Obecnie w przemyśle coraz popularniejsze są enzymy w formie immobilizowanej, co z jednej strony najczęściej obniża ich aktywność, natomiast z drugiej wielokrotnie zwiększa stabilność oraz zapewnia ciągłość i stałą kontrolę procesu produkcyjnego. Immobilizacja enzymów, białek, mikroorganizmów polega na unieruchomieniu, fizycznym ograniczeniu, zatrzymaniu preparatu w reaktorze [14]. Celem immobilizacji jest przeniesienie zalet katalizy heterogenicznej na rozpuszczalne katalizatory enzymatyczne. Immobilizacja enzymów posiada wiele zalet takich jak zwiększenie stabilności w szerszym zakresie ph i temperatury, możliwość użycia w wielu cyklach reakcji lub w procesach ciągłych, łatwiejsze oddzielenie produktów, możliwość immobilizacji kilku enzymów jednocześnie, prostsza praca reaktora i duży ich wybór. Głównymi wadami są utrata bądź zmniejszenie aktywności, ograniczenie dyfuzji oraz dodatkowe koszty związane z produkcją i aktywacją nośnika oraz mechanizmem unieruchamiania [15]. Znanych jest wiele metod immobilizacji enzymów, w zależności od typu wiązania (kowalencyjne, adsorpcyjne, uwięzienie w matrycy, mikrokapsułkowanie, sieciowanie), odwracalne i nieodwracalne [16,17]. W literaturze opisano wiele przykładów nośników do unieruchamiania enzymów: naturalne, syntetyczne, organiczne, nieorganiczne [18-20]. Poszczególne immobilizacje posiadają swoje zalety i wady, dlatego dla każdego enzymu i każdego substratu należy dobrać odpowiedni nośnik i metodę immobilizacji. Korzystnym sposobem unieruchomienia enzymu na nośniku jest wiązania kowalencyjne. Pozwala na silne umocowanie enzymu, zapobiega jego odszczepieniu ułatwiając jednocześnie kontakt z substratem, gdyż enzym eksponowany jest na powierzchni [21]. Ponadto wiązanie kowalencyjne enzymu z nośnikiem często zwiększa odporność temperaturową takiego biokatalizatora. Grupami funkcyjnymi nośników najczęściej wykorzystywanymi w procesie tworzenia wiązania kowalencyjnego z białkiem są: hydroksylowa, karboksylowa, aminowa i oksiranowa [22]. Enzym jest polipeptydem ze środkową częścią bardziej zwartą, a zewnętrzną dość labilną [23]. Właśnie w części zewnętrznej mieści się aktywne centrum katalityczne oraz grupy funkcyjne zdolne do tworzenia wiązań kowalencyjnych. Grupa ε-aminowa pochodzi od 11

lizyny, merkaptanowa od cysteiny, grupy β- i γ- karboksylowe pochodzą odpowiednio od kwasów asparginowego i glutaminowego. Takich ugrupowań mieści się w zewnętrznej warstwie enzymu bardzo dużo. Silne związanie enzymu z nośnikiem może powodować zjawisko obniżenia, a w skrajnym przypadku utraty aktywności katalitycznej spowodowane blokowaniem dostęp substratu do centrum aktywnego. Aby temu zjawisku zapobiec stosuje się tzw. łącznik w postaci tzw. spacera, którym jest najczęściej aldehyd glutarowy. Jest on nietoksyczny, a dodatkowo bakterio- wiruso- i grzybobójczy. Nieoczekiwanie okazało się, że zastosowanie w reakcji enzymu naświetlanego światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym ma wpływ na wydajność i selektywność hydrolizy polisacharydów [24]. Polaryzacja to obok barwy i natężenia jedna z cech światła. Występują trzy rodzaje polaryzacji światła: liniowa, kołowa i eliptyczna. Powszechnie wiadomo, że światło wpływa na procesy biologiczne. Znane są także biologiczne efekty oddziaływania światła spolaryzowanego na organizmy żywe [25,26]. Ujawniono korzystne oddziaływanie światła spolaryzowanego o określonej barwie na ludzki organizm, co znalazło zastosowanie w medycynie i kosmetyce [27], w leczeniu oparzeń [28,29], leczeniu ran [30,31]. Wykryto także wpływ promieniowania spolaryzowanego na hydrolizę skrobi, co związane było z aktywacją towarzyszących jej amylaz [32]. Cel i zakres badań Celem badań stanowiących podstawę do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego, których wyniki przedstawiłam w cyklu monotematycznych prac B1-B10 było otrzymanie nowych enzymatycznych biokatalizatorów aktywowanych fizykochemicznie, aktywnych w reakcjach przemiany polisacharydów i mogących znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym. W wyniku fizykochemicznej aktywacji handlowo dostępnych i powszechnie stosowanych w przemyśle enzymów: stymulacji światłem spolaryzowanym lub immobilizacji na nośnikach otrzymano biokatalizatory enzymatyczne o zmienionej selektywności, wyższej aktywności, stabilności, tolerancji temperaturowej i ph w porównaniu z enzymami natywnymi. Określono kluczowe parametry stymulacji światłem oraz immobilizacji wpływające na właściwości biokatalizatorów. Otrzymane biokatalizatory zostały zastosowane i przetestowane pod względem funkcjonalności w reakcjach przemiany sacharydów. Biokatalizatory takie mogą być użyte w 12

przemyśle (spożywczym, farmaceutycznym, papierniczym, rafineryjnym), do utylizacji odpadów, oczyszczania ścieków oraz jako biosensory. Zastosowanie biokatalizatorów o wysokiej aktywności katalitycznej i stabilności w postaci enzymów stymulowanych elektromagnetycznie lub immobilizowanych na nośnikach polimerowych pozwoli zmniejszyć koszty wielu operacji jednostkowych w przemyśle. Nowe biokatalizatory wpisują się w założenia Zielonej Chemii, a ich zastosowanie w procesach produkcji i przetwarzania żywności może dostarczyć alternatywnych, ekologicznych produktów. Metody badawcze Enzymy handlowo dostępne i posiadające zastosowanie w przemyśle poddawano fizykochemicznej aktywacji. Aktywacja fizyczna polegała na naświetlaniu enzymów światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym. Aktywacja chemiczna odbywała się poprzez unieruchomienie enzymów na odpowiednio dobranym nośniku. Naświetlanie enzymów światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym Enzym w postaci zawiesiny umieszczano w kwarcowych celach o szerokości 1cm i naświetlano z odległości 30 cm z naświetlacza szczelinowego KB 502 (Kabid, Chorzów, Polska) wyposażonego w łuk ksenonowy 150W (XBO 150 Oriel, Maidstone, UK). Stosowano filtr o polaryzacji liniowej HN 22 filtr (Polaroid, Waltham, MA). Źródło światła emitowało ciągłe promieniowanie w zakresie widzialnym 500-780 nm. Jego strumień energii w pozycji próbki wynosił 4, 8, 16 lub 18 mw/cm 2 (w zależności od enzymu), jak sprawdzono przez Radiometr YSI (Yellow Springs, OH). Próbki były naświetlane w atmosferze azotu, w stałej temperaturze 25 C przez 30, 45, 60, 120 lub 300 min. Biokatalizatory otrzymane w wyniku naświetlania światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym testowano w reakcjach przemiany polisacharydów. Działanie katalizatorów stymulowanych światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym porównywano z działaniem enzymów naświetlanych światłem nie spolaryzowanym lub enzymów nie naświetlanych. 13

Rys. 1. Przykładowy schemat naświetlania próbki enzymu światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym. Immobilizacja enzymów Dla każdego z enzymów immobilizowanych na danym nośniku opracowano indywidualną metodę immobilizacji z uwzględnieniem temperatury, ph, czasu, sekwencji i rodzaju reakcji. Enzymy unieruchamiano na powierzchni nośnika bezpośrednio lub za pomocą łącznika aldehydu glutarowego. Przeważająca ilość immobilizacji polegała tworzeniu kowalencyjnych, wiązań iminowych nośnik-enzym lub nośnik-łącznik-enzym, ale też enzymy były otoczkowane w hydrożelu. Badano wydajność immobilizacji, stabilność wiązania nośnik-enzym oraz zawartość enzymu na powierzchni nośników metodą Lowry ego [33]. W przeprowadzonych badaniach korzystano z wielu metod fizykochemicznych w celu charakterystyki nośników, biokatalizatorów i analizy rezultatów reakcji: 1. Spektroskopia UV-Vis analiza produktów reakcji enzymatycznych oraz badania nośników enzymów, 2. Chromatografia HPLC analiza produktów reakcji, 3. Spektroskopia FT-RAMAN badania nośników enzymów oraz sposobu wiązania nośnikłącznik-enzym, 4. Spektroskopia FT-IR badania nośników enzymów, 5. Analiza DSC wyznaczanie zawartości wody, 6. Wiskozymetria i metody reologiczne wyznaczanie stopnia polimeryzacji polisacharydów, 7. Analiza termograwimetryczna w połączeniu ze spektrometrią masową (MS- TG/DTG/SDTA) badania nośników enzymów, 8. Dyfrakcja Roentgena (X-ray diffractograms) określanie struktury krystalograficznej, 14

9. Pomiar bezwzględnych mas cząsteczkowych oraz promieni bezwładności metoda wysokociśnieniowej chromatografii żelowej z użyciem detektorów refraktometrycznego oraz wielokątowego rozpraszania światła laserowego (HPSEC-MALLS-RI), 10. Metoda BET oznaczanie powierzchni właściwej nośników, 11. Analiza elementarna badania nośników enzymów, 12. Wysokorozdzielcza mikroskopia skaningowa SEM zdjęcia nośników i substratów. Materiały Fizykochemicznej aktywacji poddano stosowane w przemyśle i ogólnodostępne enzymy: a) termostabilna α-amylaza EC 3.2.1.1: SPEZMER PRIME 107-05127-001 (Genencor International, USA) z genetycznie modyfikowanych Geobacillus stearothermophilus oraz α- amylaza z Bacillus licheniformis EC 3.2.1.1 (Sigma-Aldrich), b) glukoamylaza z grzybów EC 3.2.1.3 (Genencor International, USA), c) glukozyltransferaza cyklodekstynowa (CGTase) z Thermoanaerobacter species EC 2.4.1.19 (Novozyme), d) oksydaza glukozowa z Aspergillus niger E.C 1.1.3.4 (Sigma-Aldrich), e) ksylanaza Thermomyces lanuginosus EC 3.2.1.8 (Sigma-Aldrich), f) chitozanaza z Streptomyces species EC 3.2.1.132 (Sigma-Aldrich), g) chitynaza z Serratia marcescens EC 3.2.1.14 (Sigma-Aldrich), h) celulazy EC 3.2.1.4: celulazy z Aspergillus species (Sigma-Aldrich), Novozym 476 (Sigma-Aldrich), Viscozyme L multienzymatyczny kompleks karbohydraz (m.in. celulaz EC 3.2.1.4, β-glukanaz EC 3.2.1.6, hemicelulaz EC 3.1.1.73, ksylanaz EC 3.2.1.8) w postaci roztworu (Sigma Aldrich). Polimery służące jako nośniki do immobilizacji wykonano w ramach współpracy w Zespole Polimerów na Wydziale Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego. Stosowane do immobilizacji enzymów nośniki polimerowe charakteryzowały się zazwyczaj sferycznym kształtem i posiadały na powierzchni pierwszorzędowe grupy aminowe podstawione do łańcuchów polimerowych, które stanowią silnie reaktywne centra dające się łatwo modyfikować w kontrolowanych reakcjach chemicznych [34]. Ilość grup aminowych zdolnych do wiązania enzymu miała znaczący wpływ, czy enzym wiązany był jednopunktowo czy wielopunktowo i decydowała o jego właściwościach katalitycznych. 15

Sferyczny kształt ziaren nośnika jest natomiast szczególnie pożądany, gdy proces hydrolizy prowadzony jest w reaktorze kolumnowym. Omówienie wyników Reakcje przetwarzania skrobi W patencie (B9) ujawniono sposób i efekty stymulacji światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym enzymu 1,4-α-D-glukan glukohydrolazy (glukoamylaza, amyloglukozydaza EC 3.2.1.3) powszechnie stosowanej w przemyśle do hydrolizy skrobi. Zastosowanie enzymu krótko stymulowanego przez 60 minut w reakcji hydrolizy skrobi spowodowało wzrost wydajności reakcji zaledwie w początkowym czasie reakcji tj. po 15 i 30 minutach hydrolizy (rys. 2). enzym nienaswietlany enzym nawietlany swiatlem spolaryzowanym przez 1godz. stezenie glukozy c [mg/ml] 1.4 1.2 1.0 10 20 30 40 50 60 czas reakcji enzymatycznej t [min] Rys. 2. Zależność stężenia glukozy od czasu reakcji hydrolizy skrobi sago z zastosowaniem glukoamylazy: - nie naświetlanej, - naświetlanej światłem widzialnym spolaryzowanym przez 60 min. (B9). Podjęto także próbę aktywacji glukamylazy w wyniku immobilizacji na nośniku polimeru hydrożelowego [35]. Uzyskano biokatalizator aktywny w reakcji hydrolizy skrobi sago w dwóch cyklach reakcji, ale o niższej aktywności katalitycznej niż enzym w stanie wolnym. Korzystną właściwością biokatalizatora była natomiast jego stabilność. 16

Biokatalizator przechowywany przez 30 dni (temp.4 o C) posiadał wyższą aktywność katalityczną niż zastosowany bezpośrednio po immobilizacji (rys. 3). 1.0 0.8 Glukoza [mg/ml] 0.6 0.4 0.2 0.0 glukoamylaza immobilizowana - cylk I immobillizowana - cykl II immobilizowana - po 30 dniach nie immobilizowana 0 10 20 30 40 50 60 70 Czas [min] Rys. 3. Zależność stężenia glukozy od czasu reakcji hydrolizy skrobi sago z zastosowaniem glukoamylazy: - - nie immobilizowanej, biokatalizatora z immobilizowanym enzymem: - - I cykl reakcji,.; - - II cykl reakcji, - - zastosowany po 30 dniach przechowywania. Warto zaznaczyć, że niższa aktywność glukoamylaz immobilizowanych związana jest z utworzeniem niekowalencyjnego wiązania z nośnikiem hydrożelowym, polegającego na otoczeniu i zamknięciu w żelu stosunkowo niewielkich rozmiarów enzymu jakim jest glukoamylaza. Powolne uwalnianie enzymu z hydrożelu skutkuje wyższą aktywnością po 30 dniach przechowywania. Światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym stymulowano oksydazę glukozową (GOD) typii-s z Aspergillus niger (B7). Oksydaza glukozowa (E.C 1.1.3.4.) jest oksydoreduktazą, która katalizuje utlenianie β-d-glukozy do kwasu D-glukonowego. Enzym ten posiada największe znaczenie w przemyśle spożywczym oraz w zastosowaniach analitycznych, gdzie kontrolowane jest stężenie glukozy. W przemyśle spożywczym enzym ten jest powszechnie używany do eliminacji tlenu i glukozy z produktów spożywczych oraz jako biosensor do oznaczania β-d-glukozy w żywności, substratach do produkcji żywności oraz w produktach pośrednich otrzymywanych w procesach technologicznych. 17

Oksydazę glukozową naświetlano przez 30, 60 i 120 minut światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym oraz w celu porównania, także światłem widzialnym nie spolaryzowanym o takim samym strumieniu energii. Oksydaza glukozowa była podatna na stymulację światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym. Najwyższą aktywność enzymu uzyskano w wyniku naświetlania światłem przez 60 minut, a stała szybkości reakcji utleniania glukozy była w tym przypadku blisko dwukrotnie wyższa niż dla enzymu nie stymulowanego (rys. 4). 10 D-gluconic acid [mg/ml] 8 6 4 2 0 GOD illuminated polarized light 60 min GOD illuminated polarized light 120 min GOD illuminated polarized light 30 min GOD non-illuminated 0 10 20 30 40 50 60 70 Reaction time [min] Rys. 4. Zależność stężenia kawasu D-glukonowego od czasu reakcji utleniania glukozy z zastosowaniem oksydazy glukozowej (GOD): - - nie naświetlanej, naświetlanej światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym przez: - - 30 min., - - 60 min., - - 120 min. (B7). W wyniku stymulacji światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym przez 60 minut biokatalizator zyskał większą stabilność temperaturową i ph w porównaniu do enzymu natywnego (rys. 5 i rys. 6). 18

0.35 GOD illuminated polarized light 60 min GOD non-illuminated Activity [(mg/ml)/min] 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 20 25 30 35 40 Temperature [ o C] Rys. 5. Zależność aktywności oksydoreduktazy glukozowej od temperatury reakcji dla enzymu: - - nie naświetlanego oraz - - naświetlanego światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym (B7). 0.35 GOD illuminated polarized light 60 min GOD non-illuminated Activity [(mg/ml)/min] 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 4 5 6 7 8 ph Rys. 6. Zależność aktywności oksydoreduktazy glukozowej od ph reakcji dla enzymu: - - nie naświetlanego oraz - - naświetlanego światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym (B7). 19

Dodatkowo oksydoreduktazę glukozową bezpośrednio po stymulacji światłem poddano procesowi liofilizacji. Liofilizowany biokatalizator wykazywał w reakcji zaledwie 30% spadek aktywności katalitycznej w porównaniu do enzymu nie liofilizowanego. W wyniku stosunkowo niedługiej (60min.) stymulacji światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym oksydoreduktazy glukozowej uzyskano biokatalizator o znacznie wyższej aktywności oraz większej stabilności temperaturowej i ph. Stymulację światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym można z sukcesem stosować także dla mieszaniny enzymów. W pracy B9 przedstawiono reakcje jednoczesnej hydrolizy i utleniania skrobi z zastosowaniem mieszaniny enzymów stymulowanych światłem. Sporządzono mieszaninę enzymów: glukoamylazy (EC 3.2.1.3) oraz oksydazy glukozowej (E.C 1.1.3.4.), które naświetlano światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym. Hydroliza skrobi z zastosowaniem katalizatora uzyskanego w wyniku naświetlania enzymów przebiega z większą szybkością niż w przypadku zastosowania mieszaniny enzymów nie naświetlanych. Stymulacji światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym poddano glukozyltransferazę cyklodekstynową (CGTase) (EC 2.4.1.19), która katalizuje otrzymywanie ze skrobi cyklicznych, liniowych α-(1-4) oligosacharydów α-, β-, γ-cyklodekstryn zawierających odpowiednio 6, 7 i 8 jednostek α-d-glukozowych (B9 i B5). Produktem reakcji z zastosowaniem CGTase jest mieszanina cyklodekstryn, wymagająca rozdziału na poszczególne cyklodekstryny. Na skalę przemysłową CGTase używana jest do produkcji cyklodekstryn oraz w celu upłynniania skrobi [36]. Budowa cyklodekstryn korzystnie wpływa na możliwość tworzenia kompleksów z różnymi innymi cząsteczkami. Z tego powodu cyklodekstryn znajdują bardzo szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, ale także farmaceutycznym, kosmetycznym, chemicznym a także w rolnictwie [37,38]. W przemyśle spożywczym cyklodekstryny stosowane są do pochłaniania niekorzystnych zapachów i smaków, wiązania substancji lotnych czy też toksycznych powstających podczas przechowywania. Cyklodekstryny mają też za zadanie utrwalać pożądany smak, zapach i barwę wybranych produktów. W wyniku reakcji otrzymuje się zazwyczaj najwięcej α- lub β-cyklodekstryn, a bardzo niewielkie ilości γ-cykolodekstryn. Wykonano reakcje hydrolizy o niskich stężeniach skrobi i enzymu dla których, optymalny czas stymulacji światłem wynosił 60 minut. Stymulacja światłem zmieniła 20

selektywność reakcji, w której otrzymano przeważające ilości β-cyklodekstryn, podczas kiedy zastosowanie enzymu nie naświetlanego dawało najwięcej α-cyklodekstryn (rys. 7). 0,25 CD CD CD c s =0,01 g/ml c e =0,004 ml/ml t r =2 h T=37 o C CD g/1g sago 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 10 20 30 40 50 60 70 czas naświetlania enzymu [min] Rys. 7. Zależność stężenia α-, β-, γ-cyklodekstryn od czasu naświetlania enzymu zastosowanego w reakcji przez 2godz. (małe stężenie skrobi i enzymu) (B9). W reakcjach hydrolizy o wyższych stężeniach skrobi i enzymu optymalna stymulacja światłem wynosiła 2 godziny i powodowała zwiększenie całkowitej wydajności reakcji. Znacznie wzrosła także ilość otrzymanych β-cyklodekstryn i γ-cykolodekstryn (rys. 8). 21

0,6 0,5 CD CD CD c s =0,02 g/ml c e =0,008 ml/ml t r =2 h T=37 o C CD g/1g sago 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 6 czas naświetlania enzymu [h] Rys. 8. Zależność stężenia α-, β-, γ-cyklodekstryn od czasu naświetlania enzymu zastosowanego w reakcji przez 2godz. (duże stężenie skrobi i enzymu) (B9). Dodatkowo określono trwałość stymulacji glukozyltransferazy cyklodekstynowej światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym. Stymulowany enzym przechowywano przez 90 dni w temperaturze 4 o C bez dostępu światła, a następnie zastosowano w reakcji hydrolizy i tworzenia cyklodekstryn. Uzyskano podobne rezultaty jak w przypadku zastosowania enzymu bezpośrednio po naświetlaniu (rys. 9). 22

Cyklodekstryny [g/1g sago] 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 cyklodekstryna cykoldekstryna cyklodekstryna 0.00 0 15 30 45 60 Czas naświetlania enzymu [min] Rys. 9. Zależność stężenia α-, β-, γ-cyklodekstryn od czasu naświetlania enzymu zastosowanego w reakcji przez 2godz. (małe stężenie skrobi i enzymu). Enzym po aktywacji światłem przechowywano przez 90dni (B9). W wyniku stymulacji światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym glukozyltransferazy cyklodekstynowej używanej powszechnie w przemyśle uzyskano biokatalizator o wyżej aktywności oraz odmiennej selektywności w stosunku do otrzymywanych produktów. Podjęto także próbę aktywacji glukozyltransferazy cyklodekstynowej w wyniku immobilizacji na nośniku polimeru hydrożelowego [35]. Uzyskano biokatalizator aktywny w reakcji hydrolizy skrobi sago w dwóch cyklach reakcji, ale o niższej aktywności katalitycznej niż enzym w stanie wolnym. Przechowywanie biokatalizatora przez 30 dni (temp.4 o C) nie wpływało na zmianę jego aktywności (rys. 10). 23

Cyklodekstryny [mg/ml] 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 cyclodekstryn glycosyltransferaza immobilizowana - cykl I immobilizowana - cykl Il immobilizowana - po 30 dniach nie immobilizowana 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Czas [min] Rys. 10. Zależność stężenia cyklodekstryn w przeliczeniu na β-cyklodekstryny od czasu reakcji z zastosowaniem enzymu: - - nie immobilizowanego, biokatalizatora z immobilizowanym enzymem: - - I cykl reakcji,.; - - II cykl reakcji, - - zastosowany po 30 dniach przechowywania. Opisano sposób otrzymywania i działania biokatalizatorów do reakcji hydrolizy skrobi opartych na sześciu poliwinyloamidowych i trzech poliwineloforamidowych polimerach hydrożelowych, na których immobilizowano termostabilną α-amylazę [50]. Enzym był kowalencyjnie wiązany z nośnikami przy użyciu aldehydu glutarowego jako łącznika. Procedura unieruchamiania została zoptymalizowana z uwzględnieniem temperatury, ph, czasu, sekwencji i rodzaju reakcji dla każdego z nośników. Określono także wydajność i trwałość immobilizacji. Wszystkie uzyskane biokatalizatory były aktywne w reakcjach hydrolizy skrobi. Enzymy unieruchomione na dwóch z zastosowanych nośników (nie hydrolizowany i poddany hydrolizie zasadowej) wykazywały wyższą aktywność niż enzym w stanie wolnym i były aktywne katalitycznie w dwóch cyklach reakcji. Hydrolizę skrobi prowadzono także z zastosowaniem α-amylazy z Geobacillus stearothermophilus naświetlanej światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym oraz światłem nie spolaryzowanym. Stwierdzono wzrost aktywności katalitycznej biokatalizatora po ekspozycji na światło spolaryzowane. Efektu stymulacji nie było w przypadku naświetlania światłem nie spolaryzowanym (rys. 11). 24

1.0 Maltoza [mg/1mg sago] 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 k 1 =3,2 10-2 k 1 =2,9 10-2 k 1 =4,5 10-2 k 2 =7,4 10-4 k 2 =11,1 10-4 k 2 =8,8 10-4 nonilluminated nonpolarized linearly polarized 0 20 40 60 80 100 120 Czas reakcji [min] Rys. 11. Zależność stężenia maltozy od czasu reakcji hydrolizy skrobi sago z zastosowaniem α-amylazy: - - nie naświetlanej, - - naświetlanej światłem nie spolaryzowanym, - - naświetlanej światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym. Dwie α-amylazy, ale różnego pochodzenia: termostabilną z Geobacillus stearothermophilus oraz α-amylaze z Bacillus licheniformis immobilizowano na nośniku polimeru hydrożelowego [35]. Biokatalizator otrzymany w wyniku unieruchomienia termostabilnej α-amylazy z Geobacillus stearothermophilus pracował w dwóch cyklach reakcji hydrolizy skrobi sago i posiadał wyższą aktywność niż enzym w stanie wolnym (rys. 12). 25

1.8 Maltoza [mg/ml] 1.6 1.4 1.2 1.0 immobilizowany enzym cykl I immobilizowany enzym cykl II nie immobilizowany enzym 0.8 0.6 10 20 30 40 50 60 Czas [min] Rys. 12. Zależność stężenia maltozy od czasu reakcji hydrolizy skrobi z zastosowaniem α-amylazy z Geobacillus stearothermophilus; - - enzym nie immobilizowany, biokatalizator z enzymem immobilizowanym: - - pierwszy cykl reakcji, - - drugi cykl reakcji [35]. Biokatalizator otrzymany w wyniku unieruchomienia α-amylazy z Bacillus licheniformis posiadał niższą aktywność katalityczną niż enzym nie immobilizowany. Przechowywanie biokatalizatora przez 60 dni (w temp.4 o C) spowodowało dodatkowe obniżenie jego aktywności (rys. 13). Immobilizacja tej α-amylazy wpłynęła na obniżenie aktywności katalitycznej oraz stabilności. 26

1.0 Maltoza [mg/ml] 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 amylaza immobilizowana immobilizowana - po 60 dniach nie immobilizowana 10 20 30 40 50 60 70 Czas reakcji [min] Rys. 13. Zależność stężenia maltozy od czasu reakcji hydrolizy skrobi z zastosowaniem α-amylazy z Bacillus licheniformis; - - enzym nie immobilizowany, biokatalizator z enzymem immobilizowanym: - - zastosowany bezpośrednio po immobilizacji, - - zastosowany po 60 dniach od immobilizacji [35]. Na podstawie przeprowadzonych reakcji hydrolizy stwierdzono odmienny wpływ danego nośnika na ten sam enzym, ale o różnym pochodzeniu. W pracy (B3) opisano przetwarzanie skrobi polegające na delikatnej hydrolizie jej granuli, a następnie poddaniu reakcji utleniania w celu otrzymania skrobi dialdehydowej. W warunkach naturalnych w granuli skrobi znajduje się niewielka ilość enzymów amylolitycznych. W wyniku naświetlania, aktywowano enzymy amylolityczne towarzyszące granuli skrobi, wywołując delikatne uszkodzenie granuli. Na tym etapie nie stosowano dodatkowych enzymów. Podobne efekty łagodnej degradacji skrobi w wyniku stymulacji światłem widzialnym opisano w literaturze [39-41]. Światło widzialne liniowo spolaryzowane uszkodziło granulkę skrobi, bez zmiany krystaliczności wnętrza granuli. Granule skrobi poddane wstępnej hydrolizie w wyniku aktywacji światłem, posiadały większą podatność na utlenianie (rys. 14). Naświetlone skrobie dialdehydowe hydrolizowały szybciej pod wpływem glukoamylazy. 27

a) b) c) Rys. 14. Zdjęcia SEM granuli skrobi ziemniaczanej: strona lewa nie naświetlane, prawa naświetlane światłem widzialnym linio spolaryzowanym, a) nie utleniane, b) utleniane prze 30 minut, c) utleniane przez 60 minut (B3). Jednym z wniosków pracy (B3) jest stwierdzenie, że stymulacja światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym dotyczy nie tylko enzymów wprowadzanych do reaktora podczas hydrolizy, ale także wpływa na enzymy naturalnie towarzyszące skrobi. Reakcje przetwarzania celulozy i produktów celulozowych Celulazy (EC 3.2.1.4) z Aspergillus species naświetlano światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym przez 30, 60, 120 i 180 minut (B1). Otrzymane katalizatory celulolityczne testowano w reakcjach hydrolizy celulozy mikrokrystalicznej i długołańcuchowej. Zarówno w 28

reakcji hydrolizy celulozy mikrokrystalicznej jak i długołańcuchowej zaobserwowano efekt aktywacji enzymu światłem w miarę wzrostu czasu naświetlania (rys.15 i rys. 16). Rys. 15. Zależność stopnia polimeryzacji od czasu hydrolizy celulozy mikrokrystalicznej z zastosowaniem celulazy: nie naświetlanej, naświetlanej przez: 30 minut, 60 minut, 120 minut, 180 minut (B1). 29

Rys. 16. Zależność stopnia polimeryzacji od czasu hydrolizy celulozy długołańcuchowej z zastosowaniem celulazy: nie naświetlanej, naświetlanej przez: 30 minut, 60 minut, 120 minut, 180 minut (B1). Wzrost aktywności katalitycznej enzymu korelował z wydłużaniem czasu naświetlania, ale tylko do 120 minut. Naświetlanie dłuższe niż 120 minut nie dawało dodatkowej stymulacji, co potwierdziły wyznaczone wartości stałych szybkości reakcji (B1). Stymulacja enzymu światłem wpłynęła także pozytywnie na obniżenie wartości LODP zarówno dla celulozy mikrokrystalicznej jak i długołańcuchowej. Wartość LODP (leveloff DP) określa stopień polimeryzacji trudno hydrolizowalnych (nie hydrolizowalnych) fragmentów celulozy [42]. Dla reakcji hydrolizy celulozy długołańcuchowej i mikrokrystalicznej, wyznaczono wartości stałych Michaelisa-Menten (K M ) z zastosowaniem biokatalizatorów stymulowanych światłem i nie naświetlanych enzymów. Naświetlanie od 30 do 120 minut spowodowało obniżenie wartości stałych Michaelisa-Menten (K M ), co świadczy o większym powinowactwie stymulowanych biokatalizatorów do obu substratów tj. celulozy długołańcuchowej i mikrokrystalicznej. W wyniku stymulacji celulazy z Aspergillus species światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym uzyskano biokatalizatory o wyższej aktywności, większym powinowactwie 30

do celulozy mikrokrystalicznej i długołańcuchowej i wydajniej hydrolizujące oba te rodzaje celulozy (B1). Trzy komercyjne enzymy celulolityczne: Viscozyme L, Novozym 476 oraz celulazy z Aspergillus sp. immobilizowano na polimerowym nośniku otrzymanym w procesie rodnikowej kopolimeryzacji N-winyloformamidu (NVF) z dimetakrylanem glikolu etylenowego (EGDMA) w odwróconej suspensji (otrzymano w Zakładzie Polimerów, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński) (B4). Enzymy immobilizowano stosując aldehyd glutarowy (GA) jako łącznik między nośnikiem a celulazami. Otrzymane biokatalizatory nośnik-ga-enzym testowano w reakcjach hydrolizy papieru celulozowego P1 [43,44], a także ścieru drzewnego pochodzącego ze ściętych drzew iglastych (tzw. drewno miękkie). Biokatalizator uzyskany w wyniku immobilizacji koktajlu enzymatycznego Viskozyme L wykazywał dużo wyższą aktywność niż enzymy w stanie wolny. Z dużą szybkością hydrolizował zarówno papier celulozowy jak i ścier drewniany, był aktywny aż w trzech cyklach reakcji. W przypadku hydrolizy papieru we wszystkich trzech cyklach miał wyższą aktywność niż enzym nie immobiliowany, w przypadku drewna aktywność ta była wyższa w dwóch cyklach hydrolizy. Biokatalizator otrzymany w wyniku unieruchomienia na nośniku celulaz Novozym 476 posiadał wyższą aktywność katalityczną niż enzym w stanie wolnym w reakcji hydrolizy papieru celulozowego. Otrzymane biokatalizatory wykazywały większe powinowactwo do substratów, o czym świadczy niższa wartość stałej Michaelisa-Menten K M w porównaniu do wolnych enzymów. Celulaza z Aspergillus sp. obniżyła swoją aktywność w wyniku immobilizacji na nośniku, ale i tak była aktywna w trzech cyklach reakcji hydrolizy ścieru drzewnego i papieru celulozowego. W pracy (B4) zaprezentowano heterofazowe biokatalizatory w postaci celulaz immobilizowanych na nośniku polimerowym posiadającym silnie polarne grupy formamidowe. Biokatalizatory były aktywne w trzech cyklach hydrolizy ścieru drzewnego i papieru celulozowego. Część otrzymanych katalizatorów posiadała wyższą aktywność katalityczną niż enzymy w stanie wolnym. Biokatalizatory wykazywały odmienne powinowactwo do każdego z substratów, dlatego w celu uzyskania optymalnej wydajności reakcji hydrolizy biokatalizatory należy indywidualnie dobierać dla każdego z materiałów celulozowych. 31

Na nośniku poli(n-winyloformamidowym) hydrolizowanym w środowisku kwaśnym unieruchomiono celulazę z Aspergillus sp. W jednym przypadku zastosowano aldehyd glutarowy (GA) jako łącznik, w drugim enzym unieruchomiono bezpośrednio na nośniku. Biokatalizator typu nośnik-ga-enzym testowano w rekcji hydrolizy celulozy długołańcuchowej (rys. 17). Stezenie cukrow redukujacych [mg/ml] 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 cellulaza z Aspergillus sp. nie immobilizowana immobilizowana z GA immobilizowana bez GA 0 100 200 300 400 500 Czas reakcji [min] Rys. 17. Zależność stężenia cukrów redukujących od czasu reakcji hydrolizy celulozy długołańcuchowej z zastosowaniem celulazy z Aspergillus sp.; - - enzym nie immobilizowany, biokatalizator z enzymem immobilizowanym: - - z GA jako łącznikiem, - - bez łącznika. Oba biokatalizatory posiadały wyższą aktywność katalityczną niż enzym w stanie wolnym, jednak enzym unieruchomiony bezpośrednio na nośniku był najbardziej aktywny, co potwierdzają wysokie wartości stałych szybkości reakcji oraz wydajność reakcji hydrolizy (Tabela 2). 32

Tabela 2. Stałe szybkości i wydajność reakcji hydrolizy celulozy długołańcuchowej z zastosowaniem celulazy z Aspergillus sp. Celulaza z Aspergillus sp. Stała szybkości [mg ml -1 min -1 ] k 1 x10-3 k 2 x10-4 Wydajność hydrolizy po 24 h [mg/ml] Nie immobilizowana 2,9 11,8 0,46 Immobilizowana z GA 7,9 8,7 0,56 Immobilizowana bez GA 11,7 3,4 0,75 Natomiast w przypadku biokatalizatora nośnik-ga-enzym zaobserwowano wzrost stabilności na zmiany temperatury i ph reakcji w porównaniu do biokatalizatora nośnik-enzym oraz enzymu w stanie wolnym (rys. 18) i (rys.19). Stezenie cukrow redukujacych [mg/ml] 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 cellulaza z Aspergillus sp. nie immobilizowana immobilizowana z GA immobilizowana bez GA 20 30 40 50 60 70 Temperatura [ o C] Rys. 18. Zależność stężenia cukrów redukujących od temperatury w reakcji hydrolizy celulozy długołańcuchowej z zastosowaniem celulazy z Aspergillus sp.: - - enzym nie immobilizowany, biokatalizator z enzymem immobilizowanym: - - z GA jako łącznikiem, - - bez łącznika. 33

0.9 Stezenie cukrow redukujacych [mg/ml] 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 cellulaza z Aspergillus sp. nie immobilizowana immobilizowana z GA immobilizowana bez GA 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 ph Rys. 19. Zależność stężenia cukrów redukujących od ph w reakcji hydrolizy celulozy długołańcuchowej z zastosowaniem celulazy z Aspergillus sp.: - - enzym nie immobilizowany, biokatalizator z enzymem immobilizowanym: - - z GA jako łącznikiem, - - bez łącznika. Immobilizacja celulaz na nośniku z zastosowaniem łącznika GA, powoduje najprawdopodobniej wielopunktowe związanie enzymu z nośnikiem, co skutkuje obniżeniem aktywności katalitycznej [45,46]. W immobilizacji wielopunktowej tworzą się ograniczenia sferyczne wokół cząsteczek enzymów dzięki czemu są one usztywnione i bardziej odporne, co objawia się podwyższoną stabilnością enzymu na zmiany temperatury i ph [47]. Biokatalizator nośnik-enzym Aspergillus sp. bez łącznika GA zastosowano także w reakcji hydrolizy stosunkowo odpornej celulozy mikrokrystalicznej (rys. 20). 34

Stezenie cukrow redukujacych [mg/ml] 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 celulaza z Aspergillus sp. nie immobilizowana immobilizowana - cykl I immobilizowana - cykl II immobilizowana - cykl III 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Czas reakcji [min] Rys. 20. Zależność stężenia cukrów redukujących od czasu reakcji hydrolizy celulozy mikrokrystalicznej z zastosowaniem celulazy z Aspergillus sp.; - - enzym nie immobilizowany, biokatalizator z enzymem immobilizowanym: - - I cykl reakcji, - - II cykl reakcji, - - III cykl reakcji. Biokatalizator posiadał bardzo wysoką aktywność katalityczną, w dwóch cyklach reakcji wyższą niż enzym w stanie wolnym (Tabela 3). Tabela 3. Stałe szybkości i wydajność reakcji hydrolizy celulozy mikrokrystalicznej z zastosowaniem celulazy z Aspergillus sp. Celulaza z Aspergillus sp. Stała szybkości [mg ml -1 min -1 ] k 1 x10-3 k 2 x10-4 Wydajność hydrolizy po 24 h [mg/ml] Nie immobilizowana 4,2 13,0 0,48 Immobilizowana - cykl I 24,3 10,1 0,83 Immobilizowana - cykl II 18,3 3,1 0,74 Immobilizowana cykl III 3,2 7,4 0,41 35

Biokatalizatory w postaci celulazy Novozym 476 unieruchomionej na trzech nośnikach opisano w pracy (B2). Do immobilizacji enzymu wybrano trzy nośniki o różnym stopniu usieciowania (otrzymane w Zakładzie Polimerów, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński). Celulazy unieruchamiano na nośnikach poprzez łącznik aldehyd glutarowy. Otrzymano stabilne biokatalizatory posiadające kowalencyjne wiązania imidowe nośnikłącznik-enzym. Wszystkie biokatalizatory wykazywały aktywność katalityczną w reakcji hydrolizy celulozy mikrokrystalicznej. Stwierdzono że, wyższą aktywność niż enzym nie immobilizowany miał biokatalizator otrzymany poprzez unieruchomienie celulazy na nośniku o wysokim stopniu usieciowania i sferycznym kształcie ziaren. Reakcje przetwarzania ksylanu Hydrolizę ksylanu przeprowadzono z zastosowaniem katalizatora otrzymanego w wyniku stymulacji światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym endo-1,4-β ksylanazy (EC 3.2.1.8) z Themomyces lanuginosus otrzymanej na drodze fermentacji genetycznie modyfikowanych mikroorganizmów Aspergillus oryzae (B6 i B9). Enzym stymulowano światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym oraz światłem nie spolaryzowanym (o podobnym strumieniu energii) przez 60 i 120 minut. W celu porównania rezultatów, wykonano także reakcje hydrolizy z naświetlanym wyłącznie substratem (ksylan) oraz z naświetlaną mieszaniną reakcyjną (ksylan + ksylanaza w buforze fosforanowym). Rezultaty hydrolizy ksylanu przedstawiono na rys. 21 (B9). 36

0.9 0.8 Ksyloza [mg/mg xylan] 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 50 100 150 200 250 300 350 Czas reakcji [min] Rys. 21. Zależność stężenia ksylozy od czasu reakcji hydrolizy ksylanu z zastosowaniem ksylanazy z Themomyces lanuginosus.; - - enzym nie naświetlany, - - enzym naświetlany 120 min., - - naświetlany substrat, - - naświetlana mieszanina reakcyjna do 300 min. Naświetlanie mieszaniny reakcyjnej podczas hydrolizy nie przyniosło żadnych zmian w przebiegu reakcji. Najwolniej przebiega hydroliza naświetlanego substratu (ksylanu) z nie naświetlanym enzymem (ksylanazą). Biokatalizator o najwyższej aktywności katalitycznej uzyskano w wyniku naświetlania enzymu przez 120 minut. Wykazano także, że stymulujący wpływ na ksylanazę miało naświetlanie światłem nie spolaryzowanym. Wyższą aktywność katalityczną obserwuje się jednak w przypadku enzymu naświetlanego światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym rys. 22 (B9). 37

0.8 wzorzec 1godz. bez filtra polaryzacyjnego 1godz. 2godz. 0.7 Stężnie ksylozy [mg/ml] 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 60 120 Czas reakcji enzymatycznej [min] Rys. 22. Zależność stężenia ksylozy od czasu reakcji enzymatycznej hydrolizy ksylanazy z Themomyces lanuginosus: nie naświetlanej, - naświetlanej światłem nie spolaryzowanym przez 1 godz., - naświetlanym światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym przez 1 godz., - naświetlanym światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym przez 2 godz. Reakcje przetwarzania chityny i chitozanu Hydrolizę chityny i chitozanu z zastosowaniem enzymów stymulowanych światłem opisano w pracy (B8). Zaobserwowano stymulący wpływ światła spolaryzowanego na wzrost aktywności katalitycznej chitynazy rys. 23 i chitozanazy rys. 24. 38

0.6 N-Acetyl-D-glucosamine [mg/ml] 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 20 40 60 80 100 120 140 Czas reakcji [min] Rys. 23. Zależność stężenia N-acetylo-D glukozaminy od czasu reakcji hydrolizy z zastosowaniem chitynazy: - - nie naświetlanej, - - naświetlanej światłem nie spolaryzowanym, oraz naświetlanej światłem spolaryzowanym przez: - - 30 min., - - 60 min., - - naświetlany substrat przez 60 min. (B8). 0.6 Glukozamina [mg/ml] 0.5 0.4 0.3 0.2 0 20 40 60 80 100 Czas reakcji [min] Rys. 24. Zależność stężenia glukozaminy od czasu reakcji hydrolizy z zastosowaniem chitozanazy: - - nie naświetlanej, naświetlanej światłem spolaryzowanym przez: - - 30 min., - - 60 min., - - 60 min. (B8). 39

Efekt stymulacji światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym korelował ze wzrostem czasu naświetlania. Nie stwierdzono efektu aktywującego w przypadku naświetlania światłem nie spolaryzowanym oraz naświetlania światłem spolaryzowanym mieszaniny reakcyjnej. Podjęto próbę aktywacji chitozanazy i chitynazy w wyniku immobilizacji na nośniku polimeru hydrożelowego [35]. Uzyskano biokatalizator aktywny w reakcji hydrolizy chityny w dwóch cyklach reakcji, ale o niższej aktywności katalitycznej niż enzym w stanie wolnym (rys. 25). N-acetylo-glucosamina [mg/ml] 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 chitynaza nie immobilizowana immobilizowana - cykl I immobilizowana - cykl Il 10 20 30 40 50 60 Czas reakcji [min] Rys. 25. Zależność stężenia N-acetylo-D glukozaminy od czasu reakcji hydrolizy z zastosowaniem chitynazy: - - nie immobilizowanej, oraz biokatalizatora z immobilizowanym enzymem: - - I cykl reakcji, - - II cykl reakcji [35]. Chitozanaza immobilizowana na nośniku posiadała bardzo niską aktywność katalityczną (rys. 26). 40

Glucosamina [mg/ml] 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 chitozanaza immobilizowana nie immobilizowana 20 40 60 80 100 Czas reakcji [min] Rys. 26. Zależność stężenia glukozaminy od czasu reakcji hydrolizy z zastosowaniem chitozanazy: - - nie immobilizowanej oraz - - biokatalizatora z enzymem immobilizowanym [35]. Przeprowadzone badania spektroskopowe (RAMAN i UV-Vis) wykazały, że reaktywne grupy formamidowe na powierzchni nośników nie zapewniają trwałego wiązania enzym-ganośnik, z tego powodu w przeprowadzonych testach katalitycznych badane biokatalizatory charakteryzowały się mniejszą aktywnością niż enzym w formie natywnej. Reakcje przemiany mieszaniny polisacharydów W patencie (B10) głównym celem było opracowanie metody badania szybkości degradacji polisacharydów w produktach leczniczych, zwłaszcza w syropach ziołoleczniczych, przeznaczonych do dłuższego przechowywania. Szybkość degradacji polisacharydów jest miarą rozpadu produktu leczniczego. Ustalenie czasu, po którym nastąpi krytyczny stopień rozkładu polisacharydu w produkcie leczniczym pozwala na określenie, po jakim czasie produkt leczniczy traci swoje właściwości lecznicze. Umożliwia to tym samym wyznaczenie okresu przydatności do spożycia lub okresu ważności produktów leczniczych. Z tego powodu konieczne było przeprowadzenie badań i określenie jakim reakcjom ulegają polisacharydy w produktach. Badaniom poddano syrop prawoślazowy wyprodukowany z Zakładzie Farmaceutycznym AMARA w Krakowie. Badano między innymi degradację polisacharydów na drodze kwaśnej hydrolizy, utleniania a także hydrolizy enzymatycznej, określono wpływ promieniowania UV i światła liniowo spolaryzowanego na stopień 41

polimeryzacji polisacharydów w syropie. Część z powyższych rezultatów została zaprezentowana w pracy magisterskiej Edyty Pięty pt. Opracowanie alternatywnych metod badania preparatów farmaceutycznych w procesie produkcyjnym, której habilitantka była promotorem [51]. Podczas badań enzymatycznej hydrolizy syropu prawoślazowego z zastosowaniem mieszaniny enzymów: glukoamylazy i ksylanazy wykazano wpływ naświetlania światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym na przebieg degradacji polisacharydów w syropie. Hydroliza polisacharydów z zastosowaniem enzymów aktywowanych światłem przebiegała z większą szybkością, co potwierdzają wyznaczone stałe szybkości reakcji (rys. 27). 1.0 Stezenie cukrow redukujacych [mg/ml] 0.9 0.8 0.7 0.6 k 1 =1.17 10-2 [mg ml -1 min -1 ] k 1 =1.32 10-2 [mg ml -1 min -1 ] k 2 =8.7 10-4 [mg ml -1 min -1 ] k 2 =11.1 10-4 [mg ml -1 min -1 ] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Czas reakcji enzymatycznej [min] Rys. 27. Enzymatyczna degradacja polisacharydów w syropie prawoślazowy z zastosowaniem mieszaniny enzymów: glukoamylaza + ksylanaza: - - nie stymulowanej światłem, - - naświetlanej światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym. Wnioski wyciągnięte na podstawie degradacji polisacharydów w syropie prawoślazowym i potwierdzenie wpływu światła widzialnego liniowo spolaryzowanego na degradację syropu były powodem, dla którego habilitantka zajęła się tą problematyką badań. 42

Wnioski Otrzymano biokatalizatory homo- i heterofazowe w postaci enzymów aktywowanych fizycznie poprzez naświetlanie światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym oraz chemicznie w wyniku immobilizacji na nośnikach polimerowych. Uzyskane biokatalizatory efektywnie hydrolizują surowce polisacharydowe: skrobię, celulozę, ksylan, chitynę, chitozan. Fizykochemiczna aktywacja spowodowała, że otrzymane biokatalizatory mają wyższą aktywność, stabilność temperaturową i ph, odmienną selektywność w porównaniu do enzymu natywnego. Wykazano korzystną stymulację enzymów poprzez naświetlanie światłem liniowo spolaryzowanym o długości fali z zakresu światła widzialnego. Naświetlanie światłem liniowo spolaryzowanym indukuje zmiany konformacji enzymów, co wpływa na zmianę ich aktywności katalitycznej, selektywności, a w przypadku niektórych enzymów zmieniało stabilność na zmiany temperatury i ph. Stymulacja enzymów bezpośrednio przed wprowadzeniem do reakcji zapewniała największe korzyści. Jednak zmiany konformacji wywołanie naświetlaniem były na tyle trwałe, że niektóre ze stymulowanych enzymów można było przechowywać przez okres 1-3 miesięcy bez utraty ich właściwość. Należy zaznaczyć że, reakcję enzymatyczną z naświetlanymi biokatalizatorami wykonywano w sposób standardowy i ze standardowych substratów. Stwierdzono, że optymalna ilość energii dostarczonej do enzymu w wyniku naświetlenia (regulowana natężeniem i czasem naświetlania) była stała dla danego enzymu. Badania z zakresu immobilizacji enzymów na nośnikach wykazały, że ten sam nośnik na jeden enzym działał synergizująco, jeśli chodzi o aktywność katalityczną, na inny wywierał wpływ wręcz dezaktywujący, a jeszcze w innych przypadkach pozostawał mniej lub bardziej obojętny. Podobne zmiany zaobserwowano w przypadku stabilności temperaturowej i ph immobilizowanych enzymów. Z przeprowadzonych badań jak i ze światowej literatury [48,49] wynika, że brak jest ogólnych wytycznych, które pozwalałyby usystematyzować dobór najefektywniejszego nośnika dla określonego enzymu, sposobu immobilizacji, zastosowania łączników itp. dominuje zasada prób i błędów. Stwierdzono, że właściwości nośników w odniesieniu do immobilizacji enzymów determinowane są takimi cechami jak porowatość matrycy, wielkość i kształt porów, hydrofilowość czy hydrofobowość szkieletu, polarność spowodowana obecnością różnych grup funkcyjnych. Udowodniono, że polimery oparte na poli(n-winyloformamidzie) mogą być z sukcesem stosowane jako nośniki do immobilizacji wielu enzymów. 43

Unieruchomienie enzymów na nośnikach przeprowadzono wieloma sposobami, najkorzystniejsze jednak okazało się związanie enzymów z podłożem wiązaniem kowalencyjnym. Zastosowanie aldehydu glutarowego jako łącznika determinowało jednopunktowy sposób wiązania i było dla niektórych enzymów korzystne, a dla innych nie. Wykazano, że większość nośników z grupami aminowymi wymaga aktywacji aldehydem glutarowym, zanim zostaną użyte do immobilizacji z wytworzeniem wiązania kowalencyjnego enzym-nośnik. Jednak w przypadku zastosowania nośników hydrożelowych enzymy były otaczane i zamykane przez łańcuchy polimerowe. Na skutek wielopunktowych, niekowalencyjnych odziaływań cząsteczek białek z grupami nośnika, dochodziło do ich unieruchomienia dzięki stosunkowo słabym oddziaływaniom elektrostatycznym i hydrofobowym oraz wiązaniom wodorowym. W cyklu prac wykazano, że wiele parametrów decyduje o efekcie końcowym immobilizacji, czyli o ilości, aktywności, trwałości wiązania enzym-nośnik i właściwościach enzymatycznych związanego białka (aktywności katalitycznej, selektywności, stabilności temperaturowej itp.). Głównymi czynnikami, które opisano są: skład nośnika, powierzchnia dostępna dla enzymu, ilość zaktywowanych grup funkcyjnych nośnika, rodzaj czynnika wiążącego enzym z nośnikiem, dostępność grup funkcyjnych białka w danym zakresie ph, odległość związanego enzymu od powierzchni nośnika oraz orientacja przestrzenna centrum aktywnego, mono- lub wielopunktowe związanie enzymu z nośnikiem, powinowactwo chemiczne enzymu do materiału nośnika. Różne właściwości i zachowanie enzymów po immobilizacji na nośniku, wynikają z ich struktury, konformacji, stopnia polimeryzacji i rodzaju i sekwencji jednostek proteinowych. W dalszym cyklu prac badawczych należałoby dokładniej wyjaśnić odmienny wpływ danego nośnika na ten sam enzym, ale o różnym pochodzeniu. Zaobserwowano również odmienną podatność otrzymanych biokatalizatorów w stosunku do hydrolizowanych substratów. Dlatego wymiernym efektem byłoby w przyszłości opracowanie bazy biokatalizatorów o pożądanych właściwościach, celem wykorzystania w dalszych badaniach inwestycyjnych przez potencjalnych partnerów z przemysłu. W zależności od wymagań procesowych (wzrost aktywności, zmiany selektywności, stabilności temperaturowej i ph) należy dla każdej reakcji, substratu, enzymu indywidualnie na drodze eksperymentu dobierać odpowiedni sposób aktywacji fizykochemicznej. Takie postępowanie gwarantuje uzyskanie biokatalizatora o pożądanych właściwościach. 44

Przeprowadzone prace badawcze wskazują, iż zaproponowane sposoby aktywacji fizykochemicznej są stosunkowo proste i niskokosztowe, stanowią więc obiecującą metodę otrzymywania biokatalizatorów dla potrzeb procesowych i mogą znaleźć zastosowanie w wielu dziedzinach przemysłu. Dodatkowo opisane biokatalizatory otrzymywane są z powszechnie dostępnych i stosowanych w przemyśle enzymów, więc ich zastosowanie nie wymaga konieczności zmiany technologii, infrastruktury przemysłowej czy wprowadzania nowych procesów produkcyjnych. W przemyśle spożywczym wykorzystanie nowych biokatalizatorów może przyczynić się do zwiększenia funkcjonalności artykułów spożywczych, poprawy wartości odżywczych, własności sensorycznych. Pozwoli także na obniżenie kosztów i ulepszenie procesów przetwarzania żywności oraz utylizacji odpadów. Otrzymane biokatalizatory mogą przynosić korzyści w zakresie ochrony środowiska, ze względu na biodegradowalność i obniżenie zużycia energii, wpisują się więc w założenia zasad Zielonej Chemii. Literatura [1] A.D. Smith, S.P. Datta, G.H. Smith, Campbell P.N., Bentley R., McKenzie H.A. (eds) Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Oxford University Press, Oxford, 1997. [2] L. Michaelis, M. Menten, Biochemische Zeitschrift 49, 333-369. [3] R. Boyer, Concepts in Biochemistry, 2nd edn (wyd. ang.) John Wiley & Sons, Inc., New York, 2002. [4] R.M. Berka, J.R. Cherry, Enzyme biotechnology. In: Ratledge C, Kristiansen B, editors. Basic Biotechnology. 3rd edition. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2006. [5] J. Norus, (2006) European Planning Studies, 14 (5), 681 696. [6] P.B. Poulsen, H. Klaus Buchholz, History of enzymology with emphasis on food production. In: Whitaker JR, Voragen AGJ, Wong DWS, Handbook of Food Enzymology, New York, NY, USA: Marcel Dekker; 2003. [7] P. Fernandes, Enzymes in sugar industries. In: Panesar P, Marwaha SS, Chopra HK, editors, Enzymes in Food Processing: Fundamentals and Potential Applications, New Delhi, India: I.K. International Publishing House; 2010. [8] D.E. Robertson, B.A. Steer, (2004) Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 141-149. [9] L. Betancor, A. Hidalgo, G. Fernández-Lorente, C. Mateo, R. Fernández-Lafuente, J.M. Guisán (2003) Biotechnol. Prog. 19, 763-767. [10] BRENDA Enzyme Information Database, http://www. Brenda-enzymes.info/ [11] www.cazy.org/ [12] Celuloza (CID: 14055602) (ang.) w bazie PubChem, United States National Library of Medicine, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/14055602 [13] P.W. Goodenough, (1995) Molecular Biotechnology, 4, 151-166. 45

[14] E. Katchalski-Katzir, (1993) TIB, 11, 471-478. [15] B. Wang, F. Cheng, Y. Lu, W. Ge, M. Zhang, B. Yue, (2013) J. Mol. Catal. B. Enzym. 97, 137-143. [16] A. Sassolas, L.J. Blum, B.D. Leca-Bouvier, (2012) Biotech. Adv. 30, 489-511. [17] J.M. Guisan, Methods in biotechnology: immobilization of enzymes and cells, 2nd ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2006. [18] S.A. Ansari, Q. Husain, (2011) Biotech. Adv. 30, 512-523. [19] J. Kim, J.W. Grate, P. Wang, (2008) Trends Biotechnol. 26 (11) 639-646. [20] R.A. Sheldon, (2007) Adv. Synth. Catal. 349, 1289-1307. [21] C. Walsh, Enzymatic Reaction Mechanism, Freeman, San Francisco, 1979 [22] L. Cao, L. van Langeny, R.A. Sheldon, (2003) Current Opinion in Biotechnology, 14, 387 394. [23] A.R. Fersht, Structure and Mechanism in Protein Science, Freeman, New York, 1999. [24] M. Fiedorowicz, A. Konieczna Molenda, G. Khachatryan, (2007) Starch: Progress in structural studies, modifications and applications. Eds: P.Tomasik, V.Yuryev, E.Bertoft, Polish Society of Food Technologist Małopolska Branch, ISBN 978-8-390269-96-2. [25] T. Kubasowa, M. Fenyo, Z. Somosy, L. Gazso, I. Kertesz, (1988) Photochemistry and Photobiology, 48, 4, 505 509. [26] Biologic Effects of Light; Eds. M. F. Holik, E. G. Jung, Proceedings of a Symposium Basel, Switzerland, 1998. [27] Patent DE4015406 (Int.Cl. 5 A61N5/06; A61F7/00 M. Munz; Heat and light therapy procedure - radiating selection of colored polarized light for treatment of skin ailments and bodily functions. [28] H. Hoeksema, S. Monstrey, K. Van Landuyt. Ph. Blondeel, P. Tonnard, A. Verpaele, The use of polarised light in the treatment of severely burned patients. 10th Congress of the International Society for Burn Injuries, Jerusalem, Israel, 1998. [29] K. Depuydt, S. Monstrey, H. Hoeksma, The stimulating effects of polarized light on wound healing and Avoiding surgery in the treatment of deep dermal burn wounds using polarized light. 10 th Annual Meeting of the European Association of Plastic Surgeons (EURAPS), Madrid, 1999. [30] E. Bazso, Sz. Varju, P. Szego, K. Roza, P. Apai, Application of Incoherent Wide Band Polarised Light To Promote Healing of Wounds; Central Research Institute for Physics: Budapest, Hungary, 1982. [31] W. Vanscheidt, (2002) Eur. J. Plast. Surg., 24, 383-390. [32] A.E. Nave, B.B. Rubenstein, (1928) J. Biol. Chem., 89, 503-513. [33] O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall, (1951) J. Biol. Chem., 193, 265-275. [34] K. Yamamoto, Y. Imamura, E. Nagatomo, T. Sevizawa, Y. Muraoko, M. Akashi, (2003) J. Appl. Polym. Sci., 89, 1277-1282. [35] A. Konieczna-Molenda, A. Kochanowski, A. Grabiec, E. Bortel, P. Tomasik; (2008) Starch: Recent Progress in Biopolymer and Enzyme Technology, (Eds.: P. Tomasik, E. Bertoft, A. Blennow), PTTZ-Malopolska Branch, Krakow, 8, 103-120. [36] S. Pedersen, L. Dijkhuizen, B.W. Dijkstra, B.F. Jensen, S.T. Jřrgensen; (1995) Chemtech., 25, 19 25. 46

[37] J. Szejtli, (1990) Carbohydr Polym., 12, 375 392. [38] A. Lejeune, K. Sakaguchi, K. Imanaka, (1989) Anal. Biochem. 181, 6 11. [39] M. Fiedorowicz, P. Tomasik, P. C.Y. Lii, (2001) Carbohydr. Polym., 45, 79-87. [40] M. Fiedorowicz, C.Y. Lii, P. Tomasik, (2002) Carbohydr. Polym., 50, 57-62. [41] M. Fiedorowicz, G. Khachatryan, (2003) J. Sci. Food Agric., 84, 36-42. [42] O.A. Battista, S. Coppiek, J.A. Hoesmon, F.F. Morehead, W.A. Sisson, (1956) Ind. Eng. Chem., 48, 333-335. [43] A. Barański, A. Konieczna-Molenda, J.M. Łagan, L.M. Proniewicz; (2003) Restaurator, 24, 36-45. [44] L.M. Proniewicz, C. Paluszkiewicz, A. Wesełucha-Birczyńska A. i in.: (2001) Journal of Molecular Structure, 596, 163-169. [45] C. Mateo, J.M. Palomo, G. Fernandez-Lorente, J.M. Guisan, R. Fernandez-Lafuente, (2007) Enzyme Microb. Technol., 40, 1451 1463. [46] F. Lopez-Gallego, L. Betancor, A. Hidalgo, N. Alonso, G. Fernandez-Lorente, J.M. Guisan, R. Fernandez-Lafuente, (2005) Enzyme Microb. Technol., 37, 750 756. [47] F. Lopez-Gallego, L. Betancor, C. Mateo, A. Hidalgo, N. Alonso-Morales, G. Dellamora-Ortiz, J.M. Guisian, R. Fernıandez- Lafuente, (2005) J. Biotechnol., 119, 70 75. [48] J. Bryjak; (2003) Biochemical Engineering Journal, 16, 347 355. [49] I. Gancarz, J. Bryjak, M. Bryjak, G. Pozniak, W. Tylus, (2003) European Polymer Journal, 39, 1615 1622. [50] A. Konieczna-Molenda, A. Kochanowski, A. Walaszek, E. Bortel and P. Tomasik; (2009) Chemical Engineering Journal, 146, 3(15) 515-519. [51] Edyta Pięta (2010) Praca magisterska pt. Opracowanie alternatywnych metod badania preparatów farmaceutycznych w procesie produkcyjnym Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński. 47

4. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO - BADAWCZYCH Mój dotychczasowy dorobek naukowy obejmuje łącznie 29 prac, w tym 15 publikacji w czasopismach indeksowanych w bazie JCR (łączny IF wg roku opublikowania wynosi 21,875, a ilość punktów według MNiSW wynosi 549), 10 rozdziałów w monografiach (w tym 5 w materiałach konferencyjnych indeksowanych w bazie Web of Science) oraz 2 pełnotekstowe prace w innych recenzowanych czasopismach. Jestem autorem 2 patentów (w tym jednego wdrożonego w przemyśle) oraz współautorką 58 doniesień opublikowanych w materiałach konferencyjnych. Publikacje, których jestem współautorem były cytowane 205 razy (198 - bez autocytowań) według bazy Web of Science, współczynnik h (Hirsch index) w wymienionej bazie wynosi odpowiednio 6. Szczegółowa analiza bibliometryczna oraz wykaz wszystkich prac i patentów zostały przedstawione w Załączniku 6. Główny nurt prowadzonych przeze mnie badań dotyczy reakcji przemian, hydrolizy polimerów naturalnych głównie polisacharydów. W roku 1998 w ramach mojej pracy doktorskiej rozpoczęłam badania dotyczące degradacji celulozy. Badania realizowane w Zespole Katalizy Heterogenicznej oraz w Zakładzie Technologii Chemicznej pod kierunkiem Prof. dr. hab. Andrzeja Barańskiego dotyczyły problematyki degradacji papieru. Opracowałam wówczas metodykę testów przyspieszonego starzenia celulozy w warunkach tlenowych i beztlenowych, w szerokim zakresie temperatur i wilgotności względnych. 1,2 Określiłam optymalne warunki przechowywania (temperatury, wilgotności, oświetlenia itp.) książek i dokumentów w bibliotekach i archiwach. 3,4 Opracowałam kinetyczny model degradacji celulozy w zakresie temperatur 40-100 o C. 5,6 1 A. Barański, R. Dziembaj, A. Konieczna, A. Kowalski, J.M. Łagan, L. Proniewicz; (2000) Methodology of Kinetic Investigation of Cellulose Degradation; Methodology of kinetic investigation of cellulose degradation, Technologia Chemiczna na Przełomie Wieków, Wydawnictwo Stałego Komitetu Kongresów Technologii Chemicznej, Gliwice, 441-450 2 F. Krok, P. Piątkowski, P. Czuba, A. Konieczna, A. Barański, M. Szymoński; (2000) Atomic Force Microscopy Imaging of the Paper Surface Subjected to Process of Artificial Ageing; Electron Technology 33(3) 361-365 3 A. Barański, A. Konieczna Molenda, J.M. Łagan, L.M. Proniewicz; (2003) Catastrophic room temperature degradation of cellulose; Restaurator 24 36-45 4 A. Barański, R. Dziembaj, A. Konieczna-Molenda, J.M. Łagan, S. Walas; (2003) Wpływ siarczanu glinu na kwaśną degradację celulozy; Przemysł Chemiczny 82/8-9 1109-1112 5 L.M. Proniewicz, C. Paluszkiewicz, A. Wesełucha-Birczyńska, H. Majcherczyk, A. Barański, A Konieczna; (2001) FT-IR and FT-Raman study of hydrothermally degraded cellulose; Journal of Molecular Structure 596 163-169 6 A. Barański, R. Dziembaj, A. Konieczna Molenda, J.M. Łagan, S. Walas; (2004) On the Applicability of Arrhenius Equation to Accelerated Ageing Tests. The Case of Alum-impregnated Cellulose; Polish Journal of Chemical Technology 6, 1-8 48

Określiłam wpływ zakwaszenia papieru na jego trwałość podczas przechowywania. 7 Wykonałam ocenę i opis dostępnych w świecie technologii odkwaszania papieru. Po doktoracie kontynuowałam badania dotyczące problematyki degradacji polisacharydów w różnych warunkach temperatury, ph, obecności związków utleniających, naświetlania itp. Opracowałam metodę pozwalającej określić degradację polisacharydów w produktach leczniczych i spożywczych. Sposób ten został opatentowany oraz wdrożony w Zakładzie Farmaceutycznym AMARA w Krakowie 8,9. Metoda, została zatwierdzona przez Urząd Rejestracji Leków, wykorzystywana jest obecnie w przemyśle farmaceutycznym w celu określania terminu przydatności do spożycia syropu prawoślazowego. W 2005 roku rozpoczęłam pracę w Katedrze Chemii Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie pod kierownictwem Prof. dr. hab. Piotra Tomasika. Na początku mojej pracy zajmowałam się modyfikacjami i hydrolizą polisacharydów, w szczególności skrobi oraz badałam wpływu światła liniowo spolaryzowanego na właściwości polisacharydów. Byłam współautorką prac wyjaśniających wpływ światła widzialnego liniowo spolaryzowanego na strukturę krystaliczną ziaren skrobi o różnym pochodzeniu biologicznym. Określiłam wpływ tego promieniowania na podatność na hydrolizę, właściwości termiczne, masę cząsteczkową, lepkość, a więc właściwości funkcjonalne skrobi posiadające znaczenie w jej przetwórstwie przemysłowym. 10,11 Wykazałam większą podatność polisacharydów naświetlanych światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym na hydrolizę enzymatyczną. 12,13 7 A. Barański, D. Dutka, R. Dziembaj, A. Konieczna-Molenda, J.M. Łagan; (2004) Effect of Relative Humidity on the Degradation Rate of Cellulose. Methodology Studies; Restaurator 25 68-74. 8 A. Konieczna-Molenda; (2011) Sposób określenia szybkości degradacji polisacharydów w produktach leczniczych, zwłaszcza w syropach ziołoleczniczych, polski patent PL 379152. 9 L. Krzemińska-Fiedorowicz, K. Khachatryan, A. Konieczna-Molenda (2018) Evaluation of Polysaccharides Durability in Syrup of Marsh Mallow (2018) Procceedings of the 14th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Prague, Czech Republic, Prague, Czech Republic, 238-242. 10 Fiedorowicz M., Khachatryan G., Konieczna - Molenda A., Yuryev V. P., Wasserman L. A. (2006) Illumination of sago starch with linearly polarized visible light, In: Starch: Recent Achievements in Understanding of Structure and Functionality, (Eds. Yuryev V., Tomasik P., Bertoft E.) Nova Science Publishers, NY, ISBN: 1-60021-227-1. 11 M. Fiedorowicz, A. Konieczna Molenda, G. Khachatryan, H. Staroszczyk, P. Tomasik, (2007), Polarized light as a powerful tool in physical and enzymatic modifications of carbohydrates, In: Consumer Protection through Food Process Improvement & Innovation in the Real World, Hellenic Association of Food Technologists, North Greece Branch, Thessaloniki GREECE ISBN 978-960-88557-3-1. 12 M. Fiedorowicz, A. Konieczna-Molenda, G. Khachatryan, (2008) The Effect of Illumination of Polarized Light on Polysaccharides and Polysaccharide Degrading Enzymes, Polysacharidy (2008) Chem. Listy 102, 837 858. 13 A. Konieczna-Molenda, M. Fiedorowicz and P. Tomasik; (2008) The Polarized Light-induced Enzymatic Formation and Degradation of Biopolymers; Macromol. Symp. 272, 117-124. 49

W kolejnej pracy przedstawiłam, że naświetlanie światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym ziaren skrobi uszkadza je, przez co staje się ona bardziej podatna na utlenianie i hydrolizę. 14 Wykazałam, także wpływ naświetlania światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym na właściwości i strukturę celulozy. 15 Scharakteryzowałam naświetlaną celulozę pod względem zmian struktury, krystaliczności, stopnia polimeryzacji, zawartości wody związanej, podatności na hydrolizę kwaśną i enzymatyczną. Jednym z głównych kierunków moich badań było określenie wpływu światła widzialnego liniowo spolaryzowanego na właściwości enzymów takie jak: aktywność katalityczna, stabilność temperaturowa i ph oraz selektywność. Enzymy powszechnie stosowane w przemyśle symulowałam światłem i otrzymałam biokatalizatory o odmiennych właściwościach niż enzymy natywne. Otrzymane biokatalizatory posiadały wysoką aktywność w reakcji hydrolizy skrobi 16,17, ksylanu 18, celulozy 19, chityny i chitozanu 20 oraz utleniania glukozy 21. Transferaza cyklodekstrynowa pod wpływem naświetlania światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym zmieniła selektywność w stosunku do otrzymywanych produktów. 22 Sposób stymulacji enzymów światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym został opatentowany. 23 14 A. Para and Anna Konieczna Molenda; (2010) Starch dialdehyde from potato starch illuminated with linearly polarized white light; Carbohydrate Polymers, 79 (2), 445-448. 15 A. Konieczna-Molenda A., M. Molenda, M. Fiedorowicz, P. Tomasik; (2008) Illumination of cellulose with linearly polarized visible light; Macromol. Symp. 272, 156-160. 16 M. Fiedorowicz, A. Konieczna-Molenda, G. Khachatryan, (2008) The Effect of Illumination of Polarized Light on Polysaccharides and Polysaccharide Degrading Enzymes, Polysacharidy (2008) Chem. Listy 102, 837 858 841-842. 17 M. Fiedorowicz, A. Konieczna Molenda and G. Khachatryan; (2007) Light stimulated enzymatic processes on selected polysaccharides; Starch: Progress in structural studies, modifications and applications. Polish Society of Food Technologist Małopolska Branch, ISBN 978-8-390269-96-2, 191-199. 18 A. Konieczna- Molenda, V. M. F. Lai, M. Fiedorowicz, G. Khachatryan, P. Tomasik; (2008) Polarized Lightstimulated Enzymatic Hydrolysis of Xylan Biotechnology Progress, 24, 385-388. 19 A. Konieczna-Molenda; (2012) Effect of illumination of cellulose with the visible linearly polarized light upon digestion of cellulose, Recent. Devel. Carbohydrate Res. 3, 1-10. 20 A. Konieczna-Molenda, M. Fiedorowicz, W. Zhong, P. Tomasik, (2008) Polarized light-stimulated enzymatic hydrolysis of chitin and chitosan; Carbohydr. Res. 343, 3117-3119. 21 A. Konieczna-Molenda, M. Fiedorowicz, P. J. Tomasik, (2010) Stimulation of Glucose Oxidase with White Linearly Polarized Light, Biotechnology Progress, 26(1) 393-396. 22 M. Fiedorowicz, G. Khachatryan, A. Konieczna-Molenda, P. Tomasik, (2009) Formation of cyclodextrin with cyclodextringlucosyltransferase stimulated with polarized light, Biotechnogy Progress, 25 (1), 147-150. 23 M. Fiedorowicz, A. Konieczna-Molenda, G. Khachatryan, P. Tomasik; (2010) Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów, polski patent PL 379950. 50

W kolejnych moich badaniach zajęłam się immobilizacją enzymów na nośnikach polimerowych. Badania odbywały się we współpracy z Zakładem Technologii Chemicznej i Zespołem Polimerów, Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, gdzie wykonano syntezy polimerów. Powszechnie stosowane w przemyśle enzymy immobilizowałam różnymi metodami na nośnikach polimerowych poli(winyloamidowych) oraz poli(winyloforamidowych) aktywowanych lub nie aldehydem glutarowym 24. Otrzymałam biokatalizatory aktywne w reakcjach hydrolizy skrobi 24, ksylanu, chityny i chitozanu 25. Opracowałam metody immobilizacji celulaz na nośnikach poli(amidowych) i poli(formamidowych) 26,27. Zbadałam sposób wiązania enzymu z nośnikiem i określiłam aktywność immobilizowanych enzymów w reakcjach hydrolizy 28,29. Otrzymane biokatalizatory posiadały wysoką aktywność w reakcjach hydrolizy celulozy oraz produktów celulozowych. Ostatnim wątkiem moich zainteresowań badawczych było otrzymywanie i badanie biodegradowalnych kompleksów 30 i folii 31 do żywności oraz bionanokompozytów posiadających potencjalne zastosowanie jako sensory do określania świeżości żywności 32. 24 A. Konieczna-Molenda, A. Kochanowski, A. Walaszek, E. Bortel and P. Tomasik; (2009) Immobilization of α-amylase on poly(vinylamine) and poly(vinylformamide) supports and its performance, Chemical Engineering Journal, 146, 3(15) 515-519. 25 A. Konieczna-Molenda, A, Kochanowski, A. Grabiec, E. Bortel, P. Tomasik, (2008) The Role of Polymeric Enzyme Carriers Based on Crosslinked Poly(N-vinylformamide) Polymers in Enhancing and Reducing Enzymatic Activities; Starch: Recent Progress in Biopolymer and Enzyme Technology, PTTZ-Malopolska Branch, Krakow, 8, 103-120. 26 K. Sokołowska, A. Konieczna-Molenda, E. Witek, (2016) Hydroliza odpadów celulozowych katalizowana enzymami celulolitycznymi immobilizowanymi na nośniku polimerowym, Polimery, 9, 633-641. 27 K. Sokołowska, A. Konieczna-Molenda, E. Witek, (2015) Cellulase immobilized on copolymers based on N- vinylformamide: Influence of immobilization on the catalytic activity of the enzyme (Celulaza immobilizowana na kopolimerach N-winyloformamidu: Wpływ immobilizacji na aktywność katalityczną enzymu), Chemik 69, 447-452. 28 A. Tata, K. Sokołowska, J. Świder, A. Konieczna-Molenda, E. Proniewicz, E. Witek, (2015) Study of cellulolytic enzyme immobilization on copolymers of N-vinylformamide, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 149 494 504. 29 L. Krzemińska-Fiedorowicz, G. Khachatryan, A. Konieczna-Molenda (2018) Studies of Cellulose Hydrolysis Kinetics Affected Immobilized Cellulase, Procceedings of the 14th International Conference on Polysaccharides- Glycoscience. Prague, Czech Republic, Prague, Czech Republic, 232-237. 30 E. Jamróz, A. Konieczna-Molenda, A. Para, (2018) Otrzymywanie i charakterystyka binarnych kompleksów furcelleranu z żelatyną i albuminą surowicy bydlęcej, Polimery, 6, 416-423. 31 E. Jamróz, A. Konieczna-Molenda, A. Para, (2017) Trójskładnikowa folia: skrobia ziemniaczana-furcellaranżelatyna jako nowa generacja biodegradowalnych folii, Polimery, 9, 673-679. 32 K. Khachatryan, G. Khachatryan, A. Konieczna-Molenda, M. Janik, (2018) Bionanocomposite of ZnS nanoparticles in carboxymethyl cellulose as sensor of food freshness, Procceedings of the 14th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Prague, Czech Republic, 204-207. 51

Udział w projektach: 1) 2010-2015r. N N204 354840 Synteza i spektroskopowa charakterystyka oraz badania aktywności biologicznej enzymatycznych katalizatorów immobilizowanych na nowych nośnikach polimerowych, Kierownik: Prof. dr hab. Edyta Proniewicz. Instytucja realizująca: Uniwersytet Jagielloński, Wydział Chemii (wykonawca), 2) 2008-2011r. N R12 0015 06 Nanosensory do monitorowania zawartości, stanu świeżości i zawilgocenia żywności w opakowaniach foliowych, Kierownik: Prof. dr hab. Maciej Fiedorowicz. Instytucja realizująca: Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie, Wydział Rolniczo-Ekonomiczny (wykonawca), 3) 2000-2003r. projekt badawczy 3T00B 081 19 pt. Kinetyka degradacji celulozy w zakresie podwyższonych temperatur. Instytucja realizująca: Uniwersytet Jagielloński, Wydział Chemii promotorski (główny wykonawca), 4) 2000-2005r. Wieloletni Projekt Rządowy pt. Kwaśny papier finansowany przez MEN, Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Barański. Instytucja realizująca: Uniwersytet Jagielloński, Wydział Chemii (wykonawca), 5) 1998-2002r. projekt badawczy 3T09B 030 15 pt. Naukowe podstawy studiów nad degradacją papieru dla potrzeb masowego odkwaszania zagrożonych zasobów archiwalnych i bibliotecznych w Polsce, Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Barański. Instytucja realizująca: Uniwersytet Jagielloński, Wydział Chemii (wykonawca), 6) 03-07.2013r. projekt pt. Wiedza, praktyka, kadry klucz do sukcesu w biznesie dla przedsiębiorstw, pracowników przedsiębiorstw i ośrodków naukowo-badawczo-rozwojowych Projekt Małopolskiej Agencji Rozwoju Regionalnego SA, współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (lider), 7) 06-08. 2013r. projekt Wiedza i kompetencje z fizyki, chemii i informatyki na potrzeby gospodarki WIKING organizowanym przez Uniwersytet Jagielloński, Kapitał Ludzki Narodowa strategia Spójności, projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (opiekun stażysty), 52

8) 07-08. 2014r. - projekt Wiedza i kompetencje z fizyki, chemii i informatyki na potrzeby gospodarki WIKING organizowany przez Uniwersytet Jagielloński, Kapitał Ludzki Narodowa Strategia Spójności, projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (opiekun stażysty), 9) 2006-2007 projekt pt. Wędka technologiczna organizowany przez Zespół Badawczy Integracja Wydział Nauk Ekonomicznych i Zarządzania, Uniwersytet Szczeciński, realizowany z Zakładem Farmaceutycznym AMARA w Krakowie (wykonawca), Odbyłam zagraniczny staż naukowy w 2000r. w TNO Centre for Paper and Board Research, Delft, Holandia (1 miesiąc). Pracowałam na stanowisku Kierownika Laboratorium Kontrolnego (1 rok), Kierownika Kontroli Jakości (7 miesięcy) oraz Specjalisty ds. Naukowo- Badawczych (ponad 8 lat) w Zakładzie Farmaceutycznym AMARA w Krakowie. Nagrody: 08.2012 07.2013 stypendium z Własnego Funduszu Stypendialnego, Rektora Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, 01 05.2009r. stypendium z Rektorskiego Funduszu Stypendialnego na realizację projektu badawczego pt. Immobilizacja enzymów stymulowanych światłem, 2003r. wyróżnienie rozprawy doktorskiej pt. Kinetyka degradacji celulozy w zakresie podwyższonych temperatur przyznane przez Radę Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego. Brałam czynny udział w konferencjach krajowych i zagranicznych: 1) EUPOC Biobased Polymers and Related Biomaterials, 2011, 2) International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society, 2011, 3) International Starch Convention, 2010, 2008, 2006, 3) (Bio)Degradable Polymers from Renewable Resources, 2007, 5) 3rd Workshop of Young European Scientists YES, 2007, 53

6) Cultural Heritage Research: a Pan-european Challenge, 5th EC Conference, 2002, 7) European Materials Research Society Spring Meeting, 2001, 8) Zjazd PTChem, 2018, 2015, 2014, 2002, 9) Kongres Technologii Chemicznej, 2018, 2015, 2012, 2003, 2000, 10) Ogólnopolskie Kolokwium Katalityczne, 2015, 2014. 54