PRACE ORYGINALNE Marta ZALEWSKA Marta KRÓLIK Halina MILNEROWICZ Wp³yw pracy w hutnictwie i palenia papierosów na stê enie malonylodialdehydu i 8-hydroksydeoksyguanozyny we krwi Impact of working in metallurgy and cigarettes smoking on the concentration of malondialdehyde and 8-hydroksydeoxyguanosine in the blood Zak³ad Biomedycznych Analiz Œrodowiskowych, Wydzia³ Farmaceutyczny z Oddzia³em Analityki Medycznej, Akademia Medyczna, Wroc³aw Kierownik: Prof. dr hab. Halina Milnerowicz Studenckie Ko³o Naukowe przy Zak³adzie Biomedycznych Analiz Œrodowiskowych, Wydzia³ Farmaceutyczny z Oddzia³em Analityki Medycznej, Akademia Medyczna, Wroc³aw Opiekunowie: Prof. dr hab. Halina Milnerowicz, dr in. Marta Zalewska Dodatkowe s³owa kluczowe: 8-hydroksydeoksyguanozyna arsen kadm malonylodialdehyd o³ów Additional key words: 8-hydroxydeoxyguanosine arsenic cadmium lead malondialdehyd Adres do korespondencji: Dr in. Marta Zalewska Zak³ad Biomedycznych Analiz Œrodowiskowych Akademia Medyczna 50-355 Wroc³aw, ul. Grunwaldzka Tel. 7 784 0 73; Fax: 7 784 0 7 e-mail: zalewska.m@gmail.com Istotnym Ÿród³em nara enia na metale ciê kie i wa nym czynnikiem powoduj¹cym powstawanie stresu oksydacyjnego jest praca w hutnictwie oraz palenie papierosów. U zawodowo nara onych grup wystêpuje wiêksze ryzyko oksydacyjnego uszkodzenia DNA i lipidów. Celem pracy by³a ocena ekspozycji zawodowej hutników na metale ciê kie wykonana poprzez oznaczenie stê enia kadmu i o³owiu w pe³nej krwi oraz arsenu i kadmu w moczu. Analizie poddany zosta³ wp³yw nara enia na metale ciê kie na procesy peroksydacji lipidów oraz DNA poprzez oznaczenie odpowiednio malonylodialdehydu (MDA) w osoczu i 8-hydroksydeoksyguanozyny (8-OHdG) w surowicy. W badaniach uwzglêdniono równie nara enie na dym tytoniowy. Zaobserwowano istotny statystycznie oko³o -krotny wzrost stê enia kadmu, 6-krotny o³owiu i oko³o 5-krotny wzrost arsenu u niepal¹cych hutników w porównaniu do grupy kontrolnej. Zaobserwowano równie istotny statystycznie -krotny wzrost stê enia kadmu, 7- krotny o³owiu i 7-krotny arsenu u hutników pal¹cych papierosy w porównaniu do wartoœci obserwowanych u osób grupy kontrolnej niepal¹cych papierosy, co wskazuje, e dym tytoniowy jest istotnym Ÿród³em tych metali. Najwy sze stê enia kadmu, o³owiu i arsenu stwierdzono u pal¹cych hutników. Nara enie zawodowe na metale ciê kie skutkowa³o wzrostem stê enia MDA we krwi pal¹cych i niepal¹cych hutników w porównaniu do osób z grupy kontrolnej. Najwy sz¹ wartoœæ stê enia zaobserwowano w osoczu hutników pal¹cych papierosy, co wskazuje na to, e palenie papierosów powoduje dalszy wzrost stê enia MDA w osoczu hutników. Œrednie stê enie MDA w osoczu hutników pal¹cych papierosy by³o ponad -krotnie wy sze w stosunku do wartoœci obserwowanych u niepal¹cych osób grupy kontrolnej. Nie zaobserwowano natomiast statystycznie istotnej ró nicy w stê eniu 8-OHdG w surowicy pal¹cych i nie- An important source of the exposure to heavy metals and an important factor in the formation of oxidative stress is work in metallurgy, and cigarette smoking. Occupationally exposed groups are at higher risk of oxidative DNA and lipids damage. Objective of the study was to assess occupational exposure to heavy metals of steelworkers by determining the concentration of cadmium and lead in whole blood and arsenic and cadmium in urine. The impact of the exposure to heavy metals on the processes of lipid and DNA peroxidation has been analyzed by determining the appropriate malonyldialdehyde (MDA) in plasma and 8-hydroksydeoksyguanozyny (8-OHdG) in serum. The studies also included analysis of the exposure to tobacco smoke. It was observed a statistically significant - fold increase in the concentration of cadmium, 6-fold of lead, and approximately 5-fold increase in arsenic concentration in nonsmoking steelworkers compared to the control group. It was also observed statistically significant -fold increase in the concentration of cadmium, 7-fold of lead, and 7- fold in arsenic in smoking steelworkers compared to those observed in nonsmoking persons of control group, suggesting that tobacco smoke is a major source of these metals. The highest concentrations of cadmium, lead and arsenic were found in smoking steelworkers. Occupational exposure to heavy metals resulted in an increased concentration of MDA in blood of smoking and nonsmoking steelworkers in comparison to the control group. The highest value was observed in plasma concentration of smoking steelworkers, suggesting that cigarette smoking causes a further increase in plasma MDA concentration. Average MDA concentration in plasma of smoking steelworkers was more than -fold higher compared to this observed in nonsmokers of the control group. There was no statisti- 770 Przegl¹d Lekarski 0 / 68 / 0 M. Zalewska i wsp.
Wstêp ywe organizmy s¹ stale nara one na dzia³anie reaktywnych form tlenu (ROS), powsta³ych w wyniku normalnych reakcji biochemicznych oraz z dzia³ania ró nych czynników zewnêtrznych odnosz¹cych siê do stylu ycia i œrodowiska, takich jak palenie tytoniu [] i zanieczyszczenie powietrza []. W normalnych warunkach fizjologicznych, utrzymana jest równowaga miêdzy endogennymi utleniaczami i przeciwutleniaczami. Kiedy pojawia siê zaburzenie równowagi, stworzone przez nadmierne powstawanie utleniaczy lub spadek przeciwutleniaczy, powstaje stres oksydacyjny [6]. D³ugotrwa³a zawodowa ekspozycja na metale ciê kie i ich akumulacja prowadzi do powstawania stresu oksydacyjnego i mo e prowadziæ do powa nych schorzeñ i powodowaæ zarówno ostre jak i przewlek³e procesy mog¹ce zaburzaæ dzia³anie ca³ego organizmu. Miejscem zawodowego nara enia na metale ciê kie jest huta. Dodatkowym czynnikiem zwiêkszaj¹cym powstawanie ROS jest palenie papierosów. Nale y zauwa yæ, e uszkodzenia oksydacyjne DNA wystêpuj¹ czêsto od egzogennych ROS, takich w³aœnie jak palenie papierosów, promieniowanie UV i promieniowanie jonizuj¹ce []. ROS wp³ywaj¹ na trzy grupy zwi¹zków, poprzez uszkodzenie DNA, bia³ek i t³uszczów. Peroksydacja lipidów uruchamia kaskadê kwasu arachidonowego, z produkcj¹ eikozanoidów stymuluj¹c¹ proliferacjê komórek. Podczas gdy wolne rodniki wywo³uj¹ uszkodzenia DNA bezpoœrednio, produkty peroksydacji lipidów, takie jak malonylodialdehyd (MDA) oraz 4-hydroksynonenol (4- HNE) s¹ równie czynnikami uszkadzaj¹cymi DNA. Wolne rodniki mog¹ równie modyfikowaæ bia³ka w tym, systemy enzymów bior¹cych udzia³ w naprawie DNA i zmieniaæ sygnalizacjê œmierci komórki poprzez modyfikacjê kaspaz i modulacjê œcie ek prze ycia komórek regulowanych przez kluczowe cz¹steczki, takie jak JNK i p38 Kinazy MAP [0]. Rodniki tlenu reaguj¹ z wielonienasyconymi resztami kwasu t³uszczowego w fosfolipidach a w wyniku tego procesu powstaj¹ produkty reaktywne wzglêdem bia³ka i DNA. Jednym z najbardziej rozpowszechnionych produktów peroksydacji lipidów jest MDA, który jest równie generowany w procesie biosyntezy prostaglandyn. MDA mo e przedostawaæ siê do odleg³ych tkanek i tam, dziêki mo liwoœci tworzenia wi¹zañ kowalencyjnych z innymi cz¹steczkami modyfikuje ich strukturê, a w konsekwencji zmienia ich w³aœciwoœci. MDA to zwi¹zek o wysokiej cytotoksycznoœci, ma dzia³anie mupal¹cych pracowników huty miedzi w porównaniu do niepal¹cych osób grupy kontrolnej. Wykazano, e na stê- enie kadmu we krwi i w moczu wp³ywa g³ównie palenie papierosów, natomiast kumulacja o³owiu i arsenu zale- y przede wszystkim od nara enia zawodowego. Przeprowadzone badania wykaza³y, e zawodowa ekspozycja na metale ciê kie oraz palenie papierosów generuj¹ wolne rodniki, które wywieraj¹ dzia³anie toksyczne na lipidy, co skutkuje zwiêkszon¹ zawartoœci¹ markera peroksydacji lipidów - MDA w osoczu. cally significant difference at concentrations of 8-OHdG in serum of smoking and nonsmoking workers compared to the control group. It was shown that the concentration of cadmium in blood and in urine is primarily affected by cigarette smoking, and the accumulation of lead and arsenic depends primarily on the occupational exposure. The study showed that occupational exposure to heavy metals and cigarette smoke generates free radicals, which cause toxic effects on lipids, resulting in increased content of a marker of lipid peroxidation - MDA in plasma. Tabela I Stê enie kadmu i o³owiu w pe³nej krwi oraz kadmu i arsenu w moczu hutników i osób grupy kontrolnej. The concentrations of cadmium and lead in whole blood as well as cadmium and arsenic in urine of smelters and in persons of control group. Grupy badane Kontrola (n=56) Hutnicy niepal¹cy (n=46) Hutnicy pal¹cy (n=),,3 Ró nice istotne statystycznie: p<0,05. Tabela II Stê enie MDA w osoczu i 8-OHdG w surowicy hutników i osób grupy kontrolnej. The concentration of MDA in plasma and 8-OHdG in serum of smelters and in persons of control group. Badane grupy, Ró nice istotne statystycznie: p<0,05. Tabela III Korelacje pomiêdzy stê eniem metali ciê kich a markerami stresu oksydacyjnego, MDA w osoczu i 8-OHdG w surowicy grupy kontrolnej i hutników Correlation between concentrations of heavy metals and markers of oxidative stress, concentration of MDA in plasma and 8-OHdG in serum of smelters Korelacje MDA osocze [µmol/l] 8-OHdG surowica [U/ml] Kadm we krwi Pb we krwi r = 0,39; p = 0,00 - nieistotne statystycznie, p> 0,05. Kadm w moczu [µg/g kreatyniny] 0,89±0,80,5±0,70 Cd we krwi tagenne, hamuje aktywnoœæ szeregu enzymów, prowadz¹c do zahamowania replikacji DNA, transkrypcji i oddychania. Jest to substancja najczêœciej wykorzystywana do oceny peroksydacji lipidów in vivo w barwnej reakcji z kwasem tiobarbiturowym. Peroksydacja lipidów jest Ÿród³em endogennego uszkodzenia DNA, które mo e znacz¹co przyczyniæ siê do powstawania raka i innych chorób genetycznych zwi¹zanych ze stylem ycia i czynnikami ywieniowymi [4]. MDA jest aldehydem zdolnym do reakcji z DNA i tworzenia adduktów deoksyguanozyny, deoksyadenozyny i deoksycytydyny, w tym egzocyklicznego adduktu, 3 - (-deoksy-ß-d-erytro-pentafuranozylu) pirymido [,-?] puryn-0 (3H)-deoksyguanozyny (MdG), który to produkt wskazano jako mutagenny [3]. Uszkodzenia oksydacyjne DNA odgrywaj¹ rolê w patofizjologii wielu chorób, w tym nowotworów, mia d ycy, chorób neurodegeneracyjnych i procesu starzenia siê [6]. Mimo, e wszystkie zasady DNA s¹ podatne na uszkodzenia, guanina jest najbardziej podatna na utlenianie. 8-hydroksyguanina (8-OH-Gua) i jej odpowiednik 'deoksynukleozyd, 8-hydroksy-'-deoksyguanozyna (8-OHdG), s¹ najczêœciej wystêpuj¹cymi produktami w stresie oksydacyjnym [7]. Podczas utleniania grupa hydroksylowa jest dodawana w pozycjê 8 cz¹steczki guaniny i powstaje utleniony produkt 8-OHdG, który jest jednym z dominuj¹cych form uszkodzeñ DNA indukowanych przez wolne rodniki. O³ów we krwi Cd w moczu [µg /g kreatyniny] Arsen w moczu [µg/g kreatyniny],,, 0 37,54±6,84 3,08±,09 0,9±,74 0,57±0,35 6,03±3,8 6,07±,53,,60±0,96,70±0,33 Stê enie MDA w osoczu [µmol/l] () Kontrola (n=56),8±0,4, 3 0 69,00±,80 0,0±6,90, 3 Stê enie 8-OHdG [ng/ml] w surowicy (), 0,66±0,49 Hutnicy niepal¹cy (n=46) 0,99±0,6,67±0,4 Hutnicy pal¹cy (n=),09±0,57,78±0,30 As w moczu [µg /g kreatyniny] r = 0,30; p = 0,00 Przegl¹d Lekarski 0 / 68 / 0 77
Oksydacyjna modyfikacja DNA w postaci 8- OHdG mo e byæ oznaczana iloœciowo do wskazania zakresu uszkodzeñ DNA [4]. Wszelkie oksydacyjne uszkodzenia, które nie s¹ naprawiane mog¹ prowadziæ do mutacji, co zwiêksza ryzyko powstawania raka [9]. 8-OHdG, jest wa nym wskaÿnikiem w mutagenezie i karcynogenezie. Iloœciowe oznaczanie MDA jest przydatne do wykazania stopnia uszkodzenia lipidów w wyniku stresu oksydacyjnego w ró - nych systemach lipidów, jak osocze i b³ony komórkowe. Ocena wolnorodnikowych uszkodzeñ kwasów nukleinowych opiera siê g³ównie na pomiarach 8-OHdG w moczu i surowicy. Celem badania by³a ocena dzia³ania metali ciê kich takich jak arsen, o³ów i kadm na procesy peroksydacji lipidów i DNA u osób nara onych na metale ciê kie, dym papierosowy poprzez oznaczenie stê enia MDA i 8-OHdG. Materia³y i metody Materia³ Badania przeprowadzono we krwi i w moczu pracowników Huty Miedzi Zag³êbia Legnicko-G³ogowskiego (u 67 hutników) oraz u osób nienara onych zawodowo na metale ciê kie (56 osób z grupy kontrolnej). Wszyscy pracownicy huty, jak równie ochotnicy grupy kontrolnej, po zapoznaniu siê z przedmiotem badañ, wyrazili zgodê na ich przeprowadzenie. Na wykonanie badañ na pobranym materiale klinicznym uzyskano zgodê Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej we Wroc³awiu (Nr 469/008). Krew yln¹ pobierano rano na czczo. Surowicê otrzymywano zgodnie ze standardow¹ procedur¹, pobieraj¹c krew yln¹ do jednorazowych probówek typu S-Monovette (Nr kat. 03.54.00, Sarstedt, Niemcy). W celu uzyskania osocza krew pobierano do jednorazowych probówek typu S-Monovette zawieraj¹cych EDTA (Sarstedt, Nr kat. 04.93.00, Niemcy) i bezzw³ocznie, delikatnie mieszano. Krew wirowano (500 g, 5 min), a uzyskan¹ surowicê i osocze porcjowano i przechowywano w zamkniêtych probówkach (Nr kat. 00300.00, Eppendorf, Germany). Nastêpnie próby porcjowano i przechowywano w -80 C. Mocz pobierano do probówek polistyrenowych (Nr kat. 0.5.00, Sarstedt, Germany), nastêpnie próby wirowano (500 g, 0 min), a supernatant przechowywano w -80 C. Dane dotycz¹ce palenia tytoniu otrzymano z bezpoœredniego wywiadu. U wszystkich osób oznaczono równie stê enie kotyniny w surowicy. Na podstawie uzyskanych informacji dotycz¹cych palenia papierosów zweryfikowanych wynikami testu, populacjê hutników podzielono na niepal¹cych (n=46) i pal¹cych (n=). Metoda oznaczania stê enia metali ciê kich - kadmu, o³owiu i arsenu Stê enie Pb i Cd oznaczano metod¹ bezp³omieniow¹ w kuwecie grafitowej Massmana na spektrofotometrze absorpcji atomowej SOLAAR M6 firmy Thermo Elemental, natomiast oznaczenia stê enia As dokonano równie na spektrofotometrze SOLAAR M6 z wykorzystaniem przystawki PU 9360 Phillips, s³u ¹cej do generacji wodorków. W metodzie tej stosowano d³ugoœæ fali l=93,7 nm, deuterow¹ korekcjê t³a i elektrycznie grzan¹ kwarcow¹ komorê atomizacji. Dok³adnoœæ i powtarzalnoœæ metody weryfikowano na podstawie pomiaru stê eñ metali w próbkach kontrolnych (ang. Seronorm TM Trace Elements Serum, firmy Sero AS, Bilingstad, Nr Kat.: 0405, Norwegia). Oznaczenie stê enia kotyniny w surowicy Stê enie kotyniny wykonano w surowicy przy u yciu testu Cotinine ELISA (Nr kat. EIA-34), firmy DRG International, USA. Do studzienek 96-do³kowej p³ytki, op³aszczonych poliklonalnymi przeciwcia³ami anty-kotynina, wprowadzano po 0 µl badanej surowicy oraz po 0 µl pozytywnych i negatywnych kalibratorów. Nastêpnie do ka dej studzienki odpipetowano po 00 µl koniugatu, zawieraj¹cego kotyninê znakowan¹ peroksydaz¹ chrzanow¹. Podczas pierwszej 30 minutowej inkubacji, kotynina znakowana peroksydaz¹ chrzanow¹ wspó³zawodniczy³a o miejsce wi¹zania z woln¹ kotynin¹ zawart¹ w badanej próbie. Nastêpnie p³ytkê p³ukano cztery razy buforem myj¹cym w celu usuniêcia nadmiaru niezwi¹zanej z przeciwcia³ami kotyniny. Do ka dej studzienki wprowadzono po 00 µl substratu dla peroksydazy i inkubowano przez 30 minut. Nastêpnie dodawano po 00 µl roztworu o odczynie kwaœnym, hamuj¹cego reakcjê katalizowan¹ przez peroksydazê. Spektrofotometryczny pomiaru absorbancji wykonywano przy d³ugoœci fali l=450 nm. Stê enie kotyniny w badanych próbach odczytywano z krzywej wzorcowej, wykonanej ze standardów kotyniny traktowanych analogicznie do prób badanych. Oznaczenie stê enia malonylodialdehydu w osoczu Stê enie malonylodialdehydu (MDA) oznaczano w oparciu o reakcjê z kwasem tiobarbiturowym (TBA) w osoczu osób badanych. Zasada metody opiera siê na wytworzeniu barwnego produktu w reakcji pomiêdzy TBA a MDA [6]. Do probówki wirówkowej dodawano ml badanego osocza, ml 5% roztworu kwasu trichlorooctowego (Nr kat. 5779705, POCH, Polska) w 0,5 M HCl i ml 0,37% TBA (Nr kat. T5500, Sigma-Aldrich, Niemcy) w 0,5 M HCl. Próba kontrolna zawiera³a, zamiast 0,37% roztworu TBA, ml wody. Do próby œlepej dodawano ml 0,0 M buforu fosforanowego (Nr kat. P5368, Sigma- Aldrich, Niemcy) zamiast próby badanej. Po dok³adnym wymieszaniu, próby ogrzewano przez 5 min w temperaturze 00 C. Po och³odzeniu i odwirowaniu (000 g, 0 min), mierzono absorbancjê supernatantu próby badanej i próby kontrolnej wzglêdem próby œlepej przy d³ugoœci l=535 nm. Stê enie MDA w osoczu obliczano z ró nicy absorbancji próby badanej i próby kontrolnej oraz na podstawie molowego wspó³czynnika absorpcji dla kompleksu MDA-TBA równego 56 mmol - x cm -. Oznaczenie stê enia 8- hydroksydeoksyguanozyny w surowicy Do oceny stê enia 8-hydroksydeoksyguanozyny (8- OHdG) w surowicy, u yto komercyjnego zestawu Oxi- Select Oxidative DNA Damage ELISA Kit (Nr kat. STA- 30, Cell Biolabs, Inc, USA). Na 96-do³kow¹ p³ytkê pipetowano po 00 µl koniugatu 8-OHdG/BSA i inkubowano przez noc w 4 C, a nastêpnie p³ukano HO. W kolejnym etapie dodawano po 00 µl buforu do blokowania i inkubowano w temp. pokojowej przez godzinê. Próby o nieznanym stê eniu 8-OHdG oraz standardy 8-OHdG dodawano po 50 µl. Po 0 minutach inkubacji, dodawano przeciwcia³a monoklonalne anty-8-ohdg (00 µl, godzina inkubacji w temp. pokojowej), p³ukano 3-krotnie a nastêpnie dodawano przeciwcia³a drugorzêdowe sprzê- one z peroksydaz¹ chrzanow¹ (00 µl, godzina inkubacji w temp. pokojowej). P³ytkê p³ukano trzy razy buforem myj¹cym i do ka dej studzienki wprowadzano po 00 µl substratu dla peroksydazy i inkubowano przez 0 minut. Nastêpnie dodawano po 00 µl roztworu hamuj¹cego reakcjê katalizowan¹ przez peroksydazê. Spektrofotometryczny pomiar absorbancji wykonywano przy d³ugoœci fali l=450 nm. Zawartoœæ 8-OHdG w badanych próbach wyliczano przez porównanie z krzyw¹ wzorcow¹ wyznaczon¹ ze standardów traktowanych analogicznie do prób badanych. Analiza statystyczna Wyniki dotycz¹ce stê enia metali, MDA i 8-OHdG analizowano nieparametrycznym testem U-Manna Whitneya. Dla okreœlenia zwi¹zku korelacyjnego pomiêdzy mierzonymi parametrami, wykorzystano test istotnoœci wspó³czynnika korelacji rang Spearmana. Do obliczeñ wykorzystano program Statistica 9.0 PL. Wyniki Stê enie kadmu we krwi Zaobserwowano istotny statystycznie,7-krotny wzrost stê enia Cd we krwi pal¹cych hutników w porównaniu do niepal¹cych pracowników huty. Najwy sze stê enie Cd stwierdzono w pe³nej krwi hutników pal¹cych papierosy i by³o ono,8-krotnie wy sze od stê enia Cd zaobserwowanego u osób grupy kontrolnej niepal¹cych papierosy. Nie zaobserwowano istotnej statystycznie zmiany w stê eniu Cd u hutników niepal¹cych papierosy w stosunku do grupy kontrolnej (tabela I). Stê enie kadmu w moczu Wykazano istotny statystycznie wzrost stê enia Cd w moczu hutników niepal¹cych wzglêdem osób z grupy kontrolnej. Najwy - sze stê enie Cd zaobserwowano w moczu hutników pal¹cych papierosy 0,70±0,33 [µg/ g kreatyniny] i by³o ono,3-krotnie wy sze od stê enia Cd w moczu kontroli niepal¹cej (tabela I). Stê enie o³owiu we krwi Wykazano istotny statystycznie 5,7-krotny wzrost stê enia Pb we krwi hutników niepal¹cych wzglêdem osób z grupy kontrolnej. Najwy sze stê enie Pb zaobserwowano w pe³nej krwi hutników pal¹cych papierosy 69,00±,80 i by³o ono 7,-krotnie wy sze od stê enia Pb we krwi osób niepal¹cych grupy kontrolnej (tabela I). Stê enie arsenu w moczu W grupie hutników niepal¹cych papierosy zaobserwowano istotny statystycznie 5,- krotny wzrost stê enia As w porównaniu do niepal¹cych osób grupy kontrolnej. Wykazano istotny, 6,5-krotny wzrost stê enia As w moczu hutników pal¹cych wzglêdem osób z grupy kontrolnej. Najwy sze stê enie arsenu 0,0±6,90 [µg/g kreatyniny] zaobserwowano w moczu hutników pal¹cych papierosy (tabela I). Istotn¹ statystycznie ró nicê w stê eniu As w moczu wykazano równie miêdzy grup¹ hutników pal¹cych i niepal¹cych papierosy. Stê enie malonylodialdehydu w osoczu Wykazano istotny statystycznie wzrost stê enia MDA u hutników zarówno pal¹cych jak i niepal¹cych papierosy w porównaniu do niepal¹cych osób z grupy kontrolnej. Najwy sz¹ wartoœæ stê enia MDA zaobserwowano w osoczu hutników pal¹cych papierosy i by³a ona,3-krotnie wy sza w stosunku do wartoœci obserwowanych u niepal¹cych osób grupy kontrolnej (tabela II). Nie wykazano natomiast istotnych statystycznie ró nic w stê eniu MDA miêdzy niepal¹cymi a pal¹cymi hutnikami (tabela II). Stê enie 8-hydroksydeoksyguanozyny w surowicy Wyniki tego badania wykaza³y brak statystycznie istotnej ró nicy w stê eniu 8- OHdG w surowicy pal¹cych i niepal¹cych pracowników huty miedzi w porównaniu do niepal¹cych osób grupy kontrolnej (tabela II). Analiza korelacyjna Wartoœci wspó³czynnika korelacji pomiêdzy stê eniem metali ciê kich a poziomem MDA w badanych grupach zestawiono w tabeli III. Wykazano pozytywn¹ korelacjê pomiêdzy stê eniem MDA a stê eniem o³owiu we krwi pe³nej oraz arsenu w moczu (tabela III). Istotne statystycznie korelacje wykazano pomiêdzy stê eniem MDA a wzrastaj¹cym stê eniem o³owiu we krwi (r=0,39; p=0,00) i arsenu w moczu (r=0,30; p=0,00). 77 Przegl¹d Lekarski 0 / 68 / 0 M. Zalewska i wsp.
Omówienie W obecnej pracy wykazano, e pracownicy huty miedzi s¹ nara eni na metale ciê - kie, co manifestowa³o siê istotnym statystycznie wzrostem stê enia Pb we krwi oraz Cd i As w moczu hutników niepal¹cych w porównaniu do osób z grupy kontrolnej. W grupie hutników pal¹cych papierosy w porównaniu do hutników niepal¹cych wykazano istotny statystycznie wzrost Cd we krwi i As w moczu. Ostre zatrucie nieorganicznymi zwi¹zkami As mo e spowodowaæ pojawienie siê objawów o³¹dkowo-jelitowych, zaburzeñ uk³adu kr¹ enia, zaburzeñ oœrodkowego uk³adu nerwowego i cukrzycy. Podczas metabolizmu arsenu dochodzi do produkcji reaktywnych form tlenu, g³ównie rodnika ponadtlenkowego i nadtlenku wodoru. Rodniki te powoduj¹ peroksydacjê lipidów i uszkodzenie materia³u genetycznego [3]. W moczu niepal¹cych hutników zaobserwowano ponad 5-krotnie wy sze stê enie As w stosunku do osób z grupy kontrolnej. Wykazano tak e wp³yw palenia papierosów na stê enie arsenu w moczu, co skutkowa- ³o dodatkowym wzrostem poziomu As w moczu hutników pal¹cych papierosy w stosunku do niepal¹cych osób z grupy kontrolnej. O³ów jest metalem toksycznym, wp³ywaj¹cym niekorzystnie na dzia³anie w¹troby, uk³adu krwiotwórczego i centralnego uk³adu nerwowego [3]. Wykazano, e o³ów powoduje, lub jest zwi¹zany z peroksydacj¹ lipidów [4]. W prezentowanej pracy zaobserwowano ponad 6-krotny wzrost stê enia Pb w grupie hutników niepal¹cych w stosunku do grupy kontrolnej i ponad 7-krotny w grupie pal¹cej papierosy. Jak wykazano, na stê enie Pb w pe³nej krwi wp³ywa zarówno nara enie zawodowe w hucie, jak i palenie papierosów. Kadm jest toksycznym pierwiastkiem, kumuluj¹cym siê w tkance t³uszczowej, uk³adzie nerwowym, koœciach, p³ucach, w¹trobie i nerkach. G³ówn¹ drog¹ toksycznoœci Cd, jest jego wi¹zanie siê do grup sulfhydrylowych bia³ek [3]. W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano wp³yw nara enia na dym tytoniowy na stê enie kadmu we krwi pal¹cych hutników. Najwy sze stê enie Cd odnotowano w grupie hutników pal¹cych papierosy i by³o ono,8-krotnie wy- sze od wartoœci obserwowanych u niepal¹cych osób z grupy kontrolnej. Zaobserwowano równie,7-krotny wzrost stê enia Cd we krwi pal¹cych hutników w porównaniu do niepal¹cych pracowników huty. Nie zaobserwowano istotnej statystycznie zmiany w stê eniu Cd u hutników niepal¹cych papierosy w stosunku do grupy kontrolnej, co pokazuje, e palenie papierosów jest g³ównym Ÿród³em Cd we krwi osób badanych. Podobne zmiany stê enia Cd u osób przewlekle eksponowanych na ten metal i pal¹cych papierosy uzyskali Satarug i wsp. []. Stê enie Cd we krwi u osób pal¹cych (0,9±0,83 µg/l) by³o oko³o -krotnie wy sze od stê enia Cd we krwi osób niepal¹cych (0,55±0,48 µg/l) []. Stê enie Cd oznaczano równie w moczu. Najwy sze stê enie Cd 0,70±0,33 [µg/ g kreatyniny] zaobserwowano w moczu hutników pal¹cych papierosy i by³o ono,3- krotnie wy sze od stê enia Cd w moczu osób grupy kontrolnej. Zale ne od metali powstawanie wolnych rodników powoduje utlenianie zasad DNA oraz peroksydacjê lipidów. Nadtlenki lipidów, utworzone przez dzia³anie wolnych rodników na wielonienasycone reszty kwasowe fosfolipidów, mog¹ dalej reagowaæ prowadz¹c do powstania mutagennego i rakotwórczego malonylodialdehydu, 4-hydroksynonenalu a nastêpnie innych egzocyklicznych adduktów DNA [3]. Wykazano, e wzrost zawartoœci wolnych rodników jest proporcjonalny do stê- enia MDA, który stanowi istotny wskaÿnik intensywnoœci procesów peroksydacji lipidów zachodz¹cych w organizmie. Równie oznaczanie izoprostanów sta³o siê popularnym markerem peroksydacji lipidów, a ich zastosowanie zosta³o zwalidowane na kilku modelach [3]. MDA jest u ywany jako marker peroksydacji lipidów ze wzglêdu na prost¹ reakcjê z kwasem tiobarbiturowym, w której tworzy intensywny kolorowy chromogen [3]. W osoczu zarówno pal¹cych jak i niepal¹cych hutników zaobserwowano istotny statystycznie wzrost stê enia MDA w porównaniu do osób niepal¹cych grupy kontrolnej, co potwierdza, e stres oksydacyjny jest generowany w wyniku nara enia zawodowego w hucie. Pozytywn¹ korelacjê stwierdzono miêdzy stê eniem metali ciê kich (dla o³owiu: r=0,30, p=0,00; dla arsenu: r=0,39 p=0,00) a stê eniem MDA w osoczu. Wzrost stê enia MDA potwierdza zwi¹zek miêdzy nara eniem zawodowym na metale ciê kie a powstawaniem stresu oksydacyjnego i jego wp³ywu na b³ony komórkowe. Poziom utleniania lipidów w osoczu by³ mierzony w grupie mê czyzn zawodowo nara onych na dzia³anie o³owiu. Stwierdzono istotne ró nice w poziomie o³owiu we krwi u pracowników nara onych na o³ów 50,0±0,5 µg/l w porównaniu do grupy kontrolnej 3,7±08,9 µg/l. Stê enie MDA w osoczu (,67±0,69 µm) pracowników nara- onych na o³ów by³o znacz¹co wy sze ni w grupie kontrolnej,3±0,6 µm. [4]. Jednak wyniki przedstawione przez Dursun i wsp. wskazuj¹, e wzrost stê enia produktów peroksydacji lipidów nara onych na dzia³anie o³owiu jest zale ny nie tylko od stê- enia o³owiu, ale równie od wieku osób i czasu nara enia. Powstawanie MDA i jego reakcja z DNA do postaci mutagennych adduktów tworzy zwi¹zek miêdzy peroksydacj¹ lipidów a chorobami genetycznymi. Addukty MDA-DNA wywo³uj¹ premutagenne zmiany, które indukuj¹ mutacje czêsto wykrywane w onkogenach lub genach supresorowych w nowotworach. Tak wiêc, peroksydacjê lipidów nale y uznaæ za znacz¹ce endogenne Ÿród³o uszkodzeñ DNA i mutacji, które przyczyniaj¹ siê do rozwoju chorób genetycznych [,4]. MDA jest mutagenny i rakotwórczy. Reaguje z DNA, tworz¹c addukty deoksyguanozyny i deoksyadenozyny, wœród których g³ównym jest MdG [3]. Dzia³anie stresu oksydacyjnego powoduje równie zmiany bezpoœrednio w DNA a jako marker uszkodzenia oznacza siê stê- enie 8-OHdG. Zmodyfikowana zasada, 8- OHdG, jest defektem mutagennym, który prowadzi do zamiany zasad G:C na T:A [3,]. Wykazano, e 8-OHdG jest nie tylko biomarkerem komórkowego stresu oksydacyjnego, ale mo e byæ równie markerem ryzyka dla raka, mia d ycy i cukrzycy [4]. Ograniczenia ywieniowe, które opóÿniaj¹ starzenie siê i powoduj¹ wzrost d³ugoœci ycia u gryzoni, okaza³y siê znacznie zmniejszaæ zwi¹zany z wiekiem wzrost stê enia 8-OHdG w j¹drowym DNA we wszystkich tkankach samców myszy i w wiêkszoœci tkanek samców szczurów [8,0]. Wiêkszoœæ skutków palenia tytoniu obserwowano w tkankach lub we krwi osób nara onych. Barbato i wsp., wykonali meta-analizê u nara onych na zanieczyszczenia œrodowiskowe pracowników i w piêciu badanych grupach wykazali wzrost poziomu 8-OHdG w moczu a w trzech badaniach wp³ywu nie stwierdzono []. Howard i wsp. dowiedli, e pracownicy nara eni na dym tytoniowy w miejscu pracy wykazywali statystycznie istotny wzrost utleniania DNA, co manifestowa³o siê wzrostem stê enia 8-OHdG we krwi [9]. Wu i wsp. natomiast nie znaleÿli adnej ró nicy w stê eniu 8-OHdG w moczu miêdzy pal¹cymi a osobami nienara onymi na dym tytoniowy [4]. Musarrat i wsp., równie zaobserwowali, e stê enie adduktów 8-OHdG nie jest skorelowane ani z wiekiem ani paleniem tytoniu [5]. Palenie papierosów wydaje siê mieæ tylko niewielki wp³yw na poziom 8-OHdG we krwi i w moczu. Mo liwe jest, e normalny zakres stê- eñ 8-OHdG w moczu jest zbyt szeroki i, e palenie powoduje jedynie umiarkowany wzrost [4]. W obecnej pracy, nie wykazano istotnej statystycznie zmiany w stê eniu 8-OHdG w surowicy pal¹cych hutników w porównaniu do osób grupy kontrolnej. Ograniczeniem tego badania jest jednak pochodzenie oznaczanych oligonukleotydów, których obecnoœæ mo e wynikaæ z procesów naprawy DNA lub enzymatycznej degradacji DNA [7]. Podczas naprawy DNA, 8-OHdG jest wydalana z moczem. Stê enie 8-OHdG w moczu czêsto u ywane jest, jako biomarker do oceny zakresu naprawy uszkodzeñ DNA spowodowanych dzia³aniem ROS w warunkach nara enia zawodowego [5,8]. Dostêpnych jest niewiele informacji o tym, czy uszkodzenia oksydacyjne DNA w surowicy lub moczu odzwierciedlaj¹ szkody obecne w tkankach [7]. Na przyk³ad, zwi¹zek, który zwiêksza iloœæ wydalanego 8- OHdG mo na interpretowaæ, jako niekorzystny - pozornie wzrost uszkodzeñ DNA, ale mo e w rzeczywistoœci byæ korzystny - jeœli stymuluje naprawê DNA, a zatem zmniejszenie stanu stacjonarnego stê enia 8-OHdG w DNA [7]. Podsumowuj¹c, wolne rodniki w dymie papierosowym powoduj¹ oksydacyjne uszkodzenie bia³ek, DNA i lipidów. Przedstawione wyniki wykazuj¹, e nara enie na metale ciê kie takie jak Pb i As skutkuje zaawansowaniem procesów peroksydacji lipidów w organizmie. Zawodowa ekspozycja na ksenobiotyki wymaga prowadzenia rutynowych badañ diagnostycznych, umo liwiaj¹cych wczesne wykrycie zaburzeñ zachodz¹cych jeszcze przed pojawieniem siê objawów. Przegl¹d Lekarski 0 / 68 / 0 773
Wnioski. W Hucie Miedzi Zag³êbia Legnicko- G³ogowskiego istnieje zawodowe nara enie na As, Pb i Cd, o czym œwiadczy zwiêkszone stê enie tych metali we krwi i moczu hutników w porównaniu do osób z grupy kontrolnej.. Dym tytoniowy stanowi dodatkowe Ÿród³o nara enia na metale ciê kie, o czym œwiadczy zwiêkszone stê enie Cd we krwi oraz As w moczu hutników pal¹cych w stosunku do niepal¹cych pracowników huty miedzi. 3. Zawodowa ekspozycja na metale ciê kie mo e wywieraæ dzia³anie toksyczne na struktury b³on komórkowych poprzez peroksydacjê lipidów, co objawia siê zwiêkszonym stê eniem malonylodialdehydu we krwi. 4. Wykazanie pozytywnych korelacji pomiêdzy stê eniem o³owiu we krwi i arsenu w moczu a poziomem MDA, œwiadczy o prooksydacyjnym dzia³aniu tych metali. 5. We krwi pracowników huty miedzi nara onych na metale ciê kie nie wykazano istotnych statystycznie zmian stê enia 8- OHdG. Piœmiennictwo. Barbato D.L., Tomei G., Tomei F., Sancini A.: Traffic air pollution and oxidatively generated DNA damage: can urinary 8-oxo-7,8-dihydro--deoxiguanosine be considered a good biomarker? A meta-analysis. Biomarkers 00, 5, 538.. Bono R., Romanazzi V., Munnia A., et al.: Malondialdehyde-deoxyguanosine adduct formation in workers of pathology wards: the role of air formaldehyde exposure. Chem. Res. Toxicol. 00, 6, 34. 3. Bruner S.D., Norman D.P., Verdine G.L.: Structural basis for recognition and repair of the endogenous mutagen 8-oxoguanine in DNA. Nature 000, 403, 859. 4. Dursun N., Dogan P., Donmez H.: Plasma and erythrocyte lipid peroxide levels in workers with occupational exposure to lead. Biol. Trace Elem. Res. 00, 8, 9. 5. Erhola M., Toyokuni S., Okada K., et al.: Biomarker evidence of DNA oxidation in lung cancer patients: association of urinary 8-hydroxy- -deoxyguanosine excretion with radiotherapy, chemotherapy, and response to treatment. FEBS Lett. 997, 409, 87. 6. Halliwell B., Gutteridge J.M.: Free Radicals in Biology and Medicine, third ed. Oxford Univ. Press, London. 999. 7. Halliwell B.: Why and how should we measure oxidative DNA damage in nutritional studies? How far have we come? Am. J. Clin. Nutr. 000, 7, 08. 8. Hamilton M.L., Van Remmen H., Drake J.A. et al.: Does oxidative damage to DNA increase with age? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 00, 98, 0469. 9. Howard D.J., Ota R.B., Briggs L.A,. et al.: Environmental tobacco smoke in the workplace induces oxidative stress in employees, including increased production of 8-hydroxy-V-deoxyguanosine. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 998, 7, 4. 0. Kinoshita A., Wanibuchi H., Imaoka S. et al.: Formation of 8-hydroxydeoxyguanosine and cell-cycle arrest in the rat liver via generation of oxidative stress by phenobarbital: association with expression profiles of p(waf/cip), cyclin D and Ogg. Carcinogenesis 00, 3, 34.. Loft S., Poulsen H.E. Vistisen K. Knudson L.E.: Increased urinary excretion of 8-oxo-'-deoxy-guanosine, a biomarker of oxidative damage, in urban bus drivers. Mutat. Res. 999, 44,.. Loft S., Vistisen K., Ewertz M. et al.: Oxidative DNA damage estimated by 8-hydroxydeoxyguanosine excretion in humans: influence of smoking, gender and body mass index. Carcinogenesis 99, 3, 4. 3. Marnett L.J.: Lipid peroxidation-dna damage by malondialdehyde. Mutat. Res. 999 8, 44, 83. 4. Marnett L.J.: Oxy radicals, lipid peroxidation and DNA damage. Toxicology 00 7, 8, 9. 5. Musarrat J., Arezina-Wilson J., Wani A.A.: Prognostic and aetiological relevance of 8-hydroxyguanosine in human breast carcinogenesis. Eur. J. Cancer 996, 3A, 09. 6. Nielsen F., Mikkelsen B.B., Nielsen J.B. et al.: Plasma malondialdehyde as biomarker for oxidative stress: reference interval and effects of life-style factors. Clin. Chem. 997, 43, 09. 7. Patel P.R., Bevan R.J., Mistry N., Lunec J.: Evidence of oligonucleotides containing 8-hydroxy-'- deoxyguanosine in human urine. Free Radic. Biol. Med. 007, 4, 55. 8. Pilger A., Germadnik D., Schaffer A. et al.: 8- Hydroxydeoxyguanosine in leukocyte DNA and urine of quartz-exposed workers and patients with silicosis. Int. Arch. Occup. Environ. Health. 000, 73, 305. 9. Poulsen H.E., Prieme H., Loft S.: Role of oxidative DNA damage in cancer initiation and promotion. Eur. J. Cancer Prev. 998, 7, 9. 0. Roberts R.A., Smith R.A., Safe S., et al.: Toxicological and pathophysiological roles of reactive oxygen and nitrogen species. Toxicology 00, 76, 85.. Satarug S., Ujjin P., Vanavanitkun Y., et al.: Effects of cigarette smoking and exposure to cadmium and lead on phenotypic variability of hepatic CYPA6 and renal function biomarkers in men. Toxicology 004, 04, 6.. Shibutani S., Takeshita M., Grollman A.P.: Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature. 99, 349, 43. 3. Valco M., Morris H., Cronin M.T.: Metals, toxicity and oxidative stress. Curr. Med. Chem. 005,, 6. 4. Wu L.L., Chiou C.C., Chang P.Y., Wu J.T.: Urinary 8-OHdG: a marker of oxidative stress to DNA and a risk factor for cancer, atherosclerosis and diabetics. Clin. Chim. Acta 004, 339,. 774 Przegl¹d Lekarski 0 / 68 / 0 M. Zalewska i wsp.