ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH ZESZYT 576

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH ZESZYT 576 WARSZAWA 2014

ADVANCES OF AGRICULTURAL SCIENCES PROBLEM ISSUES ISSUE 576 WARSAW 2014

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH Zeszyt 576 Wydział Nauk o Żywności Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie 2014

Wydział Nauk o Żywności, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie RADA REDAKCYJNA Andrzej Lenart przewodniczący André Chwalibog (Dania) Rui Costa (Portugalia) Marco Dalla Rosa (Włochy) Frédéric Debeaufort (Francja) Jesus Frias (Irlandia) Józef Horabik Tadeusz Kudra (Kanada) Jan Łabętowicz Jan Niemiec Edward Pierzgalski KOMITET REDAKCYJNY Dorota Witrowa-Rajchert redaktor naczelna Mirosław Słowiński zastępca redaktor naczelnej Ewa Gondek sekretarz ADRES REDAKCJI Wydział Nauk o Żywności SGGW w Warszawie ul. Nowoursynowska 159c 02-776 Warszawa Opracowanie redakcyjne Agata Kropiwiec, Elżbieta Wojnarowska Czasopismo w postaci wydrukowanej jest wersją pierwotną ISSN 0084-5477 Wydawnictwo SGGW, ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa tel. 22 593 55 20 (-22; -25 sprzedaż), fax 22 593 55 21 e-mail: wydawnictwo@sggw.pl www.wydawnictwosggw.pl Druk: Agencja Reklamowo-Wydawnicza A. Grzegorczyk, www.grzeg.com.pl

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 576, 2014, 3 12 OCENA ZDOLNOŚCI BIOSYNTEZY TŁUSZCZU PRZEZ DROŻDŻE RHODOTORULA GRACILIS W PODŁOŻACH ZAWIERAJĄCYCH ZIEMNIACZANĄ ODPADOWĄ WODĘ SOKOWĄ WZBOGACONĄ GLICEROLEM Stanisław Błażejak, Iwona Gientka, Anna Bzducha-Wróbel, Lidia Stasiak-Różańska, Magdalena Maszewska Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Streszczenie. Celem badań było określenie zdolności wzrostu drożdży Rhodotorula gracilis i biosyntezy przez nie wewnątrzkomórkowego tłuszczu (SCO Single Cell Oil) podczas 72-godzinnej hodowli wgłębnej w podłożach zawierających ziemniaczaną odpadową wodę sokową wzbogaconą glicerolem w ilościach 5, 10, 15 i 20% obj. Największy plon biomasy komórkowej (28,65 g s.s. dm 3 ) uzyskano w podłożu zawierającym 5% obj. glicerolu, a najwięcej wewnątrzkomórkowego tłuszczu (25,57 g 100 g s.s. 1 ) stwierdzono w biomasie drożdży rosnących w podłożach zawierających 20% obj. glicerolu. Ta ilość tłuszczu była 3 i 5 razy większa w porównaniu z eksperymentami prowadzonymi w podłożu kontrolnym YPD (8,87 g 100 g s.s. 1 ) i doświadczalnym bez gliceryny (4,81 g 100 g s.s. 1 ). W podłożach wzbogaconych 15 lub 20% obj. dodatkiem glicerolu największa objętościowa produktywność biosyntezy tłuszczu w komórkach stosowanego szczepu drożdży przekraczała 5 g dm 3. Hodowla wgłębna drożdży Rhodotorula gracilis w podłożu stanowiącym odpadową wodę sokową ziemniaczaną wzbogaconą glicerolem w ilości 15 20% obj. prowadzi do biosyntezy tłuszczu wewnątrzkomórkowego. Słowa kluczowe: SCO (Single Cell Oil), Rhodotorula, ziemniaczana odpadowa woda sokowa, glicerol, biosynteza wewnątrzkomórkowego tłuszczu WSTĘP Wszystkie mikroorganizmy produkują substancje tłuszczowe niezbędne do tworzenia błon komórkowych. Jedynie w przypadku niektórych drobnoustrojów tłuszcz może być odkładany w komórkach jako substancja zapasowa. Szczepy, w których tłuszcz Adres do korespondencji Corresponding author: Stanisław Błażejak, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Żywności, Zakład Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, ul. Nowoursynowska 159c, 02-776 Warszawa, e-mail: stanislaw_blazejak@sggw.pl

4 S. Błażejak, I. Gientka, A. Bzducha-Wróbel i inni może stanowić więcej niż 20% suchej substancji biomasy nazywa się olejogennymi (ang. oleaginous) [Ratledge 2002, Ratledge 2004, Karatay i Donmez 2010]. Produkcja olejów pochodzenia mikrobiologicznego SCO (ang. Single Cell Oil), w porównaniu do otrzymywanych z tradycyjnych surowców roślinnych lub zwierzęcych, niesie ze sobą wiele korzyści. Jest niezależna od klimatu, wymaga stosunkowo niewiele pracy ludzkiej, cykl produkcji jest krótki, a skład kwasów tłuszczowych może być modyfikowany zmianami parametrów środowiska hodowlanego biomasy [Komorowski i Błażejak 2011]. Ze względu na zawartość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, olej mikrobiologiczny może być stosowany jako dodatek do preparatów w żywieniu ludzi lub w postaci biomasy komórkowej, jako wysokoenergetyczny dodatek paszowy dla zwierząt. Spośród poznanych szczepów drożdży olejogennych większość należy do rodzajów Cryptococcus, Lipomyces, Candida, Yarrowia i Rhodotorula [Li i in. 2008, Ageitos i in. 2011]. Drożdże z gatunku Rhodotorula gracilis są anamorficzną formą Rhodosporidium toruloides, zaliczaną do rodziny Sporidiobolaceae, rzędu Sporidiales, klasy Urediniomycetes i gromady podstawczaków (Basidiomycota) w królestwie grzybów (Fungi) [Fell i in. 1998]. Poza biosyntezą karotenoidów (beta-karoten, torulen, torularodyna), które nadają koloniom różowo-łososiowe zabarwienie, wykazują szczególną zdolność wewnątrzkomórkowego gromadzenia tłuszczu jako substancji zapasowej [Buzzini i in. 2007, Saenge i in. 2011]. Biosynteza lipidów w komórkach drożdży olejogennych rozpoczyna się zazwyczaj w obecności dużej zawartości źródła węgla w podłożu oraz ograniczonego dostępu do źródła azotu. Niedobór azotu prowadzi do zmniejszenia aktywności dehydrogenazy izocytrynianowej w cyklu Krebsa i zwiększonej produkcji cytrynianu, który poprzez błonę mitochondrialną zostaje przeniesiony do cytozolu komórkowego. Warto zaznaczyć, iż w komórkach drożdży olejogennych zawartość cytrynianu jest 3 4-krotnie wyższa niż u tych o niewielkiej zdolności do biosyntezy lipidów, a dodatkowo obecne są cytoplazmatyczne liazy cytrynianowe [Evans i in. 1983]. Następnie cytrynian w cytozolu ulega przekształceniu do acetylo-coa przy udziale liazy ATP-cytrynianowej. W kolejnym etapie karboksylacja acetylo-coa (wymaga witamin z grupy B, zwłaszcza biotyny) prowadzi do powstania malonylo-coa, który wraz z drugą cząsteczką acetylo-coa są substratami w syntezie łańcucha kwasów tłuszczowych. Proces syntezy tłuszczu w postaci trójglicerydów w komórkach drożdży zachodzi w ciałkach lipidowych, tzw. LB (ang. Lipid Bodies), oraz retikulum endoplazmatycznym [Ageitos i in. 2011]. Pozyskiwanie tłuszczu mikrobiologicznego z olejogennych szczepów drożdży z wykorzystaniem alternatywnych źródeł przyswajalnych form węgla, azotu, fosforu i składników mineralnych może być jednym ze sposobów utylizacji odpadów przemysłowych. Rolę podstawowych składników pożywki do hodowli drobnoustrojów mogą spełniać odpadowa gliceryna z produkcji biodiesla i odpadowa ziemniaczana woda sokowa. Produkcja biodiesla w warunkach krajowych osiągnęła poziom ok. 500 tys. ton, co wygenerowało ok. 100 tys. ton fazy glicerynowej zawierającej 50 60% gliceryny [Borychowski 2012]. Jednocześnie w ostatnich latach roczna produkcja skrobi ziemniaczanej kształtuje się na poziomie ok. 100 150 tys. ton, co z kolei wymaga zagospodarowania odpadowej wody sokowej powstającej po termiczno-kwasowej koagulacji białek z soku ziemniaczanego. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis... 5 Celem badań było określenie zdolności wzrostu drożdży z gatunku Rhodotorula gracilis i biosyntezy przez nie wewnątrzkomórkowego tłuszczu podczas 72-godzinnej hodowli wgłębnej w podłożach zawierających ziemniaczaną odpadową wodę sokową oraz glicerol w ilościach 5, 10, 15 i 20% obj. MATERIAŁY I METODY Materiał biologiczny W badaniach zastosowano gatunek drożdży Rhodotorula gracilis pochodzący z kolekcji czystych kultur Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Drożdże przechowywano w temperaturze +4 C na stałym podłożu YPD (skosy) [Robinson i in. 2000]. Podłoża hodowlane Podłoże kontrolne płynna pożywka YPD o następującym składzie (% wag.): glukoza (2), pepton (2), ekstrakt drożdżowy (1), ph 5,0 [Robinson i in. 2000]. Podłoża doświadczalne do ich przygotowania zastosowano ziemniaczaną odpadową wodę sokową z Przedsiębiorstwa Przemysłu Spożywczego PEPEES S.A. w Łomży oraz zróżnicowany dodatek glicerolu (POCH, Polska) w ilościach 5, 10, 15 lub 20% obj. jako główne źródło węgla. Odpadowa woda sokowa była pozostałością po produkcji białka paszowego, otrzymywanego w wyniku termiczno-kwasowej koagulacji białek soku ziemniaczanego. Zawierała ok. 3,5% suchej substancji, w tym: 0,3% cukrów bezpośrednio redukujących oraz związki mineralne, w tym fosfor (jako P 2 O 5 ok. 0,8%). Białka ogółem (oznaczone metodą Kiejdahla) stanowiły 1,0% s.s. wody sokowej, z czego ok. połowę stanowiły białka oznaczone metodą Lowry ego. Podłoża, po ustaleniu ph na poziomie 5,0 za pomocą 0,1 M HCl, sterylizowano w autoklawie w temperaturze 121 C przez 20 minut. Przygotowanie inokulum Inokulum przygotowano przez zaszczepienie 90 cm 3 płynnego podłoża YPD 48-godzinną czystą kulturą stosowanego gatunku drożdży Rhodotorula gracilis. Hodowlę prowadzono w temperaturze 28 C, przez 24 godziny w kolbach płaskodennych o obj. 500 cm 3, na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej (SM-30 Control E.Buchler, Niemcy) o amplitudzie drgań 200 cykli/min. Uzyskany materiał służył do inokulacji podłoży kontrolnych i doświadczalnych. Hodowla drożdży w podłożach kontrolnych i doświadczalnych Podłoża kontrolne i doświadczalne szczepiono 24-godzinnym inokulum, po wcześniejszym odwirowaniu biomasy z 10 cm 3 hodowli inokulacyjnej (10 min, 1400 g, 4 C, Centrifuge 5804R, Niemcy), dwukrotnym płukaniu wodą destylowaną, zawieszeniu w 10 cm 3 podłoża YPD lub jałowej odpadowej wody sokowej i ilościowym przeniesieniu do podłoży hodowlanych. W ten sposób wsiew inokulum wynosił 10% obj. Hodowle w podłożach kontrolnych i doświadczalnych prowadzono przez 72 godziny w takich samych warunkach jak w hodowli inokulacyjnej. Próbki do oznaczenia plonu biomasy nr 576, 2014

6 S. Błażejak, I. Gientka, A. Bzducha-Wróbel i inni i zawartości gliceryny w podłożach doświadczalnych pobierano bezpośrednio po inokulacji oraz po 24, 48 i 72 godzinach hodowli. Zawartość tłuszczu w suchej substancji biomasy komórkowej oznaczano po 48 i 72 godzinach. Oznaczenie plonu biomasy Plon biomasy komórkowej oznaczano metodą suszenia po odwirowaniu (10 min, 1400 g, 4 C, Centrifuge 5804R, Niemcy) określonej objętości płynu pohodowlanego w zważonej gilzie. Supernatant zlewano, a osad dwukrotnie przemywano wodą destylowaną i ponownie wirowano. Odwirowaną biomasę suszono w temperaturze 80 C (suszarka SML 32/250, Zelmed, Polska) do uzyskania stałej masy. Wynik plonu biomasy podawano w g s.s. dm 3. Oznaczenie zawartości glicerolu Oznaczanie zawartość glicerolu prowadzono metodą zaproponowaną przez Milcherta, polegającą na utleniającym działaniu kwasu meta-nadjodowego na grupy hydroksylowe w glicerolu. Wynik zawartości glicerolu w podłożach doświadczalnych podawano w g 100 cm 3 [Milchert i in. 1995]. Oznaczenie zawartości tłuszczu Wysuszoną i zważoną biomasę komórkową drożdży Rhodotorula, uzyskaną z określonej objętości płynu pohodowlanego, przenoszono do gilz, ważono i umieszczano w aparacie Soxhleta w celu ekstrakcji z użyciem eteru naftowego (POCH, Polska) jako rozpuszczalnika. Po 6 godzinach ekstrakcji gilzy suszono w temperaturze 80 C do uzyskania stałej masy. Z różnicy masy przed i po ekstrakcji obliczano zawartość wewnątrzkomórkowego tłuszczu. Wynik podawano w g 100 g s.s. biomasy komórkowej 1 drożdży. Analiza statystyczna wyników Statystyczne opracowanie wyników przeprowadzono za pomocą pakietu statystycznego Statgraphics Centurion XVI.I. Średnie wyniki plonu biomasy, zawartości gliceryny w podłożach hodowlanych oraz wewnątrzkomórkowego tłuszczu uzyskane z trzech serii doświadczeń analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji. Wnioskowanie prowadzono przy zastosowaniu testu Tukeya na poziomie istotności α = 0,05. WYNIKI I DYSKUSJA Stosowany gatunek drożdży Rh. gracilis wykazał zdolność asymilacji glicerolu z podłoży doświadczalnych w badanym zakresie stężeń (5 20% obj.). Największy plon biomasy (tab. 1.) uzyskano w podłożu z 5-procentowym dodatkiem glicerolu (28,65 g s.s. dm 3 ). Większe dawki glicerolu (10, 15 i 20% obj.) prowadziły do statystycznie istotnego zmniejszenia plonu biomasy, co mogło świadczyć o zakłóceniu metabolizmu komórkowego spowodowanego wzrostem ciśnienia osmotycznego. Wielu autorów [Galafassi i in. 2012, Taccari 2012, Yen i in. 2012] wskazywało podobnie, iż duże stężenia glicerolu zmniejszają plon biomasy drożdży gatunków: Rh. glutinis, Rh. mucilaginosa i Rh. graminis. Z tego Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis... 7 Tabela 1. Plon biomasy komórkowej drożdży Rh. gracilis podczas hodowli wgłębnej w podłożach kontrolnych i doświadczalnych Table 1. Biomass yield of Rh. gracilis yeast during bath cultivation in control and experimental media Rodzaj podłoża hodowlanego Medium type Kontrolne YPD Control YPD Woda sokowa Wastewater Woda sokowa + 5% glicerolu Wastewater + 5% glycerol Woda sokowa + 10% glicerolu Wastewater + 10% glycerol Woda sokowa + 15% glicerolu Wastewater + 15% glycerol Woda sokowa + 20% glicerolu Wastewater + 20% glycerol Czas hodowli Time of cultivation [h] 0 24 48 72 Plon biomasy Biomass yield [g s.s. dm 3 ] 0,98 ±0,02 a* 16,29 ±0,65 cd 16,95 ±0,83 d 17,22 ±0,80 d 0,96 ±0,03 a 12,02 ±0,48 b 14,82 ±0,58 c 14,91 ±0,48 c 1,23 ±0,05 a 17,43 ±0,72 d 28,11 ±0,89 h 28,65 ±0,95 h 1,15 ±0,05 a 12,52 ±0,45 b 22,45 ±0,84 g 22,66 ±0,62 g 1,26 ±0,07 a 13,12 ±0,60 b 22,64 ±0,91 g 21,68 ±0,78 fg 0,93 ±0,04 a 12,35 ±0,38 b 19,97 ±0,92 e 20,71 ±0,85 ef SD odchylenie standardowe/standard deviation. * Ten sam indeks literowy oznacza brak istotnej różnicy/the same letter indices indicate a lack of significant difference. powodu rekomendowany dodatek glicerolu jako źródła węgla w produkcji biomasy wynosi na ogół 5 6% obj. W podłożu z odpadową ziemniaczaną wodą sokową (bez suplementacji glicerolem), ze względu na niewielką zawartość przyswajalnych źródeł węgla (ok. 0,3% cukrów redukujących), plon biomasy był najmniejszy (14,91 g s.s. dm 3 ) i nie różnił się on statystycznie istotnie od plonu uzyskanego w podłożu YPD po 24 godzinach hodowli (16,29 g s.s. dm 3 ). Świadczyło to, że odpadowa woda sokowa była dobrym źródłem przyswajalnych form azotu, składników mineralnych (zwłaszcza fosforu) i witamin z grupy B dla badanego szczepu drożdży. Warto zauważyć, że w kontrolnym podłożu YPD zakończenie fazy wzrostu logarytmicznego drożdży nastąpiło w pierwszej dobie hodowli, a w przypadku podłoży doświadczalnych z gliceryną w drugiej dobie hodowli. Prawdopodobnie był to czas (po zasymilowaniu łatwo przyswajalnych cukrów redukujących zawartych w wodzie sokowej) potrzebny do ukierunkowania metabolizmu badanego szczepu na wykorzystanie glicerolu jako źródła węgla. Według danych literaturowych, biosynteza wewnątrzkomórkowego tłuszczu w postaci triacylogliceroli zachodzi w późnej fazie wzrostu stacjonarnego drożdży [Ageitos i in. 2011], a rozpoczyna się, gdy w podłożu hodowlanym wyczerpaniu ulega źródło azotu, przy czym źródło węgla pozostaje w nadmiarze [Ratledge 2004]. Oznaczenia zawartości tłuszczu w biomasie Rh. gracilis przeprowadzone po 48 i 72 godzinach wykazały zdolność biosyntezy związków lipidowych przez badany szczep (tab. 2) i zróżnicowaną jego zawartość, gdy dodatek glicerolu wynosił 5 i 10% obj. Przy większym dodatku glicerolu (15 i 20% obj.) stwierdzone różnice zawartości tłuszczu były statystycznie nieistotne. nr 576, 2014

8 S. Błażejak, I. Gientka, A. Bzducha-Wróbel i inni Najwięcej tłuszczu (25,57 g 100g s.s. 1 ). zawierały drożdże po 72 godzinach hodowli w podłożu suplementowanym glicerolem w dawce 20% obj. W tych warunkach spełniały one kryterium drobnoustrojów olejogennych, a zawartość tłuszczu w komórkach drożdży z tej hodowli była 3- i 5-krotnie wyższa niż odpowiednio w kontrolnym podłożu YPD i z wodą sokową o znikomej zawartości przyswajalnych źródeł węgla (tab. 2). Niższa wartość relacji C : N w kontrolnym podłożu YPD i podłożu doświadczalnym bez dodatku glicerolu powodowała statystycznie istotne zmniejszenie zawartości wewnątrzkomórkowego tłuszczu po 72 godzinach w porównaniu do drożdży z hodowli 48-godzinnej. Stosunek molowy C : N jest kluczowy dla wydajnej biosyntezy wewnątrzkomórkowych lipidów i na ogół powinien wynosić powyżej 100 [Rupcic i in. 1996, Ratledge 2002, Papanikolaou i in. 2004, Beopoulos i in. 2009]. O opłacalności biosyntezy tłuszczu mikrobiologicznego decydują zarówno plon biomasy, zawartość w niej tłuszczu, jak i ilość tłuszczu wytworzona w 1 dm 3 podłoża hodowlanego. Z tego punktu widzenia największą objętościową produktywność biosyntezy wewnątrzkomórkowego tłuszczu osiągnięto w podłożach doświadczalnych z 15 i 20% obj. zawartością glicerolu. W tych warunkach po 72-godzinnej hodowli wgłębnej drożdży uzyskano powyżej 5 g tłuszczu komórkowego z jednego dm 3 podłoża doświadczalnego (tab. 2). Tabela 2. Zawartość tłuszczu w biomasie komórkowej drożdży Rh. gracilis oraz objętościowa produktywność biosyntezy wewnątrzkomórkowego tłuszczu podczas hodowli wgłębnej w podłożach kontrolnych i doświadczalnych Table 2. Fat content in Rh. gracilis yeast cell biomass and volumetric productivity of biosynthesis intracellular fat during bath cultivation in control and experimental media Rodzaj podłoża hodowlanego Medium type Kontrolne YPD Control YPD Woda sokowa Wastewater Woda sokowa + 5% glicerolu Wastewater + 5% glycerol Woda sokowa + 10% glicerolu Wastewater + 10% glycerol Woda sokowa + 15% glicerolu Wastewater + 15% glycerol Woda sokowa + 20% glicerolu Wastewater + 20% glycerol Czas hodowli Time of cultivation [h] 48 72 48 72 Zawartość tłuszczu Fat content [g 100 g s.s. 1 ] Objętościowa produktywność biosyntezy Volumetric productivity of biosynthesis [g dm 3 ] 9,80 ±0,40 d* 8,87 ±0,38 c 1,66 1,53 5,41 ±0,34 b 4,81 ±0,25 a 0,80 0,72 5,79 ±0,25 b 8,24 ±0,32 c 1,63 2,40 8,58 ±0,35 c 11,88 ±0,45 e 1,93 2,69 13,48 ±0,47 f 25,45 ±0,52 g 3,05 5,52 13,97 ±0,34 f 25,57 ±0,48 g 2,78 5,30 SD odchylenie standardowe/standard deviation. * Ten sam indeks literowy oznacza brak istotnej różnicy/the same letter indices indicate a lack of significant difference. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis... 9 W pozostałych wariantach podłoży objętościowa produktywność biosyntezy tłuszczu w komórkach drożdży Rh. gracilis była kilkakrotnie niższa i w przypadku podłoża doświadczalnego bez dodatkowego źródła węgla w postaci glicerolu nie przekroczyła 1 g dm 3. Odpadową wodę sokową powstającą przy produkcji chipsów ziemniaczanych stosowano jako źródła składników odżywczych także w hodowli grzybów strzępkowych Aspergillus oryzae [Muniraj i in. 2013]. W wyniku biosyntezy lipidów w biomasie tych pleśni w 1 dm 3 podłoża hodowlanego uzyskiwano ok. 3,5 g tłuszczu. Ważnym aspektem, który należy brać pod uwagę przy mikrobiologicznych metodach pozyskiwania składników żywności z udziałem drobnoustrojów, jest wykorzystanie składników podłoży hodowlanych, w tym przypadku glicerolu (tab. 3). Po 72 godzinach wykorzystanie glicerolu było niepełne. Największe (86%) wystąpiło przy 5% obj. zawartości glicerolu w podłożu hodowlanym, a najmniejsze (59%) przy 20% obj. dodatku tego źródła węgla. Tabela 3. Zmiany zawartości glicerolu w podłożach doświadczalnych oraz stopień wykorzystania tego substratu przez drożdże Rh. gracilis podczas hodowli wgłębnej Table 3. Changes of glycerol content in experimental media and ratio of using this substrate by Rh. gracilis yeast during bath cultivation Rodzaj podłoża hodowlanego Medium type Woda sokowa + 5% glicerolu Wastewater + 5% glycerol Woda sokowa + 10% glicerolu Wastewater + 10% glycerol Woda sokowa + 15% glicerolu Wastewater + 15% glycerol Woda sokowa + 20% glicerolu Wastewater + 20% glycerol Czas hodowli Time of cultivation [h] 0 24 48 72 5,0 ±0,10 10,0 ±0,10 15,0 ±0,10 20,0 ±0,10 SD odchylenie standardowe/standard deviation. Zawartość glicerolu Glycerol content [%] 3,5 ±0,10 8,7 ±0,10 12,6 ±0,20 18,2 ±0,30 1,60 ±0,05 4,60 ±0,10 7,10 ±0,10 14,00 ±0,20 0,70 ±0,04 2,80 ±0,10 3,70 ±0,10 8,20 ±0,10 Stopień wykorzystania glicerolu Ratio of glycerol using [%] 86 73 75 59 W warunkach doświadczenia najwięcej tłuszczu w komórkach drożdży (powyżej 25% wag.) uzyskiwano przy dawkach glicerolu 15 i 20% obj., co potwierdziło zdolność gromadzenia tłuszczu przez stosowany gatunek Rh. gracilis przy dużym nadmiarze źródeł węgla, w czasie logarytmicznej fazy wzrostu. Z tego powodu hodowlę badanego szczepu drożdży w podłożach z odpadową ziemniaczaną wodą sokową i gliceryną należy prowadzić dłużej (powyżej 72 h) w celu pełnego zmetabolizowania źródła węgla [Zheng i in. 2005, Taha i in. 2010]. nr 576, 2014

10 S. Błażejak, I. Gientka, A. Bzducha-Wróbel i inni WNIOSKI 1. Badany gatunek drożdży Rhodotorula gracilis wykazał zdolność wzrostu i biosyntezy wewnątrzkomórkowego tłuszczu podczas 72-godzinnej hodowli wgłębnej w podłożach doświadczalnych z glicerolem i ziemniaczaną odpadową wodą sokową jako źródłami węgla i azotu. 2. Największy plon biomasy komórkowej (28,65 g s.s. dm 3 ) uzyskano w podłożu doświadczalnym z ziemniaczaną wodą sokową i 5% obj. dodatkiem glicerolu. 3. Biosynteza wewnątrzkomórkowego tłuszczu w podłożach doświadczalnych z glicerolem przez drożdże Rhodotorula gracilis zachodziła w fazie wzrostu stacjonarnego. Najwięcej tłuszczu (powyżej 25,00 g 100 g s.s. 1 ) i najwyższą produktywność objętościową biosyntezy wewnątrzkomórkowego tłuszczu (powyżej 5 g dm 3 ) uzyskano w podłożach doświadczalnych zawierających 15- i 20-procentowy dodatek glicerolu. 4. Wzrastająca zawartość glicerolu w podłożach doświadczalnych (od 5 do 20% obj.) prowadziła do zmniejszenia stopnia jego wykorzystania (z 86 do 59%) jako źródła węgla przez stosowane drożdże. Niepełny stopień wykorzystania glicerolu z podłoży doświadczalnych uzasadnia celowość przedłużenia hodowli wgłębnej powyżej 72 godzin. LITERATURA Ageitos J.M., Vallejo J.A., Veiga-Crespo P., Villa T.G., 2011. Oily yeast as oleoginous cell factories. Appl. Microbiol. Biotech. 90, 1219 1227. Beopoulos A., Cescut J., Haddouche R., Uribelarrea J.L., Molina-Jouve C., Nicaud J.M., 2009. Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production. Progress in Lipid Res. 48, 375 387. Borychowski M., 2012. Produkcja i zużycie biopaliw płynnych w Polsce i na świecie szanse, zagrożenia, kontrowersje. W: Roczniki Ekonomiczne Kujawsko-Pomorskiej Szkoły Wyższej w Bydgoszczy 5, 39 59. Buzzini P., Innicenti M., Turchetti B., Libkind D., Broock M., Mulinacci N., 2007. Carotenoid profiles of yeast belonging to the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces and Sporidiobolus. Can. J. Microbiol. 53, 1024 1031. Evans C.T., Scragg A.H., Ratledge C., 1983. A comparative study of citrate efflux from mitochondria of oleaginous and nonoleaginous yeasts. Europ. J. Biochem. 130, 195 204. Fell J.W., Statzell-Tallman A., 1998. Rhodotorula Harison. In: The yeast, a taxonomic study, 4 th ed., Ed by Kurtzman & Fell, Elsevier, Amsterdam, 800 827. Galafassi S., Cucchetti D., Pizza F., Bianchi D., Compagno C., 2012. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Biores. Technol. 111, 398 403. Karatay S., Donmez G., 2010. Improving the lipid accumulation properties of the yeast cell for biodiesel production using molasses. Biores. Tech. 101, 7988 7990. Komorowski P., Błażejak St., 2011. Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez wybrane drożdże. Przem. Spoż. 65(9), 48 51. Li Q., Du W., Liu D., 2008. Perspectives of microbiol olis for biodiesel production. Appl. Microbiol. Biotech. 80, 749 756. Milchert E., Goc W., Lewandowski G., Myszkowski J., 1995. Dehydrochlorination of glicerol dichlorohydrin to epichlorohydrin. Chem. Papers 49(3), 133 136. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis... 11 Muniraj I.K., Xiao L., Hu Z., Zhan X., Shi J., 2013. Microbial lipid production from potato processing wastewater using oleaginous filamentous fungi Aspergillus oryzae. Water Res. 47, 3477 3483. Papanikolaou S., Aggelis G., Komaitis M., 2004. Single Cell Oil (SCO) production by Mortierella asabellina grown on high-suger content media. Biores. Tech. 95, 287 291. Ratledge C., 2002. Regulation of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Biochem. Soc. Trans., 30, 1047 1050. Ratledge C., 2004. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for Single Cell Oil production. Biochimi. 86, 807 815. Robinson R.K., Batt C.A., Patel P.D., 2000. Encyclopedia of food microbiology. Academic, New York, 252 300, 850 854. Rupcic J., Blagowic B., Maric V., 1996. Cell lipids of the candida lipolytica yeast grown on methanol. J. Chrom. 755, 75 80. Saenge C., Cheirsilp B., Suksaroge T., Bourtoom T., 2011. Potential use of oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis for the bioconvertion of crude glycerol from biodiesel plant to lipids and carotenoides. Process Biochem. 46, 210 218. Taccari M., Canonico L., Comitini F., Mannazzu I., Ciani M., 2012. Screening of yeasts for growth on crude glycerol and optimization of biomass production. Bioresource Technol. 110, 488 495. Taha E.M., Omar O., Yousoff W.M., Hamid A.A., 2010. Lipid biosynthesis in Cunnighamella bainieri 2A1 in N-limited and N-excess media. Annuals in Microbiol. 60, 615 622. Yen W.H., Yang Y., Yu Y.H., 2012. Using crude glycerol and thin stillage for the production of microbial lipids through the cultivation of Rhodotorula glutinis. J. Biosci. Bioeng. 114(4), 453 456. Zheng S., Yang M., Yang Z., 2005. Biomass production of yeast isolate from salad oil manufacturing wastewater. Biores. Technol. 96, 1183 1187. EVALUATION OF THE ABILITY OF THE INTRACLELLULAR FAT BIOSYNTHESIS BY RHODOTORULA GRACILIS YEAST IN MEDIA CONTAINING POTATO WASTEWATER ENRICHED WITH GYCEROL Summary. The biosynthesis of intracellular fat by oleaginous yeast strains based on alternative sources of carbon, nitrogen, phosphorus and mineral ingredients can provide the opportunity for the utilization of the industrial wastes. The culture media for SCO production can include glycerol from biodiesel production as a source of carbon as well as potato wastewater as a source of nitrogen. Potato wastewater is a waste of the production of protein feed obtained by proteins thermal-acid coagulation from potato juice. The aim of the study was to determine the ability of Rhodotorula gracilis yeast to the growth and intracellular biosynthesis of fat during 72-hour bath cultivation in experimental media containing potato wastewater enriched with glycerol. Experimental media contained potato wastewater and diverse addition of glycerol in quantities of 5, 10, 15 or 20% vol. Control medium was YPD. Potato wastewater originated from PEPEES SA Food Industry in Łomża (Central East Poland). The biomass yield, intracellular fat content as well as glycerol in cultivation media content were determined during yeast cultivation. Biomass yield was performed by gravimetric method, while glycerol content by the Milchert s method. The intracellular fat content was determined after extraction according to the Soxhlet method nr 576, 2014

12 S. Błażejak, I. Gientka, A. Bzducha-Wróbel i inni with petroleum ether. The highest yield of the cell biomass (28.65 g s.s. dm 3 ) was obtained in the experimental medium with wastewater and 5% of glycerol. Culturing of the yeast of Rhodotorula gracilis in medium containing potato wastewater media enriched with 15 or 20% glycerol leads to the biosynthesis of intracellular fat. The intracellular biosynthesis of fat in the experimental media glycerol occurred in the stationary growth phase. The highest intracellular fat (25.57 g 100 g s.s. 1 ) was found in yeast biomass from the experimental media containing 20% glycerol. In comparison to the fat content in the biomass from YPD control medium (8.87 g 100 g s.s. 1 ) and experimental without glycerol (4.81 g 100 g s.s. 1 ) the value was about 3 and 5 times greater respectively. The volumetric productivity of fat in cells of the yeast strain tested exceeded 5 g dm 3 in potato wastewater media enriched with 15 or 20% glycerol. Increasing the glycerol content in the experimental media (from 5 to 20% vol) led to a reduction in glycerol utilization by yeast (from 86 to 59%). The fact of incomplete utilization of glycerol in experimental media should result in an extension of the submerged culture over 72 hours. Key words: SCO (Single Cell Oil), Rhodotorula, potato wastewater, glycerol, biosynthesis of intracellular fat Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 576, 2014, 13 21 OCENA NIEZAWODNOŚCI USUWANIA ZWIĄZKÓW BIOGENNYCH W OCZYSZCZALNI ŚCIEKÓW METODĄ WEIBULLA Piotr Bugajski Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Streszczenie. Celem pracy była ocena niezawodności usuwania związków azotu i fosforu z zastosowaniem metody niezawodności Weibulla w zbiorczej oczyszczalni ścieków w Mszanie Dolnej. Wielkość projektowana oczyszczalni wyrażona RLM wynosi 18000. Badania prowadzono w latach 2007 2011, w których pobrano i poddano analizie fizyczno- -chemicznej 60 próbek ścieków surowych i oczyszczonych. Na podstawie badań stwierdzono, że stężenia azotu ogólnego w ściekach dopływających w 83,3% przypadków odpowiadały charakterystycznym wartościom w ściekach bytowych, z kolei stężenia fosforu ogólnego były tylko w 30% na poziomie wartości charakterystycznych. Za pomocą tej metody oceniano poziom niezawodności technologicznej oczyszczalni, który to wynika z metodycznej analizy uzyskanych wcześniej wyników badań. Analizowana oczyszczalnia pracuje z obniżoną niezawodnością, która dla azotu ogólnego wynosi 87,1%, a dla fosforu ogólnego 93,9%. Na skutek obniżonej skuteczności usuwania związków azotu oraz fosforu w badanym obiekcie w ściekach odprowadzanych do odbiornika pojawiają się stężenia wyższe od dopuszczalnych określonych w pozwoleniu wodno-prawnym. Według zaproponowanego w pracy dopuszczalnego poziomu niezawodności dla tej wielkości oczyszczalni opisanego przez Andrakę i Dzienisa [2003], w przedmiotowej oczyszczalni tylko stężenia azotu są wyższe od przyjętego poziomu niezawodności, a w odniesieniu do stężeń fosforu poziom niezawodności usuwania tego biogenu zawiera się w dopuszczalnej granicy. Celem zwiększenia skuteczności procesów nitryfikacji i denitryfikacji w bioreaktorze badanej oczyszczalni należy prowadzić ciągły monitoring (online) i okresowo dawkować dodatkowe źródło węgla organicznego (BZT 5 ) bezpośrednio do bioreaktora w celu zachowania odpowiednich proporcji związków organicznych wyrażonych jako BZT 5 w stosunku do związków azotu, tak aby prawidłowo zachodziły procesy nitryfikacji i denitryfikacji odpowiedzialne za neutralizację związków azotu. Słowa kluczowe: ścieki, oczyszczalnia, niezawodność usuwania, metoda Weibulla Adres do korespondencji Corresponding author: Piotr Bugajski, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, Wydział Inżynierii Środowiska i Geodezji, Katedra Inżynierii Sanitarnej i Gospodarki Wodnej, Al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków, e-mail: p.bugajski@ur.krakow.pl

14 P. Bugajski WSTĘP Dynamiczny rozwój w ostatnich latach infrastruktury sanitarnej na terenach gmin wiejskich w Polsce niewątpliwie wpływa na poprawę stanu czystości wód [Błażejewski 2012, Jóźwiakowski i in. 2012]. W miejscowościach, w których do niedawna mieszkańcy korzystali z wybieralnych zbiorników bezodpływowych (szamba), powstają zbiorcze systemy kanalizacyjne z oczyszczalnią ścieków, a na terenach o rozproszonej zabudowie instalowane są przydomowe oczyszczalnie [Krzanowski i Wałęga 2007, Heidrich i Stańko 2008, GUS 2012]. Według aktualnych danych GUS [2012], w Polsce funkcjonuje ponad 110 000 przydomowych oczyszczalni, a docelowo szacuje się, że będzie ich ponad 600 000. W krajach Unii Europejskiej, w tym też w Polsce, przepisy dotyczące wymagań jakości ścieków oczyszczonych odprowadzanych z oczyszczalni są zróżnicowane w zależności od wielkości obiektu określonej na podstawie równoważnej liczby mieszkańców [Dz.U. Nr 137, poz. 984 z późn. zm]. Zbiorcze oczyszczalnie ścieków instalowane na terenach wiejskich są obiektami, w których wymagania odnośnie unieszkodliwiania związków biogennych nie są uwzględniane lub wymogi odnośnie tych związków są bardzo liberalne. W związku z tym technologia oczyszczania w tych oczyszczalniach jest niedostosowana do usuwania związków azotu i fosforu. Uwzględniając dużą liczbę powstających tego typu oczyszczalni w Polsce, należy mieć na względzie, iż nadmiar związków azotu i fosforu w odprowadzanych ściekach będzie skutkował zwiększonymi procesami eutrofizacji wód, zwłaszcza stojących. Aby uniknąć tego zagrożenia, należy opracować wytyczne odnośnie całego kraju lub regionów szczególnie narażonych na zanieczyszczenia wód dotyczące doboru takiej technologii oczyszczania, która pozwoli na jak największe usuwanie zanieczyszczeń eutroficznych. W tego rodzaju działaniach należy oczywiście uwzględnić specyficzne warunki dla terenów wiejskich w Polsce, tj. stężenie zanieczyszczeń w ściekach, ilość powstających ścieków, a także warunki klimatyczne [Bojanowska i Pepliński 2002, Bugajski 2013]. CEL, ZAKRES ORAZ METODYKA BADAŃ Celem pracy była ocena niezawodności usuwania związków azotu i fosforu z zastosowaniem metody Weibulla w zbiorczej oczyszczalni ścieków. Badania prowadzono w latach 2007 2011 w zbiorczej oczyszczalni ścieków w Mszanie Dolnej. W okresie badań pobrano i poddano analizie fizyczno-chemicznej 60 próbek ścieków surowych i oczyszczonych zgodnie z metodami referencyjnymi określonymi w Rozporządzeniu Ministra Środowiska z 2006 roku [Dz.U. Nr 137, poz. 984 z późn. zm.]. Ocenę efektywności usuwania zanieczyszczeń w przedmiotowej oczyszczalni określono z wykorzystaniem elementów teorii niezawodności Weibulla, która, jak wykazały wcześniejsze badania, jest przydatną metodą do oceny funkcjonowania oczyszczalni ścieków [Bugajski i in. 2012]. Rozkład Weibulla charakteryzuje się funkcją gęstości prawdopodobieństwa (1) z parametrami b, c i θ: f x c 1 c x e b b c x b (1) Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Ocena niezawodności usuwania związków biogennych w oczyszczalni ścieków... 15 gdzie: x zmienna określająca stężenie danego wskaźnika zanieczyszczeń w ściekach oczyszczonych, b parametr skali, c parametr kształtu, θ parametr położenia. Przy założeniach: θ < x, b > 0, c > 0. Estymację parametrów rozkładu Weibulla wykonano metodą największej wiarygodności. Jakość dopasowania rozkładu Weibulla do danych empirycznych przeprowadzono testem Hollandera-Proschana [Bugajski i in. 2012]. Analizę wyników badań wykonano z użyciem programu STATISTICA 8. CHARAKTERYSTYKA OBIEKTU BADAŃ Analizowana oczyszczalnia ścieków w Mszanie Dolnej oddana do użytku w 2004 roku została zaprojektowania dla RLM = 18 000 M. Do obiektu dopływają ścieki systemem kanalizacji rozdzielczej z gospodarstw domowych z obszaru miasta oraz dowożone są ścieki taborem asenizacyjnym z obszarów nieskanalizowanych z terenu gminy. Projektowany średni dobowy dopływ ścieków wynosi Q dśr. = 3600 m 3 d 1, a dopływ maksymalny wynosi Q dmax. = 4680 m 3 d 1. W okresie 5-letnich badań średni dopływ ścieków był na poziomie 57% zakładanego dopływu, zatem możliwe jest przyjęcie większej ilości ścieków niż obecnie. Aktualnie przy niedociążeniu hydraulicznym obiektu zwiększony jest koszt jednostkowy oczyszczania ścieków. Oczyszczalnia ścieków funkcjonuje na podstawie pozwolenia wodno-prawnego OŚ-622/3/6/0 wydanego przez Starostwo Powiatowe w Limanowej w dniu 8 kwietnia 2004 roku. Pozwolenie ma ważność do 31 grudnia 2018 ro - ku. Odbiornikiem ścieków oczyszczonych jest rzeka Mszanka prawobrzeżny dopływ rzeki Raby. W pozwoleniu wodno-prawnym zostały określone dopuszczalne (maksymalne) stężenia badanych wskaźników, czyli azotu ogólnego i fosforu ogólnego w ściekach oczyszczonych, które wynoszą; azot ogólny 15 mgn og dm 3, fosfor ogólny 2 mgp og dm 3. Ciąg technologiczny przedmiotowej oczyszczalni składa się z dwóch etapów oczyszczania ścieków oraz urządzeń do unieszkodliwiania osadów ściekowych. Etap pierwszy to oczyszczanie mechaniczne ścieków poprzez zastosowanie kraty gęstej schodkowej z automatycznym usuwaniem skratek oraz piaskownika pionowego wirowego. Z kolei etap drugi to oczyszczanie biologiczne w czterech bioreaktorach sekwencyjnych typu SBR, w których zachodzą procesy nitryfikacji i denitryfikacji oraz proces oddzielania osadów od oczyszczonych ścieków. Przy aktualnym niskim obciążeniu hydraulicznym użytkowane są tylko 2 bioreaktory, a w razie zwiększonego dopływu możliwe jest uruchomienie dwóch kolejnych. W skład ciągu technologicznego unieszkodliwiającego osady ściekowe wchodzą dwa zbiorniki do tlenowej stabilizacji osadu oraz prasy filtracyjne, których zadaniem jest zmniejszenie uwodnienia osadów, tak aby zminimalizować ich objętość. nr 576, 2014

16 P. Bugajski ANALIZA WYNIKÓW BADAŃ W ściekach dopływających do oczyszczalni stężenia azotu ogólnego w większości przypadków plasowały się na poziomie przeciętnych wartości podawanych w literaturze, czyli można je zakwalifikować do ścieków charakterystycznych odprowadzanych z gospodarstw domowych [Heidrich i in. 2008, Bugajski i Bergel 2008, Heidrich i Kozak 2009]. Jak wynika z wykresu przedstawionego na rysunku 1, w 83,3% przypadków stężenia azotu ogólnego zawierały się w przedziale odpowiadającym ściekom charakterystycznym odprowadzanym z gospodarstw domowych, czyli w granicach od 30 do 120 mgn og dm 3. W 5% przypadków stężenia azotu ogólnego były bardzo niskie, a w 11,7% przypadków były bardzo wysokie. Niskie stężenia azotu ogólnego w ściekach surowych mogą wynikać z okresowego dopływu wód obcych (infiltracyjnych i przypadkowych), w których ładunek azotu jest bardzo mały, z kolei ponadprzeciętnie wysokie wartości azotu w ściekach surowych były prawdopodobnie wynikiem dopływu do kanalizacji ścieków przemysłowych [Kaczor 2012, Bugajski i Satora 2011]. Częstość względna Relative frequency [%] Rys. 1. Fig. 1. 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 < x 30 30 < x 60 60 < x 90 90 < x 120 120 < x 150 x > 150 mgn og dm 3 Histogram rozkładu stężenia azotu ogólnego w ściekach dopływających do oczyszczalni Histogram of the total nitrogen concentration distribution in sewage flowing into the treatment plant W odniesieniu do wielkości stężenia fosforu ogólnego stwierdzono małe wartości tego wskaźnika w ściekach surowych. W badanym okresie w blisko 1/3 badanych próbek ścieków stwierdzono stężenia charakterystyczne dla ścieków bytowych pochodzących z gospodarstw domowych, czyli zawierały się w przedziale od 10 do 20 mgp og dm 3 (36,7% przypadków). Znaczna ilość analiz (46,7% przypadków) wykazała, iż wartości stężeń fosforu ogólnego są poniżej 10 mgp og dm 3. Zdarzyły się również sporadycznie bardzo wysokie stężenia fosforu ogólnego, powyżej 50 mgp og dm 3 (1,7% przypadków). Stężenia fosforu ogólnego w ściekach dopływających do badanego obiektu przedstawiono na rysunku 2. W dalszej analizie dla oszacowanych parametrów rozkładu dokonano weryfikacji hipotezy o przyjęciu rozkładu Weibulla do aproksymacji danych empirycznych. Wyniki dopasowania rozkładu testem Hollandera-Proschana wraz z estymowanymi parametrami przedstawiono w tabeli 1. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Ocena niezawodności usuwania związków biogennych w oczyszczalni ścieków... 17 Częstość względna Relative frequency [%] Rys. 2. Fig. 2. 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 < x 10 10 < x 20 20 < x 30 30 < x 40 40 < x 50 x > 50 mgp og dm 3 Histogram rozkładu stężenia fosforu ogólnego w ściekach dopływających do oczyszczalni Histogram of the total phosphorus concentration distribution in sewage flowing into the treatment plant Tabela 1. Wyniki estymacji parametrów rozkładu Weibulla wraz z miarami dobroci dopasowania do danych empirycznych Table 1. Results of the estimation of the Weibull distribution parameters together with the measures of goodness of fit to empirical data Wskaźnik Index Parametry rozkładu Distribution parameters b c θ Test Hollandera-Proschana Wartość testu Test value Azot ogólny Total nitrogen 8,793 1,284 0,728 0,589 0,555 Fosfor ogólny Total phosphorus 1,013 1,507 0,149 0,252 0,800 *Prawdopodobieństwo testowe; jeśli p 0,05 należy odrzucić hipotezę zerową, że dane empiryczne można opisać rozkładem Weibulla. * Probability test; if p 0,05 should be reject the null hypothesis that the empirical data can be described by Weibull distribution. Wyniki analizy niezawodnościowej opartej o metodę Weibulla dotyczącą azotu ogólnego w ściekach oczyszczonych przedstawiono na rysunku 3, a fosforu ogólnego na rysunku 4. Na podstawie dystrybuanty (rys. 3) stwierdza się, że w 13% pobranych próbkach ścieków oczyszczonych było przekroczone dopuszczalne stężenie azotu ogólnego, które wynosi 15 mgn og dm 3. Zatem w ściekach odprowadzanych do odbiornika z analizowanej oczyszczalni w około 47 dobach w rocznym okresie znajdują się ponad dopuszczalne wartości stężeń azotu ogólnego. W przypadku stężeń fosforu ogólnego w ściekach oczyszczonych wartość dopuszczalna 2 mgp og dm 3 została przekroczona w 6% przypadków, co obrazuje dystrybuanta na rysunku 4. Zatem w rocznym okresie w około 22 dobach przekroczone są dopuszczalne wartości stężeń fosforu ogólnego. Przyjmując wytyczne zaproponowane przez Andrakę i Dzenisa [2003], według których tej wielkości oczyszczalnia powinna pracować z niezawodnością co najmniej 92,3% przy ryzyku producenta na poziomie α = 0,05, dopuszcza się wadliwą p* nr 576, 2014

1,0 0,9 0,8 0,7 Niezawodność Reliability R(t) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 Azot ogólny Total nitrogen [mgn og dm 3 ] Rys. 3. Wyniki analizy niezawodnościowej Weibulla dla stężeń azotu ogólnego w ściekach oczyszczonych Fig. 3. Results of the Weibull reliability analysis for the total nitrogen concentrations in treated sewage 1,0 0,9 0,8 0,7 Niezawodność Reliability R(t) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Rys. 4. Fig. 4. 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Fosfor ogólny Total phosphorus [mgp og dm 3 ] Wyniki analizy niezawodnościowej Weibulla dla stężeń fosforu ogólnego w ściekach oczyszczonych Results of the Weibull reliability analysis for the total phosphorus concentrations in treated sewage

Ocena niezawodności usuwania związków biogennych w oczyszczalni ścieków... 19 pracę oczyszczalni o RLM od 15 000 do 49 999 przez 27 dni w roku. W przypadku przedmiotowej oczyszczalni zmniejszona jest niezawodność usuwania azotu ogólnego w 20 dobach, a wartości stężeń fosforu ogólnego są na poziomie spełniającym wymagania dotyczące niezawodności. WNIOSKI Metoda, którą zaproponowano do oceny niezawodności funkcjonowania zbiorczej oczyszczalni ścieków w Mszanie Dolnej, została oparta o rozkład Weibulla i jak wykazały wcześniejsze analizy w odniesieniu do innych tego typu obiektów umożliwia ocenę ryzyka przekroczenia dopuszczalnych wartości wskaźników zanieczyszczeń w ściekach oczyszczonych [Bugajski i in. 2012]. Na podstawie tej metody możliwe jest również określnie czasu pracy oczyszczalni z obniżoną efektywnością usuwania zanieczyszczeń, co może być przydatne w podjęciu decyzji dotyczącej np. modernizacji ciągu technologicznego lub tylko regulacji procesów oczyszczania zachodzących w bioreaktorze. Na podstawie przeprowadzonej analizy niezawodnościowej dla zbiorczej oczyszczalni w Mszanie Dolnej można sformułować następujące wnioski i stwierdzenia: 1. Oczyszczalnia ścieków charakteryzuje się okresowo obniżoną efektywnością usuwania zanieczyszczeń eutroficznych w odniesieniu do wartości granicznych. W odniesieniu do stężenia azotu ogólnego obniżona efektywność pracy wystąpiła w 13% czasu, a stężenia fosforu ogólnego były przekroczone w 6% czasu w analizowanym okresie 5 lat. 2. Ocena niezawodności pracy oczyszczalni oparta o model Weibulla w odniesieniu do wskaźników biogennych wykazała, że w przypadku skuteczności zmniejszenia stężenia azotu ogólnego obiekt ten spełniałby wymogi przez 318 dni, a w przypadku fosforu ogólnego przez 343 dni średnio w każdym roku. 3. Niezawodność działania według wskazanych wytycznych jest zadowalająca w odniesieniu do stężeń fosforu ogólnego, z kolei stężenia azotu ogólnego są wyższe od dopuszczalnych w 27 dobach w odniesieniu do rocznego okresu. 4. Na podstawie analiz fizyczno-chemicznych stwierdzono, że w ściekach dopływających stężenia azotu ogólnego w 83,3%, a stężenia fosforu ogólnego w 36,7% przypadków były na poziomie wartości stężeń charakterystycznym dla ścieków pochodzących z gospodarstw domowych. 5. Aby zwiększyć skuteczność usuwania związków azotu należy w okresie, gdy niezachowana jest odpowiednia proporcja związków organicznych (BZT 5 ) do azotu okresowo dawkować dodatkowe źródło węgla organicznego do bioreaktora, tak aby wspomagać działanie mikroorganizmów biorących udział w procesie nitryfikacji i denitryfikacji. LITERATURA Andraka D., Dzienis L., 2003. Wymagany poziom niezawodności oczyszczalni ścieków w świetle przepisów polskich i europejskich. Zeszyty Naukowe Politechniki Białostockiej. Seria Inżynieria Środowiska, z. 16, Białystok, 24 28. nr 576, 2014

20 P. Bugajski Błażejewski R., 2012. Kanalizacja terenów niezurbanizowanych. Wodociągi i Kanalizacja 1(95), 34 37. Bojanowska I., Pepliński M., 2002. Optymalizacja pracy oczyszczalni ścieków w Tczewie w zakresie usuwania biogenów i związków węgla. Ochrona Środowiska 3, 31 36. Bugajski P., Bergel T., 2008. Wielkości wybranych stężeń zanieczyszczeń w ściekach bytowych odpływających z terenów wiejskich. Gaz, Woda i Technika Sanitarna 9, 28 29. Bugajski P., Satora S., 2011. Wpływ zanieczyszczeń odprowadzanych z ubojni trzody chlewnej oraz masarni na jakość ścieków dopływających do oczyszczalni. Acta Sci. Pol., Formatio Circumiectus 10(2), 3 10. Bugajski P., Wałęga A., Kaczor G., 2012. Zastosowanie metody Weibulla do analizy niezawodności działania przydomowej oczyszczalni ścieków. Gaz, Woda i Technika Sanitarna 2, 56 58. Główny Urząd Statystyczny Ochrona Środowiska, Warszawa 2013. Heidrich Z., Kalenik M., Podedworna J., Stańko G., 2008. Sanitacja Wsi. Wydawnictwo Seidel- -Przywecki Sp. z o. o., Warszawa. Heidrich Z., Kozak T., 2009. Jednostkowe ładunki zanieczyszczeń charakteryzujące ścieki miejskie. Gaz, Woda i Technika Sanitarna 12, 20 22. Heidrich Z., Stańko G., 2008. Kierunki rozwiązań oczyszczalni ścieków dla wiejskich jednostek osadniczych. Infrastruktura i Ekologia Terenów Wiejskich 5, 169 177. Jóźwiakowski K., Pytka A., Marzec M., Gizińska M., Dąbek J., Głaz B., Sławińska A., 2012. Rozwój infrastruktury wodno-ściekowej w województwie lubelskim w latach 2000 2011. Infrastruktura i Ekologia Terenów Wiejskich 3(I), 73 86. Kaczor G., 2012. Wpływ wód infiltracyjnych i przypadkowych na funkcjonowanie małych systemów kanalizacyjnych. Z. 375, Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, Kraków. Krzanowski S., Wałęga A., 2007. New technologies of small domestic sewage volume treatment applied in Poland. Infrastruktura i Ekologia Terenów Wiejskich 3, 69 78. Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 24 lipca 2006 roku w sprawie warunków jakim powinny odpowiadać ścieki wprowadzane do wód lub do ziemi oraz w sprawie substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska wodnego [Dz.U. Nr 137, poz. 984, z późn. zm.]. ASSESSMENT OF NUTRIENT REMOVAL RELIABILITY IN A SEWAGE TREATMENT PLANT USING THE WEIBULL METHOD Summary. The aim of this study was to assess the reliability of removal of nutrients, such as total nitrogen and total phosphorus, using the Weibull reliability method. The studies, conducted during the 5 year period from 2007 to 2011, concerned the collective sewage treatment plant in Mszana Dolna in the Lesser Poland voivodeship. The designed size of the treatment plant, expressed in PE is 18000 residents. In addition to sewage flowing into the treatment plant through the sewer system from the city, sewage is also transported from septic tanks from the commune areas not-covered with the sewerage system. Sixty samples of raw and treated sewage samples were collected and subjected to physico-chemical analysis within the study period. Based on the results it was found that in 83.3% cases the concentration of total nitrogen in inflowing sewage corresponded to the typical values for domestic sewage, while the concentrations of total phosphorus were at the level of the characteristic values only in 30%. The technological reliability of the treatment plant, which stems from Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Ocena niezawodności usuwania związków biogennych w oczyszczalni ścieków... 21 the methodological analysis of previously obtained results concerning treated sewage, was evaluated using the Weibull reliability method. Based on this method it was found that the analyzed treatment plant works with reduced operating reliability in the selected periods, which for total nitrogen is 87.1%, while for total phosphorus it is 93.9%. As a result of the decreased removal efficiency of nitrogen and phosphorus compounds in the analyzed facility, the concentrations of those indicators in sewage discharged into the receiver are higher than the limits specified in the water license. According to the acceptable level of reliability for this size of the treatment plant, proposed in this paper, i.e. 92.3%, only the nitrogen concentrations are greater than the accepted level of reliability in the subject treatment plant, while in the case of phosphorus concentrations, the level of removal reliability for this nutrient falls within the permissible risk limit. The assessment of the treatment plant operation reliability, based on the Weibull model with respect to the nutrients, showed that in the case of the total nitrogen removal effectiveness, this facility would meet the requirements for 318 days, while in the case of total phosphorus on average for 343 days in each of the study year. A continuous monitoring (online) should be carried out in order to increase the effectiveness of nitrification and denitrification in the bioreactor of the analyzed sewage treatment plant. Moreover, additional organic carbon source (BOD 5 ) should be periodically dosed directly to the bioreactor, so as to maintain the correct proportions of organic compounds, expressed as BOD 5 in relation to nitrogen compounds, in order for the nitrification and denitrification processes, which are responsible for nitrogen compound neutralization, occur properly. Key words: sewage, sewage treatment plant, removal reliability, Weibull method nr 576, 2014