Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz

PRACE PRZEGL DOWE Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t, Instytut Zootechniki, Balice k. Krakowa Development of the studies on somatic cell cloning in goats Summary Domestic goat as a species with a relatively great biodiversity of dairy breeds, which possess high genetic merit and yield of milk production, can be a valuable tool for embryo gene engineering. This involves the generation of transgenic specients, providing with xenogeneic (human) recombinant proteins (i.e. biopharmaceuticals), not only by the standard zygote intrapronuclear microinjection of gene constructs, but above all with the use of somatic cell cloning technology. Key words: goat, somatic cell cloning, nuclear transfer, transgenesis. 1. Wstêp Adres do korespondencji Maria Skrzyszowska, Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t, Instytut Zootechniki, 32-083 Balice k. Krakowa; e-mail: mskrzysz@izoo.krakow.pl 1 (72) 133 150 2006 Metoda klonowania somatycznego technik¹ transplantacji j¹der komórkowych, wykorzystywana jest w badaniach biotechnologicznych prowadzonych na wielu gatunkach ssaków, w tym tak e na gatunkach zwierz¹t gospodarskich. Atrakcyjnoœæ tej techniki w odniesieniu do zwierz¹t gospodarskich wynika z rysuj¹cych siê mo liwoœci u ycia jej do multiplikacji osobników o wybitnych, wysokoodziedziczalnych cechach wartoœci hodowlanej (genetycznej) i u ytkowej, co z kolei mog³oby przyczyniæ siê do skrócenia odstêpu miêdzypokoleniowego i przyœpieszenia tempa osi¹gania postêpu hodowlanego. Jednak e, realizacja tego kierunku badañ mo liwa jest obecnie tylko w bardzo ograniczonej skali, z powodu wysokich kosztów procedury klonowania,

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec przy wci¹, relatywnie niskiej skutecznoœci metody. Upowszechnienie tej technologii mo liwe bêdzie dopiero po osi¹gniêciu wysokiej i stabilnej, tzn. gwarantuj¹cej powtarzalnoœæ wyników, efektywnoœci. Najwiêksze jednak oczekiwania zwi¹zane z praktyczn¹ aplikacj¹ techniki klonowania somatycznego, dotycz¹ mo liwoœci wykorzystania jej do produkcji zwierz¹t transgenicznych, cennych ze wzglêdu na produkt ekspresji zmodyfikowanych genów, alternatywnie w stosunku do standardowej techniki uzyskiwania transgenicznych zwierz¹t na drodze mikroiniekcji egzogennych konstrukcji genetycznych do jednego z przedj¹drzy zygot. Klonowanie somatyczne mo e byæ tak e sposobem multiplikacji ju wyprodukowanych osobników transgenicznych (1-4). 2. Znaczenie gatunkowospecyficznych cech kozy dla genetycznej in ynierii embrionalnej Koza (Capra hircus L.) jako gatunek o du ej bioró norodnoœci ras wykazuj¹cych stosunkowo wysok¹ wydajnoœæ mleczn¹ mo e byæ dobrym obiektem dla transgenicznej produkcji rekombinowanych ludzkich bia³ek terapeutycznych. Znaczna efektywnoœæ produkcji oczyszczonych (podlegaj¹cych procesowi puryfikacji) obcogatunkowych biopreparatów przez kozy u³atwi³aby zatem ich stopniowe uzdatnianie w przemyœle farmaceutycznym. Innymi wymiernymi korzyœciami uzyskiwania zmodyfikowanych genetycznie kóz klonalnych, cennych ze wzglêdu na ksenogeniczny produkt ukierunkowanej na gruczo³ mlekowy ekspresji egzogennego DNA s¹: stosunkowo krótki odstêp miêdzypokoleniowy daj¹cy mo liwoœæ przyœpieszania tempa osi¹gania postêpu genetycznego w zakresie hodowli tzw. maciorek i koz³ów-za³o ycieli rodzicielskich linii transgenicznych (ang. founder animals), a tak e niska podatnoœæ ras kóz nale ¹cych do mlecznego typu u ytkowego na infekcje patologicznymi prionami (Prp Sc ) wywo³uj¹cymi chorobê scrapie (trzêsawkê) u owiec (5). Transgeniczne kozy mog³yby byæ optymalnymi bioreaktorami równie z innego, agroekonomicznego powodu. W porównaniu z chowem krów transgenicznych, zwierzêta te mo na ³atwiej hodowaæ, szybciej kierowaæ ich naturalnym i wspomaganym metodami biotechnologicznymi rozrodem, a ich utrzymanie jest znacznie tañsze ni du ych prze uwaczy. Posiadaj¹ one bowiem doœæ du e w stosunku do rozmiarów ich cia³a wymiona o przewadze tkanki gruczo³owej nad w³óknist¹ tkank¹ mi¹ szow¹ (parenchymaln¹), co ju genetycznie predestynuje ten gatunek ma³ych prze uwaczy do wysokiego potencja³u produkcyjnego siary i mleka. Konsekwencj¹ tych anatomiczno-fizjologicznych zalet kóz mo e byæ tak e wysoka wydajnoœæ stada transgenicznych maciorek w zakresie syntezy i sekrecji rekombinowanych bia³ek terapeutycznych przez komórki pêcherzyków mlekotwórczych, wytwarzaj¹cych wydzielinê o zmodyfikowanym genetycznie sk³adzie jakoœciowym i iloœciowym. Pierwsze transgeniczne koÿlêta klonalne uzyskano po transplantacji zarodków zrekonstruowanych z j¹der komórek somatycznych, transfekowanych in vitro sto- 134 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz sunkowo prostymi konstrukcjami genowymi nie zawieraj¹cymi genomowych sekwencji regionów koduj¹cych transgeny struktury, lecz z³o onymi jedynie z segmentów eksonowych genów koduj¹cych markerowe bia³ka selekcyjne, np. fosfotransferazê glicerolow¹/kinazê fosfoglicerolow¹ neomycyny (PGKneo), warunkuj¹c¹ opornoœæ na genetycynê (G418) i/lub reporterowe bia³ko intensywnej zieleni fluorescencyjnej meduzy Aequorea victoria (Egip., ang. enhanced green fluorerescent protein). W doœwiadczeniach Zou i wsp. (6) przeprowadzonych nad klonowaniem somatycznym kóz z wykorzystaniem hodowanych in vitro fibroblastów p³odowych, transfekowanych przy u yciu konstruktu genetycznego zawieraj¹cego jedynie gen opornoœci na pochodn¹ neomycyny (neo r ) wyprodukowano 5 zmodyfikowanych genetycznie koÿl¹t. Z kolei, Keefer i wsp. (3) oraz Baldassarre i wsp. (7,8) zastosowali do zabiegu transfekcji (lipofekcji) in vitro fibroblastów p³odowych bardziej z³o on¹ plazmidow¹ konstrukcjê genow¹ (CEeGFP) zawieraj¹c¹: 1) rozbudowan¹ sekwencjê genomow¹ tzw. ludzkiego wariantu genu bia³ka egfp pod kontrol¹ promotora ludzkiego czynnika elongacji ³añcucha polinukleotydowego-1 (ang. human elongation factor-1 ) oraz regulatorowej sekwencji regionu wzmacniaj¹cego inicjacjê transkrypcji mrna cytomegalowirusa (ang. cytomegalovirus enhancer), a tak e 2) markerowy gen selekcyjny neomycyny sprzê ony z ekspresyjnym wektorem kierunkowym wyizolowanym z genomu wirusa SV-40 (ang. simian virus-40). Po transplantacji zarodków zrekonstruowanych z j¹der tak transformowanych genetycznie komórek somatycznych uzyskano jedn¹ maciorkê klonaln¹ z potwierdzon¹ molekularnie i fenotypowo ekspresj¹ reporterowego transgenu egfp. Transgeniczne zwierzêta ze zdiagnozowanym przy yciowo wysokim profilem aktywnoœci transkrypcyjnej obcogatunkowego genu mog¹ byæ nastêpnie multiplikowane technik¹ klonowania somatycznego. Ma to szczególne uzasadnienie w przypadku gdy pozyskiwane z tych zwierz¹t biofarmaceutyki mog¹ znaleÿæ powszechne zastosowanie w terapii u ludzi cierpi¹cych na szereg nieuleczalnych chorób jednogenowych. W momencie uzyskania przez transgeniczne biopreparaty odpowiednich certyfikatów dopuszczaj¹cych je do aplikacji u ludzi, somatyczne klonowanie zmodyfikowanych genetycznie osobników pozwoli, przynajmniej teoretycznie, na utrzymanie homogennoœci takich leków ekstrahowanych z fizjologicznych wydzielin i wydalin (mleko, mocz) kolejnych generacji sklonowanych zwierz¹t. Technologiê tak¹ wykorzystano z powodzeniem w amerykañskiej firmie biotechnologicznej Genzyme Transgenic Corporation, po wyprodukowaniu transgenicznych kóz z potwierdzon¹ w mleku ekspresj¹ allelu ludzkiej antytrombiny III, standardow¹ metod¹ mikroiniekcji konstruktów cdna wyposa onych w promotor kierunkowy koziej -kazeiny (1,9). W przeprowadzonych eksperymentach, z p³odów uzyskanych w wyniku krycia nietransgenicznych maciorek zmodyfikowanym genetycznie koz³em-za³o ycielem transgenicznego rodu zwierz¹t, z ukierunkowan¹ na gruczo³ mlekowy aktywnoœci¹ transkrypcyjn¹ genu ludzkiej antytrombiny III, wyprowadzono linie transformowanych genetycznie komórek fibroblastycznych. Linie klonalne tych komórek pos³u y³y jako Ÿród³o dawców j¹der w procedurze klonowania somatycznego, któ- BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 135

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec rej efektem by³o wyprodukowanie ³¹cznie 8 transgenicznych maciorek (1,9). Kolejnym przyk³adem wykorzystania techniki klonowania somatycznego do powielania populacji osobników transgenicznych s¹ wyniki doœwiadczeñ przeprowadzonych przez Cheng a i wsp. (4). W tym przypadku do rekonstrukcji enukleowanych oocytów u yto hodowane in vitro komórki linii klonalnych, wyprowadzonych z transgenicznej kozy bêd¹cej nosicielem ogólnoustrojowej ekspresji genu rekombinowanej ludzkiej erytropoetyny (rhepo). Po przeszczepieniu sklonowanych zarodków do dróg rodnych pseudociê arnych maciorek-biorczyñ, urodzi³y siê 2 zmodyfikowane genetycznie koÿlêta, z potwierdzonym molekularnie oraz fenotypowo wysokim profilem aktywnoœci transkrypcyjnej transgenu koduj¹cego ksenogeniczne bia³ko rhepo. Chocia efektywnoœæ klonowania somatycznego kóz mierzona odsetkiem urodzonych koÿl¹t jest wci¹ stosunkowo niska i z regu³y nie przekracza œrednio 10% w stosunku do liczby zarodków transplantowanych do dróg rodnych maciorek-biorczyñ oraz 5% w stosunku do liczby zrekonstruowanych oocytów, to problematyka zwi¹zana z t¹ technik¹ wspomaganego rozrodu zwierz¹t wzbudza ci¹gle rosn¹ce zainteresowanie jako metod¹ alternatywn¹ do standardowej techniki mikroiniekcji transgenów. Wydajnoœæ tej ostatniej bowiem wyra a siê bardzo niskim stopniem prawid³owej integracji obcych genów w genomie urodzonych maciorek-za³o ycielek linii transgenicznych (œrednio 1,7% w stosunku do liczby zygot przeszczepianych do matek zastêpczych; [10,11]). Natomiast technologia transplantacji j¹der transfekowanych in vitro komórek somatycznych zwiêksza istotnie prawdopodobieñstwo uzyskiwania niemozaikowego potomstwa transgenicznego, posiadaj¹cego wbudowany egzogenny konstrukt genowy równie w linii pierwotnych komórek p³ciowych. Takie niechimerowe pod wzglêdem transformacji genetycznej komórek gametogenicznych i somatycznych osobniki zachowuj¹ pe³n¹ zdolnoœæ do przekazywania fenotypowo i molekularnie zdiagnozowanej ekspresji transgenu na komórki gruczo³u mlekowego kolejnej generacji urodzonych koÿl¹t. Doskona³ym tego przyk³adem mog¹ byæ wyniki badañ Baguisi ego i wsp. (1). Detekcja wysokiego poziomu ekspresji genu koduj¹cego rekombinowan¹ ludzk¹ antytrombinê III w komórkach wymion trzech maciorek klonalnych uzyskanych z zarodków zrekonstruowanych z j¹der fibroblastów transgenicznych p³odów wyra a³a siê równie w postaci niezwykle wysokiej fenotypowej wartoœci tej zmodyfikowanej genetycznie cechy w pobranych próbkach mleka. W okresie 33 dni zainicjowanej ju w wieku 2 miesiêcy laktacji wydajnoœæ mleczna tych maciorek osi¹gnê³a wartoœæ oko³o 160 ml, a koncentracja ludzkiej antytrombiny III w pobranym mleku wynios³a a 5,8 g/l (20,5 U/mL aktywnoœci enzymatycznej oczyszczonego biopreparatu) w 5 dniu oraz 3,7 g/l (14,6 U/mL aktywnoœci) w 9 dniu laktacji. Przy tak du ym poziomie stê enia rekombinowanych bia³ek terapeutycznych w mleku, wielkostadne fermy transgenicznych kóz mog¹ dostarczyæ nawet do 300 kg wyekstrahowanego (puryfikowanego) produktu biofarmaceutycznego w skali ca³ego roku (12). Sprzê enie technologii klonowania somatycznego z hormonaln¹ indukcj¹ wczesnej laktacji u niedojrza³ych p³ciowo maciorek transgenicznych umo liwi znaczne skrócenie czasu uzyskiwania pro- 136 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz duktu ekspresji transgenu, nawet do 8-9 miesiêcy od momentu transfekcji linii komórkowych do momentu jego sekrecji w mleku (1,13). Objêtoœæ pozyskiwanych w ten sposób próbek mleka jest nie tylko wystarczaj¹ca do prawid³owego oszacowania wielkoœci produkcji rekombinowanych bia³ek, ale nawet przy stosunkowo niskim poziomie ekspresji transgenu, wyra anym w mg/ml mleka pozwala na wielokrotne przeprowadzanie klinicznych testów aktywnoœci hormonalnej lub enzymatycznej wytwarzanych biopreparatów. 3. Techniczne i molekularne aspekty klonowania somatycznego kóz 3.1. Fenotyp komórek somatycznych-dawców j¹der Fenotyp oraz stadium cyklu komórkowego komórek somatycznych s¹ czynnikami, które w du ym stopniu, wp³ywaj¹ na efektywnoœæ klonowania kóz. U kóz, stosunkowo niewiele typów komórek-dawców j¹der poddano testom, w kierunku najwiêkszej przydatnoœci pod k¹tem uzyskiwania somatycznych klonów. Do roku 2000 niewiele te by³o wiadomo o charakterze procesów epigenetycznego przemodelowania i przeprogramowania somatycznego genomu j¹drowego oraz mitochondrialnego w cytoplazmie zrekonstruowanych oocytów, a nastêpnie po aktywacji w blastomerach przedimplantacyjnych zarodków klonalnych kozy. W badaniach nad klonowaniem somatycznym kóz przetestowano w ci¹gu ostatnich kilku lat, jako dawców j¹der, komórki pochodz¹ce z kilku rodzajów tkanek pobranych zarówno od p³odów, jak i od zwierz¹t doros³ych obojga p³ci bêd¹cych w ró nym wieku. Do chwili obecnej uzyskano ³¹cznie 52 sklonowane koÿlêta po transplantacji j¹der hodowanych in vitro (transgenicznych lub nietransgenicznych): p³odowych komórek fibroblastycznych (1,3,6-9,13,14), fibroblastów tkanki skórnej dojrza³ych osobników (2,4), komórek œciennej warstwy ziarnistej antralnych pêcherzyków jajnikowych (4,7,13-15), oraz komórek wzgórka jajonoœnego (7,14,16). Na szczególn¹ uwagê zas³uguje fakt wykorzystania komórek endokrynnych przedniego p³ata (czêœci gruczo³owej) przysadki mózgowej dojrza³ych p³ciowo osobników p³ci mêskiej, czyli pituicytów, jako Ÿród³a dawców j¹der, w procedurze klonowania somatycznego kóz (17). Ten szczególny typ komórek sekrecyjnych, syntetyzuj¹cych tzw. hormony tropowe, dotychczas nie by³ stosowany w technice transplantacji j¹der somatycznych u innych gatunków zwierz¹t gospodarskich i laboratoryjnych. Postuluje siê jednak, e sztuczna (egzogenna) kontrola aktywnoœci metabolicznej oraz sekrecyjnej systemu endokrynnego wszystkich p³atów przysadki mózgowej u zwierz¹t gospodarskich mog³aby byæ mo liwa do uzyskania poprzez genetyczn¹ modyfikacjê (transfekcjê) pituicytów na poziomie hodowli in vitro. Z kolei, wykorzystanie transformowanych genetycznie komórek gruczo³owych przysadki mózgowej, wykazuj¹cych indukowan¹ ekspresjê rekombinowanych ludzkich bia³ek/polipeptydów hormonalnych, do uzyskiwania ssaków technik¹ BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 137

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec klonowania somatycznego, otwiera zupe³nie nowe mo liwoœci aplikacyjne do produkcji transgenicznych bioreaktorów zwierzêcych, dostarczaj¹cych w ekstraktach (homogenatach) cytozolowych komórek pituicytarnych lub w osoczu krwi obcogatunkowe hormony tropowe, niezbêdne w terapii wielu chorób monogenowych cz³owieka, wywo³uj¹cych wrodzone wady rozwojowe o pod³o u endokrynologicznym. W rezultacie transplantacji zarodków, rekonstytuowanych z j¹der komórkowych pituicytów, do dróg rodnych hormonalnie zsynchronizowanych matek zastêpczych, urodzi³ siê kozio³ek klonalny. Na podstawie wyników tych eksperymentów potwierdza siê, e w sklonowanych zarodkach przedimplantacyjnych kozy mo liwe jest pe³ne epigenetyczne przemodelowanie i przeprogramowanie genomu j¹drowego oraz mitochonrialnego nawet tak bardzo zró nicowanych komórek somatycznych jak pituicyty. Szczególnie du a aktywnoœæ metaboliczna komórek czêœci gruczo³owej przysadki mózgowej jest zwi¹zana z intensywn¹ syntez¹ i sekrecj¹ hormonów tropowych przez pituicyty, co skorelowane jest z bardzo szerokim i wysoce tkankowospecyficznym profilem ekspresji genów. Z kolei zwiêkszenie natê enia aktywnoœci transkrypcyjnej genomu j¹drowego komórek endokrynnych przedniego p³ata przysadki zale y w du ym stopniu od obni enia czêstotliwoœci epigenetycznych modyfikacji, obejmuj¹cych zarówno demetylacjê reszt cytozyny w obrêbie paliandromowych sekwencji nukleotydowych DNA jak i hiperacetylacjê histonów rdzenia nukleosomowego chromatyny j¹- drowej. Wydaje siê, e spadek supresji transkrypcyjnej regionów eksonowych wielu komórkowospecyficznych genów DNA genomowego pituicytów, jak i zmniejszenie stopnia represji nukleosomowej chromatyny j¹drowej powinny u³atwiæ proces epigenomowej rearan acji wzorca metylacji wysepek/dinukleotydów CpG (5 -cytydyno-3 -monofosforylo-5 -guanozyny-3 ) oraz acetylacji i metylacji reszt lizyny bia³ek histonowych (H4 oraz H3) do epigenetycznego statusu DNA j¹drowego totipotentnych komórek zarodkowych pochodzenia klonalnego. Jednak e, niew³aœciwy schemat przeprogramowania epigenetycznego dziedziczenia oraz nieprawid³owe usuniêcie (tzw. wymazanie/wyzerowanie) somatycznego piêtna genomowego (imprintingu gametycznego), warunkuj¹cego ekspresjê uniparentaln¹ genów koduj¹cych podstawowe dla wczesnego rozwoju ontogenetycznego bia³ka, jakie mia³y miejsce w blastomerach przedimplantacyjnych zarodków kozich, doprowadzi³y do wyst¹pienia zaawansowanych subletalnych defektów anatomiczno-histologicznych, które ujawni³y siê dopiero w okresie postnatalnym u kozio³ka klonalnego. Na skutek tych wad rozwojowych osobnik ten pad³ w szesnastym dniu po urodzeniu (17). Na obecnym etapie badañ nie wiadomo jednak, czy ró nice w kompetencjach rozwojowych cybrydowych zygot klonalnych kozy rekonstytuowanych technik¹ transplantacji j¹der ró nych typów komórek somatycznych do enukleowanych oocytów wynikaj¹ z ró nej podatnoœci ich genomu j¹drowego oraz mitochondrialnego na epigenetyczne przemodelowanie i przeprogramowanie w blastomerach przedimplantacyjnych zarodków, czy te odgrywaj¹ tu rolê jakieœ inne czynniki, takie jak np. techniczne niedoskona³oœci stosowanych obecnie metod enukleacji, rekonstrukcji, a tak e sztucznej aktywacji oocytów kozich. 138 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz 3.2. Synchronizacja faz cyklu mitotycznego komórek-dawców j¹der Z przeprowadzonych badañ nad klonowaniem somatycznym kóz wynika, e do rekonstrukcji enukleowanych oocytów wykorzystuje siê najczêœciej j¹dra komórek- -dawców, których cykl mitotyczny zosta³ zsynchronizowany sztucznie (z udzia³em czynników egzogennych) lub fizjologicznie w fazach G1/G0, G1, lub G2/M. Jednym z najczêœciej stosowanych systemów koordynacji faz cyklu podzia³owego hodowanych in vitro komórek somatycznych kóz jest deprywacja troficzna, czyli g³odzenie subkonfluentnych populacji fibroblastów p³odowych, fibroblastów tkanki skórnej doros³ych osobników lub komórek œciennej warstwy ziarnistej pêcherzyków jajnikowych. D³ugoœæ okresu hodowli linii klonalnych komórek-dawców j¹der w restrykcyjnych warunkach troficznych (w po ywce o zredukowanym z 10 do 0,5% stê eniu surowicy p³odów bydlêcych/fbs; ang. fetal bovine serum) wynosi od 3 do 8 dni (3,6-9, 14,18). W doœwiadczeniach Zou i wsp. (16), do transplantacji egzogennych j¹der somatycznych wykorzystywano komórki wzgórka jajonoœnego, pochodz¹ce z aktywnie dziel¹cych siê (subkonfluentnych) linii klonalnych, hodowanych in vitro w po ywce o pe³nym sk³adzie jakoœciowym i iloœciowym polipeptydowych czynników wzrostowych, mitogennych oraz troficznych (10% FBS). Z kolei, w drugiej grupie eksperymentów przeprowadzonych przez Zou i wsp. (16), enukleowane oocyty rekonstruowano z j¹der nie poddawanych hodowli in vitro komórek wzgórka jajonoœnego, które by³y wyizolowane z ekspanduj¹cych (zmucyfikowanych) kompleksów komórek pêcherzykowych, otaczaj¹cych dojrza³e oocyty w stadium metafazy II podzia³u mejotycznego. Na szczególn¹ uwagê zas³uguje fakt, e ponad 90% subpopulacji komórek pêcherzykowych pochodz¹cych z dojrza³ych in vivo lub in vitro kompleksów cumulus oophorus-corona radiata-oocyt znajduje siê w fazie G0/G1 cyklu mitotycznego (19-21). Innym Ÿród³em komórek-dawców j¹der w procedurze klonowania somatycznego kóz by³y hodowane in vitro (transfekowane) fibroblasty p³odowe, w których koordynacja faz cyklu podzia³owego w stadium G2/M by³a indukowana chemicznie poprzez ich d³ugotrwa³¹ (17-godzinn¹) inkubacjê w po ywce z dodatkiem inhibitora polimeryzacji mikrotubuli wrzeciona kariokinetycznego nokodazolu (6). Synchroniczna indukcja fazy G2/M, inicjowana za poœrednictwem odwracalnego blokera anafazowej segregacji chromosomów skonfigurowanych w p³ytkê metafazow¹ wrzeciona mitotycznego, spowodowa³a wzrost odsetka komórek somatycznych, których cykl podzia³owy zosta³ przejœciowo zahamowany na granicy tych dwóch stadiów (ok. 40%) w porównaniu do udzia³u komórek w fazach G2/M w subkonfluentnych populacjach komórek o wysokiej aktywnoœci proliferacyjnej (ok. 20%). Ponadto, w przeprowadzonej analizie cytometrycznej rozk³adu faz cyklu mitotycznego w transgenicznych liniach komórek fibroblastycznych, poddawanych 3-dniowej deprywacji troficznej lub inhibicji kontaktowej migracji i proliferacyjnego wzrostu w warunkach pe³nej konfluencji nie wykazano ró nic w odsetku subpopulacji komórek, których cykl podzia³owy by³ zsynchronizowany w fazach G0/G1 (odpowiednio, 75% vs. 72% BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 139

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec komórek; [6]). Z kolei, Behboodi i wsp. (2) zastosowali unikatowy system dwustopniowej (sekwencyjnej) koordynacji faz cyklu mitotycznego komórek, najpierw na granicy stadiów G1/G0, a nastêpnie G0/G1. Pierwszy etap tej metody obejmowa³ 4-dniowe g³odzenie fibroblastów tkanki skórnej doros³ych osobników transgenicznych w po ywce o ograniczonej do 0,5% koncentracji FBS, w celu inicjacji synchronicznej indukcji stadium G0. Natomiast, w drugim etapie, 3-10-godzinna stymulacja troficzna komórek mitogenami pochodz¹cymi z surowicy p³odów bydlêcych o podwy szonym do 10% stê eniu, spowodowa³a odblokowanie/wznowienie ich cyklu mitotycznego, zahamowanego w tzw. fazie uœpienia (represji metabolicznej i transkrypcyjnej; ang. quiescence state) oraz skoordynowan¹ progresjê cyklu do stadium G1 okresu interfazowego. Z cytometrycznych analiz cyklu komórkowego fibroblastów pochodzenia skórnego poddawanych 4-dniowej hodowli in vitro w restrykcyjnych warunkach troficznych, a nastêpnie mitogennej oraz energetycznej stymulacji aktywnoœci proliferacyjnej i metabolicznej wynika, e 94% subpopulacji komórek znajdowa³o siê w stadium G0/G1, 1,5% komórek w fazie S, a 4% w stadiach G2/M cyklu mitotycznego (2). Udzia³ frakcji komórek w fazach G0/G1 oraz innych stadiach cyklu podzia³owego w ca³kowitej puli komórek analizowanych populacji nie ulega³ istotnym zmianom w zale noœci od zmiany funkcji czasu, a zatem wyd³u ania okresu hiperaktywacji troficznej (od 0 do 10 godzin). Ponadto, rozk³ad faz cyklu mitotycznego subkonfluentnych linii komórek fibroblastycznych kóz o wysokiej aktywnoœci podzia³owej nie ró ni³ siê istotnie w porównaniu do g³odzonych linii klonalnych komórek (odpowiednio, 89% komórek w stadiach G0/G1, 4% w fazie S, oraz 6,5% w stadiach G2/M). Poniewa fluorescencyjna diagnostyka cyklu komórkowego przy wykorzystaniu cytometru przep³ywowego nie pozwala na odró nienie subpopulacji komórek w stadium G1 od frakcji komórek o zahamowanej aktywnoœci kariokinetycznej i transkrypcyjnej (w fazie G0), niezbêdne by³o zastosowanie analiz molekularnych (Northern blotting) do oszacowania wzglêdnej koncentracji cz¹steczek informacyjnego RNA (mrna) cykliny D1, którego ekspresja (aktywnoœæ translacyjna) jest charakterystyczna dla fazy G1, a represja dla stanu spoczynkowego (stadium G0). Okreœlenie relatywnego poziomu stê enia transkryptów cykliny D1 za poœrednictwem analizy Northern blotting przy jednoczesnym (komplementarnym) zastosowaniu metod cytometrii przep³ywowej umo liwi³o dopiero diagnostykê ró nicow¹ (segregacjê) subpopulacji komórek w fazie G1 oraz w fazie G0 (2,22). Cykliny typu D (D 1-3 ) stanowi¹ wa ne ogniwo regulacji cyklu komórkowego w o- kresie interfazowym. Stymulacja troficzna g³odzonych, subkonfluentnych linii klonalnych komórek somatycznych indukuje wznowienie podzia³ów mitotycznych poprzez zahamowanie supresji transkrypcyjnej i wzrost tempa metabolizmu komórek w fazie G0 i ponowne rozpoczêcie fazy G1, której towarzyszy inicjacja biosyntezy cyklin klasy D oraz cykliny E. Bia³ka te wi¹ ¹ siê preferencyjnie z cz¹steczkami kinaz cyklino-zale nych, odpowiednio CDK 4, CDK 6 oraz CDK 2 (ang. cyclin-dependent kinases 4, 6 and 2) w heterodimeryczne kompleksy holoenzymatyczne, z³o one z podjed- 140 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz nostek regulatorowych oraz podjednostek katalitycznych (23-25). Ich aktywnoœæ jest z kolei wymagana do formowania i funkcjonowania tzw. czynników prereplikacyjnych, np. czynnika zezwalaj¹cego na replikacjê DNA (RLF, ang. replication licensing factor), a tak e czynników inicjuj¹cych fazê S (SPF, ang. S-phase promoting factor). Dlatego te wykazano, e poziom syntezy cyklin typu D jest wa nym cytobiochemicznym wskaÿnikiem limituj¹cym wejœcie aktywnie proliferuj¹cych komórek w fazê S, a tym samym krytycznym elementem czynnej regulacji interfazowych punktów kontrolnych/restrykcyjnych cyklu mitotycznego. St¹d wynika bezpoœrednio fakt, e aktywnoœæ kinaz zwi¹zanych kowalencyjnie z cz¹steczkami cykliny D1 nie jest wykrywana w cytoplazmie komórek, których cykl mitotyczny nie osi¹gn¹³ jeszcze œrodkowej fazy stadium G1 okresu miêdzypodzia³owego (23,25). Funkcja regulatorowa cykliny D1 w aktywnoœci katalitycznej serynowo-treoninowych kinaz CDK4/6 jest uruchamiana dopiero po przekroczeniu krytycznego centralnego punktu stadium G1, a nastêpnie wzrasta stopniowo w miarê progresji cyklu komórkowego ze œrodkowej do póÿnej fazy G1, osi¹gaj¹c maksimum w momencie przejœcia okresu interfazowego ze stadium G1 do stadium pó³zachowawczej (semikonserwatywnej) autoreplikacji DNA. Dlatego te, indukcja ekspresji transkryptów cykliny D1 poprzedza proces nabywania przez bia³kowe produkty tego systemu translacji mrna cech wysokiego powinowactwa oraz zdolnoœci tworzenia kompleksów enzymatycznych z kinazami grupy CDK 4/6 w przedziale czasowym przypadaj¹cym na okres od œrodkowej do póÿnej fazy G1. Natomiast detekcja aktywnoœci katalitycznej heterodimerów bia³kowych z³o onych z cyklin D/E oraz kinaz cyklino-zale nych 4/6/2 nie jest cytofizjologicznym wyznacznikiem przejœcia cyklu komórkowego z fazy G0 do G1, lecz funkcjonalnym indykatorem œrodkowego i póÿnego stadium fazy G1 oraz progresji okresu miêdzypodzia³owego do punktu granicznego stadiów G1/S (24,25). W celu uzyskania stosunkowo homogenicznej subpopulacji fibroblastów o zwiêkszonym do maksimum udziale komórek w fazie G1 cyklu mitotycznego, niezbêdne by³o wyd³u enie okresu stymulacji mitogenno-energetycznej komórek uprzednio poddawanych g³odzeniu do oko³o 10 godzin. Wysoki stopieñ sekwencyjnej synchronizacji faz cyklu komórkowego transgenicznych fibroblastów pochodzenia skórnego w stadium G1 zosta³ potwierdzony przez zdiagnozowanie technik¹ Northern blotting znacznej koncentracji cz¹steczek mrna cykliny D1 w komórkach 10-godzinnie inkubowanych w obecnoœci 10% FBS w porównaniu do znikomego (œladowego) stê- enia transkryptów cykliny D1 w cytoplazmie fibroblastów hodowanych 4 dni w restrykcyjnych warunkach troficznych przed zainicjowaniem hiperstymulacji od ywczej przez zwiêkszenie poziomu surowicy. Przypuszcza siê, e detekcja jedynie niewielkiego profilu ekspresji cz¹steczek mrna cykliny D1 w komórkach g³odzonych linii klonalnych mo e wynikaæ z niskiego stopnia heterogenicznoœci analizowanych fibroblastów, zwi¹zanego z obecnoœci¹ ma³ego odsetka komórek we wczesnej fazie S (autoreplikacji DNA), w których jeszcze nie dosz³o do ca³kowitej biodegradacji (nukleolizy) transkryptów cykliny D1 i/lub niewielkiego udzia³u frakcji komórek w fazie G1 cyklu mitotycznego (2,22). BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 141

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec Z kolei, w przeciwieñstwie do fibroblastów poddawanych deprywacji troficznej, komórki subkonfluentnych (nie g³odzonych), aktywnie dziel¹cych siê populacji, posiada³y podobnie jak komórki stymulowane kariokinetycznie po okresie kilkudniowej hodowli in vitro w obecnoœci 0,5% FBS, bardzo wysoki poziom ekspresji transkryptów cykliny D1 w cytoplazmie. Na podstawie wyników uzyskanych z przeprowadzonej analizy Northern blotting wskazuje siê jednoznacznie, e inicjacja aktywnoœci transkrypcyjnej genów koduj¹cych cyklinê D1 ma miejsce przed osi¹gniêciem œrodkowej fazy stadium G1 przez komórki poddawane mitogennie wspomaganej inhibicji represji migracji i proliferacyjnego wzrostu po okresie przejœciowego g³odzenia, które indukuje wyciszenie (ang. silencing) ekspresji genomu j¹drowego. Spowodowane wznowieniem, odwracalnie zablokowanego w stadium G0 cyklu mitotycznego, wejœcie g³odzonych komórek w fazê G1 (presyntetyczn¹) nastêpowa³o w ci¹gu 5 godzin od zapocz¹tkowania stymulacji hipertroficznej komórek, co potwierdza³ stopniowy (powolny) przyrost koncentracji mrna cykliny D1, który ulega translacji po przejœciu okresu miêdzypodzia³owego z fazy uœpienia (stanu spoczynkowego) do fazy G1. Poziom stê enia, a tym samym profil ekspresji (aktywnoœci translacyjnej) transkryptów cykliny D1 w cytozolu, znacznie wzrasta³ miêdzy 5a10godzin¹ od momentu indukcji mitogennie wspomaganej stymulacji tempa migracji oraz czêstotliwoœci proliferacji komórek. Zgodnie z interpretacj¹ opisanych wyników analizy Northern blotting g³odzonych, a nastêpnie stymulowanych troficznie fibroblastów mo na stwierdziæ, e przewa aj¹ca wiêkszoœæ zdiagnozowanej (odsortowanej) cytometrycznie subpopulacji komórek w fazach G0/G1 posiada cykl mitotyczny faktycznie zsynchronizowany w pocz¹tkowym stadium fazy G1, czyli niemal zaraz po przekroczeniu przez okres interfazowy punktu granicznego miêdzy stanem represji metabolicznej i transkrypcyjnej (G0) a stadium presyntetycznym (G1; [2,22,24]). Kolejnym efektywnym sposobem synchronizacji faz cyklu mitotycznego hodowanych in vitro komórek somatycznych, stosowanym na potrzeby klonowania kóz, jest tzw. synergistyczne zahamowanie (czyli wspó³inhibicja) proliferacyjnego wzrostu subkonfluentnych populacji komórek w stadium G0/G1 za poœrednictwem ich sekwencyjnej (dwustopniowej) inkubacji w po ywce o drastycznie obni onej koncentracji surowicy p³odów bydlêcych, a nastêpnie w po ywce o pe³nym sk³adzie mitogenów i czynników troficznych, lecz uzupe³nionej dodatkiem olomucyny (26). Olomucyna jest biosyntetycznym analogiem puryny, który posiada zdolnoœæ niespecyficznego blokowania aktywnoœci enzymatycznej kinaz cyklino-zale nych (CDKs) poprzez, wynikaj¹ce z w³aœciwoœci hamowania wspó³zawodniczego (inhibicji kompetycyjnej), silne powinowactwo do kinaz cyklin klasy/typu A, B oraz E. W badaniach in vitro wykazano bowiem, e skutecznoœæ przejœciowego hamowania przez olomucynê aktywnoœci biokatalitycznej heterodimerycznych kompleksów bia³kowych CDK1/cyklina B, p33cdk2/cyklina A oraz p33cdk2/cyklina E utrzymuje siê na podobnym poziomie. Dlatego te, cykl mitotyczny aktywnie dziel¹cych siê komórek somatycznych, inkubowanych w obecnoœci olomucyny, mo e byæ odwracalnie zatrzymany albo na granicy faz G1/S, b¹dÿ G2/M, w zale noœci od stopnia progresji wzrostu 142 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz proliferacyjnego, wynikaj¹cego równie ze stosunku procentowego komórek znajduj¹cych siê w okresie interfazowym do komórek w okresie podzia³owym cyklu komórkowego (27,28). W badaniach przeprowadzonych przez Yu i wsp. (26), kombinacja 2-dniowej deprywacji troficznej (g³odzenia) fibroblastów tkanki skórnej ucha i ich 9-godzinnej inkubacji w po ywce z dodatkiem 100 M/L olomucyny doprowadzi³a do koordynacji faz cyklu mitotycznego w stanie spoczynkowym (G0) oraz w stadium presyntetycznym (G1) w 85,5% hodowanych in vitro komórek. Jednoczeœnie zastosowana metoda synchronizacji cyklu podzia³owego fibroblastów pochodzenia skórnego nie powodowa³a istotnego wzrostu subpopulacji komórek apoptotycznych. Odsetek komórek wykazuj¹cych morfologiczne i biochemiczne symptomy œmierci apoptotycznej okaza³ siê bowiem stosunkowo niski (oko³o 4% analizowanych fibroblastów). 3.3. ród³o komórek-biorców egzogennych j¹der somatycznych W procedurze klonowania somatycznego kóz, biorc¹ egzogennych j¹der komórkowych s¹ zarówno dojrza³e in vivo (owulowane) oocyty pozyskiwane z jajowodów stymulowanych hormonalnie samic-dawczyñ (1,2), jak i oocyty osi¹gaj¹ce dojrza³oœæ j¹drowo-cytoplazmatyczn¹, a tak e epigenomow¹ w warunkach hodowli in vitro (3,9,14,17). W badaniach Baguisi ego i wsp. (1), którzy jako pierwsi uzyskali sklonowane koÿlêta, do doœwiadczeñ u yte by³y oocyty dojrza³e in vivo (postowulacyjne). Jednak e, tylko w jednej z grup eksperymentalnych, do zabiegu klonowania wykorzystane by³y oocyty z ca³kowicie wyrzuconym do przestrzeni oko³o ó³tkowej cia³kiem kierunkowym I rzêdu, których cykl mejotyczny zosta³ zablokowany w stadium Metafazy II (Met II). Strukturalno-funkcjonalnym wyznacznikiem dojrza³oœci j¹drowej oocytów w stadium Met II jest stopieñ zaawansowania procesu wyrzucenia I cia³ka kierunkowego do przestrzeni oko³o ó³tkowej. Proces wyrzucenia polocytu I rzêdu pod os³onkê przejrzyst¹ jest efektem tzw. szcz¹tkowej/poronnej lub biegunowej cytokinezy oocytu, która prowadzi do powstania ob³onionej struktury komórkowej, zawieraj¹cej poronne wrzeciono kariokinetyczne oraz perikarion, czyli cienk¹ warstwê œciœle przylegaj¹cej do zespo³u silnie skondensowanych chromosomów tzw. resztkowej cytoplazmy oocytu. W kolejnych doœwiadczeniach, Baguisi i wsp. (1) wykorzystali oocyty dojrza³e in vivo, poddane sztucznej aktywacji (protokó³ preaktywacji) w warunkach 2-4-godzinnej inkubacji w niezdefiniowanej chemicznie po ywce hodowlanej o wysokiej sile jonowej, która by³a generowana dodatkiem kationów wapnia. W procedurze enukleacji i transplantacji j¹der komórek somatycznych (protokó³ jednoczesnej fuzji i aktywacji elektrycznej) u yte by³y zatem oocyty, które wznowi³y proces mejozy i osi¹gnê³y stadium telofazy II, czego kryterium morfologicznym by³a obecnoœæ czêœciowo odcinaj¹cego siê z podb³onowej strefy kortykalnej cytoplazmy polocytu II rzêdu. Natomiast, jeœli proces wyrzucania II cia³ka kie- BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 143

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec runkowego nie zosta³ zainicjowany kilkugodzinn¹ hodowl¹ in vitro oocytów w po- ywce wzbogaconej jonami Ca 2+, preaktywacja oocytów Met II by³a indukowana w wyniku ich 5-minutowej inkubacji w tej samej po ywce, lecz uzupe³nionej dodatkowo 7% etanolem. Kolejnym etapem tej sekwencyjnej (kilkustopniowej) egzogennej prestymulacji komórek-biorców j¹der by³a 3-godzinna hodowla oocytów w wolnym od alkoholu etylowego medium, w celu progresji podzia³u wyrównawczego (ekwacyjnego) cyklu mejotycznego z punktu kontrolnego towarzysz¹cego anafazowej segregacji chromatyd siostrzanych a do inicjacji tzw. biegunowej (szcz¹tkowej/poronnej) cytokinezy. W nastêpstwie tego ostatniego procesu, bêd¹cego zarazem weryfikacj¹ efektywnoœci sztucznej aktywacji oocytu widoczny by³ w mikroskopie odwróconym zarys czêœciowo/po³owicznie odcinaj¹cego siê polocytu II rzêdu, zawieraj¹cego poronne wrzeciono kariokinetyczne. Efektem tych doœwiadczeñ by³o uzyskanie jednego sklonowanego koÿlêcia z zarodka zrekonstytuowango z u yciem cytoplastu pochodz¹cego z nieaktywowanego oocytu w stadium metafazy II podzia³u mejotycznego oraz dwóch koÿl¹t z oocytów preaktywowanych w wyniku kilkugodzinnej inkubacji w po ywce o wysokiej energii jonizacji spowodowanej obecnoœci¹ kationów wapniowych (1). Drugim Ÿród³em komórek-biorców egzogennych j¹der somatycznych w klonowaniu kóz, powszechnie stosowanym tak e u innych gatunków ssaków, s¹ oocyty dojrza³e in vitro. Do dojrzewania mejotycznego oocyty pozyskiwane s¹ z jajników stymulowanych lub niestymulowanych hormonalnie samic-dawczyñ, przy wykorzystaniu metod poubojowych, lub niechirurgicznej techniki przy yciowej LOPU (wspomaganej laparoskopowo metody aspiracji p³ynu pêcherzykowego z antralnych pêcherzyków jajnikowych, dokonywanej przez pow³oki brzuszne; ang. laparoscopic ovum pick-up [7-9,14,18]), umo liwiaj¹cej wielokrotne pozyskiwanie oocytów od jednej kozy-dawczyni. Szeroka zatem dostêpnoœæ tego materia³u biologicznego, a tak- e wysoka skutecznoœæ technologii pozaustrojowego dojrzewania mejotycznego (w³aœciwy sk³ad iloœciowy i jakoœciowy stosowanych po ywek oraz zoptymalizowane warunki hodowli in vitro) decyduj¹ o tym, e jest to szczególnie atrakcyjne Ÿród³o oocytów-biorców wykorzystywanych na potrzeby klonowania somatycznego. 3.4. Typy rekonstrukcji enukleowanych oocytów Rekonstrukcja oocytów polega na zast¹pieniu ich w³asnego genomu j¹drowego (chromosomów metafazowych), genomowym DNA komórki somatycznej. U kóz, podobnie jak u innych gatunków ssaków, rekonstrukcja przeprowadzana jest najczêœciej na drodze fuzji cytoplastu (wyj¹drzonego oocytu) z komórk¹ somatyczn¹ (1,7-9,14), a czynnikiem indukuj¹cym fuzjê s¹ impulsy elektryczne (elektrofuzja). Alternatywna metoda rekonstrukcji, oparta na doooplazmatycznej mikroiniekcji karioplastu komórki somatycznej (piezoelektrycznej lub manualnej) stosowana by³a dotychczas jedynie przez Zou i wsp. (16), a tak e Skrzyszowsk¹ i wsp. (dane nie 144 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz opublikowane). W obu przypadkach dawc¹ j¹der by³y komórki pêcherzykowe pochodz¹ce z ekspanduj¹cych (zmucyfikowanych) warstw komórek wzgórka jajonoœnego, otaczaj¹cych dojrza³e oocyty kozy. Technika rekonstrukcji enukleowanych oocytów mo e w du ym stopniu wp³ywaæ na molekularne mechanizmy rearan acji chromatyny j¹drowej, obejmuj¹ce zarówno epigenetyczne przemodelowanie i przeprogramowanie genomu j¹drowego oraz mitochondrialnego, jak i funkcjonalne interakcje miêdzy j¹drowym a cytoplazmatycznym (pozaj¹drowym) systemem ekspresji genów oraz syntezy bia³ek. 3.5. Rodzaje czynników indukuj¹cych sztuczn¹ aktywacjê rekonstruowanych oocytów W klonowaniu somatycznym kóz stosowane s¹ trzy nastêpuj¹ce uk³ady doœwiadczalne dotycz¹ce odstêpów czasowych miêdzy rekonstrukcj¹ enukleowanych oocytów a sztuczn¹ aktywacj¹ rekonstytuowanych hybryd j¹drowo-ooplazmatycznych: 1) j¹dra komórek w fazach G1/G0 wprowadza siê do enukleowanych, preaktywowanych oocytów w stadium telofazy II podzia³u mejotycznego i równoczeœnie aktywuje siê uzyskane cybrydy klonalne (protokó³ jednoczesnej fuzji/aktywacji elektrycznej; [1]); 2) j¹dra komórek somatycznych w fazach G1/G0 cyklu mitotycznego transplantuje siê do enukleowanych, nieaktywowanych oocytów w stadium metafazy II podzia³u mejotycznego (Met II) i jednoczeœnie aktywuje siê rekonstruowane hybrydy cytoplazmatyczne (protokó³ jednoczesnej fuzji/aktywacji elektrycznej; [1,4] lub protokó³ jednoczesnej elektrofuzji i aktywacji fizykochemicznej; [2,29, Skrzyszowska i wsp., dane nie opublikowane]); lub te 3) wprowadza siê j¹dra komórek zsynchronizowanych w stadiach G1, G1/G0 albo G2/M do ooplastów Met II, które aktywowane s¹ od 1 do 2-3 godzin po transplantacji j¹der somatycznych (protokó³ dwustopniowej postaktywacji chemicznej; [3,7-9,14,18,29]). Procedura sztucznej aktywacji zrekonstruowanych oocytów, jak siê wydaje, jest jednym z czynników, które w du ym stopniu decyduj¹ o pre- i postimplantacyjnych kompetencjach rozwojowych kozich zarodków klonalnych. W technologii klonowania somatycznego kóz najczêœciej stosowanymi bodÿcami aktywuj¹cymi s¹ czynniki fizyczne, takie jak impulsy pr¹du sta³ego (1,2), albo czynniki chemiczne, takie jak 7% alkohol etylowy (1,18,29) lub antybiotyki jonoforowe, np. jonomycyna wapnia (3,7-9,14,18,30). Prowadzone obecnie intensywne badania nad udoskonaleniem metod sztucznej aktywacji kozich cybryd klonalnych polegaj¹ g³ównie na optymalizacji parametrów technicznych pola elektrycznego (natê enie pola elektrostatycznego, czas trwania impulsów elektrycznych, liczba impulsów i odstêp czasowy miêdzy nimi; [1,2]) lub te, coraz czêœciej, na ³¹czeniu bodÿca aktywuj¹cego (najczêœciej jonomycyny; [3,9,14], rzadziej impulsów elektrycznych lub etanolu; [1,2,18]) ze zwi¹zkami odwracalnie blokuj¹cymi aktywnoœæ cyklino-zale nych kinaz bia³kowych (niespecyficznymi inhibitorami kompetycyjnymi CDKs; ang. cyclin-dependent protein BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 145

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec kinases), takimi jak 6-dimetyloaminopuryna (6-DMAP; [2,3, 9,14,18,30]), czy zwi¹zkami bezpoœrednio hamuj¹cymi anafazow¹ resyntezê cykliny B, bêd¹cej podjednostk¹ regulatorow¹ czynnika dojrzewania mejotycznego (MPF, ang. maturation/meiosis/m-phase promoting factor), np. cykloheksymidem (CHXM, [7,8,29]) i/lub inhibitorami polimeryzacji mikrofilamentów aktynowych cytoszkieletu, np. cytochalazyn¹ B (CB, [1,7,8,14,18,30]). 3.6. Hodowla in vitro oraz transplantacja zarodków klonalnych do pseudociê arnych maciorek-biorczyñ Z dotychczasowych badañ wynika, e zarodki kozie uzyskiwane technik¹ klonowania somatycznego poddawane s¹ ró nym systemom hodowli in vitro. Najczêœciej stosowan¹ metod¹ pozaustrojowej hodowli cybrydowych zygot klonalnych jest krótkotrwa³a (od 12 do 48 godzin) inkubacja zarodków w 25-, 35- lub 50- litrowych kroplach po ywek o ró nym sk³adzie jakoœciowym i iloœciowym takich jak: 1) TC-199 (ang. Tissue Culture Medium-199) z dodatkiem 10% surowicy p³odów bydlêcych (FBS; [1,2]); 2) G1.2 uzupe³niona 8 mg/ml albuminy surowicy bydlêcej (BSA, ang. bovine serum albumin; [3,7-9,14]); 3) syntetyczny p³yn jajowodowy (SOFaa, ang. synthetic oviductal fluid) o zmodyfikowanym sk³adzie iloœciowym/sile jonowej (o niskiej zawartoœci anionów ortofosforanowych PO 4 3- /HPO 4 2- ; [3]), czêsto uzupe³niany 10% FBS (30); oraz 4) po ywka B2 (ang. Upgraded B2 INRA Medium; [18,29-31]). Obok metod krótkotrwa³ej inkubacji stosowana jest tak e d³ugotrwa³a (9-dniowa) hodowla kozich zarodków klonalnych do stadium blastocysty, w chemicznie zdefiniowanych po ywkach (17). Powszechnie wykorzystywanym systemem hodowli in vitro jest równie kilkudniowa (od 2 do 9 dni) wspó³inkubacja sklonowanych zarodków kozy z komórkami nab³onka jajowodowego (1,2,29) lub z komórkami nerki pawiana zielonego (VERO, ang. Verro cells; [18,30]), tworz¹cymi warstwê od ywcz¹ w po ywce z dodatkiem od 2,5 do 5% FBS. Alternatywnym systemem hodowli rekonstruowanych hybryd cytoplazmatycznych kozy jest ich 5-6-dniowa inkubacja w podwi¹zanych jajowodach hormonalnie zsynchronizowanych maciorek-biorczyñ poœrednich do stadium moruli/blastocysty (2,4). Hodowane in vitro lub in vivo kozie zarodki klonalne (w stadium 1-8 blastomerów lub moruli/blastocysty) transferowane s¹ chirurgicznie (z zastosowaniem laparotomii) lub niechirurgicznie (laparoskopowo) do jajowodów lub rogów macicy pseudociê arnych maciorek-biorczyñ ostatecznych. Do dróg rodnych jednej matki zastêpczej przeszczepianych jest od 4 do 15 zarodków w stadium 1-16 komórek lub od 2 do 5 zarodków w stadium kompaktnej moruli/blastocysty. 146 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz 4. Badania nad klonowaniem somatycznym kóz prowadzone w Instytucie Zootechniki W Dziale Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t Instytutu Zootechniki w Balicach prowadzone s¹ badania nad klonowaniem somatycznym zwierz¹t gospodarskich, w tym równie nad klonowaniem kóz. W procedurze klonowania tego gatunku, jako Ÿród³o komórek-dawców j¹der, wykorzystywane s¹ p³odowe komórki fibroblastyczne jak i fibroblasty tkanki skórnej transgenicznych i nietransgenicznych osobników doros³ych, a tak e komórki wzgórka jajonoœnego (29,31). Natomiast, biorc¹ egzogennych j¹der komórkowych s¹ dojrza³e in vitro oocyty kozie, enukleowane technikami mikrochirurgicznymi, standardow¹ lub wspomagan¹ chemicznie. Technika enukleacji wspomaganej chemicznie jest obecnie preferowana z powodu ograniczenia objêtoœci usuwanej mechanicznie wraz z chromosomami matecznymi ooplazmy, a tym samym niewielkiego stopnia inwazyjnoœci w ultrastrukturê cytoszkieletu oocytu. Umo liwia ona bowiem precyzyjn¹ eliminacjê (aspiracjê) wraz z cia³kiem kierunkowym I rzêdu, jedynie sto ka ooplazmatycznego, uwypuklaj¹cego siê na powierzchni plazmolemmy, po 1-godzinnej inkubacji oocytów w po ywce z dodatkiem kolcemidu/demekolcyny (inhibitor polimeryzacji mikrotubuli wrzeciona kariokinetycznego) oraz sacharozy (osmotycznie czynny disacharyd indukuj¹cy wzrost objêtoœci przestrzeni oko³o ó³tkowej). Dlatego te, wyraÿnie widoczne w przestrzeni oko³o ó³tkowej oocytu sto kowate uwypuklenie, powsta³e na skutek zmian napiêcia powierzchniowego b³ony cytoplazmatycznej, a tak e wzrostu mechanicznych naprê eñ oraz si³y motorycznej mikrofilamentów membranoszkieletu, zawiera silnie skondensowan¹ masê chromosomów skonfigurowanych w ma³¹ p³ytkê metafazow¹. Zmniejszenie wielkoœci p³ytki metafazowej oocytów indukowane jest w wyniku zaburzeñ dynamicznej równowagi miêdzy polimeryzacj¹ a depolimeryzacj¹ w³ókien cytoszkieletu mikrotubularnego. Skrócenie d³ugoœci w³ókien kinetochorowych i biegunowych wrzeciona mejotycznego na skutek nasilenia depolimeryzacji mikrotubuli, spowodowanej dzia³aniem kolcemidu, u³atwia z kolei przemieszczenie (alokacjê) ca³ego zespo³u chromosomów do powsta³ego wzgórka cytoplazmatycznego. Na szczególn¹ uwagê zas³uguje tak e fakt, e metoda enukleacji mikrochirurgicznej wspomaganej chemicznie ma jeszcze jedn¹ przewagê nad standardow¹ eliminacj¹ chromosomów matecznych. Nie wymaga ona bowiem fluorescencyjnej weryfikacji na skutek wzbudzania wi¹zk¹ œwiat³a ultrafioletowego (UV) biochemiluminescencji generowanej za poœrednictwem barwnika wi¹ ¹cego siê z usuwanym genomem j¹drowym oocytów oraz poronnym wrzecionem podzia³owym cia³ek kierunkowych (fluorochrom Hoechst 33342). U wielu gatunków ssaków (œwinia, królik, mysz) udowodniono bowiem szkodliwy wp³yw zarówno tego barwnika, jak i promieniowania UV wzbudzaj¹cego emisjê fotonów z kowalencyjnych wi¹zañ fluorochrom-dna oocytów na przedimplantacyjne kompetencje rozwojowe oraz jakoœæ morfologiczn¹ zarodków klonalnych rekonstytuowanych z ooplastów uzyskiwanych na drodze enukleacji mikrochirurgicznej standardowej. Rekonstrukcja wyj¹drzo- BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 147

Maria Skrzyszowska, Marcin Samiec nych oocytów kozich dokonywana jest przede wszystkim na drodze elektrofuzji kompleksów cytoplast-komórka somatyczna (gdy Ÿród³em dawców j¹der s¹ hodowane in vitro/konfluentne fibroblasty p³odowe lub fibroblasty tkanki skórnej doros³ych osobników), ale tak e metod¹ doooplazmatycznej iniekcji karioplastów wyizolowanych z komórek somatycznych (gdy Ÿród³em dawców j¹der s¹ komórki wzgórka jajonoœnego, pochodz¹ce z dojrza³ych in vitro kompleksów oocyt-corona radiata-cumulus oophorus). Rekonstruowane cybrydy klonalne po 2-godzinnej inkubacji w medium B2 poddawane s¹ dwustopniowej aktywacji chemicznej (protokó³ postaktywacji) przy wykorzystaniu jonomycyny oraz 6-dimetyloaminopuryny (6-DMAP) lub cykloheksymidu (CHXM). Po krótkotrwa³ej (18-72 godzin) hodowli in vitro, zarodki klonalne przenoszone s¹ do dróg rodnych zsynchronizowanych kóz-biorczyñ. W badaniach ultrasonograficznych maciorek-biorczyñ w 40-45. dniu po transplantacji zarodków klonalnych potwierdzono postimplantacyjny rozwój zarodków klonalnych u 5 biorczyñ. Jednak e, u czterech z nich stwierdzono obecnoœæ pêcherzy p³odowych z objawami wczesnej resorbcji. Eksperymenty z zakresu klonowania somatycznego kóz, które maj¹ na celu zwiêkszenie postimplantacyjnego potencja³u rozwojowego zarodków i p³odów klonalnych, s¹ nadal intensywnie prowadzone. 5. Podsumowanie BodŸcem do rozwoju badañ nad klonowaniem somatycznym kóz, szczególnie w ostatnich latach, jest przede wszystkim mo liwoœæ praktycznego zastosowania tej techniki do produkcji transgenicznych koÿl¹t przy wykorzystaniu transfekowanych in vitro komórek-dawców j¹der oraz do multiplikacji uzyskanych ju transformowanych genetycznie maciorek i koz³ów, ze wzglêdu na wa ne implikacje w biomedycynie, a tak e farmacji (1,4,7,8,14). Praca wykonana w ramach tematu statutowego nr 3306.1. Literatura 1. Baguisi A., Behboodi E., Melican D. T., Pollock J. S., Destrempes M. M., Cammuso C., Williams J. L., Nims S. D., Porter C. A., Midura P., Palacios M. J., Ayres S. L., Denniston R. S., Hayes M. L., Ziomek C. A., Meade H. M., Godke R. A., Gavin W. G., Overstrom E. W., Echelard Y., (1999), Nat. Biotechnol., 17, 456-461. 2. Behboodi E., Memili E., Melican D. T., Destrempes M. M., Overton S. A., Williams J. L., Flanagan P. A., Butler R. E., Liem H., Chen L. H., Meade H. M., Gavin W. G., Echelard Y., (2004), Transgenic Res., 13, 215-224. 3. Keefer C. L., Baldassarre H., Keyston R., Wang B., Bhatia B., Bilodeau A. S., Zhou J. F., Leduc M., Downey B. R., Lazaris A., Karatzas C. N., (2001), Biol. Reprod., 64, 849-856. 148 PRACE PRZEGL DOWE

Rozwój badañ nad klonowaniem somatycznym kóz 4. Cheng Y., Wang Y. G., Luo J. P., Shen Y., Yang Y. F., Ju H. M., Zou X. G., Xu S., Lao W. D., Du M., (2002), Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 18(1), 79-83. 5. Meade H. M., Echelard Y., Ziomek C. A., Young M. W., Harvey M., Cole E. S., Groet S., Smith T. E., Curling J. M., (1998), Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, in: Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Eds. J. M. Fernandez, J. P. Hoeffler, San Diego: Academic Press, 399-427. 6. Zou X., Wang Y., Cheng Y., Yang Y., Ju H., Tang H., Shen Y., Mu Z., Xu S., Du M., (2002), Mol. Reprod. Dev., 61(2), 164-172. 7. Baldassarre H., Wang B., Kafidi N., Keefer C., Lazaris A., Karatzas C. N., (2002), Theriogenology, 57, 275-284. 8. Baldassarre H., Keefer C., Wang B., Lazaris A., Karatzas C. N., (2003a), Cloning Stem Cells, 5(4), 279-285. 9. Reggio B. C., James A. N., Green H. L., Gavin W. G., Behboodi E., Echelard Y., Godke R. A., (2001), Biol. Reprod., 65, 1528-1533. 10. Ebert K. M., Schindler J. E. S., (1993), Theriogenology, 39, 121-135. 11. Baldassarre H., Wang B., Kafidi N., Gauthier M., Neveu N., Lapointe J., Sneek L., Leduc M., Duguay F., Zhou J. F., Lazaris A., Karatzas C. N., (2003b), Theriogenology, 59, 831-839. 12. Clark A. J., (1998), J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 3, 337-350. 13. Baldassarre H., Wang B., Pierson J., Neveu N., Sneek L., Lapointe J., Cote F., Kafidi N., Keefer C. L., Lazaris A., Karatzas C. N., (2004), Cloning Stem Cells, 6(1), 25-29. 14. Keefer C. L., Keyston R., Lazaris A., Bhatia B., Begin I., Bilodeau A. S., Zhou F. J., Kafidi N., Wang B., Baldassarre H., Karatzas C. N., (2002), Biol. Reprod., 66, 199-203. 15. Keefer C. L., Keyston R., Bhatia B., Lazaris A., Begin I., Kafidi N., Bilodeau A., Wang B., Tao T., Laurin D., Zhou J. F., Downey B. R., Baldassarre H., Karatzas C. N., (2000), Proceedings of the 33 rd Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, July 15-18, Biol. Reprod., 62 (Suppl. 1), 192 (Abstr. 218). 16. Zou X., Cheng Y., Wang Y., Luo J., Zhang Q., Zhang X., Yang Y., Ju H., Shen Y., Lao W., Xu S., Du M., (2001), Cloning, 3(1), 31-37. 17. Ohkoshi K., Takahashi S., Koyama S., Akagi S., Adachi N., Furusawa T., Fujimoto J., Takeda K., Kubo M., Izaike Y., Takunaga T., (2003), Cloning Stem Cells, 5(2), 109-115. 18. Apimeteetumrong M., Thuangsanthia A., Leingcharoen N., Yiengvisavakul V., Harintharanon A., Kunavongkrit A., Sumretprasong J., Vignon X., Techakumphu M., (2004), J. Vet. Med. Sci., 66(12), 1529-1534. 19. Schuetz, A.W., Whittingham, D.G., Snowden, R., (1996), Reprod. Fertil. Dev., 8, 935 943. 20. Wakayama T., Perry A. C. F., Zuccotti M., Johnson K. R., Yanagimachi R., (1998), Nature, 394, 369-374. 21. Ogura A., Inoue K., Ogonuki N., Noguchi A., Takano K., Nagano R., Suzuki O., Lee J., Ishino F., Matsuda J., (2000), Biol. Reprod., 62, 1579-1584. 22. Memili E., Behboodi E., Overton S. A., Kenney A. M., O Coin M., Zahedi A., Rowitch D. H., Echelard Y., (2004), Cloning Stem Cells, 6(2), 58-66. 23. Matsushime H., Roussel M. F., Ashmun R. A., Sherr C. J., (1991), Cell, 65, 701-713. 24. Meyerson M., Harlow E., (1994), Mol. Cell Biol., 14, 2077-2086. 25. Sherr C. J., Roberts J. M., (1995), Genes Dev., 9, 1149-1163. 26. Yu Y. S., Sun X. S., Jiang H. N., Han Y., Zhao C. B., Tan J. H., (2003), Theriogenology, 59, 1277-1289. 27. Abracham R. T., Acquarone M., Andersen A., Asensi A., Belle R., Berger F., Bergounioux C., Brunn G., Buquet-Fagot C., Fagot D., Glab N., Goudcau H., Goudcau M., Guerrier P., Houghton P., Hendriks H., Kjoareg B., Lippai M., Marie D., Maro B., Meijer L., Mester L., Mulner-Lorillon O., Poulel S. A., Schierenberg E., Schutte B., Vaulot D., Verlhac M. H., (1995), Biol. Cell, 83, 105-120. 28. Schutte B., Nieland L., van Engeland M., Henfling M. E. R., Meijer L., Ramaekers F. C. S., (1997), Exp. Cell Res., 236, 4-15. 29. Skrzyszowska M., Smor¹g Z., K¹tska L., Ryñska B., Kania G., Gajda B., Kareta W., Jurkiewicz J., (2001), Materia³y Konferencyjne II Zjazdu Towarzystwa Biologii Rozrodu (TBR), s. 55-56. BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 133-150 2006 149