Metabolizm fosfolipidów inozytolowych w płytkach krwi. Metabolism of phosphoinositides in blood platelets

Metabolizm fosfolipidów inozytolowych w płytkach krwi Metabolism of phosphoinositides in blood platelets BEATA OLAS Spis treści: I. W stęp II. M etabolizm fosfolipidów inozytolow ych w płytkach krwi II-l. Klasa I kinazy 3-fosfatydyloinozytolu II-2. Klasa II i III kinazy 3-fosfatydyloinozytolu III. Drogi działania kinazy 3-fosfatydyloinozytolu w płytkach krwi IV. Rola kolagenu w regulacji aktyw ności kinazy 3-fosfatydyloinozytolu w płytkach V. Rola białkowej kinazy C w regulacji aktywności kinazy 3-fosfatydyloinozytolu w płytkach VI. Uwagi końcowe Contents: I. Introduction II. M etabolism of phosphoinositides in blood platelets II-l. Class I PI-3K II-2. Class II and III PI-3K III. 3-K inase phosphoinositide pathways in blood platelets IV. Role o f collagen in regulation of platelet PI-3K activity V. Role of protein kinase C in regulation of PI-3K activity in platelets VI. Concluding remarks Wykaz stosowanych skrótów: ADP adenozynodifosforan; ATP adenozynotrifosforan; BIT ang. breakpoint-chester- region hom ology domain', cam P cykliczny adenozynom onofosforan; cgm P cykliczny guanozynom onofosforan; CP fosfataza kreatyny; CPK fosfokinaza kreatyny; CRP ang. collagen-related peptide', DAG diacyloglicerol; Dom eny PH (ang. pleckstrin hom ology) dom eny hom ologiczne do sekwencji am inokwasowych w białku plekstrynic; Domeny SH - (ang. Src hom ology) dom eny hom ologii z białkam i Src; IAS ang. inhibitors o f autocrine stimulation', Ins( 1,4,5)P3 ino- zytolotrifosforan; ITAM (ang. im m unoreceptor tyrosine based activation motif)', PAF czynnik aktyw ujący płytki (ang. platelet activating factor)', PC fosfatydylocholina; PDGF plytkopochodny czynnik wzrostu (ang. platelet derived growth factor)', PE fosfatydyloetanoloam ina; PI-3K kinaza 3-fosfatydyloinozytolu; PI-4K 4-kinaza fosfatydyloinozytolu; PKC kinaza białkowa C; PLC fosfolipaza C; PLCP2 fosfolipaza C typu p2; PLCy2 fosfolipaza C typu y2; PLD fosfolipaza D; PS fosfatydyloseryna; Ptdlns fosfatydyloinozytol; PtdIns(3)P fosfatydyloinozytolo(3)fosforan; Pt- d!ns(3,4)p2 fosfatydyloinozytolo(3,4)bisfosforan; Pt- dins(3,4,5)p3 fosfatydyloinozytolo(3,4,5)trifosforan; Ptdlns(4)P fosfatydyloinozytolo(4)fosforan; PtdIns(4,5)P2 fosfatydyloinozytolo(4,5)bisfosforan; PtdIns(5)P fosfatydyloinozytolo(5)fosforan; TRAP ang. thrombin receptor activating peptide', TXA2 trom boksan A 2 Dr, Katedra Biochemii Ogólnej, U niw ersytet Łódzki, Banacha 12/16, 90-237 Łódź, tel/fax: 0-42-6354484; e-mail: olasb@ biol.uni.lodz.pl I. Wstęp Błona plazmatyczna płytek krwi, podobnie jak innych typów komórek, ma budowę dynamiczną i podlegającą ciągłym zmianom. Zawiera ponad 30% lipidów, około 57% białek i około 8% cukrów. Jest strukturą bardzo aktywną metabolicznie, a w jej obrębie zachodzą procesy o istotnym znaczeniu dla funkcji i metabolizmu płytki krwi. Ważną rolę pełnią ułożone asymetrycznie fosfolipidy błony płytek stanowiące około 3/4 wszystkich lipidów. Większość sfingomieliny i fosfatydylocholiny (PC) znajduje się po stronie zewnętrznej, gdzie nie ma fosfatydyloseryny (PS) i fosfatydyloinozytolu (Ptdlns). Kwas arachidonowy błony plazmatycznej stanowi ponad połowę całkowitej jego zawartości w płytce. Występuje przede wszystkim w fosfatydyloetanolaminie (PE) i fosfatydyloinozytolu, a jest nieobecny w sfingomielinie. W małych ilościach występuje w fosfatydylocholinie. Głównymi składnikami fosfolipidowymi płytek są: PC (36-39 mol%), PE (28-30 mol%), sfingomielina (19-24 mol%), PS (9-10 mol%) i Ptdlns (2-4 mol%). Przemiana fosfolipidów błony, głównie fosfatydyloinozytolu zawierającego kwas arachidonowy, zachodzi bardzo intensywnie w pobudzonych płytkach krwi. Przemiany fosfolipidów w błonie plazmatycznej indukowane sygnałami zewnętrznymi, m. in. trom- biną, kolagenem, tromboksanem A2 (TXA2) czy czynnikiem aktywującym płytki (PAF, ang. platelet POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003 http://rcin.org.pl 185

activating fa cto r) są źródłem wielu biologicznych mediatorów i cząstek sygnałowych przekazujących w komórce informacje docierające do niej ze środowiska zewnętrznego. W płytkach krwi, podobnie jak w innych komórkach, cykliczny guanozynomono- fosforan (cgmp), cykliczny adenozynomonofosfo- ran (camp), fosforany inozytolu, diacyloglicerol, metabolity kwasu arachidonowego i jony wapnia jako grupa tzw. wtórnych przekaźników przekazują sygnały zewnątrzkomórkowe do wnętrza komórki. Jednym z bardziej uniwersalnych i powszechnych mechanizmów przekazywania informacji także w płytkach krwi jest kaskada przemian inicjowana hydrolizą fosfatydyloinozytoli w wewnętrznej warstwie błony plazmatycznej. Hydrolizie fosfolipidów inozytolowych towarzyszy zawsze zwiększenie stężenia jonów wapnia w komórce [1-8]. Dokładny udział pochodnych inozytoli w przekazywaniu informacji w różnych typach komórek został omówiony przez Barańską [9]. Różne molekularne formy fosfatydyloinozytoli zawierają najczęściej kwas stearynowy w pozycji sn-1 i kwas arachidonowy w pozycji sn-2 szkieletu glicerolowego. Fostatydyloiznozytol jest jedynym fosfolipidem, który w obecności ATP i odpowiednich kinaz ulega fosforylacji. W komórkach eukariotycznych może powstawać siedem różnych form ufosforylowanego fosfatydyloinozytolu: trzy mono- fosforany (fosfatydyloinozytolo(3)fosforan (Pt- dłns(3)p), fosfatydyloinozytolo(4)fosforan (Pt- dins(4)p), fosfatydyloinozytolo(5)fosforan (Pt- dins(5)p)); trzy bisfosforany (fosfatydyloinozyto- Io(4,5)bisfosforan (PtdIns(4,5)P2), fosfatydyloinozytolo(3,4)bisfosforan (PtdIns(3,4)P2), fosfatydyloinozytolo(3,5)bisfosforan (PtdIns(3,5)P2)) i jeden trifosforan - fosfatydyloinozytolo(3,4,5)trifosforan (PtdIns(3,4,5)P3) (Rye. 1). ADP pochodzące z płytek krwi i uszkodzonych komórek krwi oraz śródbłonka. Do dalszej aktywacji (tzw. autokrynnej stymulacji płytek krwi) mogą przyczyniać się substancje uwalniane z samych płytek krwi tj. serotonina, ADP, tromboksan A2 i PAF (Ryc. 2) [1-8], Ptdlns Ryc. 1. Drogi powstawania ufosforylowanych fosfatydyloinozytoli w komórkach eukariotycznych. Przyłączenie fizjologicznych agonistów płytkowych m. in. trombiny, kolagenu, TXA2, ADP czy PAF do specyficznych receptorów obecnych na powierzchni błony płytek powoduje aktywację fosfoliserotonina II. Metabolizm fosfolipidów inozytolowych w płytkach krwi Płytki krwi dzięki wyjątkowo rozwiniętemu systemowi receptorów w błonie reagują na różne bodźce zewnętrzne, ulegają aktywacji i spełniają dwie zasadnicze funkcje w hemostazie. Pierwszą z nich jest tworzenie hemostatycznych czopów płytkowych, a drugą funkcją jest udział w reakcjach krzepnięcia krwi. Aktywacja płytek wywołana różnorodnymi czynnikami jest złożonym i wieloetapowym procesem, którego oznakami są: adhezja, zmiana kształtu płytki, sekrecja i tworzenie agregatów płytkowych. Do fizjologicznych agonistów płytek krwi należą: trombina, kolagen, adrenalina, wazopresyna, PAF i Ryc. 2. Autokrynna stymulacja płytek krwi. Aktywacja płytek krwi wywołana pierwotnymi agonistami (trombina, kolagen) indukuje sckrccją oraz syntezą wielu dodatkowych płytkowych aktywatorów (PAF, TXA,, serotonina, ADP), które potągują aktywacją płytek krwi. pazy C (PLC) (EC 3.1.4.3) swoiście hydrolizującei fosfolipidy inozytolowe. W płytkach krwi obecne są dwie izoformy PLC: PLC 32 i PLCy2 [3]. PLCp2 aktywowana jest przez mechanizm zależny od białek G: podjednostki a białek Gq i/lub kompleksu podjedno- 186 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003

stek 3y białek Gj, natomiast PLCy2 ulega aktywacji z udziałem niereceptorowych kinaz białkowych. PLCp2 i PLCy2 prowadzą do hydrolizy fosfatydyloinozytolo(4,5)bisfosforanu i powstania dwóch wtórnych przekaźników informacji: diacyloglicerolu (DAG) oraz inozytolotrifosforanu (Ins(l,4,5)P3) [3]. Diacyloglicerol jako związek hydrofobowy pozostaje w błonie plazmatycznej, ale przemieszczając się w niej może aktywować kinazę białkową C (PKC; EC Wzrost stężenia DAG jest krótkotrwały, gdyż jest on natychmiast przekształcany do kwasu fosfatydowego z udziałem kinazy diacyloglicerolowej. Reakcja ta jest odwracalna, ale tworzenie kwasu fosfatydowego jest szybsze od jego rozkładu. Związek ten ulega przemianie do cytydylomonofosforanu kwasu fosfatydowego, który z kolei reaguje z wolnym inozytolem dając fosfatydyloinozytol zamykający cykl przemiany. Ins(l,4,5)P3 natomiast, jako związek roz- P I-5K l l kolagen trom bina ADp Ryc.3. Struktura chemiczna fosfatydyloinozytoli ufosforylowanych w pozycji 3 inozytolu: PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P,, PtdIns(3,5)P, i PtdIns(3,4,5)P3. Fosfatydyloinozytolo(3)fosforan (PtdIns(3)P) z udziałem 4-kinazy PI jest przekształcany do fosfatydyloiriozytolo(3,4)bisfosforanu (PtdIns(3,4)P,), a 5-kinaza PI prowadzi do wytworzenia fosfatydyloinozytolo(3,5)bisfosforanu (PtdIns(3,5)P2). Hydrofobowe grupy acylowe fosfatydyloinozytoli obecne są w wewnętrznej części błony plazmatycznej, natomiast część hydrofilowa tych związków znajduje się w cytoplazmie. Ponadto większość sfingomieliny i fosfatydylocholiny znajduje się po stronic zewnętrznej błony, gdzie nic ma fosfatydyloinozytolu (wg. [6], zmodyfikowano). 2.7.1.37), która fosforyluje przede wszystkim pleks- trynę. Fosforylacja plekstryny jest niezbędna dla procesu sekrecji wielu związków biologicznie czynnych zmagazynowanych w specyficznych ziarnisto- ściach płytkowych. Uwalniane do osocza swoiste białka płytkowe czynnik płytkowy 4, p-trombo- globuliny czy przemieszczenie P-selektyny wraz z błonami a-ziarnistości na powierzchnię płytek jest uważane za wskaźnik aktywacji płytek krwi in vivo. http://rcin.org.pl puszczalny w środowisku wodnym, dyfunduje do cytoplazmy i jest odpowiedzialny za wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie. Wzrost stężenia jonów wapnia jest niezbędny m.in. do aktywacji fosfolipazy A2 (PLA2) (EC 3.1.1.4) uruchamiającej kaskadę kwasu arachidonowego i do stymulacji kinazy lekkiego łańcucha miozyny (EC 2.7.1.117) [1-8]. Fosfa- tydyloinozytolo(4,5)bisfosforan w płytce odgrywa nie tylko istotną rolę jako prekursor lipidowych POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003 187

wtórnych przekaźników (DAG i Ins( 1,4,5)P3), ale także jako regulator reorganizacji cytoszkieletu, w tym filamentów aktynowych [10]. Gdy na płytkę krwi działają agoniści (m. in. trombina, kolagen, tromboksan A2, ADP czy PAF) może nastąpić nie tylko hydroliza PtdIns(4,5)P2, lecz również dalsza fosforylacja tego fosfolipidu. Kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI-3K) (EC 2.7.1.137) wprowadza grupę fosforanową z ATP na grupę -OH w pozycję 3 pierścienia inozytolu; fosfatydyloinozytole ufosforylowane w pozycji 3 inozytolu nie podlegają hydrolizie z udziałem poznanych izoform fosfolipazy C i nie są substratami, z których powstają wtórne przekaźniki informacji. Strukturę chemiczną fosfatydyloinozytoli ufosforylowanych w pozycji 3 inozytolu przedstawia rycina 3. Kinazy 3-fosfatydyloinozytolu ze względu na selektywną specyficzność substratową w warunkach in vitro i w oparciu o ich budowę strukturalną podzielono na trzy klasy; klasę I, II i III [11-13]. Krótką charakterystykę kinaz 3-fosfatydyloinozytolu w płytkach krwi przedstawia tabela 1. II-l. Klasa I kinazy 3-fosfatydyloinozytolu Do klasy I PI-3K należą enzymy będące heterodi- merami posiadającymi część regulatorową i katalityczną fosforylującą grupę -OH w pozycji 3 Ptdlns, PtdIns(4)P i PtdIns(4,5)P2; w warunkach in vitro preferowanym substratem tej klasy PI-3K jest Pt- dins(4,5)p2. W klasie I można wyróżnić 2 grupy: grupę A i B. Enzymy klasy IA zbudowane są z podjednostki katalitycznej (plooa, pl00[3 i p 1105) i z białek regulatorowych p85 (50-85 kda), takich jak p85 i p85. Podjednostki regulatorowe posiadają: dwie domeny SH2 (ang. Src hom ology), które reagują z ufosforylowaną tyrozyną, jedną domenę SH3, domenę BH (ang. breakpoint-cluster-region homology domain) i dwa regiony bogate w reszty proliny [14]. W płytkach krwi obecne sąpl-3k (tzw. p85/pi-3k) klasy IA posiadające podjednostki katalityczne pl 10a i pl 10p połączone z podjednostkami regulatorowymi p85a i p85p [4], W czasie aktywacji płytek krwi wywołanej trombiną czy syntetycznym peptydem (SFLLRN), zwanym TRAP (ang. throm bin receptor activating p ep tid e), dochodzi do wzrostu aktywności p85/pi-3k w immunoprecypitatach rozpuszczalnych w Tritonie X-100 i we frakcji cytoszkieletu błon komórkowych nierozpuszczalnej w Tritonie X-100. Wskazuje to na przemieszczenie się PI-3K do frakcji błonowej. W płytkach krwi niesty- mulowanych tylko niewielkie ilości p85/pi-3k połączone są z cytoszkieletem błon płytek [4, 15], natomiast w czasie aktywacji płytek krwi p85/pi-3k ulega przemieszczeniu do frakcji cytoszkieletu błon komórkowych. Podczas aktywacji płytek krwi trombiną ważną rolę w przekazywaniu sygnału zewnątrz- komórkowego, gdy fibrynogen przyłączy się do integryny otnbp3, spełnia oddziaływanie p85/pi-3k z cytoszkieletem (m. in. a-aktyniną) oraz wytwarzanie PtdIns(3,4)P2 [16]. W czasie przekazywania sygnału zewnątrzkomórkowego obserwuje się również fos- forylację reszt tyrozynowych białka Cbl, co jest powiązane z działaniem PI-3K oraz kinazy Syk [17]. Stymulacja płytek krwi słabym agonistą ADP powoduje odwracalne przemieszczenie p85/pl-3k do cytoszkieletu, ale bez wytwarzania PtdIns(3,4)P2 [18]. Uważa się, że przemieszczenie p85/pi-3k klasy IA do cytoszkieletu nie odgrywa istotnej roli w akty wacj i enzymu [16], Obecne w płytkach krwi białka Rho należące do małych białek G mogą być też efektorami i regulatorami p85/pi-3k [19] oraz 4-kinazy fosfatydyloinozytołu (EC 2.7.1.67) [20]. W płytkach krwi PI-3K klasy IB (tzw. PI-3Ky) są aktywowane przez podjednostki Py białek G [16, 21]. PI-3Ky posiada podjednostkę katalityczną p 110, zawierającą miejsce wiązania białka Ras i domenę homologiczną do plekstryny (PH, ang. pleckstrin homology) w N-końcowej części białka. W płytkach krwi kinazy 3-fosfatydyloinozytolu klasy IB obecne są w cytosolu. Z h a n g i wsp. [16] wykazali, że w czasie aktywacji płytek krwi trombiną dochodzi do przemieszczenia PI-3Ky do cytoszkieletu. Tang i D o w n e s [22] z cytosolu płytek krwi świni wyizolowali dwie różne PI-3Ky. Jedna z nich aktywowana przez podjednostki Py białek G o stężeniu 1 pm odpowiedzialna jest za fosforylację grupy -OH w pozycji 3 inozytolu Ptdlns, PtdIns(4)P i PtdIns(4,5)P2; preferowanym substratem dla tej kinazy jest Pt- dins(4,5)p2. Druga PI-3Ky nie jest aktywowana przez podjednostki Py białek G, ale z udziałem receptora dla płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) należącego do receptorów kinazy tyrozyno- wej [22], W płytkach krwi traktowanych LY294001 - inhibitorem obu kinaz należących do klasy I, dochodzi do hamowania transportu jonów Ca2+ wywołanego działaniem trombiny [20, 23]. II-2. Klasa II i III kinazy 3-fosfatydyloinozytolu Kinaza 3-fosfatydyloinozytolu klasy II zbudowana jest z olbrzymich katalitycznych podjednostek (170-220 kda), zawierających C2 domenę w C-ko- ńcowej części białka. Fosforyluje ona głównie Ptdlns i PtdIns(4)P, jakkolwiek PI-3K-C2a także może fosforylować Ptdlns(4,5)P2 w obecności fosfatydy- 188 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003

loseryny [11, 12]. W płytkach krwi obecna jest również izoforma kinazy 3-fosfatydyloinozytolu klasy II tzw. HsC2-PI-3K, a wzrost jej aktywności obserwuje się podczas akumulowania PtdIns(3)P w komórce. Proces ten jest hamowany przez wortmaninę (IC50=7nM). Budowa i rola PI-3K klasy III nie jest dostatecznie poznana. Wiadomo jedynie, że substratem dla PI-3K klasy III jest fosfatydyloinozytol, z którego powstaje fosfatydyloinozytolo(3)fosforan [24, 25]. Do tej pory w płytkach krwi nie udało się zidentyfikować PI-3K klasy III. III. Drogi działania kinazy 3-fosfatydylO inozytolu w płytkach krwi poziom PtdIns(3,4)P2 jest osiągnięty po 4-5 minutach działania agonisty [4, 35, 36]. Kolejność tworzenia różnych ufosforylowanych w pozycji 3 inozytoli budzi wiele kontrowersji. Cunningham i wsp. [37] sugerują następującą kolejność: Pt- dins->ptdins(3)p->ptdins(3,4)p2->ptdins(3,4,5)p3. Carter i wsp. [38] oraz Hawkins i wsp. [39] uważają natomiast, że ma miejsce inna kolejność powstawania: PtdIns(4,5)P2->PtdIns(3,4,5)P3-»PtdIns(3,4)P2 ze względu na działanie 5-fosfatazy katalizującej proces defosforylacji PtdIns(3,4,5)P3. Pt- dins(3,4)p2 może również powstawać w wyniku działania PI-3K, która może fosforylować Pt- dins(4)p. Rozbieżności wyników badania kolejności trombiną TRAP W płytkach krwi, podobnie jak i w innych komórkach, tworzenie różnych form fosfatydyloinozytolu ufosforylowanego w pozycji 3 inozytolu jest kontrolowane przez wiele kinaz oraz fosfataz. Aktywacja płytek krwi silnym agonistą trombiną czy TRAP prowadzi do tworzenia fosfatydyloinozytolo(3,4)bisfosforanu i fosfatydyloinozytolo(3,4,5)trifosforanu. Proces ten jest hamowany przez nieodwracalny i specyficzny inhibitor kinazy 3-fosfatydyloinozytolu wortmaninę [15, 21, 26]. Reakcja hamowania przez wortmaninę jest obserwowana również w innych komórkach, np. linii komórkowej CHRF-288 pochodzącej z megakariocytów [26]. W płytkach krwi wortmanina o stężeniu 1 nm hamuje aktywność p85/pi-3k, natomiast w wyższym stężeniu (10 nm) hamuje aktywność kinazy PI-3Ky (Ryc. 4) [4]. Sugeruje się, że PI-3K odgrywa istotną rolę w odwracalnej (początkowej) fazie agregacji płytek krwi wywołanej nie tylko trombiną, ale również czynnikiem aktywującym płytki (PAF) [27]. Wortmanina może hamować agregację płytek krwi stymulowaną kolagenem lub konwulksyną (gliko- proteina wyizolowana z jadu węży) m. in. poprzez modulowanie funkcji integryny anb[33 i/lub w mechanizmie niezależnym od PI-3K. Wyniki badań wskazują, że wortmanina nie jest jednak specyficznym inhibitorem PI-3K w płytkach aktywowanych kolagenem czy konwulksyną [28]. W płytkach stymulowanych trombiną zaobserwowano, że kinazy pp60c'src i p59fyn [29] oraz ppl25fak [30-33] tworzą kompleksy z PI-3K. Natomiast małe białka G białka Rac aktywują kinazę PI-5K i przyczyniają się do powstania Ptdlns(4,5)P2 [34], Trombiną, jak i TRAP indukują syntezę PtdIns(3,4,5)P3 już po 15-30 sekundach działania, a produkcja PtdIns(3,4)P2 następuje po wytworzeniu PtdIns(3,4,5)P3. Najwyższy POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003 http://rcin.org.pl Ryc. 4. Regulacja PI-3K w płytkach krwi aktywowanych trombiną łub TRAR Trombiną czy TRAP po połączeniu z receptorem serpentynowym (zbudowanym z 7 domen transbłonowych) z udziałem podjednostki a białek Gq aktywują fosfolipazę C (PLCP2), co prowadzi do powstania dwóch wtórnych przekaźników: diacyloglicerolu (DAG) i 1,4,5 trifosforanu inozytolu (Ins( 1,4,5)P3). DAG pobudza białkową kinazę C (PKC), a Ins(l,4,5)P3 stymuluje napływ jonów Ca2+ do cytoplazmy. Białkowa kinaza C wraz z małymi białkami G białkami RhoA indukuje aktywacją p85/pi-3k. W przekazywaniu sygnału do płytki krwi, po przyłączeniu trombiny czy TRAP do specyficznego receptora, uczestniczą także podjednostki ()y białka Gq, które są odpowiedzialne za aktywacją innej izoformy kinazy 3-fosfatydyloinozytolu, tzn. PI-3Ky. PI-3Ky i p85/pi-3k wytwarzają Ptdłns(3,4)P, i PtdIns(3,4,5)P3, które w płytce są prawdopodobnie niezbędne dla przyłączenie fibrynogenu do integryny a lb(33. Dalsze objaśnienia w tekście. fosforylowania fosfatydyloinozytoli w płytkach krwi mogą wynikać z różnego czasu działania agonisty. Cunningha m i wsp. [37] inkubowali płytki krwi z trombiną przez 10 minut, natomiast Carter i wsp. [38] stosowali bardzo krótki czas działania agonisty, bo zaledwie 20-60 sekund. Jeżeli stężenie płytek krwi było wysokie (~ 1,1 x 109 płytek/ml) i zastosowano wysoką dawkę trombiny (3 j/ml) przez 10 minut, to dochodziło do tworzenia agregatów płytko

wych i sekrecji fibrynogenu z a-ziarnistości płytkowych [40]. Powodowało to opóźnione gromadzenie PtdIns(3)P powstającego w wyniku działania kinazy 3-fosfatydyoloinozytolu klasy II na fosfatydyloinozytol. W płytkach krwi obecna jest ponadto kinaza PI-4K, która fosforyluje grupę -OH w pozycji 4 inozytolu PtdIns(3)P i prowadzi do powstania Ptd- Ins(3,4)P2 [41]. Tworzenie PtdIns(3,4)P2 w płytkach Natomiast zastosowanie inhibitorów wiązania fibrynogenu do integryny anb[33 powodowało hamowanie wytwarzania PtdIns(3,4)P2 o około 60% [44]. Podobne zahamowanie było także obserwowane w obecności antagonisty receptora dla TXA2 SQ 29.548. W obecności antagonistów PAF lub serotoniny był obserwowany bardzo słaby efekt lub brak wpływu na produkcję fosfolipidów inozytolowych. W obecno- Tabela 1 Charakterystyka kinaz 3-fosfatydyloinozytolu w płytkach krwi (kompilacja danych z: [4, 15, 16, 21]) Klasa kinazy 3- Budowa kinazy 3-fosfatydyloinozytolu fosfatydyloinozytolu K lasa I K lasa II (tzw. HsC2-PI-3K ) K lasa IA (tzw. p85/pi-3k) Klasa IB (tzw. PI-3Ky) Podjednostka katalityczna p l 10a, p 110p Podjednostka regulatorow a p85a, p85p Podjednostka katalityczna p il Oy Podjednostka katalityczna (170-220 kda) (9) krwi po krótkotrwałej stymulacji trombiną(20-60 sekund) może wskazywać, że szybciej działa PI-4K niż PI-3K, ponieważ PtdIns(4)P jest fosforylowany przed PtdIns(3)P. Dlatego też kolejność zdarzeń może być następująca: PtdIns(4)P-»PtdIns(3,4)P2 i/lub PtdIns(4,5)P2 >PtdIns(3,4,5)P3 >PtdIns(3,4)P2. Stymulacja płytek krwi fizjologicznymi aktywatorami (trombiną czy kolagenem) powoduje wytwarzanie oraz sekrecję różnych płytkowych aktywatorów wzmagających działanie pierwotnych agoni- stów i indukujących autokrynną stymulację płytek [1-8]. Zastosowanie inhibitorów autokrynnej stymulacji płytek krwi (IAS, ang. inhibitors o f autocrine stim ulation) pozwoliło ocenić, jak przebiegają szlaki przekazywania sygnałów w płytkach krwi aktywowanych kolagenem czy trombiną [42], Do inhibitorów IAS należą: (1) układ fosfataza kreatyny/fosfokinaza kreatyny (CP/CPK), który przekształca ADP w ATP (antagonista receptorów dla ADP), (2) SQ 29.548 antagonista tromboksanu A2, (3) peptyd RGDS chroniący przed przyłączeniem fibrynogenu do integryny ctilbp3, (4) cyproheptadyna antagonista serotoniny i (5) BN 52021 antagonista PAF [42]. Jeżeli płytki krwi aktywowano trombiną, to IAS znosiły syntezę PtdIns(3,4)P2 i PtdIns(3,4,5)P3, natomiast podczas aktywacji kolagenem stosowane IAS nie miały istotnego wpływu na tworzenie tych fosfolipidów. W płytkach krwi aktywowanych trom- binąnajsilniejszym inhibitorem kinazy 3-fosfatydyloinozytolu okazał się system CP/CPK, gdyż powstawanie PtdIns(3,4)P2 było zahamowane w 78% [43]. ści inhibitorów cyklooksygenazy (m. in. kwasu acetylosalicylowego, który hamuje tworzenie TXA2), słaby aktywator płytek krwi ADP stymulował produkcję zarówno PtdIns(3,4)P2 jak i Pt- dins(3,4,5)p3. Analog TXA2 U46619 i kwas lizo- fosfatydowy indukowały także syntezę Pt- dins(3,4)p2 i PtdIns(3,4,5)P3 w płytkach krwi [4]. Wydaje się, że sam ADP nie ma wpływu na tworzenie fosfoinozytoli ufosforylowanych w pozycji 3 inozytolu [18, 43], jednak prawdopodobnie wytwarzanie w znacznych ilościach tych fosfolipidów w płytkach krwi aktywowanych trombiną zależy od au- tokrynnych agonistów płytek, np. ADP. Może to być wynikiem synergistycznego działania trombiny i ADP na płytki krwi. Na błonie płytek obecne są co najmniej 3 typy receptorów dla ADP: receptor meta- botropowy P 2 Y j (połączony z białkami G j) [45, 46], receptor P 2 Y A D [> (połączony z białkami G j lub G q) [47] i receptor P2Xi (umożliwia napływ jonów Ca2^ ze środowiska do cytoplazmy komórek) [48]. Szczegółowa interakcja ADP z płytkowymi receptorami została opisana przez Olas [49]. IV. Rola kolagenu w regulacji aktywności płytkowej kinazy 3-fosfatydyloinozytolu Integralną częścią procesu przekazywania sygnałów w płytkach krwi aktywowanych kolagenem jest nie tylko fosforylacja tyrozyny, ale również fosforylacja inozytolu, w której ważną rolę spełnia PI-3K [42], Kolagen indukuje aktywację płytek krwi 190 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003

poprzez receptor GPVI. Przyłączenie kolagenu do GPVI powoduje aktywację kinazy Src oraz fosfory- lację cząsteczek tyrozyny w motywie ITAM (ang. im m unoreceptor tyrosine-based activation motif) w łańcuchu y receptora Fe, co jest niezbędne do aktywacji PLCy2. Trombina natomiast nie powoduje fosforylacji łańcucha y receptora Fc [50], G i b b i n s i wsp. [50, 51] opisali, że w czasie aktywacji płytek krwi kolagenem dochodzi do interakcji podjednostki regulatorowej (p85) kinazy 3-fosfatydyloinozytolu z ufosforylowaną tyrozyną w motywie ITAM łańcucha y receptora Fc. Produkty działania PI-3K odgrywają istotną rolę w translokacji i aktywacji PLCy? w różnych typach komórek. W komórkach jądrzastych, np. limfocytach domeny PH i SH2 w PLCy2 mogą wiązać Pt- dins(3,4,5)p3 i umożliwiać przemieszczenie fosfolipazy C [52, 53, 54], W płytkach krwi aktywowanych kolagenem szczególną funkcje spełniają fosfolipido- we produkty PI-3K [55, 56], Inhibitory PI-3K (wortmanina czy LY294002) silnie redukują aktywność płytkowej PLCy2. Inhibitory te nie chronią przed fos- forylacją tyrozyny w PLCy2, ale znoszą jej przemieszczenie, co obserwowano po dodaniu egzogennego PtdIns(3,4,5)P3 do płytek krwi [56]. Płytkowa PLCy2 jest zdolna do interakcji z PtdIns(3,4,5)P3, chociaż rola tego procesu nie jest jasna. Ostatnio stwierdzono, że wprowadzenie domen PH czy SH2 pochodzących z PLCy2 do komórek PC 12 nie powoduje wiązania ich z PtdIns(3,4,5)P3 [57]. Wytwarzanie dużych ilości PtdIns(3,4)P2 i PtdIns(3,4,5)P3 w płytkach krwi oraz aktywacja PI-3K jest niezbędna dla maksymalnej stymulacji aktywności PLCy2 po aktywacji receptora GPVI peptydcm podobnym do kolagenu (CRP, ang. collagen-related peptide) [55]. Stwierdzono również, że interakcja kolagenu z inte- gryną cc2[3i obecną na powierzchni błony płytkowej jest odpowiedzialna za uruchomienie produkcji fosfolipidów inozytolowych, hamowanej przez wort- maninę [58]. Produkty działania PI-3K bisfosforany fosfatydyloinozytolu (PtdIns(3,4)P2 lub PtdIns(3,5)P2) mogą spełniać rolę specyficznego kofaktora dla płytkowej fosfolipazy D (PLD) (EC 3.1.4.4). Aktywność PLD wzrasta w obecności tych fosfolipidów, natomiast nie ulega zmianie w obecności monofosfora- nów fosfatydyloinozytolu czy fosfatydyloinozytolu. Rola bisfosforanów fosfatydyloinozytolu, jako kofaktora PLD może zapewniać łączność pomiędzy różnymi enzymami (PLC, PLD i PI-3K) uczestniczącymi w przekazywaniu sygnałów w płytkach krwi. Podobnie jak GPVI, udział w wytwarzaniu fosfoinozytoli w płytkach krwi bierze receptor FCyllA (receptor fragmentu Fc immunoglobuliny G). Receptor FCyllA uczestniczy w aktywacji kinazy Syk, PLCy2, podjednostki p85 PI-3K, co w konsekwencji prowadzi do produkcji PtdIns(3,4)P2 i Ptd- Ins(3,4,5)P3 [56, 59, 60], Receptor FCyllA stymuluje aktywność PLCy2 nawet w obecności wortmaniny, natomiast peptyd o sekwencji RGDS nie ma istotnego wpływu na aktywność PLCy2 [55, 58]. Interakcja receptora GPIb/IX/V z czynnikiem von Willebranda indukuje też połączenie PI-3K z cytoszkieletem oraz wywołuje jej aktywację [61]. V. Rola białkowej kinazy C w regulacji aktywności kinazy 3-fosfatydyloinozytolu w płytkach Białkowa kinaza C uczestniczy w procesach przekazywania sygnału w płytkach krwi, fosforylując m. in. 4-kinazy fosfatydyloinozytolu, w wyniku czego dostarcza prekursorów dla PI-3K. PKC jest niezbędna do wytwarzania w płytkach krwi fosfatydyloinozytoli, posiadających ufosforylowaną grupę -OH w pozycji 3 inozytolu. Właściwości te stwierdzono na podstawie następujących obserwacji: (1) w płytkach krwi stymulowanych trombiną zahamowanie aktywności PKC jest połączone z redukcją ilości powstających PtdIns(3,4)P2 i PtdIns(3,4,5)P3 [62], (2) estry forbolu stymulują PKC, która indukuje syntezę tych fosfolipidów, nawet przy braku aktywatora płytkowego - - trombiny [15], (3) octan mirystynianu forbolu stymuluje p85/pi-3k, ale nie aktywuje PI-3Ky, a stymulacja płytek krwi przez estry forbolu jest hamowana przez peptyd o sekwencji RGDS, przy obniżeniu wytwarzania PtdIns(3,4)P2 o około 80% [15]. Ponadto stwierdzono, że w płytkach krwi PtdIns(3,4,5)P3 promuje fosforylację plekstryny (p47) głównego substratu PKC, hamowanej w obecności wortmaniny [63]. Chociaż funkcja plekstryny w warunkach in vivo nie jest w pełni wyjaśniona, sugeruje się, że plekstryna może mieć wpływ na szlaki przekazywania sygnałów z udziałem PLC, PI-3K czy fosfataz inozytolowych. Ufosforylowaną plekstryna hamując aktywność kinazy 3-fosfatydyloinozytolu blokuje tworzenie produktów działania PI-3K biorących udział w mechanizmach aktywacji płytek [64, 65], VI. Uwagi końcowe Mechanizmy przekazywania sygnałów w płytkach krwi są bardzo złożone. Pomimo różnic w POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003 http://rcin.org.pl 191

strukturze chemicznej, właściwościach i wielkości cząsteczki różnych fizjologicznych stymulatorów, aktywność biologiczna przejawiająca się m. in. adhezją, sekrecjączy agregacją płytek jest natychmiastowa i taka sama. Aktywność biologiczna płytek krwi uzależniona jest od szlaku przekazywania sygnału i tworzenia różnych wtórnych przekaźników informacji. Produkty działania kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (zarówno ufosforylowane fosfatydyloinozytole, jak i ufosforylowane białka) są powiązane bezpośrednio z przekaźnictwem sygnału w płytkach krwi. Istotną rolę w aktywacji płytek krwi spełniają nie tylko kinazy fosfatydyloinozytolu, ale także fosfatazy inozytolowe, przeprowadzające defosforylację Ptd- Ins(3,4,5)P3 i prowadzą do powstania PtdIns(3,4)P2, który z kolei uczestniczy w stabilizowaniu agregatów płytkowych [66]. Podziękowania Praca finansowana z badań własnych UŁ 505/448. Piśmiennictwo Artykuł otrzymano 31 marca 2003 Zaakceptowano do druku 31 lipca 2003 1. Blockmans D.Dcckmyn H, Vermylen J (1995) Blood Rev 9: 143-156 2. Kroll MH, Schafer AJ (1995) Immunopharmacology 29: 31-65 3. L e v y-t o 1e d a n o S (1999) Haemostasis 29: 4-15 4. Rittenhousc S E (1996) Blood 12: 4401-4414 5. Ryningcn A,Holmsen I I (1999) W: G undu H,R a o R (rc d ) Platelet Physiology and Pharmacology. Kluwcr Academic Publishers, Norwell, 1-22 6. S e 1 h e i m F, H o 1m s c n H, Vassbotn F S (2000) Platelets 11: 69-82 7. W h i t e G C (2000) Blood Coagul Fibrinol 11: 53 8. W u K (1996) J Internal M ed 239: 17-34 9. BarańskaJ(l 995) W:Konarska L (red) Molekularne mechanizmy przekazywania sygnałów w komórce. PWN, Warszawa, str. 138-153 10. T a k e n a w a T, 11 o h T, F u k a m i K. (1999) Chem Phys Lipids 98: 13-22. 11.Domin J, Pages F, Volin i a S, Rittenhousc SE, Zvelcb il MJ, Stein RC, Watcrficld M D (1997) Biochem J 326: 139-147 12. Domin J, Watcrficld M D (1997) FEBS Lett 410: 91-95 13. Wymann MP, Pirola L (1998) Biochim Biophys Acta 1436: 127-150 14. Rubio I, Rodrigue a-v i c i a n a P, D o w n w a r d J, W e t z k e r R (1997) Biochem J 326: 891-985 15. Z h a n g J (1996) J Biol Chem 271: 6265-6272 16. Zhang J, Fry MJ,Watrficld MD, Jakcn S, L i a o L, Fox JE, Rittenhousc SE (1992) Biol Chem 267: 4686-4692 17. S ac i A, R e n d u F, B a c h c 1o t-l o z a Ch (2000) Biochem J 351: 669-676 18. G a c h e t C, P a y r a s t r e B, G u i n e b a u 11 C, T r u m e 1 C, Ohlmann P, Mauco G, Ca ze nave JP, Plantavid M, C h a p H (1997) J Biol Chem 272: 4850-4854 19. Z h a n g J, K i n g W G, D i 1 1 o n S, II a 1 1 A, F c i g L, Rittenhousc S E ( 1 993) J Biol Chem 268: 22251-22254 20. R o s a d o J A, S a g e S O (2000) J Biol Chem 275: 9110-9113 21. Z h a n g J, Shattil SJ, Cunningham MC, Rittenhouse S E (1996) J Biol Chem 271: 6265-6272 22. Tang X, D o w nc s C P {\9 9 1 )J Biol Chem 272: 14193-14199 23. L u P J, H s u A L, W a n g D S, C h c n C S (1998) Biochemistry 37: 9776-9783 24. Corvcra S, Czech M P (1 998) Trends Cell Biol 8:442-446 25. F r u m a n D A, R a m e h L E, C a n 11e y L C (1999) Celi 97: 817-820 26. Vcmuri GS, Zhang J, Huang R, Keen JH, Rittenhouse SE (1996) Biochem J 314: 805-810 27. Laucner R W, Stevens ChM, Sayed MR, Salari H, D u r a n i o V (1999) Biochim Biophys Acta 1999: 197-208 28. Lagruc AH,Franclschetti JMB,GuimaraesJA(1999) FEBS Lett 448: 95-100 29. Gutkind JS,Lacal PM, Robbins K C (1990) Mol Celi Biol 10: 3806-3812 30. J i P, Haimovich B (1 999) Biochim Biophys Acta 1448: 543-552 31. Haimovich B,Lipfert L,Brugge JS,Shattil S J (1993) J Biol Chem 268: 15868-177 32. Rankin S, Hooshman d-r ad R, Clacsso n-w e 1s h L. Rozengurt E (1996) J Biol Chem 271: 7829-7834 33. N o rm an RG and A u g u s t i n e J A (1998)5/oor/91: 930-939 34. Zheng Y, Baghrodia S,Cerione R A (1 994) J Biol Chem 269: 18727-18730 35.Nolan RD, Lapetina EG (1990) JB io l Chem 265: 2441-2445 36. Sultan C, Breton M, Mauco G, Grondin P, Plantavid M, Chap H (1990) Biochem J 269: 831-834 37. Cunningham T W, Lips DL, B ans a 1V S, Caldwell KK, M itchell CA, M ajerus PW (1990) J Biol Chem 265: 21676-21683 38. Carter AN, Huang R, Sorisky A, Downes CP, Rittenhouse S E ( 1 994) Biochem J 301: 415-420 39. Hawkins PT, Jackson TR, Stephens L R (1992) Nature 358: 157-159 40. H o 1m s e n H, D a y 11 J, S e t k o w s k y C A (1972) Biochem J 129: 67-82 41. Yamamoto K,Graziani A,Carpenter C,Cantley LC, Lapetina EG (1990) J Biol Chem 265: 22086-22089 42. RyningenA, Holmsen H (1998) Biochem Biophys Res Commun 245: 757-763 43. S c 1h c i m F, I dosc R, F uka m i M,H o 1m sen II, Vassbo t n F S (1999) Biochem Biophys Res Commun 263: 780-785 44. Sultan C, Plantavid M, Bachclot C, Grondin P, Breton M, Mauco G, Levy TS, C a e n JP, C h a p H (1991) J Biol Chem 266: 23554-23557 45. L c o n C, II c c h 1c r B, V i a I C, L e r a y C, C azanave J P, G a c h e t C (1997) FEBS Lett 403: 26-30 46. M i 11s D C B (1996) Thromb Haemost 76: 835-856 47. Hourani SM (1996) J Automatic Pharmacol 16: 243-298 48. Vial C, Hechler B, Leon C, Casenave JP, Gachet C (1997) Thromb Haemost 78: 1500-1504 49. O 1a s B (2001) Acta Haematol Polon 32: 393-405 50. Gibbins J,Asselin J, Far n dale R, Barncs M,Law CL, Watson S P (1996) J Biol Chem 271: 18095-18099 51. Gibbins JM,Briddon S,Shutes A,van VM,van-deWJ, SaitoT, Watson S P (1998) J Biol Chem 273: 34437-34443 52. Falasca M, Logan SK, Lchto VP, Baccante G, Lemmon MA, SchlessingerJ (\998) E M B R O J17:414-422 53. B ac Y S, C a n 11e y L G, C h e n C S, K i m S, K w o n K S, R h e e S G (1998) J B io l Chem 273: 4465-4469 54. Ramch LE, Rhcc SG, Spokes K, Kazlauskas A, C a n tle y LC, C a n tle y LG (1998) J Biol Chem 273: 23750-23757 55. Pasquet JM,Bobc R, Gross B,Gratacap MP, T omliso n MG, Payrastre B, Watson S P ( 1 999) Biochem J 342: 171-177 56. Gratae a p MP, Payrastre B, V i a 1a C, Mauco G, Plantavid M, Chap H (1998) JB iol Chem 273: 24314-24321 57. Bobe R, Wilde JL, Mascgbcrger P, Venkateswarlu K, Cullen PJ, Sicss W, Watson SP (2000) J Biol Chem 275: 8016-8026 58. J u n g S M, M o r o i M (2000) J B io l Chem 275: 8016-8026 192 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003

59. C h a c k o G W, B r a n d t JT, Coggcshall K M, A n d c r s o n C L (1996) J Biol Chan 271: 10775-10781 60. S a c i A, P a i n S, R c n d u F, B a c h c 1o t-l o z a C (1999)JB io l Chan 2 2 :1898-1904 61.Ja c k so n SP, S ch o en w a eld e r S M, Y u a n Y, Rabinowitz I, S a 1c m H FI, Mitchell C A (1994) J Biol Chan 269: 27093-27099 62. K i n g W G, K u c era GL, S o risk y A, Z h a n g J, Rittenhousc S E (1991) Bioclian J 278: 475-480 63. Z h a n g J, F a 1c k J R, R c d d y KK.Abrams C S, Z h a o W (1995) J Biol Chan 270: 22807-22810 64. A b r a in s C S, Z h a n g J, D o w n c s C P, T a n g X, Z h a o W. Rittenhousc SE (1996) J Biol Chem 271: 25192-25197 65. Abrams C S, Z h a o W, Belmonte E, Brass L F (1995) M Biol Chem 270: 23317-23321 66. Giuriato S, Payrastrc B, Draycr L, Plantavid M, Woscholski R, Parker P, Erncux C (\9 9 1 )J B io l Chem 212: 26857-26863 POSTĘPY BIOCHEMII 49(3), 2003 http://rcin.org.pl 193