(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. A23L 27/30 ( ) C07H 15/256 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/24 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: NOWE GLIKOZYDY STEWIOLOWE (30) Pierwszeństwo: JP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/31 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/12 (73) Uprawniony z patentu: Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd., Osaka, JP (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 TOYOSHIGE MORITA, Osaka, JP ISAO FUJITA, Osaka, JP FUMITO MATSUURA, Fukuyama, JP MASAYA OTA, Fukuyama, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Renata Piekarz AOMB POLSKA SP. Z O.O. ul. Emilii Plater piętro Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis DZIEDZINA TECHNIKI [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowego glikozydu stewiolowego, środka słodzącego zawierającego rebaudiozyd A i nowy glikozyd stewiolowy, który występuje w odmianie Stevia Rebaudiana Bertoni zawierającej wysoką zawartość rebaudiozydu A, sposobu wytwarzania produktów spożywczych, farmaceutycznych, niefarmaceutycznych i kosmetycznych, potwierdzenia odmian stewii i sposobu analizy nowego glikozydu stewiolowego. TŁO WYNALAZKU [0002] Stewia jest rośliną wieloletnią z rodziny Asteraceae, uprawianą w Paragwaju, w Ameryce Południowej. Jej naukową nazwą jest Stevia Rebaudiana Bertoni. Stewia zawiera komponenty, których słodycz jest 300 razy lub więcej większa niż ta z sacharozy, i sadzi się ją do stosowania jako naturalny środek słodzący po ekstrakcji słodkich komponentów. [0003] Stewiozyd (C 38 H 60 O 18 ), rebaudiozyd A (C 44 H 70 O 23 ), rebaudiozyd C, D i E, dulkozyd A itd. są znane jako słodkie komponenty stewii. W na ogół sadzonej odmianie stewii stewiozyd (dalej ST) jest głównym komponentem wśród wymienionych powyżej słodkich komponentów z zawartą ilością rebaudiozydu A (dalej RA) wynoszącą około 40% masowych zawartości i nieco mniejszą tę dla rebaudiozydu C. Jednak w zależności od odmiany występują różne rodzaje, takie jak te z rebaudiozydem C jako głównym komponentem. [0004] Ponieważ ST ma stopień słodyczy wynoszący 300 razy więcej niż ten dla sacharozy, szeroko stosuje się go w przemyśle spożywczym jako naturalny środek słodzący. Jego słodycz jest względnie podobna do tej cukru, ale wiadomo, że w porównaniu z RA w ustach pozostawia nieprzyjemny smak goryczy. W porównaniu z tym RA ma dobrą jakość słodyczy ze stopniem słodyczy od 1,3 do 1,5 razy tego dla ST, więc na ogół pożądany jest środek słodzący ze stewii z wysokim stosunkiem zawartości RA niż ST. Twórcy niniejszego wynalazku przeprowadzili hodowlę roślin poprzez powtarzanie selektywnych zapłodnień krzyżowych odmian konwencjonalnych, w wyniku czego uzyskali wyłącznie odmiany stewii z bardzo małą 3

3 ilością ST w porównaniu z RA i opracowali środki słodzące z tych odmian (patrz na przykład Literatura patentowa 1). [0005] Jednak wśród smaków takich jak gorycz, cierpkość i łagodność dla języka łagodny smak jest dość delikatny. Ta delikatna łagodność nie zależy wyłącznie od stosunku między ST i RA. Gdy do struktury chemicznej różnych słodkich komponentów zawartych w stewii jest dodana glukoza, ulepsza się łagodny smak, dlatego opracowano sposób ulepszania łagodnego i mocnego smaku poprzez strukturalne dodanie glukozy do słodkich komponentów stewii (Literatura patentowa 2 i 3). [0006] Zatem nawet jeśli ilość zawartości jest mała, bardzo ważne jest przeanalizowanie nieznanych komponentów zawartych w stewii, w szczególności wychwycenie komponentów, w których glukoza jest strukturalnie dodana zamiast ST i z perspektywy kontroli jakości smaku niezwykle ważne jest przeprowadzenie dokładnego badania dodanej do nich strukturalnie glukozy. [0007] Jednocześnie ponieważ jakość smaku zależy od słodkich komponentów obecnych w samych roślinach stanowiących surowiec, ważne jest dokładne wychwycenie słodkich komponentów w celu uzyskania znakomitych odmian stewii i ich stosowania. Od teraz ulepszanie hodowli roślin stanowiących surowiec prawdopodobnie stanie się bardzo popularne, ale szczegółowe wychwycenie wyników ulepszania hodowli będzie możliwe poprzez staranne określenie słodkich komponentów zawartych w uzyskanych roślinach. [0008] Z drugiej strony twórcy niniejszego wynalazku opracowali sposób ustanawiania odmiany dla odmian roślinnych nowo uzyskanych za pomocą genów (Literatura patentowa 4 i 5), ale właściwie nie było żadnych sposobów na określenie roślin stanowiących surowiec pod kątem środka słodzącego wyekstrahowanego i przetworzonego z tych roślin stanowiących surowiec i produktów, w których znajdują zastosowanie. [0009] [Literatura patentowa 1] publikacja patentowa JP przedłożona w dzienniku [Literatura patentowa 2] publikacja patentowa JP w dzienniku 4

4 [Literatura patentowa 3] publikacja patentowa JP przedłożona w dzienniku [Literatura patentowa 4] publikacja patentowa JP przedłożona w dzienniku [Literatura patentowa 5] międzynarodowa publikacja patentowa w ramach Układu o Współpracy Patentowej - PCT WO06/ w dzienniku [0010] EP dotyczy rośliny należącej do odmiany Stevia rebaudiana Bertoni, która zawiera 4 części masowe lub więcej rebaudiozydu A względem jednej części masowej stewiozydu i umożliwia wytworzenie środka słodzącego o dobrej jakości. [0011] EP dotyczy mieszaniny smakowej obejmującej jedną lub większą liczbę substancji o słodkim smaku wybieranych z grupy substancji o słodkim smaku występujących naturalnie i ich fizjologicznie dopuszczalnych soli bez fyllodulcyny i jej fizjologicznie dopuszczalnych soli. Kobayashi et al. Phytochemistry, Pergamon Press, vol. 16, Styczeń 1977, strony dotyczy dulkozydów A i B, nowych diterpenowych glikozydów ze Stevia rebaudiana. [0012] Shintaro Kamiya et al, Agricultural and Biological Chemistry, Japan Soc. For Bioscience, Biotechnology and Agrochem, vol. 43, no. 9, 1 Stycznia 1979, strony dotyczy syntezy i smaku niektórych analogów stewiozydu. UJAWNIENIE WYNALAZKU PROBLEMY DO ROZWIĄZANIA [0013] Pięć komponentów słodzika ze stewii (ST, RA, rebaudiozyd A, dulkozyd A i biozyd stewiolowy) przeanalizowano i znormalizowano, ale brakowało wiedzy na temat innych nieznanych komponentów. Dodatkowo nie było możliwości potwierdzenia ich obecności nawet w przypadku już znanych słodkich komponentów, ponieważ nie było żadnego ustalonego sposobu analizy. Jednak ostatnio dla 7 komponentów z glikozydów stewiolowych ustanowiono standard JECFA, potwierdzono środki słodzące zawarte w stewii i stwierdzono nieznane komponenty, a także zwrócono uwagę na istotność znajomości wpływu delikatnego smaku z tych komponentów. [0014] Celem niniejszego wynalazku jest określenie struktury środków słodzących 5

5 zawartych w małej ilości w odmianie stewii i potwierdzenie ich wpływu na smak słodzika ze stewii. [0015] Ponadto innym celem jest zapewnianie środków do określania rośliny stewii, która stała się surowcem, pod kątem słodzika ze stewii i produktów, w których znajduje zastosowanie. [0016] Twórcy niniejszego wynalazku poszukiwali nowych glikozydów stewiolowych zawartych w odmianie stewii, których głównym komponentem jest RA i odkryli 10 komponentów stanowiących nowe glikozydy stewiolowe, które mogą mieć subtelny wpływ na jakość smaku. Następnie ukończyli niniejszy wynalazek poprzez odkrycie, że występuje różnica w objętości zawartości tych komponentów wśród odmian, a pewne komponenty występowały wyłącznie w określonych odmianach stewii, które miały RA jako swój główny komponent, po czym potwierdzono, że możliwe było stosowanie tego jako markera słodzików pochodzących z takich roślin. SKUTKI WYNALAZKU [0017] Glikozydy stewiolowe według niniejszego wynalazku mają struktury, w których dodanych jest więcej glukoz niż ST lub RA, a zatem zapewniają słodzik ze stewii mający znakomity mocny smak. [0018] Poza tym możliwe jest zakładanie pochodzenia surowca poprzez potwierdzenie glikozydu stewiolowego X w ekstrakcie lub kryształach, a analiza produktu końcowego pozwala oceniać czy roślina stanowiąca surowiec jest sprzeczna z prawami, takimi jak patentowe lub inne. (Najlepszy sposób wykonania wynalazku) [0019] Odmiana stewii z RA jako główny komponent wymieniona w niniejszym wynalazku jest odmianą, która ma większą zawartość RA niż ST, i opisano ją w zgłoszeniach patentowych JP i JP ; ekstrakt uzyskany z suchych liści ma większą zawartość RA niż ST, a także zawiera rebaudiozyd D (R-D), glikozyd stewiolowy III, V, VI, VII i X, dzięki czemu możliwe jest uzyskanie znakomitego słodzika o mocnym smaku, ponieważ zawiera komponent, w którym więcej jest strukturalnie dodanych glukoz niż ST i/lub RA. [0020] Dodatkowo za pomocą rekrystalizacji możliwe jest wydajne uzyskiwanie słodzika RA o wysokiej czystości, zawierającego śladowe ilości ST i glikozydu 6

6 stewiolowego X. [0021] Pierwszym przykładem wykonania niniejszego wynalazku jest glikozyd stewiolowy o wzorze od III do X, przy czym związki niepodlegające pod zastrzeżenia uznaje się za przykłady odniesienia przydatne dla zrozumienia wynalazku: gdzie R 1 i R 2 oznaczają łańcuch cukrowy zdefiniowany w następującej tabeli; Nr (glikozyd stewiolowy) R 1 R 2 III (rebaudiozyd I) B-glc-B-glc(3 1) IV (rebaudiozyd H) B-glc V (rebaudiozyd L) B-glc VI (rebaudiozyd K) Bglc-B-glc(2 1) 7

7 VII (rebaudiozyd J) B-glc-α-rha(2 1) VIII (rebaudiozyd M) IX (rebaudiozyd N) X (rebaudiozyd O) [0022] Symbole we wzorach stanowią poniższe cukry: glc: D-glukopiranozyl rha: L-ramnopiranozyl xyl: ksylopiranozyl [0023] Ekstrakt zawierający glikozyd stewiolowy X (rebaudiozyd O) można uzyskiwać poprzez ekstrakcję, wodą lub rozpuszczalnikiem zawierającym wodę, całej rośliny Stevia Rebaudiana Bertoni, rośliny z rodziny Asteraceae, lub jej suchych liści, której głównym komponentem jest rebaudiozyd A. [0024] Sposób uzyskiwania rebaudiozydu A o wysokiej czystości zawierającego glikozyd stewiolowy X (rebaudiozyd O) można zapewnić poprzez rekrystalizację wyżej wymienionego ekstraktu. [0025] Można zapewniać sposób wytwarzania produktów żywnościowych, w którym ekstrakt z powyższego ekstraktu dodaje się do żywności w ilości równej lub mniejszej niż 1% żywności. [0026] Można zapewniać sposób wytwarzania produktów żywnościowych, w którym 8

8 rebaudiozyd A o wysokiej czystości, uzyskany według powyższego sposobu, dodaje się do żywności w ilości równej lub mniejszej niż 1% żywności. [0027] W ekstrakcie uzyskanym z surowca będącego odmianą, której głównym komponentem jest ST, nie występuje glikozyd stewiolowy X, ale ponieważ ekstrakt uzyskany z surowców będących odmianami, których głównym komponentem jest RA, ma glikozyd X, możliwa jest ocena odmiany będącej surowcem w oparciu o to, czy głównym komponentem jest ST czy RA. Czyli potwierdzenie odmian będących surowcami jest możliwe, ponieważ glikozyd X nie występuje w ekstrakcie zawierającym RA jako główny komponent, który uzyskuje się poprzez usuwanie ST za pomocą krystalizacji z ekstraktu uzyskanego z odmian zawierających ST jako główny komponent, lub w produktach o wysokiej czystości uzyskanych z ich rekrystalizacji. Szóstym przykładem wykonania niniejszego wynalazku jest sposób potwierdzania odmian stewii za pomocą glikozydu stewiolowego X. [0028] Sposób analizy glikozydów stewiolowych III-X można zapewnić poprzez wysokosprawną chromatografię cieczową (dalej HPLC). [0029] W celu realizacji tych celów twórcy niniejszego wynalazku szeroko przebadali słodkie komponenty zawarte w odmianach, których głównym komponentem jest RA i odmianach ze zgłoszeń JP i JP , znaleźli nowe słodkie komponenty i określili ich strukturę chemiczną. Dodatkowo potwierdzili oni przydatność tych komponentów jako środków słodzących i za pomocą tych odmian opracowali sposób analizy i sposób potwierdzania odmian. [0030] Potwierdzenie nowych komponentów przeprowadzono za pomocą ekstrakcji wodą lub rozpuszczalnikiem zawierającym wodę, odmian, których głównym komponentem był RA, jak w Przykładzie 1 (dalej nazywane Odmianą A), i suchych liści ze zgłoszeń JP (dalej nazywane Odmianą B) i (dalej nazywane Odmianą C). [0031] Następnie, roztwór ekstraktu bezpośrednio zatęża się lub, jeśli to konieczne, za pomocą żywicy jonowymiennej lub żywicy kationowymiennej, lub węgla aktywnego usuwa się zanieczyszczenia jonowe, słodkie komponenty pozostawia się do zaabsorbowania przez żywicę absorpcyjną, po czym następuje elucja hydrofilowym rozpuszczalnikiem i, jeśli to konieczne, elucję zatęża się i osusza, a eluat ponownie traktuje się za pomocą żywicy jonowymiennej lub żywicy 9

9 kationowymiennej, lub węgla aktywnego i tak uzyskany ekstrakt lub ekstrakt uzyskany za pomocą odpowiednich sposobów oczyszczania w konwencjonalnej technice, takich jak odbarwianie, można potwierdzić. [0032] Glikozydy stewiolowe z ekstraktu RA-C uzyskanego w Przykładzie 1(1) opisanym poniżej rozdzielono i przeanalizowano za pomocą urządzenia do wysokosprawnej chromatografii cieczowej spektrometrii masowej (HPLC-MS) według Przykładu 5 i określono strukturę każdego glikozydu I-X: gdzie R 1 i R 2 odpowiednio oznaczają atom wodoru i wymieniony wcześniej łańcuch cukrowy. [0033] Glikozyd stewiolowy I (dulkozyd B) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 788, jak potwierdzono na Figurze 1 przez chromatograficzny czas retencji (dalej R.T.) w HPLC wynoszący około 13 minut. [0034] Glikozyd stewiolowy II (rebaudiozyd G) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 804, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 15 minut. [0035] Glikozyd stewiolowy III (rebaudiozyd I) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1128, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 28 minut. [0036] Glikozyd stewiolowy IV (rebaudiozyd H) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1112, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 29 minut. [0037] Glikozyd stewiolowy V (rebaudiozyd L) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1128, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 34 minuty. Glikozyd stewiolowy VI (rebaudiozyd K) jest 10

10 glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1112, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 34 minuty. [0038] Glikozyd stewiolowy VII (rebaudiozyd J) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1112, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 34 minuty. [0039] Glikozyd stewiolowy VIII (rebaudiozyd M) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1290, jak potwierdzono na Figurze 1 poprzez duplikowanie rebaudiozydu D przez R.T. w HPLC przez około 34 minuty. [0040] Glikozyd stewiolowy IX (rebaudiozyd N) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1274, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 43 minuty. [0041] Glikozyd stewiolowy X (rebaudiozyd O) jest glikozydem o strukturze mającej masę cząsteczkową wynoszącą 1436, jak potwierdzono na Figurze 1 przez R.T. w HPLC wynoszący około 51 minut. [0042] Jednak znawca dziedziny zrozumie, że R.T. podany powyżej z analizy wykorzystującej elucję gradientową jest zmienny. [0043] Jak wspomniano powyżej, zapewnia to ważną informację dla identyfikacji odmiany będącej surowcem w zależności od tego czy glikozyd stewiolowy X występuje w produkcie końcowym czy nie. [0044] Jednocześnie ponieważ możliwe jest potwierdzanie tych glikozydów stewiolowych za pomocą HPLC, nawet w przypadku gdy stosuje się je jako środki słodzące, za pomocą analizy HPLC można z łatwością całkowicie kontrolować jakość i smak. [0045] Uzyskany ekstrakt lub kryształy można stosować jako środek słodzący w cukierkach, żelkach, napojach w proszku, makaronach instant, dżemach, mrożonych owocach, gumach do żucia, japońskich słodyczach, zdrowej żywności, czekoladzie, słodzikach stołowych, smażonych słodyczach, przysmakach, żywności gotowanej w wodzie, fermentowanym napoju mlecznym, napojach kawowych, napojach kakaowych, napojach herbacianych, likierach, winach, sorbetach, płatkach śniadaniowych, żywności z warzyw zawierających błonnik, sosach, sosie sojowym, paście sojowej, octach, dressingach, majonezach, ketchupach, curry, zupach, 11

11 słodyczach ryżowych, Arare, chlebach, biszkoptach, krakersach, ciastach naleśnikowych w proszku, owocach puszkowanych, warzywach puszkowanych, produktach mięsnych, produktach przygotowanych z pasty z gotowanej ryby, żywności słonej, marynatach, mieszankach przypraw, żywności luksusowej, kosmetykach itd. co skutkuje między innymi zmniejszeniem ilości kalorii, redukcją sacharozy, obniżeniem temperatury topnienia, ulepszeniem jakości w słodyczy i efektu maskującego, przy czym można również dodawać go do innych naturalnych lub sztucznych słodzików i rozpuszczalników. PRZYKŁADY Przykład 1 Wytwarzanie ekstraktu RA (1) Ekstrakt [0046] 100 g suchych liści uzyskanych z odmian A, B lub C, których głównym komponentem jest RA, ekstrahowano kilkukrotnie 20-krotną ilością wody względem masy, dopóki nie dało się wyczuć słodyczy. Ekstrakt przepuszczono przez kolumnę wypełnioną 300 ml żywicy absorpcyjnej (Diaion HP-20) i słodkie komponenty ekstraktu były absorbowane przez żywicę, którą w wystarczającym stopniu przemyto wodą, a komponenty eluowano 900 ml metanolu. Eluat przepuszczono przez kolumnę wypełnioną 200 ml żywicy jonowymiennej (Diaion WA-30), do eluatu dodano 10 g węgla aktywnego i mieszano. Mieszaninę przefiltrowano, filtrat zatężono, a pozostałość osuszono dla uzyskania odpowiednio 13,0 g ekstraktu RA-A, którego głównym komponentem jest jasnożółty rebaudiozyd A (ST 35,4%, RA 41,7% i RC 9,8%), 11,5 g ekstraktu RA-B (ST 19,5%, RA 58,1% i RC 8,8%) i 12 g ekstraktu RA-C (ST 5,4%, RA 72,3% i RC 8,1%). (2) Rekrystalizacja RA [0047] Każde 5 g z wyżej wymienionego ekstraktu RA-B i ekstraktu RA-C rozpuszczono w 10-krotności masy 90% metanolu przy ogrzewaniu i pozostawiono w 4 C na sześć dni. Uzyskane kryształy rozdzielono, przemyto zimnym metanolem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem dla uzyskania odpowiednio 3,9 g białych kryształów RA-B (ST 0,2%, RA 95,0% i RC 0,2%) i 4,5 g kryształów RA-C (ST 0,2%, RA 95,6% i RC 0,1%). Przykład 2 Wytwarzanie ekstraktu ST 12

12 [0048] Dla celów porównania tę samą procedurę przeprowadzono dla odmiany, której głównym komponentem jest ST, dla uzyskania 11,3 g ekstraktu ST (ST 51,9%, RA 23,7% i RC 7,4%). Przykład 3 Ciecz macierzysta RA-A, ciecz macierzysta ST [0049] Każde 10 g z wyżej wymienionego ekstraktu RA-A i ekstraktu ST rozpuszczono w 10-krotności masy 90% metanolu przy ogrzewaniu i pozostawiono w 4 C na sześć dni. Uzyskane kryształy rozdzielono, przemyto zimnym 98% metanolem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem dla uzyskania odpowiednio 2,1 g kryształów RA-ST, które są białymi kryształami stewiozydu, i 3,8 g kryształów ST- ST. [0050] Każde 8,8 g odpowiednio cieczy macierzystej RA-A (ST 15,7%, RA 43,8% i RC 6,9%) i 6,1 g cieczy macierzystej ST (ST 20,0%, RA 37,1% i RC 11,2%), których głównym komponentem jest RA, zatęża się i osusza dla uzyskania proszku z cieczy macierzystej, którego głównym komponentem był bladożółty RA. Przykład 4 Kryształy RA-A, kryształy ST-RA [0051] Każdy z proszków z cieczy macierzystej z Przykładu 3 rozpuszczono w 10- krotności masy 90% metanolu przy ogrzewaniu i pozostawiono w 4 C na sześć dni. Uzyskane kryształy rozdzielono, przemyto zimnym 98% metanolem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem dla uzyskania odpowiednio 2,2 g białych kryształów RA-A (ST 1,6%, RA 90,4% i RC 1,4%) i 1,2 g kryształów ST-RA (ST 1,6%, RA 96,9% i RC 1,4%). Przykład 5 Określenie struktury glikozydów stewiolowych [0052] Jak opisano poniżej, analizę przeprowadzono poprzez zastosowanie HPLC. Rozdzielenie glikozydów stewiolowych zawartych w każdym ekstrakcie przeprowadzono poprzez stosowanie Shimazu LC-10Advp HPLC z wykorzystaniem kolumny TSKgel Amide-80 (4,6 x 250 mm Tosoh). Jako rozpuszczalnik zastosowano acetonitryl-wodę i przeprowadzono elucję gradientową, w której stosunek acetonitryl:woda zmieniał się z 82:18 do 66:34 w ciągu 60 minut. Szybkość przepływu wynosiła 0,65 ml/min, temperatura kolumny wynosiła 40 C, a detekcję przeprowadzono przy absorpcji w ultrafiolecie wynoszącej 210 nm. [0053] Do pomiaru masy cząsteczkowej zastosowano Waters Alliance HPLC System 13

13 2695 i spektrometr masowy Waters Quattro Micro (potrójny kwadrupolowy masowy) wyposażony w elektrosprej do jonizacji (ESI). W HPLC kolumną była TSKgel Amide- 80 (2,0 x 250 mm, Tosoh), jako rozpuszczalnik zastosowano acetonitryl-wodę i przeprowadzono elucję gradientową, w której stosunek acetonitryl:woda zmieniał się z 82:18 do 66:34 w ciągu 60 minut. Szybkość przepływu wynosiła 0,2 ml/min, temperatura kolumny wynosiła 40 C. Jako gaz desolwatacyjny zastosowano gazowy azot, a jako gaz kolizyjny zastosowano gazowy argon. W analizie glikozydów stewiolowych w trybie ujemnym zastosowano napięcie na kapilarze wynoszące 15,0 kv, a w analizie ABEE-oligosacharydów w trybie dodatnim zastosowano 13,5 kv. W trakcie analizy MS/MS jako napięcie na stożku i napięcie kolizyjne zastosowano napięcie wynoszące od 10 V do 80 V. Temperatura źródła i temperatura desolwatacyjna wynosiły odpowiednio 100 C i 400 C, a objętość przepływu gazu przez stożek i gazu desolwatacyjnego wynosiła odpowiednio 50 l/godz. i 900 l/godz. [0054] Wyniki analizy HPLC dla każdego ekstraktu i kryształów zilustrowano na Figurach od [0055] Wyniki analizy dla każdego chromatograficznego piku przedstawionego na Figurach od 2-10 przedstawiono w poniższych Tabelach od 1-9. [Tabela 1] - Kryształy RA-A CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 4, ,2192 Stev mono 2 8, , ,0642 Rubuso 4 10, , , ,4726 Rebau B ,8535 Stev 8 18, ,1379 Rebau C 9 19, ,7400 Rebau F 10 23, ,9772 Rebau A 14

14 11 28, ,1541 Rebau E+III+IV 12 34, ,1869 V+VI+VII 13 35, V 0,8895 Rebau D+VIII 14 37, , ,2195 IX 16 51, ,0854 X TOT ,0000 [Tabela 2] - Kryształy RA-B CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , V 3 2, , , ,8021 I 6 14, ,4539 Rebau B 7 16, , , V 0,2891 Stev 10 18, , V 0,2348 Rebau C 12 20, ,6240 Rebau F 13 23, ,9097 Rebau A 14 27, , ,1663 III + Rebau E+IV 16 31, ,

15 17 35, ,2484 Rebau D+V+VI+VII 18 37, , ,1301 IX 20 51, ,0552 X TOT ,0000 [Tabela 3] - Kryształy RA-C CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , , , ,6822 Rubuso 5 14, ,1457 Rebau B 6 16, ,1642 Stev 7 18, ,0853 Rebau C 8 19, ,4211 Rebau F 9 22, ,1825 Rebau A 10 34, ,1477 V+VI+Rebau D+VII+VIII 11 36, , , ,0609 IX 13 50, ,0127 X TOT ,0000 [Tabela 4] - Ekstrakt RA-A 16

16 CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , , V 4 4, V 5 4, V 6 4, V 1,3702 Stev mono 7 5, V 8 6, V 9 6, V 10 7, V 11 7, V 0,7699 Stev bio 12 8, V 13 8, V 14 9, V 1,5208 Rubuso 15 10, V 16 10, V 17 12, ,9229 Dulco A 18 13, V 0,1861 I 19 14, ,6931 Rebau B 20 16, ,7133 Stev 21 18, V 9,9554 Rebau C 22 20, V 1,8980 Rebau F 23 22, , ,1931 Rebau A 25 26,

17 26 28, , , V 0,0881 III + Rebau E 28 30, V 0,4285 IV 29 33, ,1563 V+VI+VII 30 35, ,7458 Rebau D+VIII 31 42, ,2278 IX 32 51, ,0515 X TOT ,0000 [Tabela 5] - Ekstrakt RA-B CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , , , V 5 4, V 3,2793 Stev mono 6 5, V 7 6, V 8 7, V 0,3964 Stev bio 9 7, V 10 8, V 11 8, V 12 9, V 0,4751 Rubuso 13 9, V 14 10, V 15 12,

18 16 12, V 0,5187 Dulco A 17 13, V 0,7239 I 18 15, ,8928 II 19 17, ,2115 Stev 20 19, V 9,1836 Rebau C 21 20, V 1,6322 Rebau F 22 23, S 54,9446 Rebau A 23 26, T 24 29, , V 26 30, V 0,2574 Rebau E+III+IV 27 32, , , V 0,2454 V+VI+VII 30 36, V 0,8839 Rebau D+VIII 31 37, , ,2677 IX 33 51, ,0877 X TOT ,0000 [Tabela 6] - Ekstrakt RA-C CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , , , , V 19

19 6 4, V 0,8853 Stev mono 7 5, V 8 6, V 9 8, , V 11 9, , V 0,5673 Rubuso 13 10, V 14 11, , V 0,1506 Dulco A 16 14, ,1024 Rebau B 17 16, V 7,1167 Stev 18 19, ,6852 Rebau C 19 20, V 1,6256 Rebau F 20 23, ,4290 Rebau A 21 26, , , V 0,2606 Rebau E 24 30, V 0,0701 III+IV 25 32, , , V 0,3286 V 27 34, V 0,6092 VI+VII 28 35, V 1,3346 Rebau D+VIII 29 42, ,5360 IX 30 51, ,2987 X TOT ,

20 [Tabela 7] - Ekstrakt ST CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , , V 4 3, V 5 4, V 6 4, V 7 4, V 3,2613 Stev mono 8 5, V 9 6, V 10 6, V 11 6, V 12 7, V 4,8701 Stev bio 13 8, V 14 9, V 1,6194 Rubuso 15 10, V 16 10, V 17 12, ,3017 Dulco A 18 13, V 0,5254 I 19 14, V 20 14, V 0,7483 Rebau B 21 15, V 0,2512 II 22 16, SV 55,9165 Stev 23 18, T 24 18, V 6,2969 Rebau C 21

21 25 20, V 1,2830 Rebau F 26 22, , SV 21,8246 Rebau A 28 26, T 29 30, ,4980 Rebau E+III+IV 30 34, ,1581 V+VI+VII 31 35, V 0,3841 Rebau D+VIII 32 42, ,0616 IX TOT ,0000 [Tabela 8] - Kryształy ST-ST CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , , , ,7198 Rubuso 5 13, ,1723 I 6 16, S 95,2514 Stev 7 19, T 0,0353 C 8 21, ,0770 Rebau F 9 23, V 3,4615 A 10 26, , ,2827 Rebau E+III+IV TOT ,

22 [Tabela 9] - Kryształy ST-RA CH PKNO T A H MK IDNO CONC N 1 1 2, , , , ,4290 Rebau B 5 15, , ,2248 Stev 7 18, ,1393 Rebau C 8 20, ,2981 Rebau F 9 23, ,4203 Rebau A 10 28, ,1713 Rebau E+III+IV 11 33, ,1445 V+VI+VII 12 35, ,1289 Rebau D+VIII 13 42, ,0437 IX TOT ,0000 [0056] Skróty stosowane w tabelach powyżej są następujące: PKNO: numer piku T: czas (minuty) A: pole piku H: wysokość piku CONC: stężenie (%) N: nazwa glikozydu TOT Stev mono: łącznie monozyd stewiolowy 23

23 Stev bio: Rebuso: Rebau: Stev: Dulco: biozyd stewiolowy rubuzozyd rebaudiozyd stewiozyd dulkozyd [0057] Stężenie oblicza się z całkowitego pola widma absorpcji w ultrafiolecie przy 210 nm i konieczne jest skorygowanie masy cząsteczkowej w celu zmierzenia zawartej objętości. Wykresy chromatograficzne od I do X wskazują nowe glikozydy stewiolowe od I do X. Przykład 6 Ocena jakości smaku [0058] 10 osób zaznajomionych z testem sensorycznym z wykorzystaniem stewii oceniło 0,05% roztworu wodnego każdego ekstraktu i 0,03% roztworu wodnego kryształów, a wyniki uśrednionej oceny przedstawiono w Tabeli 10 poniżej: Ocena 5: znakomity, 4: dobry, 3: zwyczajny, 2: zły, 1: najgorszy [Tabela 10] Przedmiot testu sensorycznego 1) 2) 3) 4) 5) 6) Ekstrakt RA-A 4,1 3,8 4,1 4,9 3,4 3,8 Kryształy RA-A 5,0 4,9 4,9 3,2 4,9 4,9 Ekstrakt RA-B 4,2 3,8 4,1 4,9 3,5 3,7 Kryształy RA-B 5,0 5,0 4,9 3,5 4,9 4,9 Ekstrakt RA-C 4,2 4,0 4,5 4,8 3,5 3,8 Kryształy RA-C 5,0 5,0 5,0 3,8 5,0 5,0 Ekstrakt ST 1,2 1,3 1,2 4,0 2,0 2,0 Kryształy ST-RA 4,8 4,6 4,6 3,0 4,8 4,3 24

24 1) Jakość słodyczy 2) Smak pozostający w ustach 3) Cierpkość 4) Delikatny smak 5) Uczucie orzeźwienia 6) Tracenie słodyczy [0059] Trzy rodzaje ekstraktów RA zawierających glikozydy stewiolowe od II do X (rebaudiozydy od G do O) są znakomite pod względem delikatnego smaku w porównaniu z trzema rodzajami kryształów RA, natomiast kryształy RA są znakomite pod względem innych ocen. Poza oceną delikatnego smaku ekstrakt ST jest gorszy od kryształów ST-RA. Na podstawie tego wyniku zweryfikowano, że glikozydy stewiolowe od II do X wpływają na delikatny smak. Przykład 7 Określanie odmiany [0060] Według analizy HPLC każdego ekstraktu i/lub kryształów ekstrakt uzyskany z odmian zawierających RA jako główny komponent (tu Odmiana RA) zawiera więcej rebaudiozydu D, a także zawiera glikozyd stewiolowy X (rebaudiozyd O), w porównaniu z ekstraktem uzyskanym z odmian zawierających ST jako główny komponent (tu Odmiana ST). Dalej stwierdzono, że glikozyd stewiolowy X jest również zawarty w kryształach RA uzyskanych za pomocą oczyszczania ekstraktu z odmian RA, chociaż w ilości śladowej. [0061] Z drugiej strony glikozyd stewiolowy X nie występuje w ekstrakcie uzyskanym z odmian ST. Oczywiście glikozyd stewiolowy X nie występuje w kryształach ST-RA uzyskanych z odmian ST, a zatem jeśli stwierdza się obecność glikozydu stewiolowego X, możliwe jest potwierdzenie, że ekstrakt lub kryształy uzyskano z odmiany RA. Przykład 8 Sposób analizy glikozydu stewiolowego [0062] Według warunków HPLC opisanych w Przykładzie 5 możliwe jest 25

25 potwierdzenie każdego glikozydu stewiolowego od I-X. Zasadniczo możliwe jest potwierdzanie obecności glikozydu stewiolowego na podstawie R.T. na wykresie analizy HPLC, ale każdy glikozyd stewiolowy od I-X można potwierdzić poprzez zmierzenie masy cząsteczkowej po preparatywnej izolacji każdego glikozydu. Przykład 9 Cukier stołowy [0063] 1) Cukier stołowy otrzymano poprzez zmieszanie 1 g kryształów RA-A i 99 g cukru pudru. 2) Cukier stołowy otrzymano poprzez zmieszanie 1 g kryształów RA-B i 99 g erytrytolu. 3) Cukier stołowy otrzymano poprzez zmieszanie 1 g kryształów RA-C i 99 g wysokofruktozowego syropu kukurydzianego. Przykład 10 Cukierki [0064] Cukierki otrzymano z 0,3 g ekstraktu RA-C, 100 g Palatinitu i odpowiedniej objętości przypraw. Przykład 11 Mleczne żelki [0065] Mleczne żelki otrzymano z 15 g cukru, 0,08 g ekstraktu RA-B, 250 g mleka, 5 g żelatyny i odpowiedniej objętości aromatu mleka. Przykład 12 Napoje sportowe [0066] Napój sportowy otrzymano z 0,075% kryształów RA-B, 0,11% mleczanu wapnia, 0,045% kwasu cytrynowego, 0,03% cytrynianu trisodowego, 0,015% chlorku magnezu, 0,0055% kwasu glutaminowego i 99,72% wody. Przykład 13 Napoje gazowane [0067] Napój gazowany otrzymano poprzez dodanie 0,012% kryształów RA-B, 8,4% fruktozy, 0,6% kwasu cytrynowego, 0,12% argininy, 0,1% inozytolu, 0,0025% kofeiny, 26

26 0,0034% pantotenianu wapnia, 0,003% niacynamidu, 0,002% witaminy B6, 0,00009% witaminy B2, 0,000002% witaminy B12 i odpowiednich objętości przypraw i wody do dopełnienia 100% wszystkich składników, a następnie wprowadzenie gazu w postaci dwutlenku węgla. ZASTOSOWANIE PRZEMYSŁOWE [0068] Za pomocą analizy HPLC nowych glikozydów stewiolowych zapewnianych przez niniejszy wynalazek możliwe jest wytwarzanie słodzików i innych produktów żywnościowych o pewnym stopniu i jakości słodyczy i delikatnym smaku. Ponadto umożliwia on określenie odmian będących surowcami i wynalazek jest przydatny do oceny poprawności wskazania pochodzenia, obszaru hodowli odmian stewii lub naruszenia prawa. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0069] [Fig. 1] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla ekstraktu RA-C. [Fig. 2] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla kryształów RA-A. [Fig. 3] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla kryształów RA-B. [Fig. 4] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla kryształów RA-C. [Fig. 5] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla ekstraktu RA-A. [Fig. 6] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla ekstraktu RA-B. [Fig. 7] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla ekstraktu RA-C. [Fig. 8] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla ekstraktu ST. [Fig. 9] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla kryształów ST-ST. [Fig. 10] Przedstawiono na niej wykres analizy HPLC dla kryształów ST-RA. 27

27 Zastrzeżenia patentowe 1. Glikozyd stewiolowy o wzorze III, VII, VIII, IX i X: gdzie R 1 i R 2 oznaczają łańcuch cukrowy zdefiniowany w następującej tabeli; Nr R 1 R 2 III B-glc-B-glc(3 1) VII B-glc-α-rha(2 1) VIII IX X 2. Glikozyd stewiolowy o wzorze III według zastrzeżenia 1. 28

28 3. Glikozyd stewiolowy o wzorze VII według zastrzeżenia Glikozyd stewiolowy o wzorze VIII według zastrzeżenia Glikozyd stewiolowy o wzorze IX według zastrzeżenia Glikozyd stewiolowy o wzorze X według zastrzeżenia 1. 29

29 30

30 31

31 32

32 33

33 34

34 35

35 36

36 37

37 38

38 39

39 WCZEŚNIEJSZE PUBLIKACJE WYMIENIONE W OPISIE Niniejsza lista publikacji przywołanych przez Zgłaszającego przygotowana jest wyłącznie dla wygody czytelników. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Chociaż dołożono wielkiej staranności przy układaniu listy przywołanych publikacji, nie można wykluczyć błędów lub pominięć, a Europejski Urząd Patentowy uchyla się od wszelkiej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe wymienione w tym opisie JP A [0009] JP B [0009] JP A [0009] JP A [0009] WO A [0009] EP A [0010] EP A [0011] JP A [0019] [0029] 0030] JP A [0019] [0029] Literatura nie patentowa wymienione w tym opisie KOBAYASHI et al. Phytochemistry. Pergamon Press, Styczeń 1977, vol. 16, [0011] SHINTARO KAMIYA et al. Agricultural and Biological Chemistry, Japan Soc. For Bioscience, Biotechnologyand Agrochem, 01 Stycznia 1979, vol. 43 (9), [0012] 40