Rok XXXIX, Nr l Streszczenie

Transkrypt

1 PSZCZELNICZE ZESZYTY NAUKOWE Rok XXXIX, Nr l 1995 IZOLACJA I IDENTYFIKACJA BAKTERII WYWOŁUJĄCYCH POSOCZNICE U PSZCZÓŁ Z d Z i S ł a w G I i ń s k i, M a rek C h m i e I e w s k i, L a s s i K a u k 0* Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych Zwierząt Akademii Rolniczej, ul. Akademicka 12, Lublin *27840 Kakkuri, FINLANDIA Streszczenie Hafnia alvei, drobnoustrój dotychczas izolowany z przypadków wtórnych zakażeń bakteryjnych czerwia i pszczół, może również wywoływać samoistne choroby a zwłaszcza posocznice. Masowe zachorowania i osypywanie się rodzin pszczelich w Finlandii spowodowało badania nad ustaleniem czynnika etiologicznego choroby i określeniem jego właściwości biologicznych. Na podstawie badań wirusologicznych, bakteriologicznych, mikologicznych, parazytologicznych, toksykologicznych i przeprowadzenia testów biochemicznych, wyizolowany drobnoustrój zidentyfikowano jako Hafnia alvei. Określono też wrażliwość wyosobnionych szczepów na antybiotyki. Słowa kluczowe: Hafnia alvei, Apis mellifera, posocznice. WSTĘP Chorobotwórczość entomopatogennych bakterii jest wyrazem zależności oraz wzajemnego oddziaływania bakterii i owada. Drobnoustroje warunkowo chorobotwórcze, które występują ubikwitarnie w środowisku bytowania pszczoły miodnej, nie tylko posiadają właściwość wikłania wielu chorób zakaźnych i pasożytniczych czerwia i pszczół, ale mogą też same wywoływać choroby, zwłaszcza posocznicę. Ostatnio coraz większą rolę przypisuje się posocznicy, wywołanej przez Hafnia alvei (A I b i s e t t i, B r i z a r d 1982). Drobnoustrój ten występuje w organizmie zdrowych ludzi, zwierząt domowych i ptaków, a także zanieczyszcza środowisko, zwłaszcza glebę i wodę. Ścieki, woda, gleba i rośliny mogą stanowić źródło zakażenia dla rodziny pszczelej. Występowanie masowych zachorowań i padanie rodzin pszczelich na terenie Finlandii w pierwszej połowie 1993 roku zaowocowało badaniami nad ustaleniem przyczyny choroby, właściwości biologicznych oraz wrażliwości na leki czynnika etiologicznego. 107

2 MATERIAŁ I METODY Zachorowania wystąpiły w dwu pasiekach liczących 190 rodzin (pasieka A - 130, pasieka B - 60). Ogółem padło 100 rodzin (80 w pasiece A i 20 w pasiece B). Spośród 50 rodzin Apis mellifera ligustica padło 49, z 20 Buckfast -10, ze 120 Apis mellifera carnica Pierwsze zachorowania i padnięcia wystąpiły u A.m.ligustica i Buckfast. Arn.carnica chorowały i padały na początku maja. Na czoło objawów chorobowych wysuwało się osłabienie i utrata zdolności lotnych pszczół. Chore pszczoły o rozdętych odwłokach, wymazane kałem koloru ciemnobrązowego i konsystencji kleistej, pełzały na ziemi przed ulem i po dennicy. W rodzinach, w których zachorowania wystąpiły najwcześniej, plamy kału występowały na plastrach, wewnętrznych ściankach ula i na deseczce wylotowej. Rodziny, które przeżyły, były silnie osłabione i nie wyrównały ubytków pszczół. Do badań bakteriologicznych, mikologicznych i toksykologicznych wykorzystano pszczoły pochodzące z rodzin chorych i zamarłych, miód z zapasów zimowych oraz zapasy miodu w plastrach zebrane wiosna i latem 1993 r., z chorych i padłych rodzin. W badaniach wirusologicznych i parazytologicznych wykorzystano padłe pszczoły. Schemat badań podano w tabeli 1. Tabela 1 Schemat badań materiału patologicznego oraz miodu Scheme of the examination of biological rnaterials and honey Rodzaj badania - Sort of examinations Materia! Material.s Bakteriolog. Wirusolog. Mykologiczne Parazytolog. Toksykolog. Bacteriologie Virologic Mycolog ic Perasitologic Tcxyco log ic Hemolimfa.. Haemoliph Micśnie tułowi Thoracal muscles Przewód pokarmowy Alimentary Inlct Główki pszczół Heeds Miód - Honey... l - Barwienie negatywne solami złota lub kwasem fosforowolframowym Negative staining with gold ar phosphotungstic acid 2 - SDA + y 28 C i 35 C 3 - Nosema apis, Acarapis woodi, Malpighamoeba mellificae 4 - HPLC - insektycydy fosforoorganiczne, karbaminiany, dwunitrofenole, pest. formamidynowe Phosphoroorganic insecticides, carbamates, dinitroalilophenols, fonnamidins. 108

3 Badania mikrobiologiczne. Treść przewodu pokarmowego, homogenat mięśni pszczół (PBS l: l) i miód rozcieńczony jałowym PBS (1 :5) posiewano na agar z dodatkiem 5% krwi owczej oraz na agar SS. Posiewy inkubowano w 25 i 35 C w warunkach tlenowych. Wyrosłe po 24 godzinach kolonie pałeczek Gram ujemnych zakwalifikowano w oparciu o test API 20 E do rodzaju Hafnia. Przynależność gatunkową wyizolowanego drobnoustroju określono w oparciu o charakterystyczne dla tego gatunku cechy biochemiczne. W badaniach uwzględniono charakterystykę wzrostu na podłożu Simmondsa, odczyn Voges- Proskauera (inkubacja w 22 i 35 C), wytwarzanie ureazy, H 2 S, lipazy i DRNazy, hydrolizę żelatyny, dekarboksylację lizyny i ornityny, wzrost na podłożu Moellera, fermentację cukrów prostych i wielocukrów (E d war d s, E w i n g 1962; M a r t i g n o n i, S t e i n h a u s 1961). Wrażliwość na antybiotyki określono metodą krążkową na podłożu Grove RandalIa (Manuał ). Badania mikologiczne. Treść przewodu pokarmowego pszczół robotnic i próbki miodu (rozcieńczenie PBS l :5) posiewano na agar Sabourauda z wyciągiem drożdżowym i glukozą i inkubowano w 28 i 35 C. Właściwości morfologiczne i biochemiczne wyizolowanych szczepów drożdży oznaczono wg Wickerham (W i c ker h a m 1951). Badania wirusologiczne. Homogenaty sporządzone z głów pszczół, po wybarwieniu negatywnym kwasem fosfowolfrarnowyrn oglądano w mikroskopie elektronowym (powiększenie 40 i 60 tys.) na obecność wirlonów (B a I I 1985, S m i t h 1976). Badania parazytologiczne. Badanie na obecność zarodników Nosema apis, form rozwojowych i imago Acarapis woodi przeprowadzono wg zaleceń OlE (l O), zaś na obecność Malpighamoeba mellificae wg Giordani (G i o r - d a n i 1952). Badania toksykologiczne w kierunku zatruć węglowodorami chlorowanymi, insektycydami fosforoorganicznymi i karbaminianami wykonano z homogenatu tkanek pszczół i z miodem wg Davisa (D a v i s 1989) oraz Anderson i Wojtas (A n d e r s o n, Woj t a s 1968). WYNIKI Z treści przewodu pokarmowego i homogenatów tkanek pszczół wyizolowano na agarze drobne, 2-4 mm, połyskujące, przezroczyste, o całym brzegu, zabarwione na szaro kolonie Gram ujemnych pałeczek (1,00 mm x 1,3-3,0 mm). Bakterie nie wytwarzały otoczek. Identyczne bakterie izolowano z zapasów miodu w plastrach. Na podstawie testów biochemicznych wyizolowany drobnoustrój zidentyfikowano jako Hafnia alvei. 109

4 Opr6cz H. alvei z treści przewodu pokarmowego i z zapas6w miodu izolowano drożdże, kt6re na podstawie badań morfologicznych, hodowlanych i biochemicznych zidentyfikowano jako Candida albicans. Spory Nosema apis występowały w treści przewodu pokarmowego pszcz6ł, przy czym nasilenie inwazji było średnie (Manuał ). Badania parazytologiczne na obecność Malpighamoeba mellijicae i Acarapis woodi wypadły ujemnie. Badania przeprowadzone w pasiece nie wykazały obecności Varroajacobsoni. Stosując metodę chromatografii HPLC w tkankach padłych pszcz6ł i w zapasach miodu nie wykryto obecności węglowodorów chlorowanych, karbaminian6w i insektycyd6w fosforoorganicznych - co pozwala na wykluczenie możliwości masowego zatrucia pszcz6ł chemicznymi środkami ochrony roślin. Wrażliwość wyosobnionych szczepów H.alvei na antybiotyki podano w tabeli 2. Tabela 2 Antybiogram izolatów Hafnia alvei Antibiotic sensitivity paterns of the Hafnia alvei isolates AMPICILINA - BACYTRACYNA - CEFALOTYNA - ERYTROMYCYNA - KOLIMYCYNA + LINKOMYCYNA - NEOMYCYNA - OKSACYKLINA - PENICYLINA G - KARBENICYLINA +++ STREPTOMYCYNA +++ OKSYTETRACYKLIN A +++ POLIMYKSYNA B ++ KWAS NALIDYKSOWY ++ CLOPHORAN +7 - unsensitive, + partially sensitive, + + sensitive, highly sensitive, +7 possible sensitive 110

5 DYSKUSJA Posocznica wywołana przez Hafnia alvei z reguły rozwija się u pszczoły miodnej jako zakażenie wtórne, wikłające choroby wywołane przez obligatoryjne patogeny i inwazję Varroa jacobsoni. Rzadziej H.alvei jest przyczyną odrębnej jednostki chorobowej, która cechuje się masowym padaniem pszczół i padaniem rodzin. Hafnioza (hafniosis) wystąpiła w Finlandii w dwu pasiekach w okresie wiosenno-letnim w 1993 r. Odsetek śmiertelności był bardzo wysoki, przekroczył 50%. Śmiertelność była największa u Aim.ligustica i Buckfast, a najmniej sza u A.m. carnica. Rozpoznanie hafniozy, podobnie jak i innych posocznic bakteryjnych, nastręcza wiele trudności. Sa one spowodowane brakiem specyficznych objawów klinicznych i typowych zmian chorobowych. Sama identyfikacja zarazka jest przy tym pracochłonna i może być przeprowadzona w laboratorium dysponującym odpowiednio przeszkolonym personelem. Stwierdzenie H.alvei w przewodzie pokarmowym pszczół nie przesądza o istnieniu hafniozy. Dopiero wykazanie obecności H. alvei w tkankach pszczół oraz wykluczenie jako przyczyny zachorowań i masowego padania pszczół wirusów i zatruć, umożliwia prawidiowe rozpoznanie choroby. Oznaczanie wrażliwości bakterii na antybiotyki jest niezbędnym warunkiem podejmowania leczenia sterowanego. Wrażliwość Hafnia alvei na streptomycynę i oksytetracyklinę umożliwia kontrolowanie choroby przy użyciu tych antybiotyków. Tetracykliny zastosowane zgodnie z zaleceniami nie powodują zanieczyszczenia miodu konsumpcyjnego. Schemat badania zastosowany w rozpoznawaniu hafniozy powinien być zalecany w diagnostyce chorób posocznicowych pochodzenia bakteryjnego. WNIOSKI 1. Przedstawiony schemat kompleksowych badań umożliwia dokładne określenie natury czynnika etiologicznego masowych zachorowań pszczół. 2. Hafnia alvei może być przyczyną nie tylko zakażeń wtórnych pszczół. Wywołuje ona również odrębną jednostkę chorobową O charakterze posocznicy powodującą masowe zachorowania pszczół i prowadzącą do likwidacji całych rodzin. 111

6 LITERATURA A I b i s e t t i J., B r i z a r d A. (1982) - Notions esentielles de pathologie apicole. OPlDA, Echauffour. A n d e r s o n J. E., Woj t a s M. A. (1968) - Honey bees ihvmenoptera, Apidea) contarninated with pesticides and polychlorinated biphenyła. J. Econom. Entomol., 79:1200. B a ł ł B. V. (1985) - Acute paralysis virus isolayes from honey bee colonies infested with Varroa jacobsoni. J.Apic.Res., 24: 115. D a v i s A. R. (1989) - The study of insecticide poisoning of honeybee brood. Bee World, 70:1163. E d war d s P. R., E w i n g W. H. (1962) - Identyfication of Enterobacteriaceae, II ed. Burgess, Minneapolis, Min. G o r d a n i G. (1952) - Amoeba disease of the honey bee, Apis mellifera L., an attempt at its chemical control. J. lnsect. Pathol., 1:245. G r o v e D. C., R a n d a I I W. A. (1955) - Assey methods of antibiotics. Alaboratory manual. Medical Encyklopedia NY. Manuał of Recommended Diagnostic Techniques and Requirements for Biological Products for List A and B Diseases. (1989) Vol. 1. OlE, Paris. M a r i g n o n i E., S t e i n h a u s E. M. (1961) - Laboratory exercise in insect microbiology and insect physiology. Borgess Publ. Co. Univ. Califomia, Berkeley. S m i t h K. M. (1976) - Virus-insect relationships. Longman, London, NY. W i c ker h a m L. J. (1951) - Taxonomy of yeasts. USDA Techn. Buli. 1:1029. THE CAUSATIVE AGENTS OF SEPTICAEMIA OF THE HONEYBEE - ISOLATION AND IDENTIFICATION Z. G I i ń s k i, M. C h m i e I e w s k i, L. K a u k o Summary Hafnia alvei that occurs in man, anirnal and birds, in natural environments such as soil, savage and water causes secondary septicaemic infections in the honey bee (Apis mellifera L.) and a distinct illness - hafniosis. Hafniosis characterized by high losses ofbee colonies (100 out 190 bee colonies died) appeared in two bee yards (130 and 60 colonies) in the Finland. 98% of Italian, 50% of Buckfastand, 33% of camiolan bee colonies died. Hialvei was present in the eontent of intestines, tissues of bees and in food stores. Viral infections, Malpighamoeba mełlificae and Acarapis woodi invasion, and pesticide poisonings have been excluded as a cause of bee losses. The Hafnia isolated were susceptible to carbenicillin, streptomycin, tetracykline, polymyxin B and nalidixis acid. Kevwords: Hafnia alvei, Apis mellifera L., septicaemia. 112