Współczesne metody analizy materiału biologicznego

Transkrypt

1 Współczesne metody analizy materiału biologicznego biotechnologia II r. dr hab. Jacek Kęsy

2 Cel wykładu Poznanie teorii i przykładów praktycznego wykorzystania niektórych podstawowych metod analitycznych stosowanych w nowoczesnej analityce chemicznej i biochemicznej

3 Przedmiot i zadania analityki

4

5 Informacje uzyskiwane dzięki procesowi analitycznemu - Skład układów materialnych analiza jakościowa i ilościowa - Struktura cząsteczek analiza strukturalna i konformacyjna - Przemiany zachodzące w czasie i przestrzeni analiza procesowa

6 Tematy wykładów 1. Zagadnienia wstępne. Elementarna budowa materii. Promieniowanie elektromagnetyczne. Podstawy chemicznej analizy instrumentalnej. Podział technik analitycznych. 2. Absorpcja i emisja promieniowania. Omówienie technik spektroskopowych. 3. Chromatograficzne (rozdzielcze) techniki analityczne cz Chromatograficzne (rozdzielcze) techniki analityczne cz Analiza strukturalna materii. Podsumowanie.

7 Budowa materii

8 Elementarna budowa materii

9 Wymiary atomu Promień atomu Promień jądra Promień elektronu Masa jądra wodoru ok m ok m? (jest 1837 razy lżejszy od jądra atomu wodoru) g Proporcje wymiarów Gdybyśmy mogli powiększyć 10 9 razy wymiary liniowe kawałka złotej folii, obserwowalibyśmy ją jako olbrzymi stos atomów o średnicy ponad pół metra. Praktycznie cała masa atomu byłaby jednak skoncentrowana w jądrze - o średnicy ok. 0,025 mm, czyli o wielkości bardzo małego ziarenka piasku! Albo inaczej, gdybyśmy mieli 1 cm 3 (naparstek) materii składającej się tylko z jąder wodoru, to miał on masę g, czyli sześć milionów ton!

10 Kwantowy model budowy atomu Z punktu widzenia metod analitycznych najistotniejsze jest przestrzenne rozmieszczenie elektronów wokół jądra. Elektron może w tej przestrzeni zajmować tylko pewne ściśle określone miejsca, zwane orbitami, orbitalami. Wiąże się to też z jego określoną energią. Elektron może przemieszczać się pomiędzy poszczególnymi orbitalami, jednakże musi (zazwyczaj :) towarzyszyć temu pochłonięcie lub wyemitowanie pewnej ściśle określonej porcji energii nazywanej kwantem stąd mówimy, że położenie elektronu wokół jądra jest skwantowane. Stan taki jest podstawą metod pomiarowych stosowanych w analityce. Model atomu Bohra postulaty 1. Elektron porusza się po orbicie kołowej dookoła jądra. Energia elektronu jest stała (nie wypromieniowuje energii) 2. Dozwolone są orbity, dla których orbitalny moment pędu elektronu jest równy całkowitej wielokrotności wyrażenia h/2π 3. Wypromieniowanie lub pochłanianie kwantu następuje wtedy, kiedy elektron przeskakuje z jednej dozwolonej orbity na drugą. Częstotliwość wyemitowanego (pochłoniętego) promieniowania jest taka, że ΔE = hν

11 Kwantowy model budowy atomu Obecnie w miejsce orbity wprowadzono pojęcie powłoki, a elektron spostrzegany jest jako "chmura elektronowa" posiadającą swoją energię. Elektrony o zbliżonych energiach zajmują w atomie jedną powłokę a jeżeli różnią się energią to zajmują różne powłoki. Poziomy energetyczne elektronów mają oznaczenia n = 1, 2, 3, 4,..). Często w podręcznikach oprócz oznaczeń cyfrowych, powłokom nadaje się symbole literowe: K, L, M, N, O, P. Analizy wykazały jednak, że elektrony zajmujące określone poziomy energetyczne wykazują niewielkie różnice energii i są rozmieszczone na podpowłokach. Podpowłoka najniższego poziomu energetycznego ma oznaczenie s a kolejne według wzrastającej energii p, d i f.

12

13 Model atomu jest modelem matematycznym Równanie falowe Schrödingera dla funkcji psi Ψ 2 2m x U i 2 2 y t 2 2 z Prawdopodobieństwo wykrycia cząstki w objętości dv dp 2 dv dv gęstość prawdopodobieństwa Amplituda prawdopodobieństwa n,l,m

14 Kwantowy model budowy atomu Rozwiązaniami równań są zestawy liczb kwantowych n, l, m, s opisujących stan poszczególnych elektronów w atomie: n oznacza numer orbity i przyjmuje wartości całkowitych liczb dodatnich, l oznacza wartość bezwzględną orbitalnego momentu pędu i przyjmuje wartości liczb naturalnych z zakresu < 0,n 1 >, m oznacza rzut orbitalnego momentu pędu na wybraną oś i przyjmuje wartości liczb całkowitych z zakresu < l,0,+l >, s oznacza spin. Dla elektronu przyjmuje wartości +1/2 ( prawoskrętny ) lub 1/2 ( lewoskrętny ) l=1 sharp l=2 principal l=3 diffuse l=4 fundamental

15 Zestawy liczb kwantowych, mówiące o prawdopodobieństwie wystąpienia elektronu w danym miejscu dają charakterystyczne obrazy

16 Kolejność obsadzania powłok elektronowych jest inna niż wynika to z ich liczb kwantowych

17

18 Kwantowy model budowy atomu

19 Kwantowy model budowy atomu wiązania chemiczne Szczególną rolę w funkcjonowaniu atomów odgrywają elektrony ostatniej powłoki, tzw. powłoki walencyjnej (elektrony walencyjne). To dzięki nim dochodzi do łączenia się atomów w związki chemiczne. Wchodzące w reakcje chemiczne elektrony walencyjne rozlokowują się na tzw. orbitalach zhybrydyzowanych, któ-rych energia w obrębie powłoki jest taka sama. Przez to wszystkie wiązania w cząsteczce np. metanu są równocenne, pomimo że brały w nich udział różniące się przecież energią orbitale typu s i p atomu węgla. Wiązania powstają przez nakładanie się orbitali i są podobnie jak orbitale skawntowane (posiadają ściśle określoną energię).

20 Kwantowy model budowy atomu wiązania chemiczne Wiązania w cząsteczce etylenu CH 2 =CH 2 (jedno wiązanie C-C (σ), 4 wiązania C-H (σ), 1 wiązanie π) powstają ze zhybrydyzowanych orbitali sp2 węgla oraz orbitali s wodoru. Wiązanie π powstaje z orbitali p y węgla.

21 Skwantowane są również drgania (oscylacje) i rotacje cząstek Całkowita energia cząsteczki wyraża się zatem jako suma trzech składników odpowiadających trzem rodzajom ruchu w cząsteczce E = E e + E os + E rot gdzie: E e - energia elektronowa (związana z ruchem elektronów), E os - energia oscylacyjna (związana z ruchem oscylacyjnym), E rot - energia rotacyjna (związana z ruchem rotacyjnym).

22 Promieniowanie elektromagnetyczne

23 Falowa natura promieniowania elektromagnetycznego Drganie pola elektrycznego, któremu towarzyszy drganie pola magnetycznego c = 3x10 8 m/s Częstość drgań ν = c/λ [s -1, Hz] _ Liczba falowa ν = ν/c = 1/λ [cm -1 ] Współczynnik załamania n = c/u u - prędkość światła w ośr. materialnym

24 Falowa natura promieniowania elektromagnetycznego Interferencja W efekcie nakładania się fal powstają wzmocnienia i wygaszenia sygnału

25 Falowa natura promieniowania elektromagnetycznego Dyfrakcja - zjawisko zmiany kierunku rozchodzenia się fali na krawędziach przeszkód oraz w ich pobliżu. Gdy wiązka światła przechodzi przez wąską szczelinę, każdy jej punkt staje się nowym źródłem fali. Między powstałymi falami zachodzi interferencja, co powoduje wzmacnianie i osłabianie światła rozchodzącego się w różnych kierunkach. Zastosowanie wielu równo od siebie oddalonych szczelin powoduje wzmocnienie powstających prążków interferencyjnych. sin n d warunek wystąpienia maksimum

26 Charakter korpuskularny promieniowania elektromagnetycznego Hipoteza Einsteina (1905): światło składa się z kwantów (fotonów) o energii E = hν, gdzie h stała Plancka fotony zachowują się jak cząstki materii podczas zderzenia z elektronem, fotony są pochłaniane przez elektrony i mogą oddawać im swoją energię E = hν = hc/λ h stała Plancka, uniwersalna stała fizyczna = 6.62x10-34 J. s

27 Charakter korpuskularny promieniowania elektromagnetycznego Zjawisko fotoelektryczne - wybijanie elektronów z powierzchni materiałów

28 Widmo promieniowania elektromagnetycznego ν = c/λ

29

30 Pochodzenie (źródło) promieniowania elektromagnetycznego

31 Linie emisyjne wodoru w zakresie widzialnym 434 nm 486 nm 656 nm

32 Atom wodoru poziomy energetyczne

33 Poziomy energetyczne wodoru, inaczej!

34 Poziomy energii atomu sodu

35 Proces analityczny

36 Podstawowe pojęcia z zakresu analityki Metoda analityczna Analit Próbka Próbka reprezentatywna Próbka laboratoryjna Próbka analityczna Próba ślepa (zerowa) Sposób wykrywania lub oznaczania składników próbki Analizowany składnik próbki Podzbiór populacji podlegający badaniu Próbka nie różniąca się istotnie pod względem badanej cechy od populacji generalnej Część próbki reprezentatywnej przeznaczona do prowadzenia analiz Część próbki laboratoryjnej wykorzystana do pojedynczego oznaczenia Próbka porównawcza, posiadająca cechy próbki analitycznej nie zawierająca analitu

37 Podstawowe pojęcia z zakresu analityki Oznaczanie Wykrywanie Wykrywalność (granica detekcji) Oznaczalność (granica oznaczalności) Czułość metody analitycznej Selektywność metody Specyficzność metody Ilościowe określenie zawartości analitu w badanej próbce Określenie obecności lub nieobecności analitu w badanej próbce Najmniejsza ilość (stężenie) analitu wykrywalna daną metodą z określonym prawdopodobieństwem Najmniejsza ilość (stężenie) analitu oznaczalna daną metodą z określonym prawdopodobieństwem Zdolność metody do rozróżnienia zbliżonych zawartości (stężeń) analitu stosunek przyrostu sygnału analitycznego towarzyszący przyrostowi stężenia Cecha, umożliwiająca zastosowanie metody do analizy pewnej niewielkiej liczby analitów Cecha, umożliwiająca zastosowanie metody do analizy tylko jednego analitu

38 Sposoby wyrażania stężeń Stężenie Równanie definicyjne Jednostka Procent masowy Część na milion Część na miliard % mas ppm Stężenie molowe nx vx y M, mol/dm 3 Stężenie normalne nx z v wal/dm 3 Stężenie masowo-objętościowe Ułamek molowy m mx 100 m x m y mx m m x x m x m y n y m v x x y x x y n x n y ppb g/dm 3, g/ml mg/ml mol/mol

39 Mol i liczba Avogadro Mol (gramocząsteczka) to taka ilość cząstek, których masa wyrażona w gramach jest liczbowo równa ich względnej masie atomowej. Na przykład mol 12 C ma masę 12 g; mol wody (H 2 O) ma masę18 g. Liczba cząsteczek wchodzących w skład mola wynosi x10 23 i nazywa się liczbą Avogadro (AN). AN= x10 23 Czy można sobie wyobrazić wielkość liczby Avogadro? Spróbujmy! Wyobraźmy sobie, że jeden litr roztworu zawierającego AN cząstek barwnika wlewamy do morza i dobrze mieszamy, tak aby barwnik równomiernie rozpuścił się w oceanach Ziemi. Nabieramy następnie do takiego samego naczynia 1 litr wody morskiej i wtedy okazuje się, że znajduje się w niej około 400 cząstek barwnika. Można to sobie wyobrazić? *Masa wody w oceanach Ziemi wynosi ok. 1.4 x kg

40 Wielokrotności i podwielokrotności hekto h deka da decy d centy c mili m mikro μ nano n piko p femto f atto a

41 Precyzja i dokładność błędy pomiarowe Precyzja - opisuje powtarzalność i odtwarzalność wyników - wewnątrz serii pomiarowej powtarzalność (repeatibility) - między seriami pomiarowymi odtwarzalność (reproducibility) Dokładność - opisuje zgodność wielkości mierzonej z wartością rzeczywistą Błąd pomiarowy - brak precyzji, brak dokładności

42 Precyzja i dokładność błędy pomiarowe a) b) Metoda: a) dokładna i precyzyjna b) precyzyjna, ale mało dokładna c) mało precyzyjna, ale dokładna d) mało dokładna i mało precyzyjna Błędy: c) a) bezbłędnie (niewielki błąd) b) błąd systematyczny c) błąd przypadkowy d) b) + a) d) Co może być przyczyną błędu sytematycznego (b), a co przypadkowego (c) w strzelaniu do tarczy?

43 Etapy procesu analitycznego - czynności wstępne (przygotowanie literaturowe, wybór techniki, metody i liczby oznaczeń, sprzęt, odczynniki ) - pobieranie próbki - przygotowanie próbki do analizy - pomiar - obróbka wyników - wnioski i informacja analityczna

44 Etapy procesu analitycznego Pobieranie próbek do analizy próbka reprezentatywna (pobór, opakowanie, transport, przechowywanie Czynniki określające wiarygodność próbki: - zanieczyszczenia na etapie pobierania - utrata lotnych składników próbki - reakcje ze składnikami powietrza (tlen, para wodna, dwutlenek węgla) - rozkład próbki promieniowanie UV - degradacja termiczna - reakcje katalityczne

45 Etapy procesu analitycznego Przygotowanie próbek do analizy - przeprowadzenie do roztworu - wydzielanie, rozdzielanie i zatężanie analitu - maskowanie - derywatyzacja analitu

46 Etapy procesu analitycznego - przygotowanie próbek Wydzielanie, rozdzielanie, zatężanie Ekstrakcja ciecz-ciecz, ciecz-ciało stałe w stanie nadkrytycznym do fazy stałej Strącanie i współstrącanie Krystalizacja Elektroosadzanie Adsorpcja Absorpcja Odparowanie i destylacja Filtracja i ultrafiltracja Dializa Wirowanie i ultrawirowanie Wymiana jonowa Chromatografia Elektroforeza

47 Etapy procesu analitycznego pomiar Instrumenty analityczne przyrządy, urządzenia służące do celów pomiarowych w procesie analitycznym Grupy analitycznych przyrządów pomiarowych: - spektrometry oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z molekułami, atomami, jądrami atomowymi, elektronami - aparatura elektrochemiczna pomiar wielkości elektrycznych (opór elektryczny, napięcie i natężenie prądu) towarzyszących reakcjom elektrodowym w roztworach i procesom zachodzących między elektrodami - chromatografy - aparatura do pomiarów termometrycznych

48 Podział metod (nie technik) analitycznych Metody bezwzględne (absolutne) nie wymagają wzorcowania Metody porównawcze (względne) wymagają kalibracji względem znanych wzorców większość metod należy do tej grupy Rodzaje metod porównawczych - metoda krzywej kalibracyjnej - metoda dodawania wzorca - metoda wzorca wewnętrznego

49 Rodzaje metod porównawczych Metoda krzywej kalibracyjnej Y = mc + b Y wielkość mierzona (sygnał analityczny) m współczynnik kierunkowy prostej c stężenie analitu b rzędna początkowa (c = 0) wartość ślepej próby Procedura pomiaru: Przygotować serię roztworów wzorcowych (znane stężenie analitu, c i ) Zmierzyć wartość sygnału analitycznego dla każdego roztworu wzorcowego Zmierzyć wartość sygnału dla analizowanej próbki Wykreślić krzywą kalibracyjną (Y = f(c i )) Wyznaczyć stężenie analizowanej próbki (c x ) Ograniczenia: Wąski zakres liniowości Wpływ matrycy próbki (wartości m i b są różne dla wzorców i dla próbki)

50

51 Metoda dodawania wzorca Procedura pomiaru - Mierzymy wartość sygnału analitycznego (Y) dla badanej próbki - Do próbki dodajemy znaną ilość wzorca i powtórnie przeprowadzamy pomiar wartości Y. Sygnał analityczny się zmienia a wielkość zmiany jest proporcjonalna do ilości dodanego wzorca Metoda wzorca wewnętrznego Wzorzec wewnętrzny substancja nie będąca analitem. Do próbki dodaje się wzorca i mierzy się równocześnie dwa sygnały analityczne: dla analitu (Y 1 ) i dla wzorca (Y 2 ). Otrzymuje się wówczas: Y 1 = m 1 c 1, Y 2 =m 2 c 2 Podstawowe równanie metody wzorca wewnętrznego Po podzieleniu stronami: Y 1 / Y 2 = R c 1 /c 2 gdzie: R= m 1 /m 2 nazywany jest współczynnikiem odpowiedzi

52 Techniki analityczne

53 Podział technik analitycznych Techniki elektrochemiczne: pehametria, selektywne elektrody membranowe, polarografia i metody pokrewne (woltamperometria, chronowoltamperometria inwersyjna z roztwarzaniem anodowym, oscylopolarografia, polarografia krzywych pochodnych), konduktometria Techniki optyczne (spektroskopowe): spektrofotometria w świetle widzialnym (VIS), nadfiolecie (UV) i podczerwieni (IR), emisyjna spektrofotometria płomieniowa, absorpcyjna spektrofotometria atomowa (AAS), jądrowy rezonans magnetyczny NMR, elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR), spektroskopia fotoakustyczna Techniki chromatograficzne (rozdzielcze): chromatografia cienkowarstwowa (TLC), gazowa (GC), cieczowa (LC, HPLC), jonowa Spektrometria masowa i techniki łączone: chromatografia gazowa spektrometria masowa (GCMS) Techniki radiometryczne Techniki immunochemiczne Techniki termoanalityczne

54 Metody spektroskopowe Spektroskopia to dziedzina analityki, obejmująca metody badania materii przy użyciu promieniowania, które może być w danym układzie wytworzone (emisja) lub może z tym układem oddziaływać (absorpcja). (Nauka o powstawaniu i interpretacji widm powstających w wyniku oddziaływań wszelkich rodzajów promieniowania z materią) Spektrometria zajmuje się rejestracją i pomiarami efektów wytwarzania bądź oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z badaną materią.

55 Podział i kryteria podziału spektroskopii Z uwagi na zmiany energii między promieniowaniem i materią - spektroskopia absorpcyjna - zwiększenie energii układu w wyniku pochłaniania promieniowania - spektroskopia emisyjna - oddanie części energii przez układ drogą emisji promieniowania Z uwagi na składniki materii, których dotyczą badane przemiany - spektroskopia jądrowa - spektroskopia atomowa - spektroskopia cząsteczkowa Z uwagi na wielkość fotonu, który jest pochłaniany lub emitowany (wg. zakresu promieniowania) - spektroskopia rentgenowska - spektroskopię optyczną - radiospektroskopia: mikro, krótko i długofalowa

56