Gdański Uniwersytet Medyczny Katedra Biochemii Klinicznej Zakład Medycyny Molekularnej

Transkrypt

1 Gdański Uniwersytet Medyczny Katedra Biochemii Klinicznej Zakład Medycyny Molekularnej AUTOREFERAT dr n. med. Monika Sakowicz-Burkiewicz Gdańsk 2013

2 I. Monika Justyna Sakowicz-Burkiewicz Zakład Medycyny Molekularnej Katedra Biochemii Klinicznej Gdański Uniwersytet Medyczny (GUMed) II. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe 12 kwietnia dyplom magistra biologii - specjalność biologia molekularna Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Geografii i Oceanologii 8 listopad stopień doktora nauk medycznych, Akademia Medyczna w Gdańsku (obecnie GUMed), Wydział lekarski na podstawie rozprawy doktorskiej pod tytułem: Regulacja kinazy adenozyny u szczura z cukrzycą wywołaną podaniem streptozotocyny III. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych biolog - specjalista, Zakład Medycyny Molekularnej, Katedra Biochemii Klinicznej, Gdański Uniwersytet Medyczny obecnie - adiunkt, Zakład Medycyny Molekularnej, Katedra Biochemii Klinicznej, Gdański Uniwersytet Medyczny IV. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. nr 65, poz. 595, z póŝn. zm.) a) Tytuł osiągnięcia naukowego Wpływ glukozy i insuliny na przemiany ATP i adenozyny w limfocytach B oraz znaczenie tych przemian dla funkcji limfocytu B jednotematyczny cykl 8-u publikacji pełnotekstowych, opublikowanych w czasopismach z Listy Filadelfijskiej w latach wymienionych poniŝej: (IF - 21,426; KBN/MNiSzW - 218; IC - 115,29) b) Autorzy, tytuły, czasopismo, rok wydania 1. Sakowicz M., Szutowicz A., Pawelczyk T.: Differential effect of insulin and elevated glucose level on adenosine transport in rat B lymphocytes. Int. Immunol. 2005;17: [IF-3,317; KBN/MNiSzW-24] 2. Kocbuch K., Sakowicz-Burkiewicz M., Grden M., Szutowicz A., Pawelczyk T.: Effect of insulin and glucose on adenosine metabolizing enzymes in human B lymphocytes. Acta Biochim Pol. 2009;56: [IF-1,262; KBN/MNiSzW-20] 2

3 3. Sakowicz-Burkiewicz M., Kocbuch K., Grden M., Szutowicz A., Pawelczyk T.: Protein kinase C mediated high glucose effect on adenosine receptors expression in rat B lymphocytes. J Physiol Pharmacol. 2009;60: [IF- 1,489; KBN/MNiSzW-32] 4. Sakowicz-Burkiewicz M., Kocbuch K., Grden M., Szutowicz A., Pawelczyk T.: Regulation of adenosine receptors expression in rat B lymphocytes by insulin. J Cell Biochem. 2010;109: [IF-3,122; KBN/MNiSzW-27] 5. Sakowicz-Burkiewicz M., Kocbuch K., Grden M., Szutowicz A., Pawelczyk T.: Adenosine 5'-triphosphate is the predominant source of peripheral adenosine in human B lymphoblasts. J Physiol Pharmacol. 2010;61: [IF-2,130; KBN/MNiSzW-20] 6. Sakowicz-Burkiewicz M., Kocbuch K., Grden M., Maciejewska I., Szutowicz A., Pawelczyk T.: Impact of adenosine receptors on immunoglobulin production by human peripheral blood B lymphocytes. J Physiol Pharmacol. 2012;63: [IF- 2,267; KBN/MNiSzW-25] 7. Sakowicz-Burkiewicz M., Kocbuch K., Grden M., Maciejewska I., Szutowicz A., Pawelczyk T.: High glucose concentration impairs ATP outflow and immunoglobulin production by human peripheral B lymphocytes: Involvement of P2X7 receptor. Immunobiology. 2013;218: [IF-3,205; KBN/MNiSzW-35] 8. Sakowicz-Burkiewicz M., Grden M., Maciejewska I., Szutowicz A., Pawelczyk T.: High glucose impairs ATP formation on the surface of human peripheral blood B lymphocytes. Int J Biochem Cell Biol. 2013;45: [IF-4,634; KBN/MNiSzW-35] c) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Prowadzone przeze mnie badania w Zakładzie Medycyny Molekularnej pokazały, Ŝe w cukrzycy przemiany adenozyny w wielu tkankach są zaburzone, a zmiany te pod względem ilościowym i jakościowym są charakterystyczne dla danego typu tkanki. Jednym z głównych czynników indukujących te zmiany jest zmieniające się stęŝenie insuliny i glukozy. Celem badań, których wyniki zamieszczone są w niniejszej pracy habilitacyjnej było zbadanie wpływu róŝnych stęŝeń glukozy i insuliny na przemiany ATP i adenozyny w limfocytach B. Ponadto chciałam wyjaśnić, czy zmiany homeostazy ATP i adenozyny indukowane róŝnymi stęŝeniami glukozy i insuliny znajdują swoje odbicie w funkcji limfocytu B, jaką jest produkcja przeciwciał w odpowiedzi na stymulację antygenem bakteryjnym. 3

4 Cukrzycę traktuje się jako chorobę metaboliczną. Jest ona jednym z głównych i ciągle narastających problemów zdrowotnych dzisiejszego społeczeństwa. Zalicza się ją do współczesnych chorób społecznych i cywilizacyjnych. Szacuje się, Ŝe na świecie Ŝyje około 250 mln chorych na cukrzycę i liczba ta ciągle wzrasta. Tylko w Polsce na rozpoznaną i zdiagnozowaną cukrzycę choruje ponad 2 miliony osób. Niewłaściwie leczona cukrzyca skutkuje utratą zdrowia i przedwczesną śmiercią. Dzieje się tak, poniewaŝ przewlekła i narastająca hiperglikemia powoduje uszkodzenie i niewydolność róŝnych narządów, głównie nerek, nerwów, serca, oczu i naczyń krwionośnych. Ponadto obserwacje kliniczne wskazują, Ŝe u diabetyków zakaŝenia bakteryjne, wirusowe, czy grzybicze występują częściej niŝ u ogólnej populacji i cechuje je szczególne umiejscowienie oraz cięŝszy przebieg kliniczny [1,2,3]. Cukrzyca zwiększa szczególnie ryzyko zakaŝeń skóry, dróg moczowych, górnych i dolnych dróg oddechowych [4]. Ponadto zakaŝenia wywołane przez Staphylococcus aureus, czy Mycobacterium tuberculosis występują u diabetyków ze zwiększoną częstością, a zakaŝenia wywołane przez Streptococcus pneumonia, czy wirusy grypy charakteryzują się podwyŝszoną śmiertelnością [5,6]. Częstość występowania zakaŝeń wśród chorych na cukrzycę zaleŝy od poprawności jej leczenia, szczególnie metod wyrównania hiperglikemii [7]. Zwiększona podatność na zakaŝenia u osób chorych na cukrzycę, związana jest z zaburzonym funkcjonowaniem układu immunologicznego, nie tylko poprzez swoiste reakcje autoimmunologiczne. JednakŜe mechanizm zwiększonego ryzyka infekcji nie jest do końca wyjaśniony, a informacje na temat poszczególnych zmian są niepełne i sprzeczne. Jedną z przyczyn łatwiejszego rozwoju infekcji u chorych z cukrzycą moŝe być obniŝona odporność nieswoista, wynikająca z upośledzonej funkcji granulocytów obojętnochłonnych [8]. Ponadto badania prowadzone zarówno na ludziach, jak i na zwierzętach wskazują, Ŝe w cukrzycy dochodzi do upośledzenia odpowiedzi komórkowej, jak i humoralnej. Jednojądrzaste komórki izolowane z krwi obwodowej pacjentów cukrzycowych wykazują zmnienioną bazalną produkcję cytokin [9,10], a limfocyty izolowane od szczurów z cukrzycą alloksanową cechuje wyŝszy odsetek komórek apoptotycznych [11]. Obecnie nie ma zgodności, co do występowania u chorych na cukrzycę osłabionej zdolności do produkcji przeciwciał, poniewaŝ w przeprowadzonych dotąd badaniach wykazywano zarówno upośledzoną [12-14], jak i normalną [15-17] produkcję przeciwciał u chorych poddawanych szczepieniom. Ta niejednoznaczność uzyskiwanych rezultatów moŝe wynikać zarówno z heterogenności porównywanych grup pod względem typu cukrzycy, jak i rodzaju antygenu stosowanego do szczepienia. Ostatnio Eibl i wsp. [18] wykazali 4

5 upośledzoną odpowiedź humoralną u chorych na cukrzycę typu I (lecz nie typu II ), ale tylko w przypadku stosowania antygenów pierwotnie rozpoznawanych przez limfocyty T. Natomiast Rubinstein i wsp. wykazali, Ŝe w cukrzycy dochodzi do spadku poziomu przeciwciał IgG i szybkości proliferacji limfocytów B stymulowanych miogenem dopiero po 6 miesiącach trwania choroby oraz podczas wtórnej odpowiedzi immunologicznej [19]. Upośledzenie niektórych funkcji limfocytów B u chorych na cukrzycę moŝe być bezpośrednim efektem występującej hiperglikemii i hipoinsulinemii lub hiperinsulinemii, bądź jakiegoś innego czynnika, którego stęŝenie zmienia się w trakcie rozwoju cukrzycy, co wpływa na funkcjonowanie limfocytu B. Jednym z czynników modulujących funkcjonowanie układu immunologicznego jest ATP i jego metabolit - adenozyna. Sygnalizacja purynergiczna w układzie immunologicznym przyczynia się do dostrojenia nasilenia reakcji zapalnej i odpowiedzi immunologicznej w taki sposób, aby skutecznie wyeliminować niebezpieczeństwo przy minimalnym uszkodzeniu tkanek gospodarza [20-22]. ATP - nukleotyd uwalniany z aktywowanych, bądź uszkodzonych komórek działa jako cząsteczka ostrzegawcza (ang. danger signal) poprzez aktywację receptorów purynergicznych P2, co indukuje i kontroluje swoistą odpowiedź immunologiczną i aktywuje procesy zapalne [23-24]. JednakŜe rola ATP w układzie odpornościowym jest ściśle związana z jednym z produktów jego rozpadu - adenozyną [25-26]. Rola ATP i adenozyny w reakcji zapalnej i swoistej odpowiedzi immunologicznej in vivo jest bardzo złoŝona, skutki działania tych dwóch cząsteczek mogą mieć charakter immunostymulujący, bądź immunoregulacyjny, a nawet immunosupresyjny zaleŝnie od ich zewnątrzkomórkowego stęŝenia, jak i profilu ekspresji genów dla receptorów purynergicznych P1 i P2 oraz ektoenzymów, biorących udział w metabolizmie puryn [20]. Aktywacja receptorów P2 na limfocytach jest kontrolowana przez ekto-nukleotydazy. Sekwencyjna hydroliza pozakomórkowego ATP przez ekto-nukleotydazy i ekto-5 -nukleotydazę generuje adenozynę, która aktywując receptory P1 hamuje procesy zapalne i indukuje immunosupresję [27]. Głównym źródłem ATP w przestrzeni pozakomórkowej są komórki, które uwalniają ten nukleotyd w sposób konstytutywny lub w odpowiedzi na stres metaboliczny lub mechaniczny. W normalnych warunkach zewnątrzkomórkowe stęŝenie ATP i adenozyny jest bardzo niskie i gwałtownie wzrasta w warunkach stresu metabolicznego, niedotlenienia, niedokrwienia, zapalenia, infekcji, czy stresu pojawienia się napręŝeń mechanicznych (ang. shear stress) [28]. Warto podkreślić, Ŝe czynniki powodujące wzrost lokalnego stęŝenia ATP w przestrzeni pozakomórkowej mogą inicjować sygnalizację purynergiczną na drodze auto- i parakrynnej. Pozakomórkowe ATP 5

6 indukuje i reguluje odpowiedź immunologiczną poprzez aktywację swoistych receptorów błonowych P2, wśród których wyodrębniono receptory jonowe P2X 1-7 oraz związane z białkami G receptory metabotropowe P2Y 1,2,4,6,11-14 [20-23]. Adenozyna, która jest końcowym produktem rozpadu ATP takŝe odgrywa istotną rolę w regulacji układu immunologicznego poprzez aktywację receptorów purynowych typu P1 nazywanych równieŝ receptorami adenozynowymi (A1, A2a, A2b, A3) [26,27]. StęŜenie ATP i jego głównego metabolitu - adenozyny w przestrzeni pozakomórkowej z jednej strony jest kontrolowane przez szybkość uwalniania z komórki, a z drugiej strony przez ekto-enzymy katalizujące ich wzajemne konwersje. Obecnie wśród ekto-enzymów zaangaŝowanych w rozpad zewnątrzkomórkowego ATP wyróŝniono 4 rodziny: ektodifosfohydrolazy trifosforanów nukleozydów (ekto-ntpdazy), katalizujące degradację ATP i ADP do AMP; ekto-pirofosfatazy/fosfodiesterazy nukleotydowe (ekto-npp), hydrolizujące camp do AMP, ATP do AMP i ADP do AMP; niespecyficzne ekto-fosfomonoestrazy, katalizujące degradację nukleotydów; ekto-5 -nukleotydazę (CD73, ekto-5 NT), hydrolizującą AMP do adenozyny. Ponadto na ostateczne stęŝenie ATP w przestrzeni pozakomórkowej wpływają równieŝ enzymy generujące i przemieniające adeninowe i urydynowe nukleotydy pozakomórkowe (ekto-kinaza adenylanowa, ekto-kinaza difosfonukleozydowa) [29-33]. Współwystępowanie tak róŝnorodnych ekto-enzymów hydrolizujących, jak i generujących nukleotydy w środowisku pozakomórkowym sugeruje, Ŝe regulacja aktywności tych enzymów w limfocytach moŝe stymulować lub hamować procesy zaleŝne od receptorów purynergicznych. Ponadto wykazano funkcjonalne połączenie ektoenzymów metabolizujących zewnątrzkomórkowe nukleotydy i nukleozydy z ich receptorami, jak i zaleŝność odwrotną - pobudzenie receptorów modyfikuje aktywność ekto-enzymów [34]. Ekto-5 -nukleotydaza (CD73), która stanowi ostatnie ogniwo enzymatyczne w kaskadzie rozpadu ATP powoduje powstawanie pozakomórkowej adenozyny, której rola regulatorowa w układzie immunologicznym jest udokumentowana w wielu obserwacjach zarówno klinicznych, jaki i doświadczalnych [35-38]. Adenozyna moŝe być nieodwracalnie usuwana z przestrzeni pozakomórkowej poprzez deaminację do inozyny przez ekto-deaminazę adenozyny (ADA) [39]. Niedobór tego enzymu u chorych z zespołem SCID powoduje wzrost poziomu zewnątrzkomórkowej adenozyny, co wywołuje immunosupresję [40]. Ponadto adenozyna moŝe być tworzona w komórce przy udziale enzymu 5 -nukleotydazy, w cytosolu limfocytów zidentyfikowano co najmniej dwie rozpuszczalne izoformy [41,42]. Innym źródłem wewnątrzkomórkowej adenozyny moŝe być hydroliza S-adenozylohomocysteiny 6

7 przez hydrolazę SAH [43]. StęŜenie wewnątrzkomórkowe adenozyny zaleŝy od aktywności enzymów ją produkujących i aktywności enzymów konwertujących ją do innych związków. Jedną z takich reakcji jest tworzenie SAH z adenozyny i L-homocysteiny w odwracalnej reakcji katalizowanej przez hydrolazę SAH. Dodatkowo adenozyna moŝe być konwertowana do AMP przez cytoplazmatyczną kinazę adenozyny (AK) [44] i /lub deaminowana do inozyny przez cytoplazmatyczną ADA [45,46]. Zewnątrzkomórkowe stęŝenie adenozyny zaleŝy od szybkości jej uwalniania z komórek, wytwarzania przez ekto-nukleotydazy obecne na powierzchni komórek oraz jej ponownego wychwytu zwrotnego moŝliwego dzięki wyspecjalizowanym transporterom nukleozydowym (NT). Wydaje się, Ŝe wydajność transportu przez błonę plazmatyczną moŝe odgrywać istotną rolę w modelowaniu funkcji komórki determinując dostępność tego nukleozydu do wiązania z jego receptorami, bądź dla enzymów metabolizujących. Znane są dwa rodzaje systemów transportowych nukleozydów przez błonę plazmatyczną: transport bierny nośnikowy w obu kierunkach na zasadzie dyfuzji ułatwionej, zgodnie z gradientem stęŝeń (ang. egulibrative nucleoside transporter, ENT) i transport zaleŝny od jonów sodu, który przemieszcza nukleozydy tylko do wnętrza komórki (ang. sodium-dependent concentrative nucleoside transport, CNT) [47,48]. Innymi nieswoistymi nośnikami nukleozydów w poprzek błony są organiczne kationowe i anionowe transportery, nośniki peptydowe oraz białka transportowe z rodziny transporterów ABC [49]. Na podstawie wraŝliwości na nitrobenzylotioinozynę (NBTI) wyróŝnia się dwa podtypy transportu ENT: transport typu es (ang. equlibrative sensitive), który jest hamowany przez NBTI (K i 0,1-10 nm) oraz transport typu ei (ang. egulibrative insensitive), który jest niewraŝliwy na hamujące działanie NBTI do stęŝenia 1 µm. Dotąd zidentyfikowano i sklonowano cztery białka transportowe naleŝące do systemu Na + -niezaleŝnego przemieszczające nukleozydy zgodnie z gradientem stęŝeń: ENT1, ENT2, ENT3 i ENT4. Natomiast w obrębie Na + -zaleŝnego sytemu transportowego moŝna wyróŝnić ze względu na specyficzność substratową trzy podtypy: cit (ang. concentrative, insensitive to NBTI and accepts thymidine as a permeant) - białko CNT1, cif (ang. concentrative, insensitive to NBTI and accepts formicin B as a permeant) - białko CNT2 oraz cib (ang. concentrative, insensitive to NBTI and accepts a broad range of permeants) - białko CNT3. Wiele badań doświadczalnych pokazało, Ŝe poziom ekspresji genów dla transporterów nukleozydowych zaleŝy od rodzaju komórki i jej stanu fizjologicznego. Ponadto ekspozycja komórek na róŝne hormony (trijodo-l-tyronina, glukagon, insulina), glukozę, cytokiny (M- CSF, INF-γ) oraz aktywatory, takie jak PMA i LPS moduluje ekspresję i aktywność 7

8 transporterów nukleozydowych [50]. Nasze wcześniejsze badania pokazały, Ŝe metabolizm adenozyny i poziom ekspresji genów dla transporterów nukleozydowych w niektórych tkankach szczura z cukrzycą indukowaną podaniem streptozotocyny jest zmieniony [51-53]. To sugeruje, Ŝe komórkowy transport adenozyny moŝe być modyfikowany przez insulinę lub/i glukozę. Prace innych badaczy przeprowadzone na komórkach endotelialnych izolowanych z Ŝyły pępowinowej ludzi chorych na cukrzycę pokazały, Ŝe transport adenozyny wraŝliwy na NBTI jest zredukowany w tych warunkach [54]. Natomiast w komórkach mięśni gładkich izolowanych z tej Ŝyły transport adenozyny był znacząco podwyŝszony w cukrzycy [55]. Niestety nasza wiedza o obrocie wewnętrznym transporterów nukleozydowych w komórkach układu odpornościowego w cukrzycy jest bardzo ograniczona. W ludzkich limfocytach krwi obwodowej wykazano obecność białek transportowych: hcnt2, hcnt3, hent1 i hent2 [56]. Natomiast leukocyty ludzkie wychwytują adenozynę głównie (55%) przy udziale transportera ENT1 [56]. Przesłanki te skłoniły mnie do podjęcia badań zmierzających do określenia wpływu insuliny i glukozy na poziom ekspresji genów poszczególnych transporterów nukleozydowych w limfocytach B izolowanych od szczurów z cukrzycą. Poznanie rodzaju zaburzeń w systemie transportu nukleozydów w cukrzycy moŝe w istotny sposób przyczynić się do wyjaśnienia mechanizmów leŝących u podłoŝa szeregu patologii obserwowanych w układzie odpornościowym w cukrzycy. Ponadto moŝe mieć istotne znaczenie przy doborze leków, będących pochodnymi nukleozydowymi przy leczeniu róŝnych chorób u cukrzyków. Tym bardziej, Ŝe transport nukleozydów przez błonę plazmatyczną jest istotnym etapem w rozwoju i aktywacji limfocytów. Proliferacja aktywowanych limfocytów obejmuje syntezę nowego RNA i DNA z wykorzystaniem wewnątrzkomórkowej puli nukleotydów i deoksynukleotydów, które pochodzą z syntezy de novo i / lub nukleozydów ze szlaku ratunkowego. W komórkach odpornościowych, synteza de novo jest ograniczona, a droga ratunkowa przewaŝa, ze względu na zdolność komórek do wychwytu nukleozydów z zewnątrzkomórkowego środowiska [57]. Wyniki tych badań opublikowane w pracy autorstwa Sakowicz M, Szutowicz A, Pawełczyk T zatytułowanej Differential effect of insulin and elevated glucose level on adenosine transport in rat B lymphocytes pokazały, Ŝe ekspresja genów transporterów nukleozydowych rent1 i rent2 w limfocytach B izolowanych ze śledzony szczurów z cukrzycą indukowaną podaniem streptozotocyny była obniŝona odpowiednio o 80 i 50 %. Natomiast poziom mrna rcnt2 w cukrzycowych limfocytach B wzrastał ponad 2-krotnie. W celu określenia wpływu glukozy i insuliny na 8

9 poziom ekspresji genów NT i transport adenozyny kolejne doświadczenia prowadzono na limfocytach B izolowanych ze śledziony szczurów i hodowanych przez 4 dni w poŝywce, zawierającej róŝne stęŝenia insuliny ( M) i glukozy (5-20 mm). Przeprowadzone eksperymenty in vitro pokazały, Ŝe poziom ekspresji genu dla rent1 zaleŝy od stęŝenia zewnątrzkomórkowej glukozy, a nie insuliny. PodwyŜszony poziom glukozy (20 mm) hamował ekspresję genu transportera rent1 w limfocytach B, co było związane ze zmniejszonym wychwytem adenozyny przez komórki. Wpływ glukozy na poziom mrna dla rent1 był całkowicie blokowany przez inhibitor kinazy MAPK (PD98059). Natomiast poziom mrna rent2 i rcnt2 zaleŝał od stęŝenia insuliny, a nie glukozy. Ekspozycja limfocytów B na 10 nm stęŝenie insuliny powodowała 2-krotny wzrost poziomu mrna ENT2 oraz 50% obniŝenie poziomu mrna rcnt2. Zmiany w poziomie mrna korelowały ze zmienionym transportem adenozyny. Limfocyty hodowane w obecności insuliny wykazały zwiększony wychwyt adenozyny typu ei i zmniejszony transport Na + -zaleŝny. Przeprowadzone badania pokazały, Ŝe szlak przekazywania sygnału od insuliny do genu Slc29a2 kodującego rent2 zaleŝy od aktywności kinazy-3-fosfatydyloinozytolu (PI3K). Natomiast ekspresja genu transportera rcnt2 regulowana jest przez insulinę w sposób zaleŝny od kinaz MAP i w mniejszym stopniu od PI3K. Podsumowując, zaburzenia transportu nukleozydów w cukrzycowych limfocytach B są wynikiem zmienionej ekspresji genów transporterów nukleozydowych, która jest regulowana niezaleŝnie i w sposób odmienny przez insulinę i glukozę. Wzrost poziomu glukozy niezaleŝnie od insuliny zmniejsza ekspresję genu transportera ENT1, który w limfocytach odpowiada za 80% transportu adenozyny. Podczas, gdy ekspresja genu transportera rent2 i rcnt2 jest regulowana tylko przez insulinę. Wyniki przedstawione w tej pracy wskazują na stęŝenie insuliny i glukozy jako czynniki, które regulują ekspresję genów transporterów nukleozydowych, zarówno na poziomie transkrypcji, jak i translacji. MoŜe mieć to wpływ na receptorowe działanie adenozyny. Badania przeprowadzone na myszach z wyciszonym genem dla receptora adenozynowego A2a wykazały, Ŝe w otrzewnowych makrofagach adenozyna hamuje produkcję IL-12 i TNF zarówno poprzez mechanizmy zaleŝne od receptorów P1, jak i w sposób od nich niezaleŝny [58]. Obserwowano ponadto, Ŝe wychwyt adenozyny przez komórkę inicjuje np. apoptozę mysich komórek neuroblastoma [59] oraz zahamowanie wzrostu szczurzych komórek przysadki [60]. Dlatego transportery nukleozydowe odgrywają istotną rolę w immunomodulującym działaniu adenozyny. Usunięcie tego nukleozydu z przestrzeni pozakomórkowej kończy działanie adenozyny na powierzchniowe receptory. I odwrotnie, gdy następuje akumulacja adenozyny w komórce, 9

10 transportery typu ENT mogą uwalniać adenozynę to przestrzeni pozakomórkowej. W warunkach niskiego stęŝenia insuliny i wysokiego stęŝenia glukozy zmiany ekspresji genów transporterów nukleozydowych w limfocytach B prowadzą do zmniejszonego wychwytu adenozyny. MoŜna zatem przypuszczać, Ŝe w warunkach cukrzycowych dochodzi do zaburzenia transportu tego nukleozydu, co moŝe mieć wpływ na odpowiedź humoralną układu immunologicznego. Homeostaza adenozyny w warunkach cukrzycowych jest zaburzona w wielu róŝnych tkankach i komórkach z limfocytami T włącznie, co moŝe sugerować, Ŝe adenozyna w cukrzycy moŝe modulować/zmieniać funkcje wielu typów komórek immunologicznych [61, 62]. Kolejnym waŝnym czynnikiem, wpływającym na stęŝenie adenozyny w limfocytach B i na ich powierzchni są enzymy metabolizujące adenozynę. Porównanie aktywności enzymów metabolizujących adenozynę w limfocytach T i B wykazało podobną aktywność deaminazy AMP, natomiast w limfocytach T obserwuje się wyŝszą aktywność AK i ADA. Z drugiej strony limfocyty B są zdolne do uwalniania znaczących ilości adenozyny ze względu na duŝą aktywność 5 -NT i niską aktywność AK i ADA [63]. Barankiewicz i wsp. sugeruje, Ŝe limfocyty B są znaczącym źródłem adenozyny we krwi [64]. W piśmiennictwie istnieje parę prac opisujących doświadczenia na zwierzętach lub/ i obserwacje kliniczne wykazujące zmiany w aktywności np. ADA, czy 5 -NT podczas rozwoju cukrzycy [65-68]. Wyniki badań przedstawione w pracy autorstwa Kocbuch K, Sakowicz-Burkiewicz M, Grdeń M, Szutowicz A, Pawełczyk T zatytułowanej Effect of insulin and glucose on adenosine metabolizing enzymes in human B lymphocytes wskazują, Ŝe glukoza i insulina w odmienny sposób wpływają na aktywność ADA i 5'-NT, natomiast nie regulują aktywności AK w limfocytach B. Aktywność cytosolowej ADA nie zaleŝy od stęŝenia glukozy, natomiast aktywność błonowej ADA w limfocytach B hodowanych w 25 mm stęŝeniu glukozy jest zmniejszona o około 35% w porównaniu do aktywności w komórkach hodowanych w 5 mm glukozie, niezaleŝnie od stęŝenia insuliny. Aktywność 5'-NT i ekto-5'-nt w limfocytach B zaleŝy od stęŝenia insuliny, a nie glukozy. Insulina w stęŝeniu 10-8 M obniŝała odpowiednio o 60% i 70% aktywność cytosolowej i błonowej 5 -NT w porównaniu do aktywności tych enzymów obserwowanych w komórkach hodowanych w obecności M insuliny. Natomiast zewnątrzkomórkowy poziom adenozyny i inozyny w warunkach zwiększonego katabolizmu ATP w limfocytach B zaleŝy jedynie od stęŝenia glukozy, ale nie od stęŝenia insuliny. Ponadto zmiany w aktywności enzymów ADA i 5'-NT nie korelują z obserwowanymi poziomami adenozyny w poŝywce hodowlanej podczas zwiększonego rozpadu ATP. Zaobserwowaliśmy, Ŝe poziom adenozyny był znacznie wyŝszy w środowisku 10

11 komórek hodowanych w niskim stęŝeniu glukozy w porównaniu do komórek hodowanych w wysokim stęŝeniu glukozy, niezaleŝnie od stęŝenia insuliny. Podsumowując, nasze badania pokazują, Ŝe glukoza i insulina w róŝny sposób wpływają na aktywności enzymów uczestniczących w metabolizmie adenozyny w limfocytach B, ale kierunek zmian aktywności tych enzymów nie koreluje z poziomem adenozyny w poŝywce hodowlanej podczas przyspieszonego katabolizmu ATP, co moŝe oznaczać, Ŝe głównym czynnikiem regulującym poziom zewnątrzkomórkowej adenozyny jest transport nukleozydów. Ponadto, przedstawione dane podkreślają istotne róŝnice w metabolizmie adenozyny między limfocytami T i B eksponowanymi na róŝne stęŝenia insuliny i glukozy. Jak juŝ wcześniej wspomniałam adenozyna jest modulatorem funkcji komórek immunologicznych poprzez aktywację swoistych receptorów znajdujących się na powierzchni błony komórkowej, tzw. receptorów P1. Do tej pory zidentyfikowano cztery typy receptorów adenozynowych (ARs), a mianowicie: A1-AR, A2a-AR, A2b-AR, i A3-AR [69-70]. Adenozyna jest głównym ligandem dla tych receptorów. JednakŜe ostatnio wykazano, Ŝe takŝe inozyna - metabolit adenozyny jest w stanie aktywować skutecznie kilka ARs [71]. KaŜdy z czterech typów receptorów adenozyny jest sprzęŝony z białkami G (GPCR - ang. G protein coupled receptors), które stymulują (Gs) lub hamują (Gi) produkcję wewnątrzkomórkowego camp. Adenozyna w stęŝeniu fizjologicznym (poniŝej 1 µm) moŝe aktywować receptor A1, A2a i A3, natomiast znacznie wyŝsze stęŝenia tego nukleozydu, generowanego w warunkach patofizjologicznych są niezbędne do stymulacji A2b-AR [72-74]. Nasze wcześniejsze badania i prace innych badaczy pokazały, Ŝe rozwój cukrzycy powoduje zmianę ekspresji genów ARs w róŝnych rodzajach komórek i zmiany te są specyficzne dla danego rodzaju komórki, czy tkanki [75,76]. Aby, dowiedzieć się jak glukoza i insulina wpływa na ekspresję genów receptorów adenozynowych w limfocytach B przeprowadziłam badania, których wyniki opublikowano w dwóch pracach autorstwa Sakowicz-Burkiewicz M, Kocbuch K, Grdeń M, Szutowicz A, Pawełczyk T zatytułowanych,,protein kinase C mediated high glucose effect on adenosine receptors expression in rat B lymphocytes i,,regulation of adenosine receptors expression in rat B lymphocytes by insulin. Obecność czterech typów ARs na komórkach immunologicznych opisywano wcześniej [77], przy czym informacje o profilu ekspresyjnym genów tych receptorów na limfocytach B były niekompletne. Nasze prace po raz pierwszy pokazały ekspresję wszystkich czterech genów ARs w szczurzych limfocytach B, zarówno na poziomie mrna, jak i białka, przy czym poziom białka receptora A2a i A3 był ledwie wykrywalny metodą Western blot. Wyniki naszych badań wskazują, Ŝe szczurze limfocyty B 11

12 hodowane w wysokim stęŝeniu glukozy wykazują zmniejszoną ekspresję genów dla A1-, A2b- i A3- ARs, natomiast glukoza nie wpływa na ekspresję genu dla A2a-AR. Selektywny inhibitor kinazy białkowej C zaleŝnej od Ca 2+ (Go6976) znosił supresję genu Adora3 indukowaną wysokim stęŝeniem glukozy (25 mm). To sugeruje zaangaŝowanie klasycznych izoenzymów PKC w wewnątrzkomórkowym szlaku przekazania sygnału indukowanego wysokim stęŝeniem glukozy. Natomiast Go silny inhibitor kilku izoenzymów PKC (choć nie PKC-µ), całkowicie blokował wpływ glukozy na ekspresję genu dla A1-AR i A2b- AR. Inkubacja limfocytów B z rottlerinem, (selektywny inhibitor PKC-δ i PKC-θ) [78], znosiła indukowaną glukozą supresję ekspresji genu Adora1, ale nie miała wpływu na poziom ekspresji genu Adora2b. PoniewaŜ limfocyty B nie wykazują ekspresji izoenzymu PKC-θ [79-80], moŝna przyjąć, Ŝe efekt wysokiego stęŝenia glukozy na poziom ekspresji genu dla A1-AR jest mediowany głównie przez PKC-δ. Ponadto obserwacja, Ŝe wpływ wysokiego stęŝenia glukozy na ekspresję genu dla A2b-AR został zablokowany przez nieselektywne inhibitory PKC, ale nie przez inhibitory izoenzymów PKC zaleŝnych od Ca 2+, moŝe sugerować, Ŝe w limfocytach B szczura wysokie stęŝenie glukozy hamuje ekspresję genu dla A2b-AR poprzez aktywację tzw. nowych izoenzymów PKC tj. PKC-ε i/lub PKC-η. W warunkach cukrzycy moŝe dochodzić do aktywacji szlaku poliolowego i związanego z tym wzrostu syntezy de novo 1,2-diacyloglicerolu (DAG), co takŝe stymuluje PKCs [81]. Istnieje równieŝ coraz więcej dowodów na zwrotną krzyŝową aktywację PKC poprzez stres oksydacyjny indukowany hiperglikemią [82]. Ponadto aktywacja kaskady sygnalizacji MAPK moŝe być efektem pobudzenia PKC [83]. Kinaza białkowa C jest często związana z tym szlakiem sygnalizacji na poziomie kinazy Raf-1. Zaobserwowaliśmy, Ŝe zahamowanie kaskady sygnałowej Raf/MEK/ERK1/2, na poziomie Raf-1, całkowicie blokuje wpływ hiperglikemii na ekspresję genu dla A2b-AR, ale nie ma wpływu na ekspresję genu dla receptora A1 i A3. Hamowanie ekspresji genu dla A2b-AR wywołane przez wysokie stęŝenie glukozy było równieŝ zniesione przez inhibitor kinazy MAPK (MEK) PD Oznacza to, Ŝe wysokie stęŝenie glukozy hamuje ekspresję genu dla A1-AR w szczurzych limfocytach B przez aktywację PKC-δ i ścieŝki MEK/ERK1/2. Podsumowując, nasze badania udokumentowały, Ŝe w szczurzych limfocytach B, wysokie stęŝenie glukozy hamuje ekspresję genów dla A1-, A2b- i A3-ARs aktywując odmienne szlaki sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, zaleŝne od róŝnych izoenzymów kinazy białkowej C, natomiast poziom ekspresji genu dla A2a-AR nie zaleŝy od zmiany stęŝenia glukozy. W związku z tym jest moŝliwe, Ŝe w cukrzycy A2a-AR moŝe stać się dominującym 12

13 receptorem adenozynowym na limfocytach B, poprzez który adenozyna moŝe wpływać na funkcję tych komórek. Prowadząc badania nad wpływem insuliny na ekspresję genów dla receptorów adenozynowych zauwaŝyliśmy, Ŝe hodowane przez 48 h limfocyty B szczura w warunkach braku lub bardzo niskiego stęŝenia insuliny (<10-11 M) posiadały wszystkie cztery typy receptorów adenozynowych, jednakŝe białko A2a-AR było ledwo wykrywalne. Dodanie insuliny w stęŝeniu 10-8 M do poŝywki hodowlanej skutkowało wzrostem poziomu białka receptora A1 i A2a oraz znaczącym zmniejszeniem ilości białka receptora A2b. W warunkach tych poziom białka A3-AR pozostawał niezmieniony. Zmianom poziomu białka ARs towarzyszyły zmiany w poziomach mrna ARs. Zmiana stęŝenia insuliny z M do 10-8 M związana była z 50% spadkiem poziomu mrna A2b-AR i odpowiednio dwui trzykrotnym wzrostem poziomu mrna dla receptora A1 i A2a. Badania z uŝyciem szeregu specyficznych inhibitorów poszczególnych etapów kaskad sygnałowych w komórce wykazały, Ŝe insulina indukuje wzrost ekspresji genu Adora1 i Adora2a poprzez aktywację szlaku Ras/Raf-1/MEK/ERK. Rejony promotorowe ludzkich genów ADORA1 i ADORA2A zawierają sekwencje rozpoznawane przez czynnik transkrypcyjny AP-1 [84]. W moich badaniach obserwowałam, Ŝe insulina w hodowanych limfocytach B powodowała wzrost poziomu białek Jun i Fos. Ponadto podwyŝszenie poziomu białek Jun i Fos było poprzedzone fosforylacją Elk-1. Wiadomo z badań in vitro i in vivo, Ŝe fosforylacja Elk-1 jest bezpośrednim efektem aktywacji ERK1/2 [85]. W naszych badaniach zahamowanie aktywacji ERK1/2 poprzez inhibicję MEK (PD98059) wiązało się z zahamowaniem fosforylacji Elk-1 i spadkiem ilości białek Jun i Fos. Zatem badania przedstawione w naszej pracy wskazują na moŝliwość udziału czynnika AP-1 w indukowanej insuliną transkrypcji genów Adora1 i Adora2a. Z drugiej strony nasze doświadczenia pokazały, Ŝe insulina w sposób zaleŝny od szlaku sygnalizacji p38 MAPK negatywnie reguluje ekspresję genu Adora2b. Podsumowując, insulina wpływa na ekspresję genów dla ARs na powierzchni limfocytów B powodując powstanie sytuacji, w której ich wzajemny stosunek ilościowy sprawia, Ŝe limfocyty mogą stać się bardziej wraŝliwe na immunosupresyjne działanie adenozyny. NaleŜy pamiętać, Ŝe niektóre receptory adenozyny funkcjonują na powierzchni komórki w połączeniu z enzymami metabolizującymi adenozynę np. w linii ludzkich limfocytów B zaobserwowano skorelowaną ekspresję genu dla A2a-AR i ekto-5 NT [86]. Ponadto nasze badania wskazują, Ŝe w warunkach wysokiego stęŝenia insuliny, co moŝe mieć miejsce szczególnie w cukrzycy typu II w limfocytach B wzrasta poziom mrna A1-AR i A2a-AR, a zmniejsza się poziom mrna A2b-AR. 13

14 Przedstawione powyŝej fakty skłoniły mnie do zbadania źródła zewnątrzkomórkowej adenozyny w niestymulowanych limfocytach B. Wiadomo, Ŝe niestymulowane ludzkie limfocyty białaczkowe są w stanie wydzielać takie ilości ATP, aby stęŝenie w pobliŝu komórki osiągało wartości mikromolarne [87]. Nasze badania nad uwalnianiem ATP prowadzone były na ludzkich limfoblastach B linii komórkowej SKW6.4. Otrzymane wyniki zostały opublikowane w pracy autorstwa Sakowicz-Burkiewicz M, Kocbuch K, Grdeń M, Szutowicz A, Pawełczyk T zatytułowanej,,adenosine 5'-triphosphate is the predominant source of peripheral adenosine in human B lymphoblasts. W naszych badaniach obserwowaliśmy, Ŝe limfoblasty B w sposób ciągły uwalniają znaczne ilości ATP (35 pmol/10 6 komórek) do poŝywki inkubacyjnej w odpowiedzi na delikatny ruch płynu. Natomiast poziom adenozyny w środowisku inkubacyjnym był bardzo niski i zwiększał się 5- krotnie podczas zahamowania aktywności ADA 2 -deoksykoformycyną (10 µm). Ponadto zablokowanie transportera nukleozydowego wraŝliwego na NBTI powodowało dalszy wzrost stęŝenia adenozyny w środowisku inkubacyjnym. Zahamowanie aktywności ekto-atpazy (100 µm ARL67156) powodowało 2-krotny wzrost zewnątrzkomórkowego poziomu ATP i wiązało się z 3-krotnym zmniejszeniem poziomu adenozyny w środowisku. Włączenie, w tym układzie do środowiska inkubacyjnego, selektywnego inhibitora ekto-5 NT (AOPCP) skutkowało ponad 7-krotnym spadkiem stęŝenia adenozyny w środowisku. Nasze wyniki przedstawione w tej pracy wskazują, Ŝe adenozyna jest stale produkowana na powierzchni limfocytu B, ale w normalnych warunkach jej poziom jest bardzo niski z powodu skutecznego wychwytu przez transportery nukleozydowe, jak równieŝ przemianę do inozyny przez błonową ADA. Potwierdziliśmy równieŝ, Ŝe adenozyna pojawiająca się w środowisku inkubacyjnym pochodzi prawie wyłącznie z kaskadowego rozpadu ATP uwalnianego z limfocytów B. Wcześniejsze prace pokazywały, Ŝe ATP jest uwalniane z komórek mięśni gładkich naczyń, komórek śródbłonka i limfocytów T pod wpływem działania delikatnych sił mechanicznych, czy hemodynamicznych [88-90]. Nasza praca po raz pierwszy pokazuje, Ŝe równieŝ limfocyty B zawieszone w środowisku płynnym poddanemu delikatnemu przepływowi wydzielają ponad 3 razy więcej ATP niŝ w warunkach braku ruchu. W warunkach fizjologicznych transport nukleotydów z komórki do przestrzeni pozakomórkowej następuje za pomocą kanałów jonowych lub w wyniku egzocytozy pęcherzyków wydzielniczych. Ostatnio pojawiły się doniesienia, Ŝe pobudzone limfocyty T mogą uwalniać ATP poprzez kanały zbudowane z panneksyny-1 [91]. Nasza praca wskazuje, Ŝe ATP uwalniane w sposób ciągły z limfocytów B przez niezidentyfikowane mechanoczułe kanały jest hydrolizowane do AMP przez ekto-ntpdazy. Adenozyna powstająca w wyniku 14

15 działania ekto-5 NT moŝe być transportowana do komórki przez transportery nukleozydowe lub ulegać deaminacji do inozyny. Inozyna moŝe być transportowana do komórki lub konwertowana do hipoksantyny przez fosforylazę nukleozydów purynowych (PNP). Wzajemny stosunek ATP do adenozyny jest bardzo istotny w modulowaniu odpowiedzi komórek układu immunologicznego przez puryny. Przy niezmienionym poziomie uwalniania ATP z limfocytu B to właśnie aktywność ekto-enzymów i efektywność działania transporterów nukleozydowych determinuje wartość stosunku ATP/adenozyna w pobliŝu powierzchni limfocytu B. W kolejnych pracach podjęłam się zbadania przemian ATP na powierzchni limfocytu B i wpływu glukozy na te przemiany. Badania były prowadzone na ludzkich limfocytach izolowanych z krwi obwodowej i hodowanych w poŝywce zawierającej niskie (5 mm) i wysokie (25 mm) stęŝenie glukozy. Wyniki tych badań zostały opublikowane w pracy autorstwa Sakowicz-Burkiewicz M, Grdeń M, Maciejewska I, Szutowicz A, Pawełczyk T zatytułowanej,,high glucose impairs ATP formation on the surface of human peripheral blood B lymphocytes. Wcześniej wykazano, Ŝe niestymulowane ludzkie limfocyty mogą uwalniać ATP w ilości wystarczającej do osiągnięcia w warstwie powierzchniowej komórki stęŝeń mikromolarnych tego nukleotydu [87]. Niemniej jednak, zewnątrzkomórkowe stęŝenie ATP determinuje nie tylko szybkość uwalniania, ale równieŝ jego zewnątrzkomórkowy metabolizm, który zaleŝy od aktywności szeregu enzymów. Do tej pory opisano kilka zarówno rozpuszczalnych, jak i związanych z błoną plazmatyczną enzymów zaangaŝowanych w przemiany zewnątrzkomórkowego ATP [31,33,92]. Dane z piśmiennictwa wskazują, Ŝe we krwi kluczową rolę w kontroli poziomu pozakomórkowego ATP i ADP odgrywa rozpuszczalna kinaza adenylanowa-1 (AK1) i difosfohydrolaza trifosforanów nukleozydów-1 (NTPDaza-1/CD39) [93]. Wyniki naszych doświadczeń pokazały, Ŝe ludzkie limfocyty B hodowane w wysokim stęŝeniu glukozy (25 mm) uwalniają znacznie mniej ATP (~ 60%) w porównaniu z komórkami hodowanymi w obecności 5 mm stęŝenia glukozy. Zaobserwowaliśmy, Ŝe limfocyty B hodowane w poŝywce z wysokim stęŝeniem glukozy charakteryzowały się przyspieszoną hydrolizą ATP na powierzchni komórki. Zwiększona aktywność hydrolityczna błon plazmatycznych limfocytów B w stosunku do ATP związana była ze zwiększoną aktywnością NTPDaza-1/CD39. Badania z uŝyciem cytometrii przepływowej pokazały, Ŝe limfocyty B hodowane w wysokim stęŝeniu glukozy posiadają na swojej powierzchni znacznie więcej (o jeden rząd wielkości) białka NTPDazy-1/CD39, niŝ komórki trzymane w poŝywce zawierającej 5 mm glukozę. Z czterech zidentyfikowanych do tej pory NTPDaz (NTPDaza1, 2, 3 i 8) na powierzchni limfocytu B stwierdzono obecność 15

16 tylko NTPDazy-1 [94]. Nasze wyniki pokazują, Ŝe 90% aktywności hydrolitycznej w stosunku do ATP jest blokowane przez selektywne inhibitory NTPDazy-1 (ARL 67156, POM-1), co zgodne jest z wcześniejszymi doniesieniami o podstawowej roli NTPDazy-1 w rozkładzie ATP na powierzchni limfocytów B. Na poziom pozakomórkowych nukleotydów wpływają równieŝ reakcje transfosforylacji zachodzące na powierzchni komórki, w których pośredniczy ekto-kinaza adenylanowa-1β (AK-1β) i ekto-kinaza difosfonukleozydowa (ektokinaza NDP) [95]. W naszych doświadczeniach z uŝyciem znakowanych trytem nukleotydów obserwowaliśmy powstawanie znacznych ilości [ 3 H]ADP i [ 3 H]ATP, które były generowane przez ekto-enzymy obecne w błonach plazmatycznych limfocytów B, choć potencjał fosforylacji AMP do ADP przez ekto-enzymy limfocytów B hodowanych w obecności wysokiego stęŝenia glukozy był znacząco zmniejszony. Transfer grupy γ-fosforanowej z ATP do AMP był całkowicie zahamowany w obecności P 1,P 5 -di(adenozyno-5 )-pentafosforanu (Ap 5 A), który jest specyficznym inhibitorem AK-1β. Analiza przy uŝyciu cytometrii przepływowej wykazała, Ŝe poziom AK-1β na powierzchni limfocytów B hodowanych w obecności wysokiego stęŝenia glukozy był znacznie niŝszy, niŝ w komórkach z poŝywki zawierającej 5 mm glukozę. Z kolei aktywność drugiego enzymu tj. ekto-kinazy NDP nie ulegała zmianie pod wpływem hodowli limfocytów B w poŝywce z wysokim stęŝeniem glukozy. Tak więc, wyniki naszej pracy pokazały, Ŝe ludzkie limfocyty B w odpowiedzi na wzrost stęŝenia glukozy uwalniają znacznie mniej ATP, a jego rozpad na powierzchni komórek jest przyspieszony ze względu na zwiększoną aktywność NTPDazy-1/CD39, czemu towarzyszy obniŝenie aktywności AK-1β, skutkujące upośledzeniem fosforylacji AMP do ADP. W takich warunkach większość AMP powstającego na powierzchni limfocytu B moŝe ulegać hydrolizie do adenozyny w reakcji katalizowanej przez ekto-5 -NT/CD73 prowadząc do nagromadzenia się tego nukleozydu i następczej aktywacji receptorów adenozynowych. JednakŜe, poziom nukleozydu na obwodzie komórki nie zaleŝy wyłącznie od tempa jego generowania, ale takŝe od transportu przez błonę plazmatyczną. Nasze badania wykazały, Ŝe wysokie stęŝenie glukozy hamuje ekspresję genów dla transporterów nukleozydów ENT1 i ENT2, a zwiększa CNT2 zarówno w limfocytach B, jak i T. W takich warunkach zmniejszeniu ulega dwukierunkowy przepływ adenozyny przez błonę plazmatyczną, a zwiększa się Na + -zaleŝny wychwyt adenozyny przez komórkę [96,97]. ToteŜ w obecności wysokich stęŝeń glukozy spodziewać się raczej naleŝy zmniejszenia poziomu adenozyny w powierzchniowej warstwie limfocytu B. Z drugiej strony, jak to powyŝej przedstawiłam w komórkach eksponowanych na wysokie stęŝenie glukozy dochodzi do zmian ekspresji genów dla receptorów adenozynowych w taki sposób, Ŝe komórka moŝe być bardziej 16

17 wraŝliwa na immunosupresyjne działanie adenozyny. Wiele ostatnio opublikowanych prac wykazuje, Ŝe adenozyna poprzez swoje ARs wpływa na aktywację i proliferację limfocytów oraz cytotoksyczność zaleŝną od limfocytów [98,99]. Znalezienie związku między receptorowym działaniem adenozyny, a zaburzeniem funkcji limfocytów B moŝe przyczynić się do zrozumienia mechanizmu/ów, które powodują zaburzenie odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego w stanach patologicznych np. w cukrzycy. Dlatego celem kolejnych prac było zbadanie wpływu aktywacji receptorów adenozynowych na indukowaną antygenem bakteryjnym produkcję immunoglobulin klasy IgM przez ludzkie limfocyty B oraz wpływu wysokich stęŝeń glukozy na ten proces. Przesłanką do przeprowadzenia tych badań była nasza obserwacja wskazująca, Ŝe ludzkie limfocyty B hodowane w obecności 25 mm glukozy produkują dwukrotnie mniej przeciwciał IgM w odpowiedzi na stymulację antygenem bakteryjnym w porównaniu do komórek hodowanych w poŝywce zawierającej 5 mm glukozę. Doświadczenie przeprowadzono na izolowanych z krwi obwodowej ludzkich limfocytach B, które stymulowano in vitro białkiem A ze Staphylococcus aureus szczepu Cowan I (SAC) w obecności IL-2. Wyniki tych badań zostały opublikowane w pracy autorstwa Sakowicz-Burkiewicz M, Kocbuch K, Grdeń M, Maciejewska I, Szutowicz A, Pawełczyk T zatytułowanej,,impact of adenosine receptors on immunoglobulin production by human peripheral blood B lymphocytes. W naszych badaniach obserwowaliśmy, Ŝe endogenna adenozyna generowana na powierzchni limfocytu B powoduje wzrost stęŝenia wewnątrzkomórkowego camp poprzez aktywację A2a-AR, jednakŝe ma to miejsce tylko wtedy, gdy pozostałe ARs są zablokowane przez selektywnych antagonistów. Oznacza to, Ŝe w normalnych warunkach stymulacja A2a-AR na limfocytach B przez endogenną adenozynę jest równowaŝona poprzez jednoczesną aktywację innych ARs, głównie A1-AR i A3-AR. MoŜna więc było załoŝyć, ze czynniki zmieniające poziom ekspresji genów ARs będą równieŝ prowadzić do zmienionej odpowiedzi komórki na działanie receptorowe adenozyny. Taką sytuację obserwowałam na modelu zwierzęcym w przypadku cukrzycy indukowanej streptozotocyną, gdzie współwystępująca hiperglikemia i hipoinsulinemia zmienia poziom ekspresji genów dla ARs w wielu tkankach, w tym takŝe w limfocytach B, co wcześniej wykazałam w swoich pracach. Ponadto w warunkach hiperglikemii dominującym AR na komórkach B staje się A2a-AR. MoŜna było zakładać, Ŝe wysokie stęŝenie glukozy jest czynnikiem, który regulując ekspresję genów dla ARs na limfocytach B, wpływa na produkcję przeciwciał stymulowaną bakteryjnymi antygenami. W naszych doświadczeniach obserwowaliśmy, Ŝe indukowany forskoliną wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu camp związany był z obniŝoną produkcją IgM 17

18 w odpowiedzi na stymulację limfocytów B przez SAC. Efekt ten był obserwowany zarówno w komórkach hodowanych w poŝywce z niskim, jak i wysokim stęŝeniem glukozy. Jednak kiedy wzrost camp indukowany był poprzez aktywację A2a-AR (przy zablokowanych pozostałych receptorach) to obniŝenie produkcji IgM przez stymulowane SAC limfocyty B obserwowaliśmy tylko w komórkach hodowanych w poŝywce zawierającej 5 mm glukozę. Komórki hodowane w poŝywce z 25 mm glukozą charakteryzowały się obniŝoną produkcją IgM w odpowiedzi na stymulację SAC i aktywacja receptora A2a nie powodowała dalszego spadku produkcji IgM. RównieŜ zahamowanie A2a-AR (ZM lub CSC) w komórkach hodowanych w poŝywce z 25 mm glukozą skutkowało jedynie niewielkim wzrostem produkcji przeciwciał IgM w odpowiedzi na stymulację SAC. Podsumowując, wyniki przeprowadzonych badań wskazują, Ŝe zmieniona odpowiedź (mierzona produkcją IgM) na stymulację antygenem bakteryjnym limfocytów B hodowanych w obecności wysokiego stęŝenia glukozy jest spowodowana przez inne czynniki, niŝ zmiana poziomu zewnątrzkomórkowej adenozyny, czy poziomu ekspresji genów receptorów adenozynowych. Ogólnie uwaŝa się, Ŝe wytwarzanie przeciwciał jest główną funkcją limfocytów B. Jednak badania przeprowadzone w ostatnim dziesięcioleciu wskazują, Ŝe komórki B w odpowiedzi na stymulację antygenem mogą produkować równieŝ szerokie spektrum cytokin modulujących odporność [ ]. Wiele badań przeprowadzonych na zwierzętach, czy ludzkich komórkach wskazuje, Ŝe zewnątrzkomórkowe ATP poprzez interakcję z receptorami purynergicznymi P2 moŝe zarówno aktywować, jak i hamować odpowiedź immunologiczną [103]. Jak opisałam to powyŝej, ekspozycja limfocytów B na wysokie stęŝenie glukozy prowadzi do zmniejszenia wydzielania ATP i związana jest z istotnymi zmianami w zewnątrzkomórkowym metabolizmie tego nukleotydu. Kolejną zmianą w limfocycie B hodowanym w obecności wysokiego stęŝenia glukozy obserwowaną w naszych doświadczeniach jest obniŝona produkcja immunoglobulin klasy IgM w odpowiedzi na stymulację SAC. Dlatego celem moich kolejnych prac było zbadanie roli receptorów P2 w regulacji produkcji przeciwciał IgM przez ludzkie limfocyty B stymulowane antygenem bakteryjnym w warunkach róŝnych stęŝeń glukozy. Wyniki tych badań zostały opublikowane w pracy autorstwa Sakowicz-Burkiewicz M. Kocbuch K, Grdeń M, Maciejewska I, Szutowicz A, Pawełczyk T zatytułowanej,,high glucose concentration impairs ATP outflow and immunoglobulin production by human peripheral B lymphocytes: Involvement of P2X7 receptor. Nasze doświadczenia in vitro wykazały, Ŝe leukocyty krwi obwodowej (ang. peripheral blood leukocyte, PBL) hodowane w obecności 25 mm glukozy wydzielają około 18

19 55% mniej przeciwciał IgM w odpowiedzi na stymulację SAC z IL-2 w porównaniu do komórek PBL hodowanych w obecności 5 mm glukozy. Jest to obserwacja zgodna z wcześniejszymi doniesieniami pokazującymi zmniejszoną odpowiedź humoralną w cukrzycy [4,18], jednakŝe większość tych prac skupia się na wpływie hiperglikemii na zaburzenia funkcji neutrofili, makrofagów czy limfocytów T, natomiast brakuje informacji o limfocytach B. Do tego czasu, obniŝenie proliferacji limfocytów w odpowiedzi na stymulację antygenem było najczęściej opisywanym zaburzeniem funkcji limfocytów w cukrzycy [4,61,62]. W naszych eksperymentach na izolowanych z krwi obwodowej ludzkich limfocytach B obserwowaliśmy jedynie nieznaczne obniŝenie stopnia proliferacji (o 15%) komórek hodowanych w poŝywce zawierającej wysokie stęŝenie glukozy. Co więcej nasze badania pokazują, Ŝe mechanizmy powodujące zmieniony potencjał proliferacyjny limfocytów T i B w cukrzycy są róŝne. Wcześniej wykazaliśmy, Ŝe szybkość proliferacji limfocytów T znacząco zaleŝy od stęŝenia insuliny [61,62]. Natomiast w obecnych eksperymentach insulina w zakresie stęŝeń M miała marginalny wpływ na szybkość proliferacji ludzkich limfocytów B zarówno w poŝywce z niskim, jak i wysokim stęŝeniem glukozy. Odpowiedź immunologiczna limfocytów B na stymulację antygenem polega na proliferacji, jak równieŝ na róŝnicowaniu w plazmocyty i produkcji oraz wydzielaniu specyficznych immunoglobulin. ToteŜ obserwowany przez nas spadek wydzielania przeciwciał IgM przez limfocyty B w poŝywce z wysokim stęŝeniem glukozy mógł być wynikiem zmian w róŝnicowaniu. JednakŜe przeprowadzona analiza cytometryczna populacji ludzkich limfocytów B pokazała, Ŝe wysokie stęŝenie glukozy nie wypływa na procentowy udział populacji komórek CD19 + IgM -, CD19 + IgM + i CD19 - CD38 + powstających po stymulacji SAC i IL-2. Jest to pierwsza publikacja, która pokazuje, Ŝe wysokie stęŝenie glukozy nie wpływa na róŝnicowanie komórek B stymulowanych in vitro bakteryjnym antygenem. Nasze wyniki badań in vitro korelują z wynikami obserwacji in vivo wykazującymi brak róŝnic w dystrybucji subpopulacji limfocytów B u cukrzyków i osób zdrowych [104,105]. Ostatnio, ukazały się prace odnotowujące róŝnice w subpopulacji limfocytów B krwi obwodowej i populacji komórek B w śledzionie szczurów Goto-Kakizaki (genetyczny model cukrzycy typu II) w porównaniu do normalnych szczurów Wistar [106], jednak zmiany te nie były indukowane hiperglikemią. Dane z piśmiennictwa wskazują, Ŝe na limfocytach B współwystępują receptory purynergiczne naleŝące do obu podtypów tj. P2X i P2Y [107]. W naszych doświadczeniach przy uŝyciu selektywnych antagonistów zbadaliśmy znaczenie szeregu receptorów typu P2X oraz P2Y dla produkcji przez limfocyt B przeciwciał IgM. Wyniki tych doświadczeń 19

20 pokazały, Ŝe obecność aktywnego receptora P2X7 (P2X7R) jest niezbędna do tego, aby aktywowany in vitro antygenem bakteryjnym limfocyt B wydzielał IgM. Selektywne zablokowanie tego receptora (AZ ) powodowało 95% spadek wydzielania IgM niezaleŝnie od stęŝenia glukozy w poŝywce. Analiza Wester blot pokazała, Ŝe poziom białka receptora P2X7 w błonach plazmatycznych limfocytów B hodowanych w poŝywce zawierającej 25 mm glukozę jest tylko nieznacznie obniŝony. Obserwacja ta wskazuje, Ŝe za spadek wydzielania IgM przez limfocyty B hodowane w wysokim stęŝeniu glukozy nie odpowiada zmniejszenie ilości białka receptorowego P2X7, a raczej utrata jego funkcji. Z uwagi na to, Ŝe ATP jest jedynym znanym [108] fizjologicznym ligandem tego receptora za utratę funkcji P2X7R w warunkach naszych doświadczeń mógł by odpowiadać obserwowany przez nas spadek wydzielania ATP przez limfocyt B. Dla sprawdzenia tej hipotezy przeprowadziliśmy doświadczenia z uŝyciem selektywnego agonisty receptora P2X7 (BzATP). W obecności BzATP (10 µm) obserwowaliśmy prawie dwukrotne zwiększenie wydzielania IgM przez limfocyty B hodowane w poŝywce z 5 mm glukozą, natomiast limfocyty B w poŝywce z 25 mm glukozą odpowiadały na BzATP tylko 20% zwiększeniem wydzielania IgM. Wyniki te pokazały, Ŝe spadek wydzielania IgM przez limfocyty B aktywowane antygenem bakteryjnym nie jest związany ze zmniejszeniem ilości receptora P2X7 na powierzchni komórki oraz w niewielkim stopniu z obniŝeniem wydzielania ATP przez limfocyt i jego przyspieszoną degradacją, a raczej z utratą funkcji tego receptora indukowaną wysokim stęŝeniem glukozy. Kolejną istotną obserwacją wynikającą z przeprowadzonych doświadczeń jest dwufazowa odpowiedź limfocytów B na stymulację BzATP - najsilniejszym agonistą P2X7R. Maksymalną produkcję przeciwciał klasy IgM w odpowiedzi na stymulację limfocytów B przez SAC odnotowano przy 10 µm stęŝeniu BzATP, natomiast w wyŝszym stęŝeniu tego agonisty obserwowano zmniejszenie Ŝywotności komórek i spadek wydzielania przeciwciał. Jest to zgodne z wynikami wcześniejszych doświadczeń na komórkach transfekowanych ludzkim rekombinowanym receptorem P2X7, gdzie ATP zwiększało proliferację komórek, ale wysoki poziom ATP inicjował apoptozę komórek [109,110]. W naszej pracy teŝ obserwowaliśmy zahamowanie produkcji przeciwciał IgM przez limfocyty B hodowane w wysokim stęŝeniu glukozy które było związane ze zmienioną odpowiedzią na aktywację receptora P2X7 przez BzATP. Jednak ta zmiana dotyczyła tylko stymulacji receptora niskim stęŝeniem BzATP (<10 µm). Pobudzenie P2X7R z uŝyciem 100 µm BzATP powodowało spadek Ŝywotności limfocytów niezaleŝnie od stęŝenia glukozy. MoŜe to wskazywać, Ŝe w limfocytach B wysokie stęŝenie glukozy wpływa na zaleŝne od aktywacji receptora P2X7 20