(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/29 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/395 ( ) A61P 35/00 ( ) C07K 16/30 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Terapia adiuwantowa z zastosowaniem przeciwciała przeciw glipikanowi 3 (30) Pierwszeństwo: JP JP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/26 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/12 (73) Uprawniony z patentu: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, Tokyo, JP (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 YASUKO KINOSHITA, Kamakura, JP MASAMICHI SUGIMOTO, Kamakura, JP HISAFUMI OKABE, Kamakura, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 PZ/2068/AGR 1 EP B1 Opis DZIEDZINA TECHNIKI [0001] Niniejszy wynalazek odnosi się do zapobiegania nawrotom nowotworu w wyniku mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych. STAN TECHNIKI [0002] Rodzinę glipikanów opisano jako nową rodzinę proteoglikanów siarczanowo-heparanowych obecnych na powierzchni komórki. Obecnie jako członków rodziny glipikanów opisano pięć typów glipikanów (glipikan 1, glipikan 2, glipikan 3, glipikan 4 i glipikan 5). Członkowie tej rodziny mają białko rdzeniowe o jednorodnym rozmiarze (około 60 kda), dzielą unikalną i wysoce konserwowaną sekwencję cystein oraz są związane z błoną komórkową przez kotwicę glikozylofosfatydyloinozytolową (GPI, ang. glycosylphosphatidylinostiol). [0003] Gen Dally (ang. division abnormally delayed podział nienormalnie opóźniony) zidentyfikowano w badaniu genetycznym mutantów Drosophila melanogaster, które miały nienormalny wzór podziałów komórkowych w trakcie rozwoju centralnego układu nerwowego. Dla cdna Dally wykazano obecność otwartej ramki odczytu (ORF) kodującej produkt, który wykazuje homologię sekwencji (24 do 26% homologii) z integralnymi proteoglikanami błonowymi kręgowców (GRIP, ang. vertebrate integral membrane proteoglycans), mający wszystkie cechy charakterystyczne glipikanów. Później zasugerowano, że Dally odgrywa rolę w regulacji działania receptora dpp (decapentaplegia), sugerując możliwość, że glipikan ssaczy moduluje transdukcję sygnału TGF i BMP. Tym samym sugerowano, że glipikan może funkcjonować jako koreceptor dla niektórych czynników wzrostowych wiążących heparynę (np. EGF, PDGF, BMP2, FGF). [0004] Glipikan 3 został wyizolowany jako transkrypt regulowany rozwojowo z jelita cienkiego szczura (Filmus, J., Church, J.G. i Buick, R.N. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, ). Zidentyfikowano go następnie jako OCI-5, proteoglikan siarczanowo-heparanowy z typu zakotwiczonych GPI z rodziny glipikanów, mający białko rdzeniowe o masie cząsteczkowej 69 kda (Filmus, J., Shi, W., Wong, Z.-M. i Wong, M.J. (1995) Biochem. J. 311, ). U ludzi, gen kodujący glipikan 3 wyizolowano także jako MRX-7 z linii komórkowej ludzkiego raka żołądka (Hermann Lage et al., Gene 188 (1997) ). Opisano, że glipikan 3 tworzy kompleks białko-białko z insulinopodobnym czynnikiem wzrostu-2 i reguluje aktywność tego czynnika wzrostowego (Pilia, G. et al. (1996) Nat. Genet. 12, ). Doniesienie to wskazuje, że glipikan 3 niekoniecznie oddziałuje z czynnikami wzrostowymi poprzez łańcuch siarczanu heparanu. [0005] Opisano także, że glipikan 3 może być wykorzystany jako marker raka wątrobowokomórkowego (Hey-Chi Hsu et al., Cancer Research 57, (1997)). Opisano także, że przeciwciało przeciw glipikanowi 3 wykazuje aktywność cytotoksyczną przeciwko komórkom nowotworu wątroby i może być użyteczne jako środek przeciwnowotworowy (WO 03/00883). [0006] WO 04/ i EP 1,541,680 A1 dotyczą przeciwciała przeciw peptydowi N-końcowemu lub peptydowi C-końcowemu z GPC3 rozpuszczonemu we krwi. [0007] Carter et al (2001) Nature Reviews Cancer, 1: dotyczy poprawy skuteczności terapii nowotworu opartych na przeciwciałach. [0008] Jednakże, brak doniesień, według których możliwe jest stosowanie przeciwciała przeciw glipikanowi 3 w terapii adiuwantowej po terapii nowotworu.

3 PZ/2068/AGR 2 EP B1 KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0009] W wyniku rozległych i intensywnych badań, twórcy niniejszego wynalazku odkryli, że przeciwciało przeciw glipikanowi 3 jest użyteczne w zapobieganiu nawrotom nowotworu w wyniku mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych u pacjenta po resekcji nowotworu w terapii nowotworu wątroby. [0010] Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciał przeciw glipikanowi 3 do stosowania w sposobie zapobiegania nawrotom nowotworu w wyniku mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych u pacjenta po resekcji nowotworu w terapii nowotworu wątroby, przy czym glipikan 3 jest wyrażany w komórkach nowotworu wątroby poddanych resekcji. KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU [0011] Figura 1 to wykres przedstawiający wpływ środka przeciwnowotworowego według niniejszego wynalazku przy podawaniu modelowej myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym. Figura 2 to wykres przedstawiający wpływ środka przeciwnowotworowego według niniejszego wynalazku przy podawaniu modelowej myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym na wczesnym etapie. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0012] Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciał przeciw glipikanowi 3 do stosowania w sposobie zapobiegania nawrotom nowotworu w wyniku mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych u pacjenta po resekcji nowotworu w terapii nowotworu wątroby, przy czym glipikan 3 jest wyrażany w komórkach nowotworu wątroby poddanych resekcji. [0013] Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 jest korzystnie przeciwciałem monoklonalnym. [0014] Środek przeciwnowotworowy według niniejszego wynalazku jest stosowany w terapii adiuwantowej. Nawet w przypadkach gdy uważa się, że chirurgiczna terapia nowotworu spowodowała usunięcie komórek nowotworowych lub ich śmierć, nadal mogą być obecne niewykryte komórki nowotworowe. Kiedy pozostają takie komórki nowotworowe nowotwór może nawracać po pewnym okresie czasu, po terapii nowotworu musi więc następować terapia w celu zapobiegania nawrotom nowotworu. Taka terapia znana jest jako terapia adiuwantowa lub pooperacyjna terapia adiuwantowa. [0015] W kontekście niniejszego wynalazku, terapia nowotworu odnosi się do dowolnej terapii, która ma cel obejmujący zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych lub zabijanie komórek nowotworowych lub spadek komórek nowotworowych, takiej jak resekcja nowotworu, chemioterapia z zastosowaniem środka przeciwnowotworowego, radioterapia, terapia przezskórnego wstrzyknięcia etanolu, terapia przezskórnej koagulacji termicznej falami o częstotliwości radiowej lub terapia przezcewnikowej embolizacji tętniczej. W niniejszym wynalazku terapia nowotworu obejmuje resekcję nowotworu w nowotworze wątroby. Pojęcie po zakończeniu terapii nowotworu lub po terapii nowotworu oznacza po tym jak przeprowadzono taką terapię. To pojęcie po zakończeniu terapii nowotworu lub po terapii nowotworu w niniejszym wynalazku nie oznacza koniecznie, że nowotwór został wyleczony. [0016] Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 według niniejszego wynalazku jest podawane pacjentowi po terapii nowotworowej po ustaleniu czy glipikan 3 jest wyrażany w komórkach nowotworu wątroby

4 PZ/2068/AGR 3 EP B1 poddanych resekcji. W celu ustalenia czy wyrażany jest glipikan 3 można zastosować dowolny sposób. Na przykład, ekspresję białka glipikanu 3 można ustalić stosując przeciwciało przeciw glipikanowi 3, podczas gdy ekspresję genu glipikanu 3 można ustalić przez, na przykład PCR. [0017] Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 można podawać w dowolnym czasie po terapii nowotworu, a podawanie można wykonać natychmiast po terapii nowotworu lub po pewnym odstępie czasu. Korzystny czas podawania według niniejszego wynalazku mieści się w przedziale od po terapii nowotworu aż do i w trakcie nawrotu nowotworu. W przypadku pooperacyjnej terapii adiuwantowej, podawanie standardowo zaczyna się w ciągu 12 tygodni lub w ciągu 6 tygodni po terapii. Nawroty nowotworu mogą być diagnozowane sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie; na przykład; wystąpienie guza można określić przy pomocy ustaleń wizualnych lub patologicznych. Obecność guza można potwierdzić sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie, takimi jak obrazowanie lub sposoby oparte na markerze guza takim jak AFP. [0018] Nowotworem leczonym z zastosowaniem środka przeciwnowotworowego według niniejszego wynalazku jest nowotwór wątroby. Rak wątroby jest nowotworem szczególnie dobrze nadającym się do terapii z zastosowaniem środka przeciwnowotworowego według niniejszego wynalazku. Nowotwór wątroby może być nowotworem pierwotnym lub wtórnym, co obejmuje raka wątrobowokomórkowego, wewnątrzwątrobowego raka przewodów żółciowych, torbielakogruczolakoraka dróg żółciowych, połączonego raka wątrobowokomórkowego i raka przewodów żółciowych, hepatoblastomę, raka niezróżnicowanego, mięsaka naczyniowego, nowotwór gładkokomórkowy wątroby oraz mięsaka niezróżnicowanego. [0019] W niniejszym wynalazku, przeciwciało przeciw glipikanowi jest do stosowania w sposobie zapobiegania nawrotom nowotworu w wyniku mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych u pacjenta po resekcji nowotworu w terapii nowotworu wątroby, przy czym glipikan 3 jest wyrażany w komórkach nowotworu wątroby poddanych resekcji. [0020] Nie ma szczególnych wymagań względem pochodzenia, typu (monoklonalne czy poliklonalne) i postaci przeciwciała przeciw glipikanowi 3 stosowanego w niniejszym wynalazku. [0021] Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 stosowane w niniejszym wynalazku może być otrzymane znanymi środkami w postaci przeciwciała poliklonalnego lub monoklonalnego. Przeciwciało monoklonalne pochodzenia ssaczego jest szczególnie korzystnym przeciwciałem przeciw glipikanowi 3 do stosowania w niniejszym wynalazku. Przykłady przeciwciała monoklonalnego pochodzenia ssaczego obejmują przeciwciało wytworzone przez hybrydomy i przeciwciało wytworzone przez gospodarza, który był transformowany technikami inżynierii genetycznej wektorem ekspresyjnym obejmującym gen przeciwciała. [0022] Hybrydomę wytwarzającą przeciwciało monoklonalne można przygotować zasadniczo stosując znane techniki, jak poniżej. Hybrydomę można przygotować przez immunizację zwierzęcia według standardowej metody immunizacji, stosując glipikan 3 jako antygen uczulający; fuzję powstałych immunocytów ze znanymi komórkami partnerami standardową techniką fuzji komórek; a następnie wyselekcjonowanie komórek wytwarzających przeciwciało monoklonalne standardową procedurą selekcji. [0023] W konkretnych warunkach, przeciwciało monoklonalne można przygotować następująco. Najpierw, ludzki glipikan 3 do zastosowania jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciał otrzymuje się przez indukowanie ekspresji glipikanu 3 (MXR7) zgodnego z sekwencją

5 PZ/2068/AGR 4 EP B1 genu/aminokwasową jak ujawniona przez Lage, H. et al., Gene 188 (1997), Sekwencję genu i sekwencję aminokwasową glipikanu 3 przedstawiono odpowiednio w SEKW NR ID: 1 i SEKW NR ID: 2. Konkretnie, sekwencja genu kodującego glipikan 3 wstawiana jest do znanego systemu wektora ekspresyjnego; transformowana jest odpowiednia komórka gospodarz; a pożądane białko ludzkiego glipikanu 3 jest następnie oczyszczane znaną metodą, z komórki gospodarza lub z supernatantu z hodowli. [0024] Oczyszczone białko glipikanu 3 jest wówczas stosowane jako antygen uczulający. Alternatywnie, jako antygen uczulający można zastosować częściowy peptyd glipikanu 3. Taki częściowy peptyd można otrzymać przez syntezę chemiczną peptydu zgodnie z sekwencją aminokwasową ludzkiego glipikanu 3. [0025] Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 będzie wykazywało aktywność przeciwnowotworową poprzez swoją aktywność cytotoksyczną, taką jak ADCC (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał) lub CDC (cytotoksyczność zależna od dopełniacza). Również będzie ono wykazywało aktywność przeciwnowotworową przez sprzężenie przeciwciała przeciw glipikanowi 3 z substancją cytotoksyczną taką jak izotop promieniotwórczy, środek chemioterapeutyczny lub toksyna pochodzenia bakteryjnego. Epitop na cząsteczce glipikanu 3, który jest rozpoznawany przez przeciwciało przeciw glipikanowi 3 nie jest ograniczony do konkretnego epitopu. Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 może rozpoznawać dowolny epitop, który jest obecny na cząsteczce glipikanu 3. Zgodnie z tym, dowolny fragment peptydowy obejmujący epitop obecny na cząsteczce glipikanu 3 może być stosowany jako antygen do przygotowania przeciwciała przeciw glipikanowi 3 według niniejszego wynalazku. [0026] Ssak do immunizacji antygenem uczulającym nie jest szczególnie ograniczony i korzystnie wybrany jest w oparciu o rozważenie kompatybilności z komórką partnerem, która będzie stosowana do fuzji komórkowej. Na przykład, zasadniczo stosowane są króliki, małpy lub gryzonie takie jak myszy, szczury i chomiki. [0027] Zwierzę jest immunizowane antygenem uczulającym zgodnie ze znanymi technikami. Na przykład, immunizację można wykonać ogólnym sposobem, w którym ssakowi wstrzykiwany jest antygen uczulający dootrzewnowo lub podskórnie. Konkretnie, antygen uczulający jest rozcieńczany lub zawieszany w odpowiedniej objętości soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), soli fizjologicznej lub podobnych; w razie potrzeby mieszana jest z nimi odpowiednia ilość standardowego adiuwanta takiego jak kompletny adiuwant Freunda; a mieszanina jest emulgowana i podawana ssakowi wielokrotnie, co 4 do 21 dni. Ponadto, podczas immunizacji antygenem uczulającym może być również stosowany odpowiedni nośnik. [0028] Ssacza komórka szpiczaka jest stosowana jako komórka partner do fuzji z wyżej wspomnianym immunocytem. Jako komórkę szpiczaka stosuje się dogodnie liczne znane linie komórkowe, w tym, na przykład P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, ), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. i Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, ), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, ), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, ), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, ), oraz R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, ). [0029] Immunocyty poddawane są fuzji z komórkami szpiczaka, zasadniczo według znanych procedur, na przykład, procedurą według Kohler i Milstein et al. (Kohler, G. i Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

6 PZ/2068/AGR 5 EP B1 [0030] Bardziej konkretnie, fuzję komórkową wykonuje się w standardowej pożywce hodowlanej, w obecności, na przykład, promotora fuzji komórkowej. Na przykład, glikol polietylenowy (PEG), wirus Sendai (znany także jako japoński wirus hemaglutynujący lub HVJ) i tym podobne mogą być stosowane jako promotor fuzji komórkowej. Jeśli to pożądane, można dodać również substancje pomocnicze takie jak dimetylosulfotlenek, w celu dalszego zwiększenia wydajności fuzji. [0031] Immunocyty i komórki szpiczaka mogą być mieszane w dowolnej proporcji. Na przykład, korzystne jest żeby liczba immunocytów wynosiła 1 do 10-krotności liczby komórek szpiczaka. Przykłady pożywek hodowlanych stosowanych dla komórek obejmują, na przykład, pożywkę hodowlaną RPMI1640 lub pożywkę hodowlaną MEM, które są szczególnie odpowiednie do wzrostu wyżej wymienionych linii komórkowych szpiczaka oraz inne standardowe pożywki hodowlane, które są stosowane do hodowli komórek tego typu. Może być również łącznie stosowany dodatek surowicy takiej jak płodowa surowica bydlęca (FCS). [0032] Fuzję komórkową wykonuje się przez dokładne mieszanie ustalonych ilości wyżej wymienionych immunocytów i komórek szpiczaka w wyżej wymienionej pożywce hodowlanej; dodanie roztworu PEG (np. ze średnią masą cząsteczkową około 1000 do 6000) w stężeniu zasadniczo 30 do 60% (wag./obj.), który wcześniej podgrzano do około 37 C; a następnie mieszanie ich tak aby pozwolić na tworzenie pożądanych komórek fuzyjnych (hybrydom). Następnie, dodawana jest odpowiednia pożywka i wirowana w celu usunięcia supernatantu. Proces ten jest powtarzany w celu usunięcia środka do fuzji komórek i innych materiałów niesprzyjających wzrostowi hybrydomy. [0033] Tak otrzymane hybrydomy są wówczas selekcjonowane przez hodowanie ich w standardowej hodowlanej pożywce selekcyjnej, takiej jak pożywka hodowlana HAT (pożywka hodowlana zawierająca hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę). Hodowlę w pożywce hodowlanej HAT kontynuuje się przez okres czasu odpowiedni aby komórki (komórki niefuzyjne) inne niż pożądane hybrydomy obumarły (zazwyczaj kilka dni do kilku tygodni). Następnie wykonywana jest standardowa procedura ograniczających rozcieńczeń w celu selekcji i monoklonowania hybrydomy, która wytwarza pożądane przeciwciało. [0034] W dodatku do wspomnianej wyżej metody otrzymywania hybrydomy przez immunizację antygenem zwierzęcia nie będącego człowiekiem, pożądane ludzkie przeciwciała wykazujące aktywność wiązania z glipikanem 3 można także otrzymać uwrażliwiając ludzkie limfocyty na glipikan 3 in vitro i fuzję uwrażliwionych limfocytów z komórkami szpiczaka ludzkiego pochodzenia, mającymi stałą zdolność do podziałów (patrz japońska publikacja patentowa nr Hei ). Ponad to, glipikan 3 można podawać jako antygen zwierzęciu transgenicznemu mającemu kompletny zestaw ludzkich genów przeciwciał; następnie można otrzymać komórki wytwarzające przeciwciało przeciw glipikanowi 3; i można otrzymać ludzkie przeciwciało przeciwko glipikanowi 3 z komórek wytworzonych przez immortalizację komórek wytwarzających przeciwciało przeciw glipikanowi 3 (patrz międzynarodowe publikacje patentowe nr WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 oraz WO 94/02602). [0035] Tak przygotowana hybrydoma wytwarzająca przeciwciało monoklonalne może być hodowana i pasażowana w standardowej pożywce hodowlanej lub może być długoterminowo przechowywana w ciekłym azocie. [0036] Przeciwciała monoklonalne można otrzymać z hybrydomy przez, na przykład, hodowanie hybrydomy standardowymi metodami i odzyskiwanie przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli, lub hodowlę i wzrost hybrydomy w ssaku kompatybilnym z hybrydomą i otrzymywanie

7 PZ/2068/AGR 6 EP B1 przeciwciał monoklonalnych z płynu puchlinowego. Pierwsza z metod jest odpowiednia do otrzymywania przeciwciała o wysokiej czystości, podczas gdy druga z metod jest odpowiednia do masowego wytwarzania przeciwciała. [0037] Przeciwciało monoklonalne stosowane w niniejszym wynalazku może być rekombinowanym przeciwciałem monoklonalnym przygotowanym technikami inżynierii genetycznej przez klonowanie genu przeciwciała z hybrydomy, włączenie genu do odpowiedniego wektora, wprowadzenie wektora do gospodarza i spowodowanie, że gospodarz wytwarza rekombinowane przeciwciało monoklonalne (np. patrz Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, , 1990). [0038] Konkretnie, mrna kodujący region zmienny (V, ang. variable) przeciwciała przeciw glipikanowi 3 jest izolowany z hybrydomy, która wytwarza przeciwciało przeciw glipikanowi 3. mrna może być izolowany znanym sposobem, na przykład, przez ekstrakcję całkowitego RNA metodą ultrawirowania w guanidynie (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, ) lub metodą AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, ), a następnie izolację pożądanego mrna z zastosowaniem zestawu do oczyszczania mrna mrna Purification Kit (Pharmacia) lub podobnych. Ponadto, mrna można także ekstrahować bezpośrednio stosując zestaw do oczyszczania mrna - QuickPrep mrna Purification Kit (Pharmacia). [0039] cdna regionu V przeciwciała syntetyzowany jest z tak otrzymanego mrna z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy. Syntezę cdna można przeprowadzić stosując, na przykład, zestaw do syntezy pierwszej nici cdna - AMV Reverse Transcriptase First-Strand cdna Synthesis Kit (Seikagaku Corporation) i podobne. Syntezę i amplifikację cdna można również przeprowadzić, na przykład, metodą 5 -RACE z zastosowaniem zestawu 5 -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) i PCR (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, , Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, ). [0040] Docelowy fragment DNA jest oczyszczany z tak otrzymanego produktu PCR, a następnie ligowany z wektorem DNA w celu wytworzenia wektora rekombinowanego. Wektor jest wówczas wprowadzany do, na przykład, E. coli; a selekcja kolonii prowadzi do uzyskania pożądanego wektora rekombinowanego. Sekwencja nukleotydowa docelowego DNA jest wówczas ustalana znanym sposobem, takim jak metoda terminacji łańcucha z zastosowanie dideoksynukleotydów. [0041] Po otrzymaniu DNA kodującego region V docelowego przeciwciała przeciw glipikanowi 3, DNA ten jest włączany do wektora ekspresyjnego, który obejmuje DNA kodujący region stały (region C, ang. constant) pożądanego przeciwciała. [0042] W celu wytworzenia przeciwciała przeciw glipikanowi 3 do stosowania w niniejszym wynalazku, gen przeciwciała jest włączany do wektora ekspresyjnego w taki sposób, że gen jest wyrażany pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję, na przykład, sekwencji wzmacniającej (enhancera) i promotora. Następnie, wektorem ekspresyjnym transformowana jest komórka gospodarza i indukowana jest ekspresja przeciwciała. [0043] Gen przeciwciała może być wyrażony przez włączenie DNA kodującego łańcuch ciężki przeciwciała (łańcuch H, ang. heavy) i DNA kodującego łańcuch lekki przeciwciała (łańcuch L, ang. light) osobno do wektorów ekspresyjnych, a następnie równoczesne transformowanie komórki gospodarza tymi wektorami; lub przez włączenie DNA kodujących łańcuch H i łańcuch L do jednego wektora ekspresyjnego i transformowanie komórki gospodarza tym wektorem (patrz WO 94/11523).

8 PZ/2068/AGR 7 EP B1 [0044] Poza komórką gospodarzem jak opisano powyżej, do wytwarzania rekombinowanego przeciwciała można też zastosować zwierzę transgeniczne. Na przykład, można przygotować gen fuzyjny przez wstawienie genu przeciwciała do genu kodującego białko (np. kozią β-kazeinę), które będzie wytwarzane w mleku. Fragment DNA obejmujący gen fuzyjny z wstawionym genem przeciwciała jest wówczas wstrzykiwany do zarodka koziego, a zarodek jest wprowadzany do samicy kozy. Pożądane przeciwciało może być otrzymane z mleka wytwarzanego przez kozę transgeniczną (lub jej potomstwo) urodzoną z kozy, która otrzymała zarodek. Ponadto, kozie transgenicznej można podawać odpowiednie hormony w celu zwiększenia objętości mleka wytwarzanego przez kozę transgeniczną, które zawiera pożądane przeciwciało (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, ). [0045] Poza wspomnianymi wyżej przeciwciałami, w niniejszym wynalazku mogą znaleźć zastosowanie sztucznie modyfikowane przeciwciała rekombinowane genetycznie, takie jak przeciwciała chimeryczne i przeciwciała humanizowane, dla celów obniżenia heteroantygenowości u ludzi. Te modyfikowane przeciwciała mogą być wytwarzane już znanymi sposobami. [0046] Przeciwciała chimeryczne można otrzymać przez ligację DNA kodującego region V przeciwciała (otrzymanego jak opisano wyżej) z DNA kodującym region C ludzkiego przeciwciała, włączenie produktu do wektora ekspresyjnego, a następnie wprowadzenie wektora do gospodarza i indukcję wytwarzania. Przeciwciała chimeryczne użyteczne dla niniejszego wynalazku można otrzymać takimi, znanymi już metodami. [0047] Przeciwciała humanizowane, które są także określane jako przekształcone ludzkie przeciwciała, są przygotowywane przez przeszczepienie regionu determinującego dopasowanie (CDR, ang. complementarity determining region) przeciwciała ze ssaka nie będącego człowiekiem, takiego jak mysz, do regionu determinującego dopasowanie z ludzkiego przeciwciała. Ogólne techniki rekombinacji genetycznej dla tej procedury są także znane w dziedzinie (patrz EP i WO 96/02576). [0048] Konkretnie, sekwencja DNA zaprojektowana tak żeby łączyć CDR mysiego przeciwciała z regionem zrębowym (FR, ang. framework region) ludzkiego przeciwciała, jest syntetyzowana przez PCR z zastosowaniem kilku oligonukleotydów jako starterów, skonstruowanych tak żeby miały regiony, które nakładają się na regiony końcowe zarówno CDR jak i FR (patrz sposób opisany w WO 98/13388). [0049] Region zrębowy, w którym region determinujący dopasowanie tworzy doskonałe miejsce wiążące antygen, wybierany jest dla regionu zrębowego ludzkiego przeciwciała połączonego z regionami CDR. Aminokwasy w regionie zrębowym w regionie zmiennym przeciwciała mogą być podstawiane, jeśli to konieczne, tak aby region determinujący dopasowanie przekształconego ludzkiego przeciwciała tworzył odpowiednie miejsce wiążące antygen (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, ). [0050] Regiony C ludzkich przeciwciał są stosowane jako regiony C przeciwciał chimerycznych i przeciwciał humanizowanych. Na przykład, do łańcucha H stosowane mogą być Cγ1, Cγ2, Cγ3 i Cγ4, a do łańcucha L stosowane mogą być Cκ i Cλ. Ponadto, region C ludzkiego przeciwciała może być modyfikowany w celu poprawy stabilności przeciwciała lub procesu jego wytwarzania. [0051] Przeciwciało chimeryczne składa się z regionu zmiennego z przeciwciała pochodzącego od ssaka nie będącego człowiekiem oraz regionu stałego pochodzącego z ludzkiego przeciwciała, przy czym przeciwciało humanizowane składa się z regionu determinującego dopasowanie z przeciwciała pochodzącego od ssaka nie będącego człowiekiem oraz regionu zrębowego i regionu C pochodzących z ludzkiego przeciwciała. Ponieważ przeciwciało humanizowane jest zaprojektowane tak aby miało niską

9 PZ/2068/AGR 8 EP B1 antygenowość u ludzi, jest ono użyteczne jako składnik aktywny w środku terapeutycznym według niniejszego wynalazku. [0052] Przeciwciało stosowane w niniejszym wynalazku nie jest ograniczone do całej cząsteczki przeciwciała, dopóki może ono wiązać się z glipikanem 3 i hamować aktywność glipikanu 3, i tym samym obejmuje fragmenty przeciwciał i ich modyfikacje jak również przeciwciała biwalentne i przeciwciała monowalentne. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują Fab, F(ab ) 2, Fv, Fab/c mające jeden Fab i kompletny Fc oraz jednołańcuchowe Fv (scfv), w których Fv łańcucha H lub łańcucha L jest połączony odpowiednim łącznikiem. Konkretnie, fragment przeciwciała może być wytworzony przez traktowanie przeciwciała enzymem takim jak papaina lub pepsyna. Alternatywnie, gen kodujący taki fragment przeciwciała może być skonstruowany i wprowadzony do wektorów ekspresyjnych i wyrażany przez odpowiednie komórki gospodarzy (patrz np. Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, , Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, , Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, , Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, , Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, , and Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, ). [0053] scfv jest otrzymywany przez połączenie regionu V łańcucha H i regionu V łańcucha L przeciwciała. Region V łańcucha H i region V łańcucha L są połączone w scfv przez łącznik, a korzystnie łącznik peptydowy (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, ). Region V łańcucha H i region V łańcucha L z scfv mogą pochodzić z dowolnego z opisanych tutaj przeciwciał. Łącznik peptydowy łączący regiony V może być, na przykład, dowolnym jednołańcuchowym peptydem obejmującym 12 do 19 reszt aminokwasowych. [0054] DNA kodujący scfv można otrzymać następująco. DNA kodujący łańcuch H lub region V łańcucha H wyżej wspomnianego przeciwciała oraz DNA kodujący łańcuch L lub region V łańcucha L są amplifikowane przez PCR z zastosowaniem jako matryc regionów DNA kodujących wszystkie lub pożądane sekwencje aminokwasowe z wyżej wspomnianych sekwencji oraz par starterów, które określają oba końce powyższych. Następnie wykonywana jest dodatkowa amplifikacja z kombinacją DNA kodującego region łącznika peptydowego i pary starterów, która określa oba końce, które mają być ligowane z łańcuchem H i łańcuchem L. [0055] Ponadto, gdy przygotowany jest DNA kodujący scfv, wektor ekspresyjny obejmujący ten DNA oraz gospodarza transformowanego wektorem ekspresyjnym można otrzymać według standardowych metod. scfv można wówczas otrzymać standardowymi metodami stosując takiego gospodarza. [0056] Fragment przeciwciała można wytworzyć przygotowując gen kodujący ten fragment i wyrażając go w gospodarzu w taki sam sposób jak opisano wyżej. Stosowany tutaj termin przeciwciało obejmuje także te fragmenty przeciwciał. [0057] Innym przykładem modyfikowanego przeciwciała stosowanego w wynalazku jest przeciwciało przeciw glipikanowi sprzężone z dowolną z różnych cząsteczek, takich jak glikol polietylenowy (PEG). Stosowany tutaj termin przeciwciało obejmuje także te modyfikowane przeciwciała. Takie modyfikowane przeciwciało można przygotować modyfikując chemicznie przeciwciało uzyskane jak wyżej. Sposoby modyfikacji przeciwciała są już ustalone w dziedzinie. [0058] Przeciwciało stosowane w niniejszym wynalazku może być przeciwciałem dwuswoistym. Przeciwciało dwuswoiste może mieć miejsca wiążące antygen, które rozpoznają różne epitopy na cząsteczce glipikanu 3, lub jedno miejsce wiążące antygen może rozpoznawać glipikan 3 a drugie

10 PZ/2068/AGR 9 EP B1 miejsce wiążące antygen może rozpoznawać substancję cytotoksyczną taką jak środek chemioterapeutyczny lub toksynę pochodzenia komórkowego. To pozwala substancji cytotoksycznej działać bezpośrednio na komórkę wyrażającą glipikan 3, tym samym swoiście uszkadzając komórki guza i hamując proliferację komórek guza. Przeciwciało dwuswoiste można przygotować łącząc pary H-L dwóch typów przeciwciał. Można je także otrzymać przez fuzję hybrydom, które wytwarzają różne przeciwciała monoklonalne w celu przygotowania komórek fuzyjnych wytwarzających przeciwciało dwuswoiste. Przeciwciała dwuswoiste można także przygotować technikami inżynierii genetycznej. [0059] Gen przeciwciała skonstruowany jak opisano wyżej może być wyrażany i otrzymywany znanymi sposobami. W przypadku komórek ssaczych, gen może być wyrażany przez połączenie operacyjne powszechnie stosowanego skutecznego promotora, genu przeciwciała, który ma być wyrażany oraz sygnału polia poniżej jego końca 3. Przykładem promotora/sekwencji wzmacniającej (enhancera) jest bezpośredni wczesny (ang. immediate early) promotor/enhancer ludzkiego wirusa cytomegalii. [0060] Przykłady innych promotorów/sekwencji wzmacniających (enhancerów), które można stosować w niniejszym wynalazku do wyrażania przeciwciała obejmują, na przykład, wirusowe promotory/sekwencje wzmacniające (enhancery) z retrowirusa, poliomawirusa, adenowirusa lub małpiego wirusa 40 (SV40) oraz promotory/sekwencje wzmacniające (enhancery) pochodzące z komórek ssaczych, takie jak ludzki czynnik elongacyjny 1α (HEF1α). [0061] Kiedy stosowany jest promotor/sekwencja wzmacniająca (enhancer) SV40, ekspresję genów można łatwo przeprowadzić metodą według Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108), a gdy stosowany jest promotor/sekwencja wzmacniająca (enhancer) HEF1α, ekspresję genów można łatwo przeprowadzić metodą według Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322). [0062] W przypadku E. coli, ekspresję genu można osiągnąć przez operacyjne połączenie skutecznego promotora, sekwencji sygnałowej dla sekrecji przeciwciała oraz genu przeciwciała, który ma być wyrażany. Promotorem może być przykładowo promotor lacz i promotor arab. Gdy stosowany jest promotor lacz, ekspresję można osiągnąć metodą według Ward et al. (Nature (1998) 341, ; FASEB J. (1992) 6, ), a gdy stosowany jest promotor arab, ekspresję można osiągnąć metodą według Better et al. (Science (1988) 240, ). [0063] W odniesieniu do sekwencji sygnałowej dla sekrecji przeciwciała, sekwencja sygnałowa pelb (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) może być stosowana gdy przeciwciało jest wytwarzane w peryplazmie E. coli. Po wyizolowaniu przeciwciała wytwarzanego w peryplazmie, korzystnie jest odtworzyć sfałdowanie przeciwciała przed stosowaniem. [0064] Origin replikacji stosowany w wynalazku obejmuje, na przykład, te pochodzące z SV40, poliomawirusa, adenowirusa lub wirusa brodawczaka bydła (BPV). W celu zwiększenia liczby kopii genu w systemie komórki gospodarza, wektor ekspresyjny może obejmować, na przykład, gen transferazy aminoglikozydowej (APH), kinazy tymidynowej (TK), gen fosforybozylotransferazy ksantynowoguaninowej E. coli (Ecogpt) lub gen reduktazy dihydrofolianu (dhfr) jako marker selekcyjny. [0065] Dowolny system ekspresyjny, na przykład system komórek eukariotycznych lub system komórek prokariotycznych, może być stosowany do wytwarzania przeciwciała stosowanego w niniejszym wynalazku. Przykłady komórek eukariotycznych obejmują komórki zwierzęce takie jak ustalony system komórek ssaczych lub system komórek owadzich oraz komórki grzybów nitkowatych właściwych i komórki drożdży. Przykłady komórek prokariotycznych obejmują komórki bakteryjne takie jak komórki E. coli.

11 PZ/2068/AGR 10 EP B1 [0066] Przeciwciało stosowane w niniejszym wynalazku jest korzystnie wyrażane w komórkach ssaczych takich jak komórki CHO, COS, szpiczaka, BHK, Vero lub HeLa. [0067] Transformowana komórka gospodarz jest następnie hodowana in vitro lub in vivo w celu zaindukowania wytwarzania pożądanego przeciwciała. Komórkę gospodarza można hodować według znanych metod. Na przykład, można stosować DMEM, MEM, RPMI1640 lub IMDM jako pożywkę hodowlaną. Można również stosować dodatek surowicy takiej jak płodowa surowica bydlęca (FCS). [0068] Można stosować znane środki do oceniania aktywności wiązania antygenu dla przeciwciała stosowanego w niniejszym wynalazku (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) oraz do mierzenia jego aktywności hamującej wiązanie liganda z receptorem (Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, ). [0069] Aktywność wiązania antygenu przeciwciała przeciw glipikanowi 3 stosowanego w niniejszym wynalazku można zmierzyć stosując test ELISA (test immunoenzymosorbcyjny), EIA (test immunoenzymatyczny), RIA (test radioimmunologiczny) lub technikę przeciwciał fluorescencyjnych. W teście immunoenzymatycznym, na przykład, aktywność wiązania antygenu można ocenić przez dodanie próbki zawierającej przeciwciało przeciw glipikanowi 3, takiej jak supernatant z hodowli z komórek wytwarzających przeciwciało przeciw glipikanowi 3 lub oczyszczone przeciwciało, na płytkę opłaszczoną glipikanem 3; dodanie przeciwciała drugorzędowego znakowanego enzymem takim jak fosfataza alkaliczna; inkubację a następnie płukanie płytki; dodanie substratu enzymatycznego takiego jak fosforan p-nitrofenylu; oraz mierzenie absorbancji. Cytotoksyczność przeciwciała stosowanego w niniejszym wynalazku można mierzyć sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie. [0070] Aktywność ADCC można mierzyć mieszając komórki efektorowe, komórki docelowe i przeciwciało przeciw glipikanowi 3 a następnie ustalając poziom ADCC. Na przykład, mysie splenocyty lub monocyty izolowane ze szpiku kostnego lub ludzka krew obwodowa mogą być stosowane jako komórki efektorowe. Przykłady komórek docelowych obejmują ustaloną ludzką linię komórkową, taką jak linie komórkowa ludzkiego wątrobiaka HuH-7. Aktywność ADCC można mierzyć przez wstępne znakowanie komórek docelowych 51 Cr, dodanie do komórek przeciwciała przeciw glipikanowi 3; inkubację komórek; następnie dodanie komórek efektorowych w odpowiednim stosunku w odniesieniu do komórek docelowych; zebranie supernatantu po inkubacji; oraz zliczenie radioaktywności w supernatancie. [0071] Aktywność CDC można mierzyć mieszając wyżej wspomniane wyznakowane komórki docelowe z przeciwciałem przeciw glipikanowi 3; dodanie dopełniacza i inkubację; a następnie zliczenie radioaktywności w supernatancie. [0072] Ponieważ zasadniczo wymagany jest region Fc żeby przeciwciało wykazywało cytotoksyczność, przeciwciało przeciw glipikanowi 3 stosowane w niniejszym wynalazku korzystnie zawiera region Fc w tych przypadkach gdy inhibitor wzrostu komórek według niniejszego wynalazku wykorzystuje aktywność cytotoksyczną przeciwciała. [0073] Środek przeciwnowotworowy według niniejszego wynalazku jest do stosowania w sposobie zapobiegania nawrotom nowotworu w wyniku mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych u pacjenta po resekcji nowotworu w terapii nowotworu wątroby, przy czym glipikan 3 jest wyrażany w komórkach nowotworu wątroby poddanych resekcji. [0074] Skuteczna dawka wybrana jest z zakresu 0,001 mg do 1000 mg na kg masy ciała na podanie. Lub, dawka może być wybrana z zakresu 0,01 do mg/ciało na pacjenta. Jednakże, skuteczna

12 PZ/2068/AGR 11 EP B1 dawka środka przeciwnowotworowego według niniejszego wynalazku zawierającego przeciwciało przeciw glipikanowi 3, nie jest ograniczona do dawek opisanych powyżej. [0075] Środek przeciwnowotworowy według niniejszego wynalazku jest zasadniczo podawany drogą pozajelitową, na przykład, przez wstrzyknięcie (np. podskórnie, dożylnie, domięśniowo, dootrzewnowo) lud drogą przezskórną, przez błony śluzowe, donosową lub dopłucną. Może on być także podawany doustnie. [0076] W odniesieniu do czasu podawania środka przeciwnowotworowego według niniejszego wynalazku, może on być podawany przed lub po pojawieniu się klinicznych objawów choroby. Środek przeciwnowotworowy według niniejszego wynalazku jest podawany w terapii adiuwantowej po resekcji komórek nowotworu wątroby. [0077] Środek terapeutyczny obejmujący przeciwciało przeciw glipikanowi 3 według niniejszego wynalazku jako składnik aktywny, może być formułowany standardowymi metodami (Remington s Pharmaceutical Science, ostatnie wydanie, Mark Publishing Company, Easton, USA) i może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i dodatki. [0078] Te nośniki i dodatki farmaceutyczne mogą obejmować wodę, farmaceutycznie akceptowalne rozpuszczalniki organiczne, kolagen, alkohol poliwinilowy, poliwinylopirolidon, polimer karboksywinylowy, karboksymetylocelulozę sodową, poliakrylan sodu, alginian sodu, rozpuszczalny w wodzie dekstran, karboksymetyloskrobię sodową, pektynę, metylocelulozę, etylocelulozę, gumę ksantanową, gumę arabską, kazeinę, agar, glikol polietylenowy, diglicerynę, glicerynę, glikol propylenowy, wazelinę, parafinę, alkohol stearynowy, kwas stearynowy, ludzką albuminę osocza (HSA), mannitol, sorbitol, laktozę oraz środek powierzchniowo czynny dopuszczalny jako dodatek farmaceutyczny. [0079] Taki dodatek lub dodatki mogą być odpowiednio wybrane zgodnie z postacią dawkowania środka terapeutycznego według niniejszego wynalazku, ale nie są ograniczone do wypisanych powyżej. Na przykład, formulacja wstrzykiwalna może być przygotowana przez rozpuszczenie oczyszczonego przeciwciała przeciw glipikanowi 3 w rozpuszczalniku takim jak sól fizjologiczna, bufor lub roztwór glukozy, a następnie dodanie inhibitora adsorpcji takiego jak Tween 80, Tween 20, żelatyna lub ludzka albumina osocza do roztworu. Albo, do przygotowania postaci dawkowania może być stosowany środek liofilizowany, który jest odtwarzany przez rozpuszczenie przed użyciem. Przykłady zaróbki stosowanej do liiofilizatu obejmują alkohole cukrowe i cukry takie jak mannitol i glukoza. PRZYKŁADY [0080] Niniejszy wynalazek jest opisany w większych szczegółach poprzez przedstawione poniżej przykłady, które nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku. Przykład 1 Skuteczność mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu glipikanowi 3 GC33 w modelu myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym (1) Pomiar α-fetoproteiny (AFP) [0081] Stężenie ludzkiej AFP w surowicy mierzono jako marker guza stosując zestaw ELISA do pomiaru ludzkiej AFP (Hope Laboratories). Granica wykrywalności przy ELISA wynosi około 1 ng/ml, a dla próbek poniżej granicy wykrywalności przyjmowano 1 ng/ml. W celu otrzymania surowicy, pobierano krew do

13 PZ/2068/AGR 12 EP B1 Separapit S (Sekisui Chemical) przez zebranie krwi z oczodołu, pozostawiano na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez 20 minut przy 1200 x g. (2) Przygotowanie modelu myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym [0082] Model myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym przygotowano następująco. Komórki HepG2 (ATCC) doprowadzano do 1 x 10 8 /ml stosując pożywkę Hanks (Sigma). Przy znieczuleniu nembutalem, wstrzykiwano 50 µl zawiesiny komórek HepG2 (5 x 10 6 /mysz) do torebki wątroby nagich myszy (Charles River). Stężenie AFP w surowicy mierzono w dniu 21 po przeszczepie, a zwierzęta w zakresie ng.ml dzielono na dwie grupy (n = 4). W tym momencie, komórek nowotworu wątroby (masy guza) nie obserwowano wizualnie. Zwierzęta te reprezentują model niosący mikroprzerzuty wewnątrzwątrobowe ocalałe po resekcji wątroby. (3) Podawanie przeciwciała [0083] Formulację do podania przygotowywano w dniu podania przez rozcieńczenie mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu glipikanowi 3 GC33 (patrz Przykład Odniesienia poniżej) do 0,5 mg/ml w soli fizjologicznej (Otsuka Pharmaceutical). Formulację podawano wyżej wspomnianemu modelowi myszy przy 10 ml/kg przez żyłę ogonową w dniach 21-szym i 28-mym po przeszczepie guza. Nośnik sól fizjologiczną podawano w taki sam sposób jako kontrolę negatywną. (4) Ocena skuteczności przeciw guzowi [0084] Skuteczność przeciw guzowi oceniano w oparciu o stężenie AFP w 35-tym dniu po przeszczepie guza. Jak przedstawiono na Figurze 1, stężenie AFP w 35-tym dniu po przeszczepie guza było niższe dla grupy otrzymującej GC33 niż dla grupy otrzymującej nośnik, co wskazuje, że przeciwciało według wynalazku ma działanie przeciw guzowi. [0085] Jak przedstawiono w powyższych wynikach, GC33 wykazywało działanie przeciw guzowi w modelu mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych, co wskazuje, że przeciwciało według wynalazku jest użyteczne w terapii adiuwantowej. Przykład 2 Test wczesnego podania mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu glipikanowi 3 GC33 w modelu myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym (1) Pomiar α-fetoproteiny (AFP) [0086] Stężenie ludzkiej AFP w surowicy mierzono jako marker guza stosując zestaw ELISA do pomiaru ludzkiej AFP (Hope Laboratories). Granica wykrywalności przy ELISA wynosi około 1 ng/ml, a dla próbek poniżej granicy wykrywalności przyjmowano 1 ng/ml. W celu otrzymania surowicy, pobierano krew do Separapit S (Sekisui Chemical) przez zebranie krwi z oczodołu, pozostawiano na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez 20 minut przy 1200 x g. (2) Przygotowanie modelu myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym [0087] Model myszy z przeszczepem wewnątrzwątrobowym przygotowano następująco. Komórki HepG2 (ATCC) doprowadzano do 1 x 10 8 /ml stosując pożywkę Hanks (Sigma). Przy znieczuleniu nembutalem, wstrzykiwano 50 µl zawiesiny komórek HepG2 (5 x 10 6 /mysz) do torebki wątroby nagich myszy (Charles River). W następnym dniu po przeszczepie, zwierzęta losowo podzielono na dwie grupy (n = 10). Mimo że HepG2 były obecne w wątrobie myszy w następnym dniu po przeszczepie, w tym czasie w mysiej surowicy nie wykryto ludzkiej AFP. Te zwierzęta reprezentują bliższy klinicznie model niosący mikroprzerzuty wewnątrzwątrobowe pozostałe po resekcji wątroby.

14 PZ/2068/AGR 13 EP B1 (3) Podawanie przeciwciała [0088] Formulację do podania przygotowywano w dniu podania przez rozcieńczenie mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu glipikanowi 3 GC33 (patrz Przykład Odniesienia poniżej) do 0,5 mg/ml w soli fizjologicznej (Otsuka Pharmaceutical). Formulację podawano wyżej wspomnianemu modelowi myszy przy 10 ml/kg przez żyłę ogonową w następnym dniu po przeszczepie guza oraz w 7-mym dniu po przeszczepie guza. Nośnik sól fizjologiczną podawano w taki sam sposób jako kontrolę negatywną. (4) Ocena skuteczności przeciw guzowi [0089] Skuteczność przeciw guzowi oceniano w oparciu o stężenie AFP w 15-tym i 40-tym dniu po przeszczepie guza. Jak przedstawiono na Figurze 2, w żadnym punkcie czasowym nie obserwowano wzrostu w stężeniu AFP w grupie otrzymującej GC33. Przeciwnie, obserwowano wzrost w stężeniu AFP w grupie otrzymującej nośnik. [0090] Jak przedstawiono w powyższych wynikach, wzrost guza był zahamowany również w modelu, w którym komórki nowotworu wątroby przeszczepiono wewnątrzwątrobowo, przez podanie mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu glipikanowi 3 GC33 od wczesnego etapu gdy nie wykrywano AFP, co wskazuje, że przeciwciało według niniejszego wynalazku jest użyteczne w terapii adiuwantowej. Przykład Odniesienia Przygotowanie mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu glipikanowi 3 GC33 [0091] Stosując jako immunogen białko fuzyjne (GC-3) z GST i peptydu glipikanu 3 od alaniny w pozycji 524 do lizyny w pozycji 563, immunizowano trzy myszy Balb/c (kupione z Charles River Japonia) i trzy myszy MRL/lpr. Przy immunizacji początkowej, emulsję przygotowaną z FCA i doprowadzoną do 100 µg GC-3 na głowę podawano podskórnie. Po dwóch tygodniach, emulsję przygotowaną z FIA i doprowadzoną do 50 µg na głowę podawano podskórnie. Po piątej immunizacji, 50 µg na głowę wstrzykiwano do żyły ogonowej wszystkim myszom jako ostatnią immunizację, a następnie wykonywano fuzję komórek. Hybrydomy selekcjonowano testem ELISA stosując płytki, na których immobilizowano rozpuszczalne białko rdzeniowe GPC3 (z usuniętym regionem hydrofobowym od aminokwasu 564 do 580 ze strony C-końca). Selekcjonowano klony pozytywne i monoklonowano je metodą ograniczających rozcieńczeń. W ten sposób, otrzymano przeciwciało GC33 wykazujące silną aktywność wiązania dla GPC3. Sekwencję aminokwasową regionów zmiennych łańcucha H i łańcucha L z GC33 przedstawiono w odpowiednio SEKW NR ID: 3 i SEKW NR ID: 4. ZASTOSOWANIE PRZEMYSŁOWE [0092] Środek przeciwnowotworowy według niniejszego wynalazku jest użyteczny w zapobieganiu nowotworowi i zapobieganiu nawrotom nowotworu.

15 PZ/2068/AGR 14 EP B1 LISTA SEKWENCJI [0093] PRT - białko <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> Terapia adiuwantowa z zastosowaniem przeciwciała przeciw glipikanowi 3 <130> N <140> EP <141> <150> PCT/JP05/15607 <151> <150> JP <151> <150> JP <151> <160> 4 <170> PatentIn wersja 3.1 <210> 1 <211> 1743 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 <210> 2 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens

16 PZ/2068/AGR 15 EP B1 <400> 2

17 PZ/2068/AGR 16 EP B1 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

18 PZ/2068/AGR 17 EP B1 Zastrzeżenia 1. Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 do zastosowania w sposobie zapobiegania nawrotom nowotworu w wyniku mikroprzerzutów wewnątrzwątrobowych u pacjenta po resekcji nowotworu w terapii nowotworu wątroby, przy czym glipikan 3 jest wyrażany w komórkach nowotworu wątroby poddanych resekcji. 2. Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 do stosowania w sposobie według zastrzeżenia 1, przy czym wymienione przeciwciało jest podawane tak aby nieobserwowany był wzrost stężenia AFP w surowicy pacjenta. 3. Przeciwciało przeciw glipikanowi do stosowania w sposobie według dowolnego z zastrzeżeń 1 lub 2, przy czym przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. 4. Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 do stosowania w sposobie według zastrzeżenia 3, przy czym przeciwciało monoklonalne jest przeciwciałem humanizowanym. 5. Przeciwciało przeciw glipikanowi 3 do stosowania w sposobie według zastrzeżenia 4, przy czym przeciwciało humanizowane obejmuje CDRy regionu zmiennego łańcucha ciężkiego jak przedstawiono w SEKW NR ID: 3 oraz CDRy regionu zmiennego łańcucha lekkiego jak przedstawiono w SEKW NR ID: 4.

19 PZ/2068/AGR 18 EP B1

20 PZ/2068/AGR 19 EP B1 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie WO A [0005] WO A [0006] EP A1 [0006] JP HEI B [0034] WO A [0034] WO A [0034] WO A [0034] WO A [0034] WO A [0043] EP A [0047] WO A [0047] WO A [0048] EP A [0093] JP W [0093] JP A [0093] JP A [0093] Literatura nie patentowa, cytowana w opisie FILMUS, J.; CHURCH, J.G. ; BUICK, R.N. Mol. Cell. Biol., 1988, tom 8, [0004] FILMUS, J. ; SHI, W. ; WONG, Z.-M. ; WONG, M.J. Biochem. J., 1995, vol. 311, [0004] HERMANN LAGE et al. Gene, 1997, tom 188, [0004] PILIA, G. et al. Nat. Genet., 1996, tom 12, [0004] HEY-CHI HSU et al. Cancer Research, 1997, tom 57, [0005] CARTER et al. Nature Reviews Cancer, 2001, tom 1, [0007] LAGE, H. et al. Gene, 1997, tom 188, [0023] J. Immunol., 1979, tom 123, [0028] Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, tom 81, 1-7 [0028] KOHLER, G. ; MILSTEIN, C. Eur. J. Immunol., 1976, tom 6, [0028] MARGULIES, D. H. et al. Cell, 1976, tom 8, [0028] SHULMAN, M. et al. Nature, 1978, tom 276, [0028] DE ST. GROTH, S. F. et al. J. Immunol. Methods, 1980, tom 35, 1-21 [0028] TROWBRIDGE, I. S. J. Exp. Med., 1978, tom 148, [0028] GALFRE, G. et al. Nature, 1979, tom 277, [0028] KOHLER, G. ; MILSTEIN, C. Methods Enzymol., 1981, tom 73, 3-46 [0029] VANDAMME, A. M. et al. Eur. J. Biochem., 1990, tom 192, [0037] CHIRGWIN, J. M. et al. Biochemistry, 1979, tom 18, [0038] CHOMCZYNSKI, P. et al. Anal. Biochem., 1987, tom 162, [0038] FROHMAN, M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, tom 85, [0039] BELYAVSKY, A. et al. Nucleic Acids Res., 1989, tom 17, [0039] EBERT, K. M. et al. Bio/Technology, 1994, tom 12, [0044] SATO, K. et al. Cancer Res., 1993, tom 53, [0049] CO, M.S. et al. J. Immunol., 1994, tom 152, [0052] BETTER, M.; HORWITZ, A. H. Methods in Enzymology. Academic Press, Inc, 1989, tom 178, [0052] PLUECKTHUN, A. ; SKERRA, A. Methods in Enzymology. Academic Press, Inc, 1989, tom 178, [0052] LAMOYI, E. Methods in Enzymology, 1989, tom 121, [0052] ROUSSEAUX, J. et al. Methods in Enzymology, 1989, tom 121, [0052] BIRD, R. E. et al. TIBTECH, 1991, tom 9, [0052] HUSTON, J. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, tom 85, [0053] MULLIGAN et al. Nature, 1979, tom 277, 108 [0061] MIZUSHIMA et al. Nucleic Acids Res., 1990, tom 18, 5322 [0061] WARD et al. Nature, 1998, tom 341, [0062] FASEB J., 1992, tom 6, [0062] BETTER et al. Science, 1988, tom 240, [0062] LEI, S. P. et al. J. Bacteriol., 1987, tom 169, 4379 [0063] ED HARLOW ; DAVID LANE. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0068] HARADA, A. et al. International Immunology, 1993, tom 5, [0068] Remington s Pharmaceutical Science. Mark Publishing Company [0077]