Wykorzystanie materiałów opartych na częściowo redukowanym tlenku grafenu z nanocząstkami srebra jako środków bakteriostatycznych i bakteriobójczych

Transkrypt

1 prace oryginalne Polim. Med. 2013, 43, 3, ISSN Copyright by Wroclaw Medical University Anna Kędziora 1, A D, Yurij Gerasymchuk 2, A D, Ewa Sroka 1, B, Gabriela Bugla-Płoskońska 1, E, F, Włodzimierz Doroszkiewicz 1, E, F, Zbigniew Rybak 3, E, Darek Hreniak 2, C, Rafał Wiglusz, 2, A, F Wiesław Stręk Wykorzystanie materiałów opartych na częściowo redukowanym tlenku grafenu z nanocząstkami srebra jako środków bakteriostatycznych i bakteriobójczych Use of the Materials Based on Partially Reduced Graphene-Oxide with Silver Nanoparticle as Bacteriostatic and Bactericidal Agent 1 Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Wydział Nauk Biologicznych, Uniwersytet Wrocławski, Wrocław, Polska 2 Instytut Niskich Temperatur i Badań Strukturalnych, Polska Akademia Nauk, Wrocław, Polska 3 Zakład Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Wrocław, Polska A koncepcja i projekt badania; B gromadzenie i/lub zestawianie danych; C analiza i interpretacja danych; D napisanie artykułu; E krytyczne zrecenzowanie artykułu; F zatwierdzenie ostatecznej wersji artykułu; G inne Streszczenie Wprowadzenie. Otrzymywanie nanokompozytów o właściwościach antybakteryjnych jest podejmowane od kilkunastu lat. Wiele przeprowadzonych badań potwierdza antybakteryjną aktywność materiałów zawierających srebro lub oksygrafen. Cel pracy. Zbadanie i opisanie właściwości bioaktywnych grafenu jako nośnika inkrustowanego nanocząstkami srebra. Materiały i metody: Badania mikrobiologiczne zostały wykonane na szczepach referencyjnych bakterii z gatunków Staphylococcus aureus ATCC 6538 (gronkowiec złocisty), Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 (pałeczka zapalenia płuc) oraz Escherichia coli ATCC (pałeczka okrężnicy), a także na izolatach klinicznych szczepów należących do tych gatunków. Wrażliwość patogenów wyznaczono, określając minimalne stężenie hamujące wzrost (MIC) oraz minimalne stężenie bójcze (MBC) metodą seryjnych rozcieńczeń w bulionie według rekomendacji NCCLS (CLSI) doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki lub chemioterapeutyki. Nanokompozyty scharakteryzowano pod względem strukturalnym, spektralnym i morfologicznym. Wyniki. W wyniku przeprowadzonych badań mikrobiologicznych wykazano właściwości bakteriostatyczne (w zakresie 0,4 1,6 µg/ml) i biobójcze (w zakresie 0,4 3,2 µg/ml) otrzymanych nanokompozytów. Wnioski. Otrzymane nanokompozyty mogą znaleźć zastosowanie w medycynie jako środek bakteriostatyczny i bakteriobójczy oraz stanowić bardzo skuteczną alternatywę wobec dotychczas stosowanych antybiotyków i chemioterapeutyków (Polim. Med. 2013, 43, 3, ). Słowa kluczowe: grafen, nanosrebro, materiały bakteriostatyczne i bakteriobójcze. Abstract Background. Researches have been synthesizing nanocomposites with antibacterial properties for a dozen of years. A lot of study have confirmed a high antibacterial activity of silver nanoparticles and oxygraphene. Silica, titanium dioxide and hydroxyapatites of nm are used as carrier for these composites. * Praca została częściowo sfinansowana ze środków Wrocławskiego Centrum Badań EIT+ w ramach realizacji projektu NanoMat Wykorzystanie nanotechnologii w nowoczesnych materiałach (POIG /08) współfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (Program operacyjny Innowacyjna Gospodarka, Poddziałanie 1.1.2).

2 130 A. Kędziora et al. Objectives. To synthesise graphene-silver nanocomposites and to determine their antibacterial properties. Materials and Methods. The following bacteria strains from the American Type Culture Collection were tested: Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Gram-positive bacteria), Escherichia coli ATCC (Gram-negative bacteria), Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 (Gram-negative bacteria). Clinical isolates of bacteria strains (from wounds) were also tested (from species of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae). The antibacterial effect of nanocomposites was determined by minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) values according to the reference methods of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) for the determination of MICs of aerobic bacteria by broth microdilution. The samples have physical and chemical characteristics. Results. The results showed bacteriostatic ( µg/ml) and bactericidal ( µg/ml) efficacy of composities. Conclusion. The synthesized nanocomposites of graphene-oxide can be used in biology and medicine as bacteriostatic and bactericidal factor and may be used as an alternative to antibiotics and chemioterapeutics (Polim. Med. 2013, 43, 3, ). Key words: graphen, nanosilver, bacteriostatic, biocide. W ostatnich latach grafen oraz nanokompozyty na bazie grafenu ze względu na ich unikalne właściwości fizyczne i chemiczne są intensywnie badane pod kątem zastosowań w wielu różnych dziedzinach nauki i techniki. W celu zastosowania materiałów na bazie grafenu w biologii i medycynie wiele grup badawczych wykorzystuje grafen i jego pochodne do tworzenia czujników biologicznych, leków nowej generacji, obrazowania biomedycznego, a także do fototerapii [1]. Jednocześnie zwiększa się zainteresowanie właściwościami i zastosowaniem praktycznym prekursora do otrzymywania grafenu tlenku grafenu (w niektórych źródłach [1] jest on również nazywany tlenkiem grafitu graphite/ graphene oxide). Metody otrzymywania nanokompozytów o właściwościach antybakteryjnych są przedmiotem badań różnych ośrodków naukowych na całym świecie już od kilkunastu lat. W ich rezultacie potwierdzono, że szczególną samoistną aktywność antybakteryjną wykazują materiały kompozytowe zawierające srebro i oksygrafen. Najczęściej w tych zastosowaniach jako nośniki substancji bioaktywnych wykorzystuje się różnego rodzaju biokompatybilne materiały, takie jak tlenek krzemu, tlenek tytanu lub hydroksyapatyty o rozmiarach submikronowych. Nanorozmiarowe płatki (NP) tlenku grafenu (GO) jako materiał cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich nieskomplikowany i wydajny proces syntezy, szerokie możliwości chemicznej funkcjonalizacji ich powierzchni oraz dużego stopnia dyspergowania w środowisku wodnym [2]. Dyspersja nanocząstek metali albo tlenków metali na nanopłatkach GO lub częściowo zredukowanych nanopłatkach GO jest także jedną z dróg otrzymywania materiałów katalitycznych, optoelektronicznych i magnetycznych [3]. Szczególnie interesujące jest zastosowanie materiałów tego typu w medycynie i technice jako środków bakteriostatycznych, np. do systemów oczyszczania wody lub jako dodatek do materiałów opatrunkowych [4, 5]. W pierwszym etapie badań, podczas zastosowania metody niskotemperaturowej redukcji, na bazie NP GO otrzymano wiele próbek inkrustowanych nanocząstkami metalicznego srebra w stosunku wagowym GO:Ag od 1 do 10% (m/m). Zbadano ich właściwości strukturalne, spektralne i morfologiczne. Wyniki przedstawione w niniejszej pracy dotyczą nanokompozytów zawierających 10% nanosrebra (m/m). Zainteresowanie srebrem wynika z jego silnych właściwości wobec szerokiego spektrum mikroorganizmów (bakterii, grzybów i pierwotniaków oraz w pewnym stopniu wirusów) [6 13]. Ze względu na swoją oligodynamiczność srebro działa bakteriostatycznie i bakteriobójczo już w bardzo małch stężeniach. Mechanizm aktywności przeciwbakteryjnej polega m.in. na oddziaływaniu na osłony zewnątrzkomórkowe (powoduje zmiany w ich przepuszczalności ułatwiające wydostawanie się poza komórkę substancji ważnych metabolicznie lub zwiększone, niekontrolowane pobieranie składników ze środowiska, zachwianie gospodarki fosforanami, oddziaływanie na aminokwasy i enzymy, tworzenie wiązań z grupami funkcyjnymi aminokwasów szczególne powinowactwo do grupy tiolowej SH, blokowanie aktywności enzymów poprzez wiązanie do ich centrum aktywnego), utrudnieniu w pozyskiwaniu energii (poprzez wpływanie na transport elektronów w łańcuchu oddechowym i inhibicje cytochromów poprzez wiązanie do centrum aktywnego) lub oddziaływaniu na materiał genetyczny (interkalowaniu z DNA, rozrywaniu wiązań wodorowych, hamowaniu syntezy zasad azotowych czy zaburzeniach w syntezie DNA i RNA) [14, 15]. Wykorzystanie grafenu jako nośnika nanocząstek srebra sprzyja zachowaniu dyspersji nanometalu, dzięki czemu zachowuje on silne działanie antybakteryjne. Nanokompozyty okazują się idealne do dalszego zastosowania m.in. w produktach medycznych, np. materiałach opatrunkowych, gdzie jako środek bakteriostatyczny i bakteriobójczy mogą stanowić bardzo skuteczną alternatywę wobec dotychczas stosowanych antybiotyków i chemioterapeutyków. Materiały i metody Otrzymywanie GO-NPs Nanowymiarowe płatki (NP) tlenku grafenu (GO) zostały otrzymane modyfikowaną metodą Brodiego [16, 17] poprzez czterokrotne utlenienie grafitu z KClO 3

3 Wykorzystanie materiałów opartych na częściowo redukowanym tlenku grafenu z nanocząstkami srebra 131 w dymiącym HNO 3 przy nagrzewaniu do temperatury o C. Otrzymany materiał (jasnożółtą suspensję) przemywano wodą dejonizowaną, następnie trzykrotnie 10% roztworem kwasu solnego i ponownie wodą do uzyskania ph = 7. Obrazy TEM otrzymanych GO-NPs przedstawiono na ryc. 1a. Otrzymywanie GO-Ag-NPs Otrzymanie materiałów docelowych (nanokompozytów na bazie częściowo zredukowanego tlenku grafenu domieszkowanych srebrem) przeprowadzono na podstawie pracy Y. Ji et al. [18], pozwalającej otrzymywać nanocząstki srebra o rozmiarach 5 20 nm. Podczas syntezy osad oddzielano za pomocą ultrawirówki i kilkakrotnie przemywano wodą dejonizowaną oraz etanolem. Niestety, po wysuszeniu materiału nie udaje się poddać powtórnemu rozdyspergowaniu, dlatego pozostawiano go po przemyciu w postaci zawiesiny w etanolu i w takiej formie próbki przekazywano do dalszych etapów badań. Do badań mikrobiologicznych wykorzystywano materiał zawieszany w wodzie dejonizowanej. Otrzymane GO-Ag-NPs przedstawia obraz TEM na ryc. 1b. Określenie właściwości bakterio statycznych i bakteriobójczych GO-NPs i GO-Ag-NPs Właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze zaprojektowanych nanokompozytów wyznaczono, określając wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost (MIC) oraz minimalnego stężenia bójczego (MBC) metodą seryjnych rozcieńczeń w bulionie według rekomendacji NCCLS (CLSI) doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki lub chemioterapeutyki. Celem tej metody jest określenie najmniejszego stężenia bakteriostatycznego (MIC) i najmniejszego stężenia bakteriobójczego (MBC) antybiotyku lub chemioterapeutyku [19]. MIC (Minimal Inhibitory Concentration) to minimalne stężenie leku wyrażone w μg/ml (mg/l), określane w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie [20], MBC (Minimal Bactericidal Concentration) to minimalne stężenie leku wyrażone w μg/ml (mg/l) oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie [20]. Do badań mikrobiologicznych wykorzystano szczepy bakteryjne pochodzące z kolekcji ATCC: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC i Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 oraz izolaty kliniczne: S. aureus 173, S. aureus 187, S. aureus 298, E. coli 475, E. coli 555, E. coli 574 i K. pneumoniae 626. Wybór gatunków bakterii został podyktowany ich wysoką częstością kolonizowania ran, w tym zakażeń jatrogennych i szpitalnych. Badania mikrobiologiczne przeprowadzono z wykorzystaniem pożywki Mueller Hinton Broth (MHB) oraz Mueller Hinton Agar (MHA). W celu określenia działania bakteriostatycznego i bakteriobójczego GO-Ag- -NPs sporządzono szereg rozcieńczeń testowanych nanokompozytów w pożywce MHB, gdzie zawartość GO- -Ag-NPs malała w postępie geometrycznym w zakresie 512 0,25 µg/ml. Tak przygotowane próby wlewano po 100 µl do każdego dołka płytki titracyjnej, a następnie nakrapiano testowany szczep bakteryjny w końcowej a) b) Ryc. 1. Obrazy TEM dla tlenku grafenu (GO-NPs; rys. a) oraz częściowo redukowanego tlenku grafenu inkrustowanego nanocząstkami srebra (GO-Ag-NPs; ryc. b) Fig. 1. TEM images of graphene oxide (GO-NPs, fig. a) and partially reduced graphene oxide, incrusted with silver nanoparticles (GO-Ag-NPs, fig. b)

4 132 A. Kędziora et al intensywność normalizowana [a.u.] [002] Ag-NPs (Ref. code: Silver 3C) [100] GO rgo-ag absorbancja [a.u.] Θ [st.] Ryc. 2. Dyfraktogramy proszkowej dyfraktometrii rentgenowskiej (XRD) dla GO czarna linia oraz dla GO-Ag-NPs czerwona linia [21] Fig. 2. XRD patterns of GO (black line) and GO-Ag (red line) powders gęstości cfu/ml (cfu/ml colony forming units, liczba jednostek tworzących kolonie w 1 ml). Po inkubacji hodowli (37 o C/20 godz.) dokonywano odczytu wartości MIC. Odczyt MIC polega na obserwacji zmętnienia podłoża. Pierwsza studzienka, w której nie obserwuje się zmętnienia hodowli jest uważana za najmniejsze stężenie hamujące (MIC). W celu określenia wartości MBC wysiewano po 10 µl mieszaniny na podłoże MHA z czterech kolejnych stężeń powyżej wyznaczonego punktu MIC. Płytki Petriego inkubowano w temperaturze 37 C w czasie 24 godz. Minimalne stężenie, przy którym na podłożu MHA wyrasta < 0,1% kolonii, wyraża stężenie bakteriobójcze (MBC) nanokompozytów srebra. Wyniki i omówienie Morfologia i właściwości spektralne GO-Ag-NPs Obrazy TEM GO-NPs i GO-Ag-NPs przedstawiono na ryc. 1a i b. Widoczne pojedyncze płatki częściowo redukowanego tlenku grafenu mają rozmiary od 500 nm do 2 µm. Nanocząstki metalicznego srebra są związane częściowo na całej powierzchni płatków, ale cześć wbudowuje się między osobnymi warstwami GO przy krawędziach. W przedstawionym na ryc. 2 dyfraktogramie XRD można zauważyć, że następuje proces częściowej redukcji tlenku grafenu (przesunięcie sygnału) [21] z jednoczesnym tworzeniem mniejszych cząsteczek (sygnał pochodzący od GO ma mniejszą intensywność i jest widocznie poszerzony). Jednocześnie obserwuje się poszerzone piki dyfrakcyjne srebra, potwierdzające jego metaliczną strukturę (Ref. Code: Silver 3C) długość fali [nm] Ryc. 3. Widma absorbancji otrzymanych materiałów. GO niebieska linia, GO-Ag 5% (wysuszony i powtórnie rozdyspergowany) czarna linia, GO-Ag 5% (mieszanina reakcyjna) czerwona linia, GO-Ag 5% (po przemyciu) zielona linia Fig. 3. Absorption spectra of obtained materials: GO blue line, GO-Ag 5% (dried and resuspended) black line, GO-Ag 5% (reaction mixture) red line, GO-Ag 5% (washed probe) green line Zarejestrowano także widma absorbancji dla otrzymanych próbek (ryc. 3). W widmach można zaobserwować szerokie pasmo odpowiadające GO, a także charakterystyczne pasmo absorpcyjne związane z efektem plazmonowym nanocząstek srebra. Jak widać intensywność sygnału plazmonowego jest kilkakrotnie niższa po przemyciu próbki, co jest najprawdopodobniej związane z tym, iż nanocząstki srebra, które nie są związane z powierzchnią GO, mają wysoką zdatność do agregowania się, a w konsekwencji przy tworzeniu większych agregatów tracą zdolność do absorbowania światła w wyniku efektu plazmonowego. Drugim możliwym wyjaśnieniem tego zjawiska jest to, że równocześnie niezwiązane cząstki srebra są wypłukiwane z materiału w czasie przemycia, co prowadzi również do zmniejszenia absorpcji. Na ryc. 4 przedstawiono wartości MIC i MBC nanokompozytu na bazie oksygrafenu domieszkowanego nanosrebrem o zawartości Ag równej 10% (m/m). Analiza powyższych wyników pokazuje, że antybakteryjna skuteczność nanokompozytów srebra zależy od cech indywidualnych testowanego szczepu bakterii. Na tę wrażliwość bez wątpienia ma wpływ struktura molekularna wynikająca z przynależności do grupy bakterii Gram-dodatnich (bakterie z gatunku S. aureus) lub Gram-ujemnych (bakterie z gatunku E. coli i K. pneumoniae) oraz funkcjonalna. Wytworzone nanokompozyty na bazie grafenu i srebra wykazują skuteczność bakteriostatyczną (w zakresie 0,4 1,6 µg/ml) i bakteriobójczą (w zakresie 0,4 3,2 µg/ml) (ryc. 4). Otrzymane wartości świadczą o bardzo dużej skuteczności nanosrebra umiejscowionego na płatkach oksygrafenu wo-

5 Wykorzystanie materiałów opartych na częściowo redukowanym tlenku grafenu z nanocząstkami srebra 133 3,6 3,2 2,8 MIC MBC zawartość srebra [µg/ml] 2,4 2 1,6 1,2 0,8 0,4 0 S. aureus ATCC 6538 S. aureus 173 S. aureus 187 S. aureus 298 E. coli ATCC E. coli 475 E. coli 555 E. coli 574 K. pneumoniae ATCC 4325 K. pneumoniae 626 Ryc. 4. Porównanie wartości MIC i MBC dla nanokompozytów GO-Ag-Np, zawierających 10% (m/m) Ag wobec testowanych szczepów bakterii Fig. 4. Comparison MIC and MBC values for nanocomposites GO-Ag-Np contaning 10% of silver against tested bacterial strains bec testowanych mikroorganizmów. Bakteriostatyczne działanie wobec bakterii Gram-dodatnich zostało ustalone na poziomie 0,8 µg/ml. Nanokompozyt GO-Ag- -NPs wykazuje właściwości bakteriobójcze wobec S. aureus w stężeniu 4-krotnie większym niż wartości MIC (3,2 µg/ml). Na szczególną uwagę zasługują bardzo silne właściwości bakteriobójcze wytworzonego nanokompozytu wobec bakterii Gram-ujemnych, o czym świadczy wartość MBC równa wartości MIC. Dla testowanej K. pneumoniae ATCC 4352 wynosi zaledwie 0,4 µg/ml, dla E. coli 555 0,8 µg/ml, a pozostałych (E. coli 475, E. coli 574 i K. pneumoniae 626) 1,6 µg/ml. Wyjątkiem jest szczep referencyjny E. coli ATCC 11229, dla którego stężenie bakteriobójcze jest 2-krotnie większe od bakteriostatycznego (równe 3,2 µg/ml). Pod kątem antybakteryjnych własności testom mikrobiologicznym poddano także niedomieszkowany srebrem oksygrafen (GO-NPs) w czystej postaci. W zastosowanym stężeniu 512 µg/ml (wynikającym z normy CLSI [19]) GO nie wykazuje właściwości antybakteryjnych. Silniejsze działanie bakteriobójcze nanokompleksu grafen srebro wobec bakterii Gram-ujemnych niż Gram-dodatnich było potwierdzone badaniami przeprowadzonymi wcześniej przez Bao et al. [1]. Analiza wyników pokazuje, że nanokompozyt GO-Ag-NPs w stężeniu końcowym 45 µg/ml w czasie 4 godz. inkubacji w temp. 37 o C zmniejsza o 87% liczbę komórek S. aureus i o 100% liczbę komórek E. coli. Podobne korelacje wykazują testy antybakteryjnej aktywności nanokompleksu GO-Ag-NPs wykonane przez Soon Wei Chook et al. [5]. Badacze potwierdzili większą wrażliwość bakterii Gram-ujemych na nanokompleks grafen srebro niż bakterii Gram-dodatnich. GO-Ag-NPs wg Cook [5] et al. wykazuje ponadto skuteczność bakteriobójczą wobec E. coli w stężeniu powyżej 6,25 µg/ml, a wobec S. aureus w stężeniu aż powyżej 100 µg/ml. W toku dalszych badań zostanie określona antybakteryjna skuteczność nanokompozytów o zmniejszonej zawartości srebra. Posumowując, należy stwierdzić, że zaprojek towane i wytworzone nanokompozyty spełniają wszystkie wymagania fizykochemiczne. Nanokompozyt grafen srebro wykazuje bardzo wysoką skuteczność bakteriostatyczną i bakteriobójczą wobec testowanych bakterii S. aureus, E. coli i K. pneumoniae. Wartości MIC dla testowanych szczepów mieszczą się w zakresie 0,4 1,6 µg/ml, a wartości MBC w zakresie 0,4 3,2 µg/ml w zależności od testowanego szczepu bakterii. Zaobserwowano większą wrażliwość bakterii Gram-ujemnych wobec opracowanego nanokopozytu niż bakterii Gram-dodatnich. Zaprojektowane i wytworzone nanokompozyty mogą znaleźć zastosowanie w medycynie jako środek bakteriostatyczny i bakteriobójczy oraz stanowić mogą bardzo skuteczną alternatywę wobec dotychczas stosowanych antybiotyków i chemioterapeutyków.

6 134 A. Kędziora et al. Piśmiennictwo [1] Qi Bao et al.: Synthesis and characterization of silver nanoparticle and oxide nanosheet composites as a bactericidal agent for water disinfection. J. Colloid Interface Sci. 2011, 360, [2] Xiaoze Shi et al.: Graphene-based magnetic plasmonic nanocomposite for dual bioimaging and photothermal therapy. Biomaterials 2013, 34, [3] Chunhua Dai et al.: One-step synthesis of reduced graphite oxide silver nanocomposite. Materials Res. Bull. 2011, 46, [4] Manash R. Das et al.: Synthesis of silver nanoparticles in an aqueous suspension of oxide sheets and its antimicrobial activity Colloids and Surfaces B. Biointerfaces 2011, 83, [5] Soon Wei Chook et al.: Antibacterial performance of Ag nanoparticles and AgGO nanocomposites prepared via rapid microwave-assisted synthesis method. Nanoscale Res. Let. 2012, 7, 541. [6] Kühni W., Holst W.: Srebro koloidalne jako lek. Zdrowy antybiotyk. Wydawnictwo PURANA, [7] Silver S., Phung L.T., Silver G.: Silver as biocides in burn and wound dressings and bacterial resistance to silver compounds. J. Industr. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33, [8] Bugla-Płoskońska G., Leszkiewicz (Kędziora) A., Borak B., Jasiorski M., Drulis-Kawa Z., Baszczuk A., Maruszewski K., Doroszkiewicz W.: Bactericidal properties of silica particles with silver islands located on the surface. Int. J. Antimicrob. Agents 2007, 29, [9] Bugla-Płoskońska G., Jasiorski M., Leszkiewicz (Kędziora) A., Borak B., Baszczuk A., Brzeziński S., Malinowska G., Doroszkiewicz W.: Bakteriobójcze działanie immobilizowanych preparatów srebra i możliwość ich praktycznego zastosowania. Farm. Przegl. Nauk. 2008, 37 (2), (a). [10] Bugla-Płoskonska G., Jasiorski M., Leszkiewicz (Kędziora) A., Borak B., Drulis-Kawa Z., Baszczuk A., Maruszewski K., Doroszkiewicz W.: Silver nanoislands located on the silica spheres and its antimicrobial activity against Klebsiella pneumoniae strain. Nano Science and Nano Technology: Ind. J. 2008, 2, (b). [11] Kępiński E., Nawrot U., Seniuk A., Włodarczyk K., Białynicki-Birula R.: The in vitro effect of a silver-containing dressing on biofilm development. Adv. Clin. Exp. Med. 2009, 18 (3), [12] Jasiorski M., Leszkiewicz (Kędziora) A., Brzeziński S., Bugla-Płoskońska G., Malinowska G., Borak B., Karbownik I., Baszczuk A., Stręk W., Doroszkiewicz W.: Textile with silver silica spheres: its antimicrobial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J. Sol-Gel Sci. Technol. 2009, 51, [13] Kędziora A., Stręk W., Kępiński L., Bugla-Ploskonska G., Doroszkiewicz W.: Synthesis and antibacterial activity of novel titanium dioxide doped with silver. J. Sol-Gel Sci. Technol 2012, 62, [14] Bugla-Płoskońska G., Leszkiewicz A.: Biologiczna aktywność srebra i jego zastosowanie w medycynie. Kosmos 2007, 1 2, [15] Kędziora A., Sobik K.: Oporność bakterii na srebro problem stary czy nowy? Kosmos 2013, 62. [16] Brodie B..: Sur le poids atomique du graphite. Ann. Chim. Phys. 1860, 59, [17] Szabo T. et al.: Enhanced acidity and ph-dependent surface charge characterization of successively oxidized graphite oxides. Carbon 2006, 44, [18] Yuetian Ji et al.: Bimetallic Ag/Au nanoparticles: A low temperature ripening strategy in aqueous solution Colloids and Surfaces A. Physicochem. Eng. Aspects 2010, 372, 204. [19] Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard Fifth Edition M7-A5, NCCLS 2000, 20 (2). [20] Hryniewicz W., Sulikowska A., Szczypa K., Skoczyńska A., Łuczak-Kadłubowska A, Gniatkowski M.: Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego, Warszawa [21] Physics and Applications of Graphene Experiments (Edited by Sergey Mikhailov) Chapter 5: Seung Hun Huh Thermal Reduction of Graphene Oxide, InTech Adres do korespondencji: Anna Kędziora Zakład Mikrobiologii, Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytet Wrocławski ul. Przybyszewskiego 63/ Wrocław anna.kedziora@microb.uni.wroc.pl Konflikt interesów: nie występuje. Praca wpłynęła do Redakcji: r. Po recenzji: r. Zaakceptowano do druku: r. Received: Revised: Accepted: