Chromatografia cieczowa HPLC. Chromatografia Ŝelowa SEC

Transkrypt

1 Nowoczesne techniki analityczne dla konserwacji obiektów zabytkowych Chromatografia cieczowa HPLC Chromatografia Ŝelowa SEC Katarzyna Zięba Wydział Chemii UJ

2 Plan wykładu Podstawy chromatografii HPLC (High Performance Liquid Chromatography) SEC (Size Exclusion Chromatography) Badania obiektów zabytkowych

3 Podstawy chromatografii technika analityczna, w której badane składniki są rozdzielane w wyniku róŝnego podziału między fazą stacjonarną i ruchomą metoda otrzymywania czystych substancji metoda badania właściwości fizykochemicznych (np. wł. katalizatorów) planowanie optymalnej struktury leków i in. substancji biologicznie czynnych warunek rozdzielenia składników mieszaniny: róŝne czasy retencji (składniki wypływają z fazy stacjonarnej w róŝnym czasie)

4 HPLC High Performance High Pressure Liquid Chromatography Faza ruchoma CIECZ Faza stacjonarna CIAŁO STAŁE lub ciecz osadzona na nośniku

5 Chromatografia cieczowa eluent injektor pompa detektor kolumna wyniki

6 Chromatografia cieczowa eluent pompa próbka dozownik wynik detektor eluat kolumna

7 HPLC detektory kolumna eluent injektor wyniki pompa

8 HPLC - pompy stałociśnieniowe proste i niedrogie, ale zmiany w przepływie wyporowe pneumatyczne tłokowe stałoprzepływowe niezaleŝnie od lepkości i zmian oporu kolumny strzykawkowe elektromechaniczne tłokowe

9 HPLC - dozowniki dozowniki membranowe samouszczelniające lub przy zatrzymanym przepływie ale słaba odtwarzalność i rozmywanie pików zawory dozujące

10 autosamplery HPLC - dozowniki

11 HPLC - kolumny W kolumnie zachodzi właściwy proces rozdziału 250 X 4,6 mm < 20 µm N do prekolumna mała średnica mało wypełnienia i eluentu, moŝliwość wykrywania mniejszych stęŝeń

12 HPLC - kolumny sorbenty powierzchniowo- i objętościowo-porowate Ŝel krzemionkowy uwodniona krzemionka grupy silanolowe SiOH grupy siloksanowe Si O Si dezaktywacja chemiczne blokowanie grup funkcyjnych dezaktywowany Ŝel badanie alkoholi, amin niedezaktywowany analiza węglowodorów

13 HPLC - kolumny modyfikowane Ŝele krzemionkowe fazy związane przyłączenie łańcuchów alkilowych charakter hydrofobowy najczęściej stosowane: C2 C8 C18 a takŝe: łańcuchy aklilowe z gr. fenylową lub difenylową grupy propylocyjanowe (CH 2 ) 3 CN grupy propyloaminowe (CH 2 ) 3 NH 2 grupy chiralne do rozdzielania mieszanin racemicznych wymieniacze jonowe przy wyborze kolumny naleŝy uwzględnić polarność analitu do kolumny i charakteru analitu dobiera się eluent

14 HPLC - kolumny Sprawność kolumn liczba półek teoretycznych: N t 16 R = wb gdzie: t R czas retencji składnika, w B szerokość piku Wysokość równowaŝna półce teoretycznej: H = H wysokość równowaŝna półce teoretycznej, L długość kolumny Zredukowana wysokość półki: h = r H d p 2 L N

15 Współczynnik selektywności A B M R M R k k t t t t A B = = α HPLC - kolumny gdzie: t RB, t RA czasy retencji składników B i A,, t M zerowy czas retencji, k B, k A współczynniki retencji składników B i A M M R t t t k = Współczynnik retencji składnika Rozdzielczość ( ) 1) ( = k k N R α α

16 HPLC eluenty Eluent faza ruchoma wprowadzana do kolumny Eluat faza ruchoma wypływająca z kolumny duŝy wpływ eluenta na proces chromatograficzny Siła elucyjna zdolność do wypierania substacji z powierzchni fazy stacjonarnej polarna f.s. polarny eluent wyŝsza siła elucji niepolarna f.s większe fragmenty niepolarne wyŝsza siła elucji

17 HPLC eluenty waŝna lepkość inne cechy fizykochemiczne (w zaleŝności od detektora, np: współczynnik załamania światła, długość fali pochłaniającej UV) chromatografia jonowymienna przeciwjony równowaŝą ładunki elektryczne f.s. dodaje się bufory (do regulacji siły jonowej) chromatografia par jonowych do eluentu dodaje się substancję tworzącą jony hydrofobowe przeciwjony, które -oddziałują z jonami próbki biologicznie czynnej -modyfikują fazę stacjonarną

18 HPLC eluenty normalny układ faz odwrócony układ faz polarna faza stacjonarna eluent mniej polarny niŝ f.s. niepolarna faza stacjonarna eluent bardziej polarny niŝ f.s. Jak powinien być eluent? mniej polarny, gdy analizowane składniki są niepolarne bardziej polarny, gdy składniki są polarne Eluent mniej polarny w normalnym układzie faz mniejsza siła elucji czasy retencji dłuŝsze i lepsze rozdzielenie składników

19 HPLC eluenty substancje niepolarne w odwróconym układzie faz, eluent: 1-30% wody w metanolu lub acetonitrylu słabo polarne acetonitryl+chloroform o pośredniej polarności normalny układ faz, eluent: 2-50% rozpuszczalnika polarnego organicznego w niepolarnym polarne w odwróconym układzie faz, eluent: 0-50% rozpuszczalnika organicznego w wodzie WaŜne przy wyborze eluenta: krótki czas retencji dobra rozdzielczość wysoka selektywność Istnieją programy komputerowe pomagające dobrać warunki chromatografowania DryLab ChromDream

20 HPLC eluenty elucja izokratyczna skład rozpuszczalnika stały eluent moŝna odzyskać oddzielając frakcje zawierające substancję oznaczaną elucja gradientowa skład eluentu zmienia się i wzrasta siła elucyjna dla mieszanin składników o róŝnej polarności w normalnym układzie faz o bardzo róŝnej rozpuszczalności w odwróconym przy wyborze eluentu uwzględnia się rodzaj: analitu wypełnienia kolumny detektora

21 HPLC detektory fotometryczne fluorescencyjne refraktometryczne elektrochemiczne płomieniowo-jonizacyjne Konduktometryczne Diode Array Detector (DAD) spektometry masowe wielokątowego rozpraszania światła (MALLS) wiskozymetryczne wykrywające dany związek, identyfikacja następuje na podstawie czasu wypływu z kolumny, kalibracja kolumny konieczna identyfikujące związek (lub jego m.cz.) bez względu na czas retencji, kalibracja kolumny niepotrzebna

22 HPLC detektory detektor fotometryczny - absorpcja w nadfiolecie do badania związków zawierających wiązania nienasycone i gr. chromoforowe: =C=O =C=S N=N CH=CH np. olefiny, związki aromatyczne, barwniki najczęściej stosowana dł. fali 254nm (dla 65% subst. organicznych) istnieje moŝliwość płynnej zmiany dł. fali moŝliwe ustalenie optymalnej eluent nie powinien absorbowaćświatła przy danej dł. fali niewraŝliwy na zmiany przepływu i temperatury

23 HPLC detektory Diode Array Detector DAD światło z lampy jest absorbowane przez próbkę pozostała jego część rozszczepia się na siatce dyfrakcyjnej i pada na matrycę fotodiodową diody rejestrująświatło w duŝym zakresie dł. fal moŝliwa rejestracja całego widma absorpcji analitu w przepływie baza widm ułatwia analizę jakościową badanej substancji

24 HPLC detektory Detektor fluorescencyjny niektóre związki mają zdolność do fluorescencji w wyniku wzbudzenia (np. węglowodory poliaromatyczne) mierzy dł. fali światła emitowanego przez badany związek wzbudzanie fluorescencji światłem o wyŝszej energii, np. dla benzenu 270 nm (emituje 310 nm) bardzo czuły, specyficzny i selektywny związki niefluoryzujące moŝna przeprowadzić w pochodne przed lub za kolumną

25 HPLC detektory Detektor refraktometryczny mierzy róŝnicę współczynnika załamania światła czystego eluentu i eluentu z próbką uniwersalny (m.in. do węglowodanów, alkoholi i kwasów alifatycznych) o średniej czułości nie nadaje się do elucji gradientowej wraŝliwy na zmiany ciśnienia i temperatury szeroko stosowany do analizy polimerów i zw. powierzchniowo czynnych metodą SEC

26 HPLC detektory Spektrometry masowe próbka ulega jonizacji analizator rozdziela jony detektor zlicza jony powstaje widmo masowe intensywność stosunek masy do ładunku m/z

27 HPLC detektory Spektrometry masowe o spektrometr analizuje kolejne frakcje wypływające z kolumny oźródła jonów elektrorozpylacz (ESI) łagodna jonizacja, z reguły bez fragmentacji oraz APCI jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym o ze stosunku m/z wnioskuje się o masie cząsteczkowej o dzięki bibliotekom widm moŝliwa identyfikacja substancji o analiza jest utrudniona próbka w roztworze o ze względu na złoŝoność próbek układy tandemowe HPLC/MS/MS o analiza białek w złoŝonych mieszaninach o badanie zanieczyszczeńśrodowiska o przemysł spoŝywczy

28 HPLC detektory Inne detektory elektrochemiczne polarograficzne, kulometryczne do badania związków podlegających reakcjom elektrochemicznego utleniania i redukcji płomieniowo-jonizacyjny do analizy toksycznych związków fosforoorganicznych konduktometryczny w chromatografii jonowej

29 HPLC - podsumowanie dobór eluentu tak, aby rozpuścił próbkę woda, aceton, etanol, tetrahydrofuran, heksan dobór kolumny odpowiedniej do eluentu i próbki detektor musi być czuły na próbkę lub na zmianę wł. eluenta wynikającą z obecności próbki technika uniwersalna ilość próbki wstrzykiwanej rzędu ng

30 SEC Size Exclusion Chromatography Gel Permeation Chromatography Chromatografia wykluczania molekularnego Ŝelowa sitowa szczególna odmiana HPLC 0,9 Rozkłady mas cząsteczkowych MWD rozdział na zasadzie wielkości cząstek 0,8 0,7 wyznaczanie średnich mas cząsteczkowych polimerów i ich rozkładów dwt/d(logm) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 próbka o mniejszej m.cz. próbka o większej m.cz. brak oddziaływań analitu z kolumną 0, ,5 4 4,5 5 5,5 6 Log Mw dla frakcji

31 SEC próbkę polimeru rozpuszcza się w eluencie na kolumnie rozdziela się na frakcje o róŝnej wielkości większe cząsteczki wypływają wcześniej detektor analizuje próbkę uzyskany wynik jest rozkładem mas cząsteczkowych

32 Faza stacjonarna porowaty Ŝel polimerowy o zróŝnicowanej wielkości porów np. Ŝele na bazie krzemionki, polistyren (PS), kopolimer styrenu i diwinylobenzenu (PS/DVB) Eluent obojętny dla fazy stacjonarnej i badanego związku Chloroform, chlorek metylenu, tetrahydrofuran, woda Detektor wyznacza masy cząsteczkowe po wcześniejszej kalibracji na czas wypływu z kolumny refraktometryczny lub fotometryczny bez konieczności kalibracji na czas wypływu gdy mierzy wielkość związaną z m.cz. rozpraszanie światła, lepkkość SEC

33 N i ilość cząsteczek o m.cz. M i SEC Rozkłady mas cząsteczkowych Liczbowo średnia masa cząsteczkowa M Wagowo średnia masa cząsteczkowa M z-średnia masa cząsteczkowa współczynnik heterogeniczności N w = = 1 N i i i N i i N M N M 3 Ni M i M z i = 2 N M i i i i i M 2 i PDI = M w / M N i róŝne momenty funkcji będącej rozkładem mogą odzwierciedlać róŝne właściwości mechaniczne polimeru próbki homogeniczne standardy mają PDI=1

34 Badanie obiektów zabytkowych HPLC/MS do badania barwników organicznych prof. Maciej Jarosz, Laboratory of Separation Methods, Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska badanie czystych substancji oraz barwników naturalnych identyfikacja barwników pochodzących z obiektów zabytkowych: tkanin, malowideł, fresków, polichromowanych rzeźb, iluminowanych starodruków barwniki czerwone, Ŝółte i niebieskie (m.in. koszenila, kurkuma, indygotyna, alizaryna )

35 Badanie obiektów zabytkowych Sister Daniilia et.al, Evaluating of Cumaean Sibyl Domenichino or later? A multi analytical approach, Analytica, Chimica Acta, 611 (2008) wykorzystanie róŝnych technik analitycznych, m.in. HPLC/DAD do badania składu pigmentów wykryto obecność błękitu pruskiego, takŝe koszenila w mieszaninie z cynobrem badanie potwierdziło, Ŝe badany obraz jest reprodukcją obrazu z XVI wieku

36 Badanie obiektów zabytkowych Joosten I., van Bommel M.R., Hofmann de-keijzer, Reschreiter H., Microanalysis of Hallstatt Textiles colour and condition, Microchimica Acta 155(2006) HPLC z detekcją DAD badanie technik farbiarskich i barwników stosowanych w okresie lat p.n.e. analiza tkanin wełnianych z Hallstatt (Austria)

37 Badanie obiektów zabytkowych Karapanagiotis I. et.al, Organic dyes in Byzantine and post-byzantine icons from Chalkidiki (Greece), Journal of Cultural Heritage 8 (2007) HPLC/DAD badano organiczne barwniki z bizantyjskich ikon z Chalkidiki wykryto barwniki jednolite, w mieszaninach z pigmentami nieorganicznymi oraz w formie warstw pokrywających pigmenty obecność koszenili oraz barwników pochodzących z sekwoi

38 Badanie obiektów zabytkowych Domenech-Carbo M.T., Review: Novel analytical methods for characterizing binding media and protective coatings in artworks, Analytica Chimica Acta 621(2008), zestawienie róŝnorodnich technik, w tym kilku technik HPLC, badania mediów wiąŝą ąŝących: białkowych, węglowodanowych oraz farb olejnych i werniksów, Ŝywic terpenowych, opis stosowanych detektorów

39 Badanie obiektów zabytkowych techniką SEC Ocena stopnia degradacji papieru Wydział Chemii UJ Określanie rozkładów mas cząsteczkowych innych polimerów naturalnych i syntetycznych np. jedwab skrobia