Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową doniesienie wstępne

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 1, str MAŁGORZATA SIEKLUCKA 1,2, AGNIESZKA BOJARSKA-JUNAK 2, AGATA SURDACKA 2, IWONA HUS 1, EWA WĄSIK-SZCZEPANEK 1, KAMILA MAZUREK 3, JACEK ROLIŃSKI 2, ANNA DMOSZYŃSKA 1 Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową doniesienie wstępne Prostate apoptosis response - 4 (Par-4) protein expression in B cells of chronic lymphocytic leukaemia patients a pilot study 1 Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie 2 Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej UM w Lublinie 3 Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie STRESZCZENIE Gen PAR-4 zidentyfikowano podczas badania genów wykazujących zwiększoną ekspresję przy indukcji apoptozy w komórkach raka prostaty. Następnie stwierdzono, Ŝe białko Par-4 wykazuje ekspresję zarówno w limfocytach prawidłowych, jak i białaczkowych. Celem pracy była ocena ekspresji białka Par-4 w limfocytach B u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B- komórkową oraz poszukiwanie zaleŝności pomiędzy ekspresją tego białka a ekspresją innych białek regulujących proces apoptozy. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a ekspresją białek BCL-2 oraz BAX. Badano takŝe zaleŝność pomiędzy ekspresją białka Par-4 a wybranymi parametrami klinicznymi PBL-B: wykazano dodatnią korelację ze stęŝeniem LDH i β2-mikroglobuliny oraz ujemną korelację ze stęŝeniem hemoglobiny. Stwierdzono równieŝ dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a odsetkiem komórek CD38+. U chorych o fenotypie CD38+ ekspresja białka Par-4 była istotnie większa w porównaniu z chorymi o fenotypie CD38-. Wyniki te ponownie potwierdzają istnienie zaburzeń apoptozy w komórkach PBL-B; ponadto wydają się potwierdzać znaczenie rokownicze ekspresji białka Par-4 u chorych na PBL-B, jednak z uwagi na złoŝoność mechanizmów regulujących indukcję tej ścieŝki apoptozy konieczne są dalsze badania dotyczące tego zagadnienia. SŁOWA KLUCZOWE: Par-4 BCL-2 BAX CD38 Apoptoza Przewlekła białaczka limfocytowa SUMMARY Par-4 (prostate apoptosis response-4) protein was originally found upregulated in prostate tumour cells undergoing apoptosis. It was further identified as a proapoptotic protein upregulated both in normal and leukaemic lymphocytes. The aim of our study was the assessment of Par-4 protein expression in B cells of B-CLL patients and the examination of its relationship with the expression of other proteins involved in apoptosis regulation. We found positive relationships between Par-4 and both BCL-2 and BAX protein expression. The results of our research were also analysed in association with the principal B-CLL prognostic factors. There was a positive correlation between the expression of Par-4 protein and the lactate dehydrogenase (LDH) and β 2 - microglobulin serum concentrations (p<0.01 and p<0.05, respectively), and a negative correla-

2 104 M. SIEKLUCKA i wsp. tion was found between Par-4 protein expression and haemoglobin level (p<0.01). The expression of Par-4 protein in B cells correlated positively with the percentage of CD38+ cells (p<0.05), and it was higher in patients with CD38+ phenotype (p<0.05). Our results confirm the significance of apoptosis deregulation in B-CLL and suggest a possible relationship between Par-4 expression and the clinical course of the disease, which however needs further investigation. KEY WORDS: Par-4 BCL-2 BAX CD38 Apoptosis Chronic lymphocytic leukaemia WSTĘP Gen PAR-4 (prostate apoptosis response gene-4) jest genem proapoptotycznym zidentyfikowanym podczas badania genów wykazujących zwiększoną ekspresję przy indukcji apoptozy w komórkach raka prostaty. Doświadczenia na liniach komórkowych raka prostaty, nerek czy czerniaka złośliwego wykazały, Ŝe nadekspresja Par-4 zwiększa wraŝliwość komórek na bodźce apoptotyczne, takie jak leki cytostatyczne, czy promieniowanie UV. Białko Par-4 wykazuje ekspresję zarówno w limfocytach prawidłowych (B i T), jak i białaczkowych [1]. Wykazano, Ŝe w komórkach limfoidalnych nadekspresja Par-4 prowadzi do obniŝenia ekspresji BCL-2 i rozszczepienia syntazy poli-adp-rybozy (PARP) [2]. Ponadto Par-4 wpływa na translokację białek Fas i FasL do błony komórkowej, indukując w ten sposób apoptozę drogą receptorową [3]. Według części badaczy, sama nadekspresja Par-4 jest czynnikiem niewystarczającym do indukcji apoptozy, natomiast znacznie nasila apoptozę indukowaną lekami cytostatycznymi, powodując: zmniejszenie potencjału mitochondrialnego, aktywację kaspazy- 3 oraz zmniejszenie ekspresji genów z rodziny IAP (inhibitors of apoptosis), ciap i XIAP, których mechanizm działania polega na inaktywacji prokaspaz i kaspaz [2]. Jednak Gurumurthy i wsp. stwierdzili, Ŝe istnieje mechanizm prowadzący do niezaleŝnej od chemioterapii, aktywacji w komórkach nowotworowych (selektywnie) proapoptotycznej funkcji Par-4 za pośrednictwem kinazy białkowej A (PKA), której stęŝenie jest zwiększone w większości komórek nowotworowych [3]. Innymi białkami, które wchodzą w interakcję z Par-4, są białka proapoptotyczne: kinaza ZIP (ZIPK) oraz Daxx (death-associated protein 6), które tworzą kompleks z Par-4, indukując w ten sposób proces apoptozy [4]. Mechanizmy regulujące tą ścieŝkę apoptozy obejmują białka BCL-2 i p53. Działanie białek z rodziny BCL-2 jest regulowane przez gen supresorowy TP53, którego mutacje stwierdza się u 10 15% pacjentów z PBL-B, zwłaszcza u chorych w zaawansowanym stadium choroby. Gen TP53, zwany straŝnikiem genomu, odgrywa istotną rolę zarówno w regulacji cyklu komórkowego, jak i procesu apoptozy. Białko będące jego produktem, po stwierdzeniu uszkodzenia DNA, bierze udział w blokowaniu cyklu komórkowego w fazie G 1 w celu dokonania reperacji DNA. Jednak jeŝeli naprawa uszkodzeń jest niemoŝliwa, dochodzi do indukcji apoptozy. Mutacja genu TP53 jest niepomyślnym prognostycznie czynnikiem u chorych na PBL-B [5]. UwaŜa się, Ŝe białka z rodziny BCL-2 modulują wewnątrzpochodną drogę apoptozy przede wszystkim poprzez kontrolę uwalniania cytochromu c z mitochondriów, jednak istnieją takŝe

3 Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B 105 doniesienia na temat bezpośredniego wpływu tych białek na kaspazy, np. przez mechanizm sekwestracji [6]. Badania nad Par-4 w PBL-B prowadzone są od niedawna i wciąŝ wiele kwestii pozostaje niejasnych. Wydaje się, Ŝe poznanie mechanizmów związanych z indukcją apoptozy za pośrednictwem Par-4 i interakcji między nimi w komórkach PBL-B moŝe mieć znaczenie rokownicze. Celem pracy była ocena ekspresji białka Par-4 w komórkach CD19+ we krwi chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową oraz poszukiwanie ewentualnej zaleŝności pomiędzy ekspresją tego białka a ekspresją białek BCL-2 i BAX oraz wybranymi parametrami klinicznymi PBL-B, a zwłaszcza takimi czynnikami prognostycznymi, jak stęŝenie LDH czy β2-mikroglobuliny oraz ekspresja antygenu CD38. MATERIAŁ I METODY Pacjenci. Badaniami objęto 35 chorych na PBL-B hospitalizowanych w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Wiek badanych chorych wahał się w granicach od 50 do 85 lat (średnia 64,4±8,7; 63). W grupie badanej było 16 kobiet i 19 męŝczyzn. Rozpoznanie PBL-B ustalono w oparciu o standardowe morfologiczne i immunofenotypowe kryteria opracowane przez NCI-WG (National Cancer Institute-Working Group) [7]. Stadium zaawansowania choroby określono na podstawie klasyfikacji Rai a [8]: w grupie niskiego ryzyka (st. 0 wg Rai a) znalazło się 10 chorych, w grupie pośredniego ryzyka (st. 1-2 wg Rai a) 20 chorych, zaś w grupie wysokiego ryzyka (st. 3 4 wg Rai a) 5 chorych. Materiał do badań stanowiła krew obwodowa pobrana z Ŝyły odłokciowej. Krew pobierano w ilości 10 ml do strzykawek zawierających heparynę (Polfa, Warszawa) w stęŝeniu 20j/ml krwi w celu izolacji komórek jednojądrzastych (w czasie nie dłuŝszym niŝ 1 godzina). Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Krew heparynizowaną rozcieńczano (w stosunku 1:1) 0,9% zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej PBS (Wytwórnia Surowic i Szczepionek, Lublin). Komórki jednojądrzaste izolowano następnie poprzez wirowanie w gradiencie gęstości przy uŝyciu preparatu Gradisol L o cięŝarze właściwym 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź) przez 20 minut przy przyspieszeniu 700 g. Uzyskane w ten sposób komórki płukano dwukrotnie w roztworze PBS. Następnie oceniano liczbę komórek (w komorze Neubauera) oraz ich Ŝywotność (barwienie błękitem trypanu 0,4% Trypan Blue Solution, Sigma, Niemcy). śywotność poniŝej 90% stanowiła kryterium dyskwalifikujące prowadzenie dalszych badań. Cytometria przepływowa. Podstawową techniką zastosowaną w przeprowadzonych badaniach była cytometria przepływowa. Wykorzystano cytometr przepływowy FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) wyposaŝony w laser argonowy o długości 488 nm. Do analizy wyników i ich graficznej prezentacji posłuŝył program komputerowy CellQuest (Becton Dickinson). Na podstawie parametrów wielkości (forward scatter, FSC) i ziarnistości komórki (side scatter, SSC) ustalano bramkę limfocytarną (region R1 obejmujący limfocyty i niewielki odsetek erytrocytów), wyłączając z analizy m.in.

4 106 M. SIEKLUCKA i wsp. komórki martwe. Czystość bramki limfocytarnej oceniano poprzez sprawdzenie rozkładu komórek w układzie współrzędnych CD45/CD14. Ocena markerów powierzchniowych badanych komórek. W celu oceny markerów powierzchniowych otrzymaną po izolacji zawiesinę komórek rozdzielano do poszczególnych probówek w ilości /próbkę i inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi sprzęŝonymi z fluorochromami (FITC, PE) zgodnie z zaleceniami producentów (zazwyczaj 5µl przeciwciała na próbkę, 20-minutowa inkubacja w temperaturze pokojowej). Do badań wykorzystano następujące przeciwciała monoklonalne: mouse IgG 1 FITC / IgG 2a, anty-cd45 FITC / CD14 PE, anty-cd3 FITC / CD19 PE, anty- CD5 FITC / CD19 PE, anty-cd19 PE, anty-cd23 FITC, anty-cd38. Następnie komórki dwukrotnie płukano PBS (700xg, 5 minut) i niezwłocznie poddawano analizie w cytometrze przepływowym. Ocena ekspresji białek wewnątrzkomórkowych w limfocytach CD19+. W celu oceny ekspresji: BCL-2, BAX i Par-4 w komórkach CD19+, po wyznakowaniu antygenów powierzchniowych (j.w.) komórki były utrwalane i permeabilizowane za pomocą zestawu IntraPrep Permeabilization Reagent (Immunotech, Francja), zgodnie z instrukcją producenta. Tak przygotowane komórki inkubowano z odpowiednim przeciwciałem monoklonalnym według zaleceń producenta, odpowiednio: anty-bcl-2 FITC (Dako, Dania), anty-bax FITC (Santa Cruz Biotechnology), anty-par-4 (Santa Cruz Biotechnology). NaleŜy dodać, Ŝe niesprzęŝone z fluorochromem przeciwciało anty- Par-4 zostało poddane procedurze łączenia z Zenon Mouse IgG Labeling Kit. Następnie, po przepłukaniu, próbki oceniano w cytometrze przepływowym. Statystyczne opracowanie wyników. Analizę statystyczną uzyskanych wyników badań przeprowadzono przy pomocy programu Statistica 5.0. Z uwagi na fakt, Ŝe badane zmienne nie miały rozkładu normalnego, w analizie stosowano testy nieparametryczne: test U Manna-Whitney a, test kolejności par Wilcoxona, test ANOVA rang Kruskala-Wallisa, współczynnik korelacji Spearmana. Za znamienny statystycznie uznano poziom istotności p Wyniki nieistotne statystycznie oznaczono skrótem NS. WYNIKI ZaleŜność pomiędzy ekspresją Par-4 a wybranymi parametrami klinicznymi PBL-B Podczas analizy uzyskanych wyników stwierdzono ujemną korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a stęŝeniem hemoglobiny (R= 0,4; p<0,01). Stwierdzono takŝe dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a stęŝeniem LDH (R= 0,4; p<0,01) i β2-mikroglobuliny (R= 0,4; p<0,01). [Ryc. 1.]

5 Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B ,00 16,00 14,00 HGB 12,00 10,00 8,00 6, ,00 Par-4 MFI 7,00 6,00 B2M 2m B 5,00 4,00 3,00 2,00 1, PAR4_MFI Par-4 MFI LDH LDH PAR-4 MFI Par-4 MFI Ryc. 1. ZaleŜność pomiędzy ekspresją Par-4 a wybranymi parametrami klinicznymi PBL-B: stęŝeniem hemoglobiny (R= -0,4; p<0,01), stęŝeniem β2-mikroglobuliny (R= 0,4; p<0,01) i LDH (R= 0,4; p<0,01). Fig. 1. The relationship between Par-4 expression and B-CLL clinical parameters: haemoglobin level (R= -0,4; p<0,01), β2-microglobulin level (R= 0,4; p<0,01) and LDH level (R= 0,4; p<0,01).

6 108 M. SIEKLUCKA i wsp. ZaleŜność pomiędzy ekspresją białek Par-4 i BCL-2 w komórkach PBL-B Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a ekspresją białka BCL-2 (R= 0,5; p<0,001). ZaleŜność pomiędzy ekspresją białek Par-4 i BAX w komórkach PBL-B Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a ekspresją białka BAX (R= 0,6; p<0,00001). Ocena antygenu CD38 na limfocytach białaczkowych Wobec potwierdzonej wartości rokowniczej antygenu CD38 u chorych na PBL-B [9 11], badaną grupę podzielono na chorych CD38+ i CD38 [Tabela 1]. Ekspresję CD38 określano jako dodatnią, w przypadkach, gdy występowała w ponad 20% komórek białaczkowych. Dodatnią ekspresję CD38 stwierdzono u 11 spośród 35 chorych (31%), ujemną u 24 chorych (69%). Tabela 1. Porównanie parametrów laboratoryjnych w grupach chorych na PBL-B z dodatnią i ujemną ekspresją CD38 Table 1. The comparison of laboratory parameters in CD38+ and CD38- B-CLL patients WBC (G/l) LIMF(G/l) HGB (g/dl) Parametr CD38+ (n=11) 51,86±32,89 43,90 42,19±27,95 33,70 12,44±1,66 12,60 CD38- (n=24) 33,26±26,62 22,30 26,83±22,55 18,00 13,69±1,48 13,50 Wartość p (test U Manna-Whitney a) 0,02 0,04 0,03 PLT (G/l) 128,23±31,47 117,00 176,32±52,69 166,50 0,002 B2M (mg/l) 3,86±1,32 3,79 2,88±1,31 2,47 0,02 LDH (U/l) 437,42±182,76 362,50 360,73±70,65 348,00 0,3 BCL-2/ CD19 (MFI) 98,26±53,98 88,99 102,33±56,74 82,69 0,86 BAX/ CD19 (MFI) 28,36±15,86 21,57 23,74±18,39 18,48 0,166 BCL-2/ BAX (CD19) 3,77±1,86 3,37 4,68±1,84 4,58 0,046 Par-4/ CD19 (MFI) 31,16±16,65 26,78 21,96±10,08 19,85 0,028

7 Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B 109 ZaleŜność pomiędzy ekspresją białka Par-4 a odsetkiem komórek CD38+ Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a odsetkiem komórek CD38+ (R= 0,4; p<0,05) u chorych na PBL-B. Ocena ekspresji białka Par-4 w limfocytach B chorych o fenotypie CD38+ i CD38- U chorych o fenotypie CD38+ wykazano istotnie większą (p<0,05) ekspresję białka Par-4 ( MFI=26,8) w porównaniu z chorymi CD38- ( MFI=19,9). [Ryc. 2.] Par-4 MFI CD38 - CD38 + Min-Maks. 25%-75% Mediana Ryc. 2. Ocena ekspresji białka Par-4 w limfocytach B chorych o fenotypie CD38- i CD38+ (p<0,05) Fig. 2. Assessment of Par-4 protein expression in B cells of CD38- and CD38+ B-CLL patients (p<0,05) Ocena ekspresji białka Par-4 w limfocytach B chorych w róŝnych stadiach zaawansowania choroby U chorych w zaawansowanych stadiach (3 4 wg Rai a) wykazano większą ekspresję białka Par-4 ( MFI=27) w porównaniu z chorymi we wcześniejszych stadiach (0 2 wg Rai a) ( MFI=21,5). Jednak nie była to róŝnica istotna statystycznie. DYSKUSJA Biorąc pod uwagę istotną rolę przypisywaną ostatnio białku Par-4 w indukcji apoptozy wybiórczo w komórkach nowotworowych oraz znaczenie tego białka w apoptozie indukowanej lekami, celowa wydaje się ocena jądrowej drogi apoptozy związanej z Par-4 u chorych na PBL-B. We wstępnych badaniach własnych stwierdzono ujemną

8 110 M. SIEKLUCKA i wsp. korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a stęŝeniem hemoglobiny oraz dodatnią korelację pomiędzy ekspresją tego białka a stęŝeniem LDH i β2-mikroglobuliny. Ponadto u chorych o fenotypie CD38+ wykazano istotnie większą ekspresję białka Par-4 w porównaniu z chorymi o fenotypie CD38-. Odnotowano równieŝ, Ŝe u chorych w stadiach 3 4 wg Rai a ekspresja białka Par-4 była większa w porównaniu z chorymi we wcześniejszych stadiach. Wyniki te wydają się potwierdzać znaczenie rokownicze białka Par-4 u chorych na PBL-B, jednak z uwagi na złoŝoność mechanizmów regulujących indukcję tej ścieŝki apoptozy konieczne są dalsze badania dotyczące tego zagadnienia. Znajdujący się na 12 chromosomie gen PAR-4 zidentyfikowano podczas badania genów wykazujących zwiększoną ekspresję przy indukcji apoptozy w komórkach raka prostaty. Kolejne badania wykazały, Ŝe zwiększenie ekspresji białka Par-4 zwiększa wraŝliwość komórek raka prostaty na bodźce apoptotyczne przez obniŝenie ekspresji białka BCL-2. RównieŜ w przypadku fibroblastów zmniejszenie ekspresji białka BCL- 2 spowodowane nadekspresją białka Par-4 prowadzi do zwiększenia podatności tych komórek na bodźce apoptotyczne. Stwierdzono, Ŝe białko Par-4 wykazuje ekspresję zarówno w limfocytach prawidłowych, jak i białaczkowych. W badaniu Boehrera i wsp. przeprowadzonym m.in. u chorych na PBL-B we wszystkich przypadkach stwierdzono wysoką ekspresję białka Par-4, zaś w większości ekspresję mrna dla Par-4 [1]. Jak wspomniano, mechanizmy regulujące indukcję apoptozy przy udziale Par-4 obejmują m.in. antyapoptotyczne białko BCL-2. Wiele badań próbowało zdefiniować rolę białka BCL-2 w PBL-B, ale nie udało się określić jego roli jako czynnika prognostycznego. Jednak sugeruje się, Ŝe białko BCL-2 jest przynajmniej częściowo odpowiedzialne za oporność komórek PBL-B na bodźce proapoptotyczne [1]. UwaŜa się, Ŝe białka z rodziny BCL-2 modulują wewnątrzpochodną drogę apoptozy przede wszystkim poprzez kontrolę uwalniania cytochromu c z mitochondriów, jednak istnieją takŝe doniesienia na temat bezpośredniego wpływu tych białek na kaspazy, np. przez mechanizm sekwestracji [6]. Mimo licznych badań i powstających w ich wyniku róŝnych teorii dotyczących mechanizmu działania białek z rodziny BCL-2, rola tych białek jest niejasna. śadna z powstałych dotąd teorii nie wyjaśniła wszystkich szczegółów związanych z mechanizmem działania tych białek, co moŝe przemawiać za jego złoŝonością [12]. Pomimo przypisywaniu przez wielu autorów białkom z rodziny BCL-2 funkcji kontroli nad przepuszczalnością zewnętrznej błony mitochondrialnej (MOMP) i procesem uwalniania cytochromu c z mitochondriów, istnieją doniesienia na temat niezaleŝnego od tych białek uwalniania cytochromu c do cytoplazmy [13, 14]. U większości chorych na PBL-B stwierdza się wysoką ekspresję białka BCL-2, co odkryto ponad 10 lat temu, jednak mechanizmy odpowiedzialne za taki stan rzeczy nie zostały dotąd wyjaśnione. Opisywano np. hipometylację genu BCL-2, a takŝe translokacje chromosomowe [5, 15]. Koncepcja dotycząca roli białek z rodziny BCL-2 w procesie apoptozy powstała po stwierdzeniu obniŝonej ekspresji białka BCL-2 w komórkach wchodzących w apoptozę in vitro. W PBL-B istotny jest przede wszystkim stosunek BCL-2/BAX, który, jeśli jest podwyŝszony, często koreluje z agresywnym przebiegiem choroby czy opornością na leczenie [5, 6]. Stosunek BCL-2/BAX jest

9 Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B 111 większy u chorych na PBL-B w porównaniu z osobami zdrowymi, co moŝe przyczyniać się do długowieczności komórek PBL-B. Natomiast w badaniach własnych stosunek BCL-2/BAX był znamiennie większy u chorych o fenotypie CD38 analogicznie do mniejszej ekspresji białka Par-4 u tych chorych w porównaniu z chorymi o fenotypie CD38+. Wyniki te pozostają w zgodzie z wynikami naszych wcześniejszych badań, w których stwierdzono większy odsetek komórek apoptotycznych ex vivo u chorych w późnych stadiach zaawansowania klinicznego wg Rai a w porównaniu do odsetka tych komórek u chorych w stadiach wcześniejszych [16]. Jednak w świetle nowych doniesień sugerujących, Ŝe oprócz długowiecznych komórek z zaburzeniami apoptozy obecnych we krwi obwodowej, pulę krąŝących limfocytów PBL-B mogą uzupełniać komórki proliferujące pochodzące z takich narządów jak np. szpik kostny, węzły chłonne czy śledziona [17], konieczne jest kontynuowanie badań nad tym zagadnieniem. Nie wszystkie doniesienia potwierdzają związek białek BCL-2 czy BAX z przebiegiem PBL-B, wskazując na wielopłaszczyznowość zaburzeń apoptozy w tej chorobie [18]. Przykład stanowią badania przeprowadzone przez Molicę i wsp., którzy nie stwierdzili korelacji pomiędzy ekspresją BCL-2 a obrazem klinicznym PBL-B w chwili rozpoznania, czy odpowiedzią na leczenie [19]. Chandra i wsp. badali podatność komórek linii CCRF-CEM na 2-CdA, oceniając m.in. ekspresję białek z rodziny BCL- 2. Nie stwierdzili oni róŝnicy w ekspresji antyapoptotycznych białek BCL-2 i BCL-x L pomiędzy liniami podatnymi i opornymi na 2-CdA, natomiast komórki linii opornych wykazywały zwiększoną ekspresję proapoptotycznego białka BAX [20]. Bosanquet i wsp. oceniali związek pomiędzy ekspresją białek BAX i BCL-2 a podatnością komórek PBL-B (ex vivo) na apoptozę pod wpływem leków wchodzących w skład najczęstszych schematów chemioterapeutycznych. Okazało się, Ŝe obniŝona ekspresja białka BAX korelowała z opornością na leki, takie jak antracykliny, środki alkilujące i winkrystyna, nie stwierdzono natomiast takiej zaleŝności w przypadku analogów puryn czy kortykosteroidów. Ekspresja białka BCL-2 nie korelowała z podatnością na Ŝaden z badanych leków. Ponadto nie wykryto zaleŝności pomiędzy ekspresją białek BAX i BCL-2 a czasem przeŝycia [21]. U poszczególnych chorych ekspresja białek z rodziny BCL-2 jest róŝna, nie odnotowano jednak związku ze stadium zaawansowania klinicznego PBL-B [6, 22]. W badaniach własnych takŝe nie zaobserwowano związku pomiędzy ekspresją tych białek a stadium zaawansowania klinicznego PBL-B wg Rai a. Ostatnio sugerowano, Ŝe nadekspresja BCL-2 w komórkach nowotworowych moŝe być odpowiedzią na sygnały śmierci nieustannie wzbudzane w tych komórkach w związku z ich charakterystycznymi cechami fenotypowymi, takimi jak niestabilność genomu czy aktywacja onkogenów. Powoduje to ciągłe zapotrzebowanie na antyapoptotyczną funkcję białka BCL-2 i istnienie znikomej rezerwy tej funkcji. Paradoksalnie, skutkiem tego moŝe być indukcja apoptozy w komórkach z nadekspesją białka BCL-2 [23]. Wykazano, Ŝe w komórkach limfoidalnych nadekspresja białka Par-4 prowadzi do obniŝenia ekspresji białka BCL-2, ale nie powoduje zmniejszenia ekspresji białka

10 112 M. SIEKLUCKA i wsp. BAX. Natomiast u chorych na PBL-B nie stwierdzono zaleŝności pomiędzy ekspresją białek Par-4 i BCL-2 [1]. W badaniach własnych stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a ekspresją białek BCL-2 oraz BAX, co wobec przytoczonej wyŝej literatury potwierdza istnienie nieprawidłowości dotyczących mechanizmów regulacji procesu apoptozy u chorych na PBL-B. Dalsze badania obejmujące mechanizmy związane z indukcją apoptozy za pośrednictwem Par-4 pozwolą na poszerzenie wiedzy na temat biologii PBL-B oraz związku procesu apoptozy z przebiegiem choroby. Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach jako projekt badawczy nr N N PIŚMIENNICTWO 1. Boehrer S, Chow KU, Puccetti E, Ruthardt M, Godzisard S, Krapohl A, Schneider B, Hoelzer D, Mitrou PS, Rangnekar VM, Weidmann E. Deregulated expression of prostate apoptosis response gene-4 in less differentiated lymphocytes and inverse expressional patterns of par-4 and bcl-2 in acute lymphocytic leukemia. Hematol J, 2001; 2: Boehrer S, Chow KU, Beske F, Kukoc-Zivojnov N, Puccetti E, Ruthardt M, Baum C, Rangnekar VM, Hoelzer D, Mitrou PS, Weidmann E. In lymphatic cells par-4 sensitizes to apoptosis by downregulating bcl-2 and promoting disruption of mitochondrial membrane potential and caspase activation. Cancer Res, 2002; 62: Gurumurthy S, Goswami A, Vasudevan KM, Rangnekar VM. Phosphorylation of Par-4 by protein kinase A is critical for apoptosis. Mol Cell Biol, 2005; 25: Kawai T, Akira S, Reed JC. ZIP kinase triggers apoptosis from nuclear PML oncogenic domains. Mol Cell Biol 2003; 23: Kolb J-P, Kern C, Quiney C, Roman V, Billard C. Re-establishment of a normal apoptotic process as therapeutic approach in B-CLL. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol. Disord, 2003; 3: Packham G, Stevenson FK. Bodyguards and assassins: Bcl-2 family proteins and apoptosis control in chronic lymphocytic leukaemia. Immunology, 2005; 114: Cheson BD, Bennett JM, Grever M, Kay N, Keating MJ, O'Brien S, Rai KR. National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood. 1996; 87: Rai KR, Sawitzky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46: Gentile M, Mauro FR, Calabrese E, De Propris MS, Giammartini E, Mancini F, Milani ML, Guarini A, Foà R. The prognostic value of CD38 expression in chronic lymphocytic leukaemia patients studied prospectively at diagnosis: a single institute experience. Br J Haematol. 2005; 130: Hus I, Podhorecka M, Bojarska-Junak A, Rolinski J, Schmitt M, Sieklucka M, Wasik-Szczepanek E, Dmoszynska A. The clinical significance of ZAP-70 and CD38 expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Ann Oncol. 2006; 17: Ibrahim S, Keating M, Do KA, O Brien S, Huh YO, Jilani I, Lerner S, Kantarjian HM, Albitar M. CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2001; 98: Armstrong JS. Mitochondria: a target for cancer therapy. Br J Pharmacol, 2006; 147: Bouchier-Hayes L, Lartigue L, Newmeyer DD. Mitochondria: pharmacological manipulation of cell death. J Clin Invest, 2005; 115:

11 Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B Green DR, Kroemer G. Pharmacological manipulation of cell death: clinical applications in sight? J Clin Invest, 2005; 115: Thomas A, Pepper C, Hoy T, Bentley P. Bcl-2 and Bax expression and chlorambucil-induced apoptosis in the T-cells and leukaemic B-cells of untreated B-cell chronic lymphocytic leukaemia patients. Leuk Res, 2000; 24: Sieklucka M, Pozarowski P, Bojarska-Junak A, Hus I, Dmoszynska A, Rolinski J. Apoptosis in B- CLL: the relationship between higher ex vivo spontaneous apoptosis before treatment in III-IV Rai stage patients and poor outcome. Oncol Rep. 2008; 19: Messmer BT, Messmer D, Allen SL, Kolitz JE, Kudalkar P, Cesar D, Murphy EJ, Koduru P, Ferrarini M, Zupo S, Cutrona G, Damle RN, Wasil T, Rai KR, Hellerstein MK, Chiorazzi N. In vivo measurements document the dynamic cellular kinetics of chronic lymphocytic leukemia B cells. J Clin Invest. 2005; 115: Reed JC, Kitada S. Apoptosis disregulation in chronic lymphocytic leukemia. W: Chronic lymphoid leukemias. Red.: Cheson BD. Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork 2001, Molica S, Mannella A, Dattilo A, Levato D, Iuliano F, Peta A, Consarino C, Magro S. Differential expression of BCL-2 oncoprotein and Fas antigen on normal peripheral blood and leukemic bone marrow cells. A flow cytometric analysis. Haematologica; 1996; 81: Chandra J, Mansson E, Gogvadze V, Kaufmann SH, Albertioni F, Orrenius S. Resistance of leukemic cells to 2-chlorodeoxyadenosine is due to a lack of calcium-dependent cytochrome c release. Blood, 2002; 99: Bosanquet AG, Sturm I, Wieder T, Essmann F, Bosanquet MI, Head DJ, Dörken B, Daniel PT. Bax expression correlates with cellular drug sensitivity to doxorubicin, cyclophosphamide and chlorambucil but not fludarabine, cladribine or corticosteroids in B cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 2002; 16: Kitada S, Andersen J, Akar S, Zapata JM, Takayama S, Krajewski S, Wang H-G, Zhang X, Bullrich F, Croce CM, Rai K, Hines J, Reed JC. Expression of apoptosis-regulating proteins in chronic lymphocytic leukemia: correlations with in vitro and in vivo chemoresponses. Blood, 1998; 91: Del Gaizo Moore V, Brown JR, Certo M, Love TM, Novina CD, Letai A. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT J Clin Invest. 2007; 117: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres do korespondencji: Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie ul. Staszica Lublin