KRZYWA KALIBRACJI I WSPÓŁCZYNNIK SYGNAŁU DETEKTORA W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

Transkrypt

1 KRZYWA KALIBRACJI I WSPÓŁCZYNNIK SYGNAŁU DETEKTORA W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ 1. WPROWADZENIE Detektor jest jednym z trzech, obok układu wprowadzania próbki i kolumny, głównym elementem składowym chromatografu. Zadaniem detektora jest ilościowa rejestracja rozdziału chromatograficznego. Oprócz nich w systemie znajdują się: źródło gazu nośnego, regulacja przepływu gazu nośnego, kontrola i regulacja temperatury, wzmacniacz detektora oraz system zbierania i przetwarzania danych. Sygnał detektora charakteryzują trzy główne wielkości: czułość, selektywność i zakres liniowości. Czułość jest stosunkiem wielkości sygnału do wielkości próbki. Minimalny poziom detekcji definiuje się jako ilość substancji, której sygnał jest 3 do 10 razy wyższy od poziomu szumów. Wielkość ta jest szczególnie istotna w przypadku analiz próbek środowiskowych. Selektywność niektóre detektory reagują na obecność niemal wszystkich rodzajów związków, te noszą nazwę detektorów uniwersalnych. Inne czułe są wyłącznie na pewne grupy związków, cecha ta jest szczególnie użyteczna, gdy badane związki występują w złożonych matrycach nie dających sygnału na tym typie detektora. Zakres liniowości to zakres stężeń substancji, dla których sygnał detektora jest wprost proporcjonalny do ilości substancji. Detektory w chromatografii gazowej podzielić można m.in. według poniższych kwalifikacji: Selektywności lub uniwersalności Niszczenia bądź nie analizowanej próbki Poniżej omówione zostaną wybrane detektory stosowane w chromatografii gazowej z uwzględnienie obu powyższych kryteriów kwalifikacyjnych. Detektor termokonduktometryczny (katarometr lub detektor TCD). Jest to detektor uniwersalny, wykrywa związki, których przewodnictwo cieplne różni się od przewodnictwa cieplnego gazu nośnego. Katarometr rzadko stosuje się w analizach 1

2 zanieczyszczeń środowiska ze względu na swą małą czułość. Zasada działania tego detektora polega na wykorzystaniu wrażliwości niektórych oporników na małe zmiany temperatury. Zasadniczym elementem pomiarowym są cztery oporniki (których oporność silnie zależy od temperatury) włączone w ramiona mostka Wheatstone a. Dwa z nich służą jako elementy porównawcze, (przepływa przez nie czysty gaz nośny), dwa pozostałe służą jako czujniki i są umieszczone w strumieniu gazu opuszczającego kolumnę. Jeśli przez wszystkie cztery czujniki płynie czysty gaz nośny wówczas mostek jest w równowadze. Jeśli jednak wraz z gazem nośnym z kolumny chromatograficznej eluuje się związek analizowany wówczas tak zanieczyszczony gaz inaczej (zwykle gorzej), odbiera ciepło od oporników. Zmienia się więc ich temperatura a co za tym idzie ich oporność. Równowaga elektryczna mostka zostaje zachwiana i na jego narożach pojawia się napięcie, które jest wzmacniane i rejestrowane jako sygnał detektora. Sygnał detektora zależy od stężenia substancji w gazie nośnym. Czułość detektora TCD wynosi zwykle 2 x 10-6 mg/ml co praktycznie pozwala na detekcję nawet do 0,5 x 10-9 g węglowodoru. Zalicza się do detektorów nie niszczących analizowanych próbek. Detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID) Podstawowym elementem tego detektora jest palnik wodorowo- powietrzny. Detektor ten wykorzystuje zmianę przewodnictwa elektrycznego atmosfery płomienia w momencie elucji związku organicznego z kolumny. Zmiana ta jest wynikiem tworzenia się dużej ilości jonów z spalających się w płomieniu palnik cząsteczek związku opuszczających kolumnę chromatograficzną. Jony te są nośnikiem prądu elektrycznego, którego natężenie jest proporcjonalne do ilości związku w płomieniu. Prostota konstrukcji, łatwość stosowania, bardzo wysoka czułość (10-11 do g/sec) sprawiają, że jest to niewątpliwie najpowszechniej stosowany detektor w chromatografii gazowej. Detektor płomieniowojonizacyjny uważany jest za detektor uniwersalny. Tylko nieliczne związki nie mogą być przy jego pomocy analizowane. Są to: - gazy trwałe: H 2, He, N 2 - związki zawierające jeden atom węgla związany z tlenem siarką lub chlorem: CO, CO 2, CS 2, COS, CCl 4 itp., - gazy nieorganiczne: SO 2, NH 3, - woda i kwas mrówkowy. Z uwagi na swą budowę, zalicza się do detektorów niszczących analizowane próbki Detektor wychwytu elektronów ECD. 2

3 Zasada działania tego detektora polega na gwałtownym spadku natężenia prądu płynącego w komorze jonizacyjnej po wprowadzeniu do niej substancji powinowactwie elektronowym. Prąd podstawowy (niskoenergetyczne elektrony) uzyskuje się jonizując cząsteczki gazu nośnego (N 2 ) promieniowanie β ze źródła radioaktywnego jakim zwykle jest folia Ni 63. Substancje zawierające halogeny odznaczają się dużym powinowactwem bo elektronów i przejawiają tendencję do wychwytywania niskoenergetycznych elektronów zmniejszając tym samym natężenie prądu podstawowego. Wielkość tego zmniejszenia jest równocześnie miarą ilości substancji. Β + N 2 N e X + e - X - Detektor ten charakteryzuje się bardzo wysoką czułością rzędu g dla CCl 4. Sygnał do CCl 4 jest 6,7*10 6 silniejszy niż sygnał od benzenu. Względne sygnały detektora wychwytu elektronów przedstawiono poniżej w tabeli 1. Tab.1. Względne sygnały detektora wychwytu elektronów. Związki organiczne Związki halogenopochodne Benzen - 0,06 C 3 F 8-1,00 1- butanol - 1,00 CF 3 Cl - 3,3 1- chlorobutan - 1,00 CF 2 Cl 2-3 x bromobutan CFCl 3-1,2* jodobutan - 9 x 10 4 CF 2 =CFCl CCl 4-4 x 10 5 CF 2 =CCl CHCl=CCl 2-6,7 x 10 4 Detektor ten jest więc szczególnie czuły na związki zawierające halogeny i granica detekcji takich połączeń mieści się w przedziale 0,05 x do 1 x g takiego związku (zależnie od ilości atomów Cl w cząsteczce). Czułość tego detektora wzrasta wraz ze wzrostem ciężaru halogenu ( F< Cl < Br < J ) i ze wzrostem ilości atomów halogenu w cząsteczce. Detektor ECD jest stosunkowo mało czuły ( w stosunku do chloru ) na związki fluoropodobne. Detektor ECD wymaga stosowania azotu lub mieszaniny ( Ar + 5% CH 4 ) jako tzw make-up gazu przy czym azot w większości przypadków jest korzystniejszy. Selektywność tego detektora na związki chlorowcoorganiczne jest szczególnie istotna w analizie zanieczyszczeń środowiska gdzie halogenopochodne węglowodorów stanowią istotną część 3

4 najgroźniejszych antropogennych polutantów. Wśród najczęściej oznaczanych w środowisku związków wymienić można: trihalometany obecne w wodzie pitnej jako rezultat dezynfekcji chlorem; pestycydy chlorowcoorganiczne jak DDT, heksachlorobenzen, heksachloroheksan i wiele innych; polichlorowane bifenyle- grupa 209 związków bardzo szeroko rozpowszechnianych w całym środowisku; polichlorowane dibenzodioxyny i dibenzofurany- jedne z najsilniejszych trucizn organicznych. Detektor ECD zalicza się do grupy detektorów nie niszczących próbek. Detektor fotojonizacyjny ( PID) Składa się z urządzenia wytwarzającego fotony oraz komory detekcyjnej. Źródłem fotonów zwykle są wyładowania elektryczne w Ar, He lub H 2 pod zmniejszonym ciśnieniem lub lampa UV dająca światło monochromatyczne. Fotony o energii 10,2 ev (zwykle jest to przedział ev ) przechodzą przez optycznie przepuszczalne ( MgF 2 ) okno do komory detekcyjnej ( jonizacyjnej) gdzie znajduje się elektroda zbierająca i wylot kolumny chromatograficznej. Fotony padające na cząsteczki związków organicznych opuszczające kolumnę o energii jonizacji mniejszej od energii promieniowania, wzbudzają je, a te rozładowują się przez jonizację lub dysocjację i dlatego obserwuje się wzrost natężenia przepływu prądu. Prąd tła jest tu bardzo niski rzędu A, a jego wielkość zależy od ilości zanieczyszczeń w gazie nośnym. Jeśli są to H 2 O lub O 2 to energia 10,2 ev jest zbyt mała by je wzbudzić- więc nie utrudniają detekcji. Sygnał detektora PID zależy od struktury cząsteczki i podlega następującym regułom: - Czułość detektora wzrasta ze wzrostem ilości atomów węgla - Czułość dla alkanów < alkenów < związków aromatycznych - Czułość na związki cykliczne > związki niecykliczne - Czułość na alkany < alkohole < estry < aldehydy< ketony - Czułość na związki rozgałęzione > związki liniowe - Czułość na fluoropochodne < chloro- < bromo- < jodo- - Dla podstawionych benzenów: - podstawniki elektrodonorowe zwiększają czułość PID - podstawniki elektroakceptorowe zmniejszają czułość (z wyjątkiem halogenów). PID jest czulszy od FID-a około 5 10 razy dla alkanów i około 35 razy dla związków aromatycznych i jego czułość wynosi 1 10 pikogramów substancji (1 10 x g). Detektor PID zalicza się do grupy detektorów nie niszczących próbek. 4

5 Tab.2. Porównanie czułości i selektywności wybranych detektorów stosowanych w GC. Typ detektora Czułość Selektywność Łatwość stosowania [ g/sek] [ g X/g C] FID x dobra PID 2 x (benzen) zmienna dobra ECD ca zmienna dobra (zmienna) (Cl) Detektor masowy Szczególną pozycję ma jednak detektor spektrometr masowy. dlatego też układ GC/MS omówiony zostanie bardziej szczegółowo. GC/MS to jedno z najbardziej udanych połączeń dwóch technik analitycznych. GC zabezpiecz wprowadzenie czystego związku i chroni MS przed wprowadzeniem nielotnego zanieczyszczenia, a spektrometr masowy wykrywa, oznacz ilościowo i identyfikuje związek eluowany z kolumny chromatograficznej Układ GC/MS składa się z czterech głównych części :GC, separator, MS, komputer. Współczesne chromatografy gazowe mogą być wyposażane w jedną lub dwie kolumny chromatograficzne. W tej sytuacji na jednym chromatografie może być zainstalowane nawet kilka detektorów. Mogą one być zainstalowane rozdzielnie, po jednym na wylocie z każdej kolumny chromatograficznej, bądź dwa lub więcej przy wylocie tej samej kolumny. W tym przypadku pojawiające się na wylocie kolumny związki mogę być dzielony specjalnym podzielnikiem na dwa detektory pracujące niezależnie, bądź cały analit przechodzi wpierw przez jeden a następnie drugi detektor ustawione jeden nad drugim (tzw. układ on-line). Oba systemy wielodetektorowe umożliwiają otrzymanie pełniejszego obrazu analizowanego analitu. Oba te układy mają swoje zalety i wady. Układ z podzielnikiem analitu z jednej strony obniża ładunek związku dopływającego do detektora, co zasadniczo jest niekorzystne, ale w przypadku zasadniczej różnicy w czułości detektorów może być również zaletą. Z drugiej strony nie stawia detektorom wymagań dotyczących analizowania próbki bez jej zniszczenia. Bezsprzeczną wadą tego układu jest natomiast wysoka komplikacja systemu, a co za tym idzie jego wysoka cena, znacznie wyższa niż suma cen obu detektorów. Układ detektorów ustawionych jeden nad drugim (tzw. układ on-line) jest układem relatywnie tanim, cena zestawu to praktycznie sumaryczne koszty obu detektorów. 5

6 Podstawowe wady to ograniczenia w zestawianiu detektorów w pary, pierwszy z nich zawsze musi być detektorem analizującym próbki bez ich zniszczenia oraz ograniczenia w wyborze np. ekstrahentów w procesie zatężania analitu. Na przykład w układzie on-line ECD/FID do ekstrakcji próbek nie można wykorzystywać odczynników chloroorganicznych takich jak np. dichlorometan (bardzo przydatnych w niektórych analizach z wykorzystaniem detektora FID) z uwagi na niebezpieczeństwo przeładowania, grożącego nawet uszkodzeniem, czułego na związki haloorganiczne detektora ECD. Ponadto gdy oba detektory nadmiernie (np. o trzy rzędy wielkości) różnią się wykrywalnością, w przypadku monitorowania ich obu, ładunek analitu dostarczany na układ detektorów nigdy nie jest optymalny dla obu detektorów jednocześnie. Często mamy do czynienia z analizą w pobliżu poziom detekcji detektora mniej czułego albo blisko górnego poziomu wykrywalności detektora bardziej czułego. 2. CEL ĆWICZENIA Zapoznanie się z: Budową, zasadą działania i właściwościami wybranych detektorów stosowanych w chromatografii gazowej. Wykorzystaniem selektywnych i uniwersalnych detektorów w analizie związków organicznych. Opracowywaniem krzywych kalibracji z uwzględnieniem liniowego i nieliniowego współczynnika odpowiedzi detektora. Pojęciem współczynnika odpowiedzi detektora 3. ZAKRES MATERIAŁU WYMAGANY PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO WYKONYWANIA ĆWICZENIA. Detektory stosowane w chromatografii gazowej Budowa i zasada działania Detektory selektywne i uniwersalne Czułość i współczynnik sygnału detektora Liniowość i nieliniowość współczynnika sygnału detektora Detektory niszczące i nie niszczące próbek System instalacji detektorów: on-line i równoległy zalety i wady Zalecana literatura: J. Nawrocki, I. Obst : Metody analizy zanieczyszczeń powietrza atmosferycznego i organicznych zanieczyszczeń wody pitnej Wydawnictwo Naukowe UAM 6

7 4. SPRZĘT I ODCZYNNIKI Chromatograf gazowy Fisons GC 6000 wyposażony w detektory ECD i FID w układzie on-line i system nastrzyku próbki on-column. Warunki analizy: Kolumna chromatograficzna J&W DB-5 30 m x 0,32 mm x 0,32 µm Program temperaturowy 45 o C (3 min)-8 o C/min-315 o C(1 min) Ciśnienie gazu nośnego He 70 kpa, ciśnienie N 2, tzw. make up gazu 150 kpa. Strzykawki chromatograficzne o pojemności 50 µl i 5 µl Naczyńka laboratoryjne Pentanowy roztwór tetrachlorku węgla i toluenu Pentan cz.d.a. 5. SPOSÓB WYKONANIA ĆWICZENIA 5.1. WYKONANIE SERII ROZCIEŃCZEŃ MIESZANINY MIX1 Naczyńko laboratoryjne oznaczone MIX1 zawiera rozpuszczoną w pentanie mieszaninę toluenu i tetrachlorku węgla w stężeniach odpowiednio 250 µg/ ml i 5 µg/ml. Wykonać serię rozcieńczeń mieszaniny w celu wykonania krzywych wzorcowych obu związków na chromatografie gazowym wyposażonym w detektory ECD i FID ustawione w systemie online. W tym celu automatyczną pipetą pobrać porcje pentanu po 250 µl i wprowadzić do naczyniek MIX2, MIX3. MIX4 i MIX5. Strzykawką o pojemności 50 ul. usunąć z naczyńka MIX2 125 µl. pentanu a następnie dodać 125 µl roztworu MIX1. Naczyńko szczelnie zamknąć nakrętką i wstrząsając nim wymieszać zawartość Wyczyścić strzykawkę poprzez kilkakrotne zaciągnięcie pentanu. Podobnie postąpić w przypadku następnych rozcienczeń usuwając z kolejnych naczyniek odpowiednio 50 µl, 25µl, 10µl pentanu, wprowadzając na ich miejsce odpowiednie ilości roztworu MIX1. Tab.3. Stężenia tetrachlorku węgla i toluenu w poszczególnych wzorcach Stężenie wzorca [µg/ml] Tetrachlorek toluen węgla MIX MIX2 2,

8 MIX MIX4 0,5 25 MIX5 0, ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA: 1 µl roztworu z naczyńka MIX1 wprowadzić strzykawką chromatograficzną do dozownika chromatografu gazowego wyposażonego w detektory ECD i FID ustawione w systemie on-line. Po zakończeniu cyklu chromatograficznego, zebrać i wydrukować otrzymane chromatogramy. Następnie wykonać nastrzyki roztworów MIX2, MIX3, MIX4 i MIX5. Zidentyfikować na chromatogramach GC-FID pik toluenu a na chromatogramach GC- ECD pik tetrachlorku węgla. 6. OPRACOWANIE WYNIKÓW 6.1. WYKONANIE KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ W przygotowany arkusz kalkulacyjny EXCEL wprowadzić wysokości pików toluenu i tetrachlorku węgla w funkcji stężenia. Zbadać prawidłowość uzyskanych wyników tzn. dodatnią korelację między wysokością piku a stężeniem nastrzykniętego związku. W przypadku jej braku ustalić wadliwy nastrzyk i powtórzyć go. Po opracowaniu krzywych wzorcowych dla obu związków wyznaczyć zakres liniowości odpowiedzi detektora. Odpowiedzieć na pytanie: jak postąpić w przypadku gdyby wysokość piku analizowanego związku znalazła się w nieliniowym zakresie odpowiedzi detektora.? Przykładowe krzywe kalibracji dla toluenu i tetrachlorku węgla. Krzywa kalibracyjna toluenu na GC-FID Wysokość piku [mv] Stężenie toluenu [ug/ml] 8

9 Krzywa kalibracyjna tetrachlorku węgla na GC-ECD Wysokość piku [mv] Stężenie tetrachlorku węgla [ug/ml] 6.2. WYZNACZENIE ŚREDNIEGO WSPÓŁCZYNNIKA SYGNAŁU DETEKTORA DLA OBU ZWIĄZKÓW. Znając stężenia nastrzykiwanej próbki, dla każdego stężenia wyznaczyć nastrzyknięty ładunek (wyrazić go w ng) wiedząc, że objętość nastrzyku wynosi 1 µl. Następnie, dla każdego stężenia, wysokość piku odpowiadającego temu stężeniu podzielić przez wyznaczony wcześniej nastrzyknięty ładunek. Iloraz ten, jak zaznaczono to we wprowadzeniu, nosi nazwę współczynnika sygnału detektora na dany związek. Dla każdego związku wyznaczyć średni współczynnik sygnału, będący średnią arytmetyczną z wyznaczonych dla każdego związku pięciu współczynników. 6.3 WYZNACZENIE PROGU DETEKCJI DETEKTORA DLA OBU ZWIĄZKÓW Przyjmując, że najmniejszy monitorowalny pik (tj. spełniający warunek wysokość piku/poziom szumów większy od 10) ma wysokość 0,5 mv ekstrapolować krzywą trendu do tej wartości i wyznaczyć minimalne wykrywalne stężenia obu związków. Wiedząc, że objętość nastrzyku wynosi 1 µl wyliczyć, dla obu związków) minimalny wykrywany ładunek. Rezultat przeliczyć na g/nastrzyk. W opracowaniu sporządzonym z ćwiczenia wyciągnąć wnioski dotyczące czułości obu detektorów. 9

10 Tab.4. Wzorzec tabeli zestawienia wyników Zakres liniowości [µg/ml] Współczynnik sygnału detektora MIX 1 [mv/ng] Współczynnik sygnału detektora MIX 2 [mv/ng] Współczynnik sygnału detektora MIX 3 [mv/ng] Współczynnik sygnału detektora MIX 4 [mv/ng] Współczynnik sygnału detektora MIX 5 [mv/ng] Średni współczynnik sygnału detektora [mv/ng] Próg detekcji detektora [µg/ml] Minimalny wykrywany ładunek [g/nastrzyk] Tetrachlorek węgla toluen 10