Spontaneous and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY induced apoptosis and p27kip1 expression in chronic lymphocytic leukemia cells

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str STANISŁAW POTOCZEK 1, DARIUSZ WOŁOWIEC 1, BOŻENA JAŹWIEC 1, KATARZYNA KAPEL- KO-SŁOWIK 1, DONATA URBANIAK-KUJDA 1, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI 1, ANNA KORYC- KA-WOŁOWIEC 2 Apoptoza spontaniczna i indukowana przez inhibitor kinazy fosfatydyloinozytolu 3 LY oraz ekspresja białka p27 Kip1 w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej Spontaneous and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY induced apoptosis and p27kip1 expression in chronic lymphocytic leukemia cells 1 Z Katedry i Kliniki Hematologii Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku Akademii Medycznej we Wrocławiu Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. Kazimierz Kuliczkowski 2 Z Katedry i Kliniki Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak STRESZCZENIE W patogenezie przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL) kluczową rolę odgrywa zahamowanie zaprogramowanej śmierci komórek białaczkowych. Jednym z najważniejszych mechanizmów wewnątrzkomórkowych powodujących wydłużenie przeżycia limfocytów PBL jest konstytucyjna aktywacja kinazy fosfatydyloinozytolu-3 (PI3K), która za pośrednictwem kinazy białkowej C δ (PKC δ) lub na drodze zależnej od kinazy Akt, poprzez czynnik jądrowy NFκB, aktywuje ekspresję szeregu genów kodujących białka o działaniu antyapoptotycznym. Dotychczas nie zostało ustalone, na ile aktywność tego szlaku wpływa na obraz kliniczny choroby i jej dynamikę. Celem naszych obecnych badań jest uzupełnienie wcześniejszych obserwacji i ocena związku pomiędzy żywotnością i apoptozą limfocytów białaczkowych, poddanych działaniu LY w 24-godzinnej hodowli, a obrazem klinicznym 25 nieleczonych chorych na PBL w różnych stadiach zaawansowania klinicznego. Apoptozę wczesną oceniono na podstawie spadku potencjału mitochondrialnego (wiązanie barwnika CMXRos), natomiast apoptozę późną na podstawie eksternalizacji fosfatydyloseryny (znakowanie anneksyną V). Zbadano również komórkową ekspresję Ser 473 -Akt jako kinazy efektorowej PI3K oraz białka antyproliferacyjnego p27 Kip1 o postulowanym działaniu antyapoptotycznym. Przeżywalność i apoptozę limfocytów krwi obwodowej in vitro oceniano w obecności DMSO (apoptoza spontaniczna) lub z dodatkiem LY (apoptoza indukowana). Dodanie do hodowli LY istotnie zmniejszało przeżycie i zwiększało apoptozę limfocytów w stosunku do apoptozy spontanicznej. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy apoptozą spontaniczną i indukowaną, szczególnie ocenianą metodą MCXRos, a limfocytozą krwi obwodowej. Nie wykazano natomiast związku pomiędzy apoptozą ani żywotnością limfocytów, a pozostałymi parametrami klinicznohematologicznymi. Ser 473 -Akt nie była wykrywalna w limfocytach białaczkowych zarówno ex vivo, jak i po hodowli. P27 Kip1 było natomiast wykrywalne we wszystkich limfocytach, a jego zawartość komórkowa, cechowała się zmiennością osobniczą i nie wykazywała związku z podatnością limfocytów na apoptozę in vitro, ani z podstawowymi danymi kliniczno-laboratoryjnymi pacjentów. Nasze obserwacje wskazują, że konstytucyjna aktywność PI3K, której pośrednim wskaźnikiem jest wrażliwość limfocytów na proapoptotyczne działanie LY294002, jest jednym z czynników przyczyniających się do akumulacji limfocytów we krwi. Zagadnienie zaangażowania białek Akt i p27 Kip1 w apoptozę limfocytów białaczkowych in vivo wymaga jednak dalszych badań. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa Apoptoza Inhibitor kinazy fosfatydyloinozytolu-3 p27 Kip1 SUMMARY Inhibition of apoptosis plays a crucial role in the pathology of chronic lymphocytic leukemia (CLL). CLL lymphocytes contain a constitutively activated phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), which is considered to trigger an antiapoptotic signaling pathway leading, by intermediate of kinase Akt or protein kinase Cδ, and nuclear factor-kappa B

2 76 S. POTOCZEK i wsp. (NF-κB), to the expression of a number of antiapoptotic genes. LY294002, a specific inhibitor of PI3K, induces apoptosis in CLL lymphocytes. However, it is not known what is the influence of the constitutively activated PI3K-Akt pathway on the clinical picture of the disease. The aim of the current study was to complete our previous observations and to reassess the relationship between viability, spontaneous and LY induced apoptosis of CLL lymphocytes maintained in 24 hours culture, and clinical picture of the disease, using two apoptosis assessment methods: loss of mitochondrial potential (CMXRoss staining) and phosphatidyloserin externalization (annexin V staining). We checked also intracellular content of Ser 473 -Akt, a downstream effector of PI3K activity, and p27 Kip1, an antiproliferative protein with presumed antiapoptotic properties towards CLL cells. 25 previously untreated patients with CLL were enrolled into the study. Their peripheral blood lymphocytes were maintained in 24-hours culture either with LY (LY induced apoptosis) or with DMSO instead this agent (spontaneous apoptosis). LY significantly decreased the viability and increased the apoptosis ratio in cultures as compared to spontaneous one. We found a correlation between LY induced apoptosis, especially assessed by MCXRos staining, and peripheral blood lymphocytosis. Apoptosis and viability showed no relationship with the other clinical and hematological parameters studied. Ser 473 -Akt was undetectable in both fresh and cultured lymphocytes. P27 Kip1 was expressed in all CLL, but its cellular content varied from one patient to another. This content was not related to in vitro apoptosis and viability of CLL lymphocytes, or to clinical and hematological parameters studied. Our observations suggest, that the activity of PI3K, as assessed directly by the susceptibility of lymphocytes to the proapoptotic action of its inhibitor, LY294002, may contribute to the accumulation of leukemic lymphocytes in peripheral blood of CLL patients. The issue of involvement of Akt kinase and p27 Kip1 protein in the in vivo apoptosis of CLL lymphocytes requires further studies. KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukemia Apoptosis Phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor p27kip1 protein WSTĘP Do najważniejszych zjawisk wewnątrzkomórkowych odpowiedzialnych za akumulację limfocytów CD5 + /CD19 + w przewlekłej białaczce limfocytowej (PBL) należy występujące in vivo zahamowanie ich zaprogramowanej śmierci (apoptozy). Na zahamowanie apoptozy limfocytów PBL mają wpływ czynniki mikrośrodowiska, np. cytokiny (IL-4, IL-8, IFN gamma), oraz zjawiska wewnątrzkomórkowe polegające na konstytutywnej aktywacji prożyciowych szlaków przekazywania sygnałów [1, 2]. Spośród tych zjawisk, kluczową rolę dla przeżycia limfocytów PBL przypisuje się kinazie fosfatydyloinozytolu- 3 (PI3K). Kinaza ta, podobnie jak zależna od niej kinaza białkowa Cδ, ulega w tych komórkach konstytucyjnej aktywacji. PI3K jest zbudowana z podjednostki katalitycznej o masie cząsteczkowej 110 kda oraz podjednostki regulacyjnej p85. Aktywacja PI3K prowadzi do zwiększonej ekspresji genów kodujących białka antyapoptotyczne, takie jak białka z rodzin Bcl-2 i IAP (inhibitors of apoptosis) oraz do unieczynnienia kaspaz 3 i 8. Proces ten zachodzi za pośrednictwem kinazy białkowej Akt lub na drodze zależnej od kinazy białkowej Cδ (PKCδ) i powoduje, za pośrednictwem czynnika jądrowego NF-κB, zwiększenie ekspresji szeregu genów kodujących czynniki zaangażowane w przeżycie komórek. Produkty PI3K: 3,4-dwufosforan oraz 3,4,5-trójfosforan fosfatydylinozytolu, łączą się z kinazą serynowotreoninową Akt, co prowadzi do jej przemieszczenia z cytoplazmy do wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Tam Akt ulega aktywacyjnej fosforylacji na reszcie treoniny 308 (Thr 308 ) i seryny 473 (Ser 473 ). Aktywowana Akt fosforyluje z kolei szereg wewnątrzkomórkowych czynników uczestniczących w regulacji przeżycia komórki, zapobiegając jej apoptozie. Tym samym kinaza Akt jest ważnym efektorem antyapoptotycznego działania PI3K, a jej aktywację, konstytutywną lub indukowaną bodźcami o charakterze prożyciowym, stwierdzono w komórkach PBL, choć niektóre badania sugerują, że Akt może być też aktywowana niezależnie od PI3K [3 8]. Pomimo bardzo licznych danych doświadczalnych wskazujących na rolę zahamowania apoptozy limfocytów białaczkowych w patogenezie PBL, nie ustalono dotychczas, jaki jest udział prożyciowych mechanizmów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych w akumulacji limfocytów białaczkowych in vivo oraz w kształtowaniu obrazu klinicznego tej choroby. Nasza wiedza na temat tego aspektu biologii jest bardzo niepełna, co w dużej mierze wynika z trudności metodologicznych, dotyczących oceny przeżywalności limfocytów białaczkowych in vivo. Wyniki badań dotyczących przeżywalności limfocytów

3 Apoptoza spontaniczna i indukowana 77 białaczkowych in vitro w krótkoterminowych hodowlach nie odzwierciedlają bowiem w pełni właściwości tych komórek in vivo, gdyż jak wiadomo, wydłużenie ich wewnątrzustrojowego czasu przeżycia kontrastuje ze zwiększoną podatnością na apoptozę w warunkach hodowli in vitro. Prawdopodobnie dlatego jedynie w bardzo nielicznych badaniach udało się wykazać związek pomiędzy dłuższym czasem przeżycia limfocytów białaczkowych in vitro, a bardziej agresywnym przebiegiem choroby [9]. W przeprowadzonych wcześniej badaniach wykazaliśmy, zgodnie z doniesieniami innych autorów [3, 4, 6], że obecność inhibitora PI3K, LY294002, w krótkoterminowej hodowli limfocytów krwi obwodowej pacjentów chorych na PBL zwiększa odsetek komórek apoptotycznych, w stosunku do wartości obserwowanej w hodowli bez tego czynnika. Pośrednio świadczy to o aktywności PI3K w badanych populacjach komórek białaczkowych. Wykazaliśmy ponadto, że apoptoza zależna od LY była istotnie wyższa u chorych, u których doszło do progresji choroby lub rozwoju takich jej objawów, które stanowiły wskazanie do rozpoczęcia leczenia [10]. Obserwacja ta nasuwa przypuszczenie, że wyższa aktywność PI3K w limfocytach PBL jest związana z większą dynamiką choroby. Wymaga to jednak potwierdzenia badaniami bezpośrednio oceniającymi aktywność tej kinazy w komórkach poddanych działaniu jej inhibitora. Act ufosforylowana na reszcie Ser 473 (fosfo-akt Ser 473 ) jest wyrazem aktywacji szlaku PI3K-Akt, podczas gdy białko p27 Kip1 jest uniwersalnym inhibitorem kompleksów kinaz cyklinozależnych z cyklinami o właściwościach antyproliferacyjnych o postulowanej, choć nie udowodnionej formalnie, roli prożyciowej w komórkach PBL [11, 12]. Celem badań była odpowiedz na pytanie czy apoptoza indukowana in vitro przez zahamowanie szlaku PI3K-Akt ma związek z obrazem kliniczno-hematologicznym PBL. Przedstawione poniżej badania stanowią uzupełnienie dokonanych wcześniej obserwacji o ocenę wpływu inhibitora kinazy fosfatydyloinozytolu 3, jakim jest LY na spadek potencjału mitochondrialnego, jako wczesnego etapu apoptozy oraz przedstawiają komórkową ekspresję białka p27 Kip1 w limfocytach PBL ex vivo oraz po 24-godzinnej hodowli. MATERIAŁ I METODY Pacjenci Badaniami objęto 25 nie leczonych chorych na PBL: 16 mężczyzn i 9 kobiet w wieku lat (śr. 71,4, SD 11,3), będący pod opieką Poradni Hematologicznej SPSK1 we Wrocławiu w latach Rozpoznanie choroby ustalono na podstawie ogólnie przyjętych kryteriów, przyjmując 5,0 G/l jako dolną wartość graniczną liczby limfocytów krwi obwodowej o fenotypie CD5 + /CD19 + /CD23 + [13]. Dziewięciu chorych było w stadium zaawansowania klinicznego 0 wg Rai, 9 było w stadium I, 2 w II, 1 w III i czterech pozostałych w IV stadium. Liczba leukocytów wynosiła 16,2 150 G/l (śr. 51,3 + 38,2) G/l, limfocytów 14,5 130,0 (śr. 45,2 + 32,4) G/l, poziom hemoglobiny 7,7 15,8 (śr. 12,9 + 1,89) g/dl, liczba płytek krwi (śr. 156,3 + 53,9) G/l. U 6 spośród 25 pacjentów (24%) wykazano dodatnią ekspresję antygenu CD38, rozumianą jako jego obecność na co najmniej 20% komórek. Dodatnią ekspresję ZAP-70, również rozumianą jako wykrywalność tego antygenu w co najmniej 20% komórek, stwierdzono u 11 chorych (44%). Badanie uzyskało akceptację Komisji Bioetycznej przy Akademii Medycznej we Wrocławiu, a wszyscy chorzy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Materiał do badań stanowiły limfocyty krwi obwodowej uzyskane od chorych w celu wykonania rutynowych badań diagnostycznych. Ocena ekspresji antygenów CD5, CD19, CD23, CD38, ZAP-70, białek fosfo-akt Ser 473 i p27 Kip1 Komórki jednojądrowe (MNC) izolowano z krwi obwodowej w gradiencie gęstości z użyciem Gradisolu L (Aqua Medica, Łódź). Koekspresję antygenów CD5, CD19 i CD23 wykazano na powyżej 90% uzyskanych komórek. U wszystkich chorych na komórkach białaczkowych określono ponadto cytoflu-

4 78 S. POTOCZEK i wsp. orometrycznie ekspresję antygenu CD38 i cytoplazmatyczną ekspresję białka ZAP-70, białka foso-akt Ser 473, a u 20 pacjentów dodatkowo ekspresję białka p27 Kip1. Wykorzystano w tym celu przeciwciała monoklonalne do wybarwiania antygenów powierzchniowych (Beckman Coulter, Kanada), odczynnik do utrwalania/permeabilizacji (IntraPrep, Beckman Coulter, Kanada), przeciwciało anty-zap-70 (Beckman Coulter, Kanada), mysie przeciwciało anty- p27 Kip1 (Becton Dickinson, USA), odpowiednią kontrolę izotypową i odczynnik do permeabilizacji (Perm 2 Permeabilizing Solution 2, Becton Dickinson, USA), królicze przeciwciało monoklonalne anty fosfo-akt (Ser473) skoniugowane z Alexa Fluor 488 i króliczą kontrolę izotypową (Cell Signaling Technology, USA) oraz drugorzędowe przeciwciało kozie przeciwko mysim immunoglobulinom skoniugowane z fluoresceiną (Dako, Dania). Do permabilizacji błon komórkowych w celu oznaczenia ekspresji Ser 473 -Akt komórki utrwalano w 3,7% paraformaldehydzie (Sigma, Wielka Brytania) i permeabilizowano przez 30 min w 90% metanolu na lodzie. Kontrolą pozytywną dla oznaczania Ser 473 -Akt były komórki linii Jurkat. Badanie żywotności komórek oraz apoptozy spontanicznej i indukowanej LY MNC w stężeniu 1x10 6 komórek/ml poddawano 24-godzinnej hodowli. Stosowano w tym celu płytki 6-dołkowe zawierające podłoże hodowlane RPMI 1640 (Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Wrocław) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Invitrogen, USA) oraz gentamycyny (Sigma, Wielka Brytania) w końcowym stężeniu 100 µg/ml. Do hodowli dodawano inhibitor PI3K, LY (Calbiochem, Niemcy), w końcowym stężeniu 10µM. Ze względu na małą rozpuszczalność LY w podłożu hodowlanym, związek był rozpuszczany w 0,1% dwumetylosulfotlenku (DMSO). Do hodowli kontrolnych, bez LY294002, dodawano 0,1% DMSO [10]. Żywotność limfocytów białaczkowych oceniano za pomocą wybarwiania błękitem trypanu, traktując komórki które inkorporowały ten barwnik jako martwe. Kolejne etapy apooptozy oceniano przy użyciu dwóch różnych metod. Apoptozę wczesną badano na podstawie spadku potencjału mitochondrialnego ( Ψm), natomiast apoptozę późniejszą określaną dalej jako apoptoza zaawansowana oceniano na podstawie wykrywania eksternalizacji fosfatydyloseryny błonowej. Badania wykonywano po pobraniu krwi od chorego oraz po zakończeniu hodowli. Spadek Ψm badano za pomocą przyswajania barwnika CMXRos (MitoTraker Red CMXRos, Invitrogen, USA) przez mitochondria, zgodnie z instrukcją producenta. Limfocyty inkubowano przez 60 min. z roztworem barwnika w podłożu hodowlanym w temp. 37 o C, 5% CO 2, dodając w trakcie inkubacji przeciwciało przeciwko glikoforynie A sprzężone z FITC. Następnie określano cytofluorometrycznie odsetek komórek ulegających apoptozie, czyli nie wybarwiających się CMXRos ani nie wiążących przeciwciała przeciwko glikoforynie A (komórki Ψm low /Gly-A - ). Eksternalizację fosfatydyloseryny błonowej wykrywano poprzez znakowanie komórek anneksyną V sprzężoną z FITC (Becton Dickinson, USA) oraz równocześnie jodkiem propydyny w buforze bogatym w jony wapnia i analizowano cytofluorometrycznie. Odsetek komórek ulegających apoptozie obliczano jako sumę odsetka komórek barwiących się tylko anneksyną oraz anneksyną i jodkiem propydyny. Na podstawie danych uzyskanych bezpośrednio po pobraniu komórek (ex vivo) oraz po zakończeniu hodowli obliczano apoptozę spontaniczną, jako różnicę pomiędzy odsetkiem komórek apoptotycznych po zakończeniu hodowli bez LY oraz komórek apoptotycznych ex vivo oraz apoptozę indukowaną LY294002, jako różnicę pomiędzy odsetkiem komórek apoptotycznych po zakończeniu hodowli z LY oraz po hodowli bez tego inhibitora. W analogiczny sposób, określono odsetek limfocytów podatnych na śmierć na drodze apoptozy i/lub nekrozy spontanicznej i indukowanej LY jako tzw. spontaniczną i indukowaną LY utratę żywotności.oceniano ją na podstawie różnicy pomiędzy żywotnością komórek przed i po hodowli, w obecności DMSO bez LY294002, oraz po hodowli w obecności LY i bez tego czynnika,

5 Apoptoza spontaniczna i indukowana 79 Analiza cytofluorometryczna Analizę cytofluorometryczną wykonywano w cytometrze przepływowym PAS (Partec, Niemcy) wyposażonym w laser argonowy o mocy 20 mw i program do akwizycji i analizy danych FloMax 2,4b. Każdorazowo analizie poddawano komórek. W przypadku badania apoptozy obliczano odsetek komórek wiążących anneksynę lub MCXRos. Oznaczając ekspresję p27 Kip1 badano średnią intensywność fluorescencji (MFI, mean fluorescence intensity) populacji komórek przyswajających odpowiednie przeciwciało i wyrażano ją w jednostkach umownych (J.U.). Analiza statystyczna Rozkład danej cechy ilościowej w badanej populacji porównywano za pomocą testów nieparametrycznych: Manna-Whitney a oraz testu znaków dla zmiennych powiązanych. Związek pomiędzy dwiema zmiennymi ilościowymi oceniano za pomocą współczynnika R Spearmana. Za statystycznie istotne przyjęto p<0,05. WYNIKI Żywotność i apoptoza spontaniczna i indukowana limfocytów PBL Apoptoza limfocytów PBL oznaczona bezpośrednio po pobraniu ich od pacjentów (ex vivo) była niska, a ich żywotność wynosiła średnio powyżej 90%. Po zakończeniu 24-godzinnej hodowli w środowisku DMSO żywotność nie uległa istotnemu zmniejszeniu, ale zaobserwowano istotne zwiększenie się odsetka komórek apoptotycznych zarówno ocenianych metodą z anneksyną V, jak i MCXRos. Hodowla in vitro z LY istotnie zmniejszyła żywotność oraz zwiększyła apoptozę limfocytów w stosunku do wartości obserwowanych w hodowli bez tego czynnika (Tabela 1). Tabela 1. Wskaźniki żywotności i apoptozy oraz wewnątrzkomórkowa zawartość p27 Kip1 limfocytów krwi obwodowej pacjentów chorych na PBL poddanych 24-godzinnej hodowli w obecności DMSO oraz inhibitora kinazy fosfatydyloinozytolu 3, LY Table 1. Viability, apoptosis and intracellular p27 Kip1 content in lymphocytes obtained from patients with chronic lymphocytic leukemia after 24 hours culture with dimethylosulfoxide (DMSO) and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY godzinna hodowla ex vivo DMSO LY (DMSO ex vivo) (LY DMSO) Żywotność 91,8+5,7 90,2+8,3 78,8+15,5 5,0+6,5 11,4+10,4 2 vs 1=NZ (%) (76-98) (68-99,6) (45,1-96,8) (0,0-19,2) (0,0-39,1) 3 vs 2= 0,00002 Anneksyna V 13,0+8,1 29,4+16,0 44,3+16,4 17,2+15,2 15,2+7,9 2 vs 1= 0,0003 (%) (2,3-35,6) (5,8-69,6) (17,7-67,4) (0,0-63,5) (0,0-30,9) 3 vs 2=0,00001 CMXRos 4,0+3,2 21,9+19,8 36,3+21,7 18,3+18,6 14,6+10,3 2 vs 1=0,00006 (%) (1,1-14,1) (3,2-81,3) (4,6-89,3) (0,0-65,5) (0,0-41,3) 3 vs 2=0,00001 p27 Kip1 6,4+4,0 5,9+2,5 6,0+2,4-0,6+3,5 0,08+1,1 2 vs 1: NZ (J.U.) (1,9-18,6) (2,3-10,1) (2,4-10,7) (-9,2-8,2) (-2,5-2,2) 3 vs 2: NZ DMSO: dwumetylosulfotlenek; LY294002: inhibitor kinazy fosfatydyloinozytolu 3; Ex vivo: wartość danego parametru w limfocytach bezpośrednio po pobraniu od chorego; (DMSO ex vivo): różnica w wartości danego parametru pomiędzy oznaczeniem po hodowli kontrolnej, a wynikiem ex vivo; (LY DMSO): różnica w wartości danego parametru pomiędzy oznaczeniem po hodowli z dodatkiem LY294002, a hodowli kontrolnej; żywotność: odsetek komórek nie przyswajających błękitu trypanu; anneksyna V: odsetek komórek wybarwiających się anneksyną V; CMXRos: odsetek komórek o niskim powinowactwie do CMXRos; J.U.: jednostki umowne; P- analiza statystyczna; NZ: statystycznie niezamiennie W każdym polu podano wartość średnią + odchylenie standardowe oraz zakres obserwowanych wartości. p

6 80 S. POTOCZEK i wsp. Nie stwierdzono zależności pomiędzy apoptozą lub śmiertelnością limfocytów a podstawowymi danymi kliniczno-hematologicznymi pacjentów, jak wiek, płeć, stadium zaawansowania klinicznego, poziom hemoglobiny i liczba płytek. Stwierdzono natomiast związek pomiędzy liczbą limfocytów, a ich śmiertelnością (R=0,40, p = 0,05), jak i apoptozą wczesną spontaniczną (R=0,51, p=0,009), a także związek pomiędzy liczbą limfocytów a ich śmiertelnością zależną od LY294002, apoptozą wczesną i zaawansowaną (R=0,58, p= 0,002; R=0,54,p=0,005 i R=0,39, p=0,05; odpowiednio, Rycina 1). Apoptoza indukowana LY była nieco wyższa u pacjentów wykazujących ekspresję CD38 (20,21 + 7,44) w porównaniu do chorych CD38 (12, ,52) (p=0,04). Limfocytoza (G/L) R=0,5434 p=0, Apoptoza wczesna zależna od LY Ryc. 1. Zależność pomiędzy liczbą limfocytów we krwi obwodowej a apoptozą wczesną indukowaną przez LY Fig. 1. The relationship between the peripheral blood lymphocyte count and early apoptosis induced by LY Ekspresja p27 Kip1 i Ser 437 -Akt w limfocytach PBL Obecność p27 Kip1 wykazano w prawie wszystkich limfocytach (>90% komórek), jednak zawartość komórkowa oceniana za pomocą MFI wykazywała zmienność, zawierając się w granicach 1,92 18,63 (śr. 6,42 + 4,04) J.U. Była ona wyższa u pacjentów wykazujących ekspresję antygenu ZAP-70 niż u chorych ZAP-70- (odpowiednio 8,41 + 4,55 i 4,45 + 2,26 I.U., p = 0,02). Poza tym nie wykazywała ona związku z podstawowymi danymi klinicznymi i hematologicznymi (wiek, płeć, stadium zaawansowania klinicznego, liczba limfocytów i płytek, poziom hemoglobiny, ekspresja CD38), apoptozą i śmiertelnością spontaniczną ani indukowaną. Komórkowa zawartość p27 Kip1 nie ulegała istotnym zmianom podczas hodowli w obecności DMSO i LY (Tabela 1).

7 Apoptoza spontaniczna i indukowana 81 W żadnej z badanych populacji limfocytów PBL nie wykryto ekspresji Ser 437 -Akt zarówno bezpośrednio po pobraniu od pacjenta, jak i po hodowli z DMSO lub LY DYSKUSJA W patogenezie PBL kluczową rolę odgrywa zahamowanie zaprogramowanej śmierci komórek białaczkowych spowodowane konstytutywną aktywacją wewnątrzkomórkowych, prożyciowych szlaków przekazywania sygnałów, jak i oddziaływaniem zewnątrzkomórkowych czynników mikrośrodowiska, takich jak cytokiny i komórki podścieliska szpiku. To właśnie czynniki środowiskowe są prawdopodobnie odpowiedzialne za przedłużone przeżycie komórek białaczkowych w warunkach wewnątrzustrojowych, gdyż utrzymywane w hodowli in vitro obumierają w większym stopniu niż limfocyty prawidłowe. Jednym z kluczowych mechanizmów wewnątrzkomórkowych powodujących wydłużenie przeżycia limfocytów PBL jest konstytucyjna aktywacja PI3K. Kinaza ta, za pośrednictwem kinazy białkowej Cδ (PKC δ) lub na drodze zależnej od kinazy Akt, poprzez czynnik jądrowy NF-κB, aktywuje ekspresję szeregu genów kodujących białka o działaniu antyapoptotycznym, takich jak: Mcl-1, BclxL czy XIAP. Pośrednim dowodem na to jest obserwacja, że LY294002, będący specyficznym inhibitorem PI3K, indukuje apoptozę limfocytów PBL w warunkach in vitro [3-8]. Pomimo udowodnionej roli szlaku PI3K w zahamowaniu śmierci limfocytów PBL, nie zostało ustalone na ile aktywność tego szlaku wpływa na obraz kliniczny choroby i jej dynamikę. W poprzednio opublikowanych badaniach wykazaliśmy, że apoptoza limfocytów PBL indukowana w hodowli in vitro przez LY jest wyższa u pacjentów z progresywną postacią białaczki w stosunku do limfocytów uzyskanych od chorych na białaczkę o stabilnym przebiegu [10]. Celem przedstawionych powyżej badań jest uzupełnienie powyższych obserwacji poprzez ocenę związku pomiędzy żywotnością i apoptozą limfocytów białaczkowych zachodzącą w krótkoterminowej hodowli pod wpływem LY294002, a obrazem klinicznym nie leczonych chorych na PBL. Apoptozę ocenialiśmy nie tylko za pomocą znakowania anneksyną V, która rozpoznaje eksternalizację fosfatydyloseryny, a więc zaawansowany etap zaprogramowanej śmierci komórki, ale także poprzez wykrycie spadku potencjału mitochondrialnego, co zachodzi w początkowej fazie tego procesu i uwidacznia się niskim wychwytem barwnika CMXRos. Zbadaliśmy też, czy apoptozie indukowanej LY towarzyszy pobudzenie komórkowej ekspresji kinazy serynowo-treoninowej Akt ufosforylowanej na reszcie Ser 473, co ma miejsce podczas jej aktywacji przez PI3K, a także oceniliśmy zawartość białka antyproliferacyjnego p27 Kip1 o postulowanej aktywności antyapoptotycznej wobec limfocytów PBL. Zgodnie z oczekiwaniem, limfocyty PBL podczas 24-godzinnej hodowli in vitro ulegały spontanicznej apoptozie, manifestującej się zarówno utratą potencjału mitochondrialnego, jak i eksternalizacją fosfatydyloseryny. Odsetek komórek apoptotycznych istotnie zwiększał się pod wpływem inhibitora PI3K, LY294002, co potwierdza ustalony pogląd o kluczowej roli tej kinazy, ulegającej konstytucyjnej aktywacji w limfocytach białaczkowych, dla przeżycia tych limfocytów [3 7]. Oryginalnym spostrzeżeniem jest to, że apoptoza indukowana LY wykazuje dodatnią korelację z liczbą limfocytów we krwi obwodowej. Ponieważ wrażliwość limfocytów PBL na proapoptotyczne działanie LY można uznać za pośredni wskaźnik wewnątrzkomórkowej aktywności PI3K, powyższa obserwacja sugeruje, że zahamowanie śmierci komórkowej w wyniku działania szlaku przewodzenia sygnałów zależnego od tej kinazy przyczynia się do akumulacji limfocytów we krwi obwodowej pacjentów chorych na PBL. Poprzednio wykazaliśmy, że apoptoza indukowana LY jest wyższa u chorych na progresywną postać PBL w stosunku do pacjentów ze stabilną chorobą [10]. Spostrzeżenia te wskazują, że konstytucyjna aktywacja szlaku zależnego od PI3K nie tylko ma kluczowe znaczenie dla przeżycia limfocytów białaczkowych, ale też w istotnym stopniu przyczynia się do progresji choroby. Stanowi to podstawę do badań nad skutecznością inhibitorów szlaku PI3K/NFkappaB w leczeniu tej choroby. Jednym z ogniw antyapoptotycznych szlaków przekazywania sygnałów aktywowanych przez PI3K jest kinaza serynowo-treoninowa Akt, zwana również kinazą białkową B (PKB). Wiąże się ona z pro-

8 82 S. POTOCZEK i wsp. duktami PI3K: 3,4-dwufosforanem oraz 3,4,5-trójfosforanem fosfatydylinozytolu, po czym ulega aktywacyjnej fosforylacji na reszcie treoniny 308 (Thr 308 ) i seryny 473 (Ser 473 ) [14, 15]. Wykazano, że aktywna Akt jest czynnikiem prożyciowym w licznych komórkach, a jej nadekspresję wykazano w różnych nowotworach narządowych [16 18]. Odgrywa ona też istotną rolę w zahamowaniu apoptozy limfocytów PBL, choć jej miejsce w wewnątrzkomórkowych szlakach przekazywania sygnałów prożyciowych nie jest jasne. Stymulacja szlaku sygnałowego poprzez receptor komórek B (B-cell receptor, BCR) powoduje, między innymi, pobudzenie antyapoptotycznej drogi PI3K/Akt, przy czym długotrwała aktywacja Akt prowadzi do pobudzenia ekspresji białek antyapoptotycznych (Mcl-1, Bcl-xL, XIAP) oraz większej przeżywalności limfocytów PBL [7]. Niektórzy autorzy opisali podwyższoną aktywność Akt w limfocytach PBL ex vivo [6,8], co jednak nie znalazło potwierdzenia w innych doniesieniach [3, 4, 7]. Wykazano ponadto, że LY nie wpływa na aktywność enzymatyczną Akt w limfocytach PBL ex vivo lub stymulowanych za pomocą estrów forbolu (TPA) [6,8], podczas gdy w innych układach doświadczalnych fosforylacja aktywacyjna Akt w komórkach PBL ex vivo była hamowana zarówno przez LY294002, jak i inhibitor kinazy białkowej Cβ (protein kinase C β) [8]. Wskazuje to, że nabycie i utrzymanie przez kinazę Akt aktywności enzymatycznej oraz uruchomienie przez PI3K przyżyciowego szlaku przekazywania sygnałów, może być od siebie zależne w komórkach białaczkowych, ale może również zachodzić w ramach odrębnych szlaków przekazywania sygnałów. W przedstawionych badaniach nie stwierdziliśmy ekspresji Ser 473 -Akt w limfocytach PBL zarówno ex vivo, jak i po hodowli. Jest oczywiście możliwe, że wynika to ze zbyt małej czułości użytej metody cytofluorometrycznego wykrywania Ser 473 -Akt, choć technika ta pozwoliła uwidocznić obecność białka Ser 473 -Akt w komórkach linii Jurkat. Należy podkreślić, że obecności ufosforylowanych cząsteczek omawianej kinazy w świeżo uzyskanych limfocytach PBL nie udało się też wykazać niektórym innym autorom [3, 4, 7]. Nie wykrycie ekspresji Ser 473 -Akt, a tym samym aktywnej enzymatycznie formy tej kinazy, w limfocytach badanych pacjentów chorych na PBL, nie daje więc podstaw do wnioskowania o jej ewentualnej roli w kształtowaniu obrazu klinicznego tej choroby, która winna być oceniona z użyciem innych metod doświadczalnych. Badania nad zjawiskami apoptozy w limfocytach PBL uzupełniliśmy oceną zawartości w nich białka p27 Kip1. Jest to substancja należąca do rodziny inhibitorów kinaz cyklinozależnych (cdk), hamująca aktywność większości znanych kompleksów enzymatycznych utworzonych przez cdk oraz ich podjednostki regulacyjne zwane cyklinami, których podstawową rolą jest umożliwienie komórce realizację kolejnych etapów cyklu podziałowego. p27 Kip1 wywiera więc działanie antyproliferacyjne, a niektóre doniesienia wskazują też na jego pobudzającą lub hamującą rolę w procesie apoptozy [19 21]. Inaczej niż w przypadku zdecydowanej większości guzów litych, gdzie dochodzi do obniżenia zawartości tego białka na drodze nasilonej proteolizy [19], p27 Kip1 jest wykrywalne w całej populacji limfocytów PBL, a jego zawartość jest wyższa niż w prawidłowych komórkach CD5 + CD19 + [11, 22 24]. Również w przeciwieństwie do większości nowotworów narządowych, w których obniżenie komórkowej zawartości omawianego białka jest związane z większą agresywnością choroby, podwyższona komórkowa zawartość p27 Kip1 ma niekorzystne znaczenie rokownicze co do dużej dynamiki choroby [11, 23]. Zaobserwowano, że limfocyty białaczkowe wykazujące zwiększoną ekspresję p27 Kip1 dłużej przeżywają w hodowli in vitro, a ich apoptozie wywołanej przez fludarabinę towarzyszy proteoliza p27 Kip1 [11, 12]. Sugeruje to, że p27 Kip1 wywiera na komórki PBL działanie antyapoptotycznie, co mogłoby tłumaczyć niekorzystne znaczenie rokownicze jego podwyższonej zawartości cytoplazmatycznej. W przedstawionych wyżej badaniach potwierdziliśmy wcześniejsze doniesienia, że p27 Kip1 jest wyraźnie wykrywalne w całej populacji komórek PBL u wszystkich badanych pacjentów, a jego zawartość cytoplazmatyczna jest zróżnicowania. Nie wykazaliśmy natomiast związku pomiędzy tą zawartością, a żywotnością limfocytów PBL in vitro i apoptozą spontaniczną lub indukowaną LY Być może taki wynik doświadczenia wynikał z krótkiego, bo tylko 24-godzinnego czasu hodowli, podczas gdy Vrhovac i wsp. [11] oceniali cytotoksyczność i wpływ LY na apoptozę po 96-godzinnej hodowli. Zagadnienie związku p27 Kip1 z podatnością limfocytów PBL na apoptozę in vitro oraz ich przeży-

9 Apoptoza spontaniczna i indukowana 83 ciem in vivo wymaga więc dalszych badań. Warto jednak zwrócić uwagę, że średnia zawartość tego białka była wyższa u pacjentów wykazujących ekspresję ZAP-70 w stosunku do chorych, u których ten antygen był stwierdzany w mniej niż 20% limfocytów. Może to świadczyć o istnieniu związku pomiędzy ekspresją p27kip1 a ekspresją ZAP-70, która jest uważana za jeden z najistotniejszych niekorzystnych czynników rokowniczych co do szybkiej progresji choroby. WNIOSKI Przedstawione obserwacje sugerują, że konstytucyjna aktywność PI3K, której pośrednim wskaźnikiem jest wrażliwość limfocytów na proapoptotyczne działanie LY294002, jest jednym z czynników przyczyniających się do akumulacji limfocytów białaczkowych we krwi obwodowej. Zagadnienie związku pomiędzy białkami Akt i p27 Kip1, a podatnością komórek białaczkowych na apoptozę in vitro i ich czasem przeżycia in vivo wymaga natomiast dalszych badań. PIŚMIENNICTWO 1. Podhorecka M. Proces apoptozy w patogenezie przewlekłej białaczki limfatycznej B-komórkowej. Post Hig Med Dośw 2004; 58: Munk Pedersen I, Reed JC. Microenvironmental interactions and survival of CLL B-cells. Leukemia and Lymphoma, 2004; 45: Barragan M, Bellosillo B, Campas C, Colomer D, Pons G, Gil J. Involvement of protein kinase C and phosphatydylinositol 3-kinase pathways in the survival of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood 2002; 99: Ringshausen I, Scheller F, Bogner C. et al. Constitutively activated phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3K) is involved in the defect of apoptosis in B-CLL: association with protein kinase Cδ. Blood 2002; 100: Cuní S, Pérez-Aciego P, Pérez-Chacón G et al. A sustained activation of PI3K/NF-κB pathway is critical for the survival of chronic lymphocytic leukemia B-cells. Leukemia 2004; 18: Plate JMD. PI3-kinase regulates survival of chronic lymphocytic leukemia B-cells by preventing caspase 8 activation. Leukemia and Lymphoma 2004; 45: Barragan M, de Frias M, Iglesias-Serret D i wsp. Regulation of Akt/PKB by phosphatidylinositol 3-kinase-dependent and independent pathways in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells: role of protein kinase C (beta). J. Leukoc. Biol. 2006; 80: Longo PG, Laurenti L, Gobessi S, Sica S, Leone G, Efremov DG. The Akt/Mcl-1 pathway plays a prominent role in mediating antiapoptotic signals downstream of the B-cell receptor in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2008; 111: Aguilar-Santelises M, Rottenberg ME, Lewin N, Mellstedt H, Jondal M, Bcl-2, Bax and p53 expression in B-CLL in relation to in vitro survival and clinical progression Int J Cancer 1996; 69: Wołowiec D, Ganczarski G, Jaźwiec B i wsp. Ekspresja B-LyS oraz apoptoza komórek przewlekłej białaczki limfocytowej B- komórkowej indukowana inhibitorem kinazy fosfatydyloinozytolu-3 (LY294002). Acta Haematol Pol 2007; 38: Vrhovac R, Delmer A, Tang R, Marie JP, Zittoun R, Ajchenbaum-Cymbalista F. Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27kip1 in chronic B-cell lymphocytic leukemia. Blood 1998; 91: Sanhes L, Tang R, Delmer A, DeCaprio JA, Ajchenbaum-Cymbalista. Fludarabine-induced apoptosis of B chronic lymphocytic leukemia cells induces early cleavage of p27kip1 by caspases. Leukemia 2003; 17: Hallek M, Cheson BD, Catovsky D i wsp. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute- Working Group 1996 guidelines. Blood 2008; 111: Alessi DR, Andejelkovic M, Caudwell B i wsp. Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. EMBO J 1996; 15: Aoki M, Schetter C, Himly M, Batista O, Chang HW, Vogt PK. The catalytic subunit of phosphoinositide 3-kinase: requirements for oncogeinicity. J Biol Chem 2000; 275: Cheng JQ, Godwin AK, Bellacosa A i wsp. AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of proteinserine/threonine kinase, is amplified in human ovarian carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: Sun M, Wang G, Paciga JE i wsp. Akt1/PKBα kinase is frequently elevated in human cancers and its constitutive activation is required for oncogenic transformation of NIH3T3 cells. Am J Pathol 2001; 159: Datta SR, Brunet A, Greenberg ME. Cellular survival: a play in three Acts. Genes Dev 1999; 13:

10 84 S. POTOCZEK i wsp. 19. Ciszak L, Wołowiec D, Kosmaczewska A, Boćko D, Frydecka I. Białko p27: budowa, funkcje biologiczne oraz udział w patomechanizmie procesów rozrostowych. Post Biol Kom 2000; 27: Katayose Y, Kim M, Rakkar AN, Li Z, Cowan KH, Seth P. Promoting apoptosis: a novel activity associated with the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Cancer Res 1997; 57: Hiromura K, Pippin JW, Fero ML, Roberts JM, Shankland SJ. Modulation of apoptosis by the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(kip1). J Clin Invest 1999; 103: Wołowiec D., Ciszak L., Kosmaczewska A. i wsp. Cell cycle regulatory proteins and apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Haematologica 2001; 86: Wołowiec D, Wójtowicz M, Ciszak L i wsp. High intracellular content of cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in earlyand intermediate stage B-cell chronic lymphocytic leukemia lymphocytes predicts rapid progression of the disease. Eur J Haematol 2009; 82: Decker T, Schneller F, Hipp S i wsp. Cell cycle progression of chronic lymphocytic leukemia cells is controlled by cyclin D2, D3, and cyclin-dependent kinase (cdk) 4 and the cdk inhibitor p27. Leukemia 2002; 16: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Stanisław Potoczek Katedra i Klinika Hematologii Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku Akademii Medycznej we Wrocławiu ul. Pasteura Wrocław