Zaburzenia procesu O-GlcNAcylacji w nowotworach. Alterations of O-GlcNAcylation process in cancers

Transkrypt

1 Folia Medica Lodziensia, 2014, 41/1:65-91 Zaburzenia procesu O-GlcNAcylacji w nowotworach Alterations of O-GlcNAcylation process in cancers PIOTR CIESIELSKI 1, ANNA KRZEŚLAK 2 1 Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/143, Łódź 2 Oddział Urologii Ogólnej, Onkologicznej i Czynnościowej, II Klinika Urologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi, Pabianicka 62, Łódź Streszczenie O-GlcNAcylacja jest odwracalną potranslacyjną modyfikacją białek polegającą na przyłączeniu wiązaniem O-glikozydowym pojedynczych reszt β-n-acetyloglukozaminy (GlcNAc) do seryny lub treoniny. W proces O-GlcNAcylacji włączone są dwa enzymy: O-GlcNAc transferaza (OGT), enzym odpowiedzialny za przyłączanie reszt N-acetyloglukozaminy i β-n-acetyloglukozaminidaza (OGA), która katalizuje reakcję odłączania reszt GlcNAc. Dynamiczna i odwracalna O-GlcNAcylacja odgrywa istoną rolę w regulacji szeregu procesów komórkowych, takich jak przekazywanie sygnału, metabolizm, transkrypcja, translacja, degradacja białek w proteasomach i cykl komórkowy. Ponieważ O-GlcNAcylacja dotyczy reszt seryny lub treoniny, które znajdują się w miejscach rozpoznawanych przez kinazy białkowe, wpływa ona na poziom fosforylacji wielu białek i isnieje ścisła zależność pomiędzy tymi modyfikacjami. Ostanie badania wskazują, że w komórkach nowotworowych dochodzi do znacznego zwiększenia poziomu O-GlcNAcylacji. Hiper-O-GlcNAcylację stwierdzono w różnych typach nowotworów, włączając w to guzy lite np. płuc, prostaty, piersi, jelita grubego, trzustki, wątroby a także białaczki np. przewlekłą białaczkę limfatyczną. Zaburzenia O-GlcNAcylacji związane są ze zmianami w komórkach nowotworowych ekspresji enzymów odpowiedzialnych za ten proces, tj. OGT i OGA. Hiper-O-GlcNAcylacja wpływa na proliferację, przeżycie i metabolizm komórek nowotworowych, jak również zwiększa ich zdolność do inwazji i metastazy. Prezentowana praca stanowi przegląd aktualnych informacji dotyczących roli O-GlcNAcylacji w regulacji szlaków przekazywania sygnałów, cyklu komórkowego, czynników transkrypcyjnych oraz enzymów i innych białek związanych z metabolizmem komórek nowotworowych. Słowa kluczowe: O-GlcNAcylacja, nowotwory, cykl komórkowy, czynniki transkrypcyjne, transdukcja sygnału, glikoliza, metastaza. Adres do korespondencji: Piotr Ciesielski, Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, ul. Pomorska 141/143, Łódź

2 66 O-GlcNAcylacja w nowotworach Abstract O-GlcNAcylation is a post-translational modification involving the addition of a N-acetylglucosamine moiety to the serine/threonine residues of cytosolic or nuclear proteins. Two enzymes are responsible for cyclic O-GlcNAcylation: O-GlcNAc transferase (OGT) which catalyzes the addition of the GlcNAc moiety from UDP-GlcNAc to target proteins and O-GlcNAcase (OGA) which catalyses the hydrolytic removal of the sugar moiety from proteins. Dynamic and reversible O-GlcNAcylation is emerging as an important regulator of diverse cellular processes, such as signal transduction, metabolism, transcription, translation, proteasomal degradation and cell cycle. O-GlcNAcylation occurs on serine or threonine residues of proteins at sites that may also be phosphorylated. Therefore, an extensive crosstalk exists between phosphorylation and O-GlcNAcylation. Recent studies indicate that increased O-GlcNAcylation is a general feature of cancer. Elevated O-GlcNAcylation (hyper-o- GlcNAcylation) occurs in many human malignancies including solid tumors such as lung, prostate, breast, colorectal, liver, pancreatic cancers as well as non-solid cancers such as chronic lymphocytic leukemia. The changes in O-GlcNAcylation are associated with the changes in OGT and OGA expression levels. Hyper-O-GlcNAcylation may be linked to the various hallmarks of cancer, including cancer cell proliferation, survival, invasion, metastasis and metabolism. This paper reviews recent findings related to O-GlcNAc-dependent regulation of signaling pathways, cell cycle, transcription factors, and metabolic enzymes in cancer cells. Key words: O-GlcNAcylation, cancers, cell cycle, transcription factors, signal transduction, glycolysis, metastasis. Wstęp O-GlcNAcylacja jest odwracalną, potranslacyjną modyfikacją białek polegającą na przyłączeniu pojedynczych reszt β-n-acetylo-d-glukozaminy (ang. N-acetylglucosamine - GlcNAc) do grupy hydroksylowej seryny i/lub treoniny wiązaniem O-glikozydowym [1, 2]. O-GlcNAcylacja jest modyfikacją bardzo powszechną i dotyczy zarówno białek jądrowych, jak i cytosolowych. Do chwili obecnej zidentyfikowano ponad tysiąc białek ulegających O-GlcNAcylacji. Liczba ta zwiększa się z roku na rok wraz z rozwojem metod i technologii pozwalających na detekcję reszt N-acetyloglukozaminy

3 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 67 w badanych białkach. Do O-GlcNAcylowanych białek zalicza się m.in. białka związane z chromatyną, enzymy glikolityczne, kinazy, czynniki transkrypcyjne, oraz białka cytoszkieletu komórki [3, 4]. O-GlcNAcylacja to proces enzymatyczny zachodzący przy udziale O-GlcNAc transferazy (ang. O-linked N-acetylglucosamine transferase - OGT). Natomiast za usuwanie reszt GlcNAc odpowiada β-n-acetylo-d-glukozaminidaza (ang. O-GlcNAcase - OGA) [5]. Niektóre reszty seryny i treoniny w białku mogą ulegać zarówno O-GlcNAcylacji, jak i fosforylacji, przy czym procesy te wzajemnie się wykluczają, co prowadzi do stanu, w którym dane reszty aminokwasów występują w jednej z trzech form: niezmodyfikowanej, glikozylowanej lub fosforylowanej. Przykładowym białkiem ulegającym zarówno O-GlcNAcylacji, jak i fosforylacji jest polimeraza RNA klasy II. W swojej domenie C-końcowej może zawierać reszty fosforanowe albo reszty O-GlcNAc lub być w formie niezmodyfikowanej. Obie te modyfikacje wywierają przeciwstawne efekty na aktywność tego enzymu. Uważa się, że w procesie transkrypcji po przyłączeniu polimerazy RNA klasy II do promotora genu docelowego, N-acetyloglukozaminidaza (OGA) usuwa reszty O-GlcNAc z C-końcowego regionu tego enzymu, umożliwiając tym samym jej fosforylację i aktywację [6, 7]. Interesujący wydaje się również fakt, że OGT oraz fosfatazy białkowe mogą tworzyć ze sobą kompleksy. Kompleksy takie przyłączają resztę O-GlcNAc, równocześnie usuwając resztę fosforanową z białka [8]. Podobnie jak fosforylacja, O-GlcNAcylacja odpowiada za regulację wielu ważnych procesów komórkowych. Do procesów tych możemy zaliczyć m.in. kontrolę cyklu komórkowego, regulację przekazywania sygnałów, regulację transkrypcji, czy też modulowanie odpowiedzi na stres komórkowy. Nieprawidłowy poziom O-GlcNAcylacji jest obserwowany w takich chorobach jak cukrzyca, choroby neurodegeneracyjne oraz nowotwory [9, 10]. Enzymy zaangażowane w proces O-GlcNAcylacji O-GlcNAc transferaza (OGT) Jedynym enzymem odpowiedzialnym za przyłączenie reszty β-n-acetylo- D-glukozaminy do grupy hydroksylowej seryny lub treoniny białek wewnątrzkomórkowych jest β-n-acetyloglukozaminylotransferaza UDP-N-acetylo-

4 68 O-GlcNAcylacja w nowotworach glukozamina: białko (EC 2.4.1) (O-GlcNAc transferaza, OGT). Enzym ten kodowany jest przez gen OGT zlokalizowany w pobliżu regionu centromerowego chromosomu X (Xq13.1). Substratem dla OGT, a zarazem czynnikiem limitującym aktywność tego enzymu jest UDP-GlcNAc (ang. uridine diphosphate N-acetylglucosamine), będąca końcowym produktem szlaku biosyntezy heksozamin (ang. hexosamine biosynthesis pathway - HBP) [11]. U człowieka, jak i u innych ssaków, stwierdzono występowanie trzech izoform OGT o masie cząsteczkowej 78, 103 i 110 kda, które powstają w wyniku alternatywnego składania mrna [12]. Izoformy o masie cząsteczkowej 78 kda (ang. short OGT - sogt) oraz 110 kda (ang. nucleocytoplasmic OGT - ncogt) tworzą heterotrimery (dwie podjednostki 110 kda oraz jedna podjednostka 78 kda), które mają lokalizację jądrowo-cytoplazmatyczną. Natomiast izoforma o masie cząsteczkowej 103 kda występuje wyłącznie w mitochondriach (ang. mitochondrial OGT - mogt). Każda z tych izoform posiada na N-końcu wiele tandemowo ułożonych powtórzeń motywów TPR (ang. tetratricopeptide repeats), odpowiadających za interakcje pomiędzy OGT, a innymi białkami. Najwięcej powtórzeń TPR zawiera ncogt, zaś najmniej sogt. Badania wykazały, że motywy TPR tworzą na N-końcu superhelisę i zawierają zachowane ewolucyjnie powtórzenia asparaginy [13]. W części środkowej enzymu występują sekwencje lokalizacji jądrowej (ang. nuclear localization sequence - NLS), a dodatkowo w N-terminalnej części izoformy mitochondrialnej znajdują się również sekwencje warunkujące lokalizację mitochondrialną (ang. mitochondrial localization sequence - MLS). Domena katalityczna o aktywności glikozylotransferazy typu GT-B znajduje się na C-końcu enzymu i wykazuje dużą homologię do fosforylazy glikogenu, z której najprawdopodobniej się wywodzi [5, 12, 14]. Mimo, że wiele białek ulega modyfikacji przez OGT, to sposób w jaki OGT rozpoznaje docelowe białka oraz mechanizm regulacji aktywności tego enzymu pozostają słabo poznane. W cząsteczce OGT znajdują się reszty seryny oraz tyrozyny, które ulegają fosforylacji. Przypuszcza się więc, że aktywność OGT jest regulowana poprzez potranslacyjne przyłączenie reszt fosforanowych do reszt seryny i/lub tyrozyny przez różne kinazy białkowe [4, 5].

5 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 69 Ryc. 1. Wpływ O-GlcNAcylacji na aktywność czynników transkrypcyjnych. Reszty seryny i treoniny ulegające O-GlcNAcylacji oznaczone zostały kolorem ciemnoszarym, natomiast te ulegające fosforylacji kolorem jasnoszarym [wg [40]; zmieniono]. Fig. 1. Impact of O-GlcNAcylation on transcription factors activity. The O-GlcNAcylated serine and threonine residues are labelled in dark grey and phosphorylated ones in light grey (modified after [40]). β-n-acetylo-d-glukozaminidaza (OGA) Enzymem odpowiedzialnym za odłączanie reszt O-GlcNAc zarówno od białek cytoplazmatycznych, jak i jądrowych jest β-n-acetylo-dglukozaminidaza (OGA). Białko OGA kodowane jest przez gen MGEA5 (ang. meningioma expressed antigen 5) składający się z 16 eksonów, którego locus znajduje się na chromosomie 10 (10q24). Początkowo uważano, że produkt tego genu posiada aktywność hialuronidazy, aczkolwiek przeprowadzone później badania struktury i aktywności enzymatycznej OGA nie potwierdziły tego przypuszczenia [5, 15, 16].

6 70 O-GlcNAcylacja w nowotworach W N-końcowym regionie białka OGA znajduje się domena o aktywności N-acetyloglukozaminidazy, charakterystyczna dla rodziny glukozydaz GH84 (ang. glycoside hydrolase family 84). Odpowiada ona za odłączenie reszty O-GlcNAc od docelowego białka. Z kolei w C-końcu enzymu zlokalizowana jest domena wykazująca homologię do rodziny acetylotransferaz histonowych GNAT (ang. Gcn5-related N-acetyltransferase) [5, 16]. Do tej pory nie potwierdzono, czy OGA ma aktywność acetylotransferazy histonowej. Uważa się, że OGA może uczestniczyć w interakcjach z czynnikami transkrypcyjnymi, chociaż białko to nie posiada pętli P (ang. P-loop), zachowanej ewolucyjnie domeny charakterystycznej dla acetylotransferaz GNAT. Pomiędzy wyżej opisanymi domenami OGA znajduje się miejsce, które jest rozpoznawane i cięte przez kaspazę 3 podczas apoptozy [5, 14]. W wyniku alternatywnego składania transkryptu genu MGEA5 powstają dwie izoformy OGA, tj. OGA-L (ang. OGA long form) i OGA-S (ang. OGA short form). W wyniku translacji wszystkich 16 eksonów genu MGEA5 powstaje długa izoforma enzymu (OGA-L) składająca się z 916 aminokwasów. Białko OGA-L zlokalizowane jest w cytosolu, a w jego strukturze wyróżnia się obie opisane powyżej domeny o aktywności enzymatycznej zlokalizowane odpowiednio w N- i C-końcu. Natomiast w wyniku alternatywnego składania mrna MGEA5 nie dochodzi do usunięcia intronu 11, w którym znajduje się alternatywny kodon stop, co prowadzi do powstania izoformy OGA-S składającej się z 677 aminokwasów. Izoforma OGA-S pozbawiona jest domeny o potencjalnej aktywności acetylotransferazy histonowej, której obecność jest charakterystyczna dla OGA-L. Natomiast C-koniec białka OGA-S stanowi fragment składający się z 14 reszt aminokwasowych, których brak jest w izoformie OGA-L [16, 17]. Izoforma OGA-S zlokalizowana jest w jądrze komórkowym. Aktywność obu izoform jest w podobny sposób hamowana poprzez inhibitory OGA. Natomiast zauważono, że OGA-L wykazuje mniejszą aktywność enzymatyczną w badaniach in vitro. Możliwe, że obecność pewnych czynników komórkowych jest niezbędna dla prawidłowego działania tej izoformy [5].

7 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 71 Zaburzenia poziomu O-GlcNAcylacji w nowotworach Zmiany w poziomie O-GlcNAcylacji, które stwierdzono w wielu typach nowotworów, związane są ze zmianą poziomu ekspresji genów kodujących enzymy zaangażowane w ten proces. Zaobserwowano, że zależnie od stopnia zaawansowania nowotworu zmienia się poziom ekspresji OGT i MGEA5. W przypadku komórek słabo zróżnicowanych nowotworów piersi, czyli o wyższym stopniu złośliwości histologicznej (G2 i G3), obserwuje się znaczny spadek poziomu mrna dla MGEA5 oraz wzrost poziomu mrna dla OGT w porównaniu z nowotworami o niskim stopniu złośliwości histologicznej (G1) [18]. Globalny poziom O-GlcNAcylacji białek w mniej zróżnicowanych komórkach raka piersi jest dużo wyższy niż w komórkach prawidłowych [19]. Gu i wsp. [20] zauważyli, że zmiany poziomu O-GlcNAcylacji białek, wywołane zmianą ekspresji genów kodujących OGT i OGA, mają wpływ na wzrost zdolności komórek raka piersi do przerzutowania. W komórkach raka prostaty, podobnie jak w przypadku raka piersi, wraz ze wzrostem zaawansowania nowotworu obserwuje się wzrost ekspresji OGT oraz spadek ekspresji MGEA5. Również poziom mrna dla OGT ulega zwiększeniu w komórkach raka prostaty w porównaniu z komórkami prawidłowymi. Zwiększony poziom OGT, prowadzący do wzrostu stopnia O-GlcNAcylacji białek w komórkach raka prostaty, przyczynia się do przyspieszonego wzrostu nowotworu oraz prowadzi do przerzutowania [21, 22]. W przypadku raka endometrium o wysokim stopniu złośliwości histologicznej stwierdzono wzrost poziomu mrna zarówno dla OGT, jak i dla OGA w porównaniu do dobrze zróżnicowanych komórek raka błony śluzowej trzonu macicy. Ponadto wykazano istnienie zależności pomiędzy ekspresją genów kodujących enzymy uczestniczące w procesie O-GlcNAcylacji, a głębokością naciekania mięśniówki macicy. Natomiast nie obserwuje się zależności pomiędzy ekspresją OGT i MGEA5, a zdolnością komórek raka endometrium do przerzutowania do węzłów chłonnych [23].

8 72 O-GlcNAcylacja w nowotworach Ryc. 2. Wpływ O-GlcNAcylacji na progresję cyklu komórkowego. Poziom O-GlcNAcylacji zmienia się w poszczególnych fazach cyklu. Wzrost poziomu O-GlcNAcylacji obserwowany jest w fazach G0, G1 oraz G2, natomiast do spadku O-GlcNAcylacji dochodzi tuż przed fazą S oraz w samej fazie S. Poziom O-GlcNAcylacji w fazie M pozostaje do tej pory niezbadany, aczkolwiek wiadomo, że odpowiedni poziom enzymów OGT i OGA w fazie M jest niezbędny do prawidłowej progresji cyklu komórkowego [wg [40]; zmieniono]. Fig. 2. Impact of O-GlcNAcylation on cell cycle progression. O-GlcNAcylation level changes during the cell cycle progression. The level of protein O-GlcNAcylation is higher in G0, G1 and G2 than in S phase. The pattern of O-GlcNAcylation levels in the M phase remains unknown. However, the proper expression of OGT and OGA in M phase is necessary for cell cycle progression (modified after [40]).

9 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 73 Zwiększony poziom O-GlcNAcylacji białek obserwowano również w takich typach nowotworów, jak rak trzustki [24], wątroby [25], płuc, jelita grubego [26] oraz w przewlekłej białaczce limfatycznej [27]. Rożanski i wsp. [28] zaobserwowali wzrost poziomu mrna dla OGT oraz spadek poziomu mrna dla MGEA5 w próbkach moczu pacjentów z rakiem pęcherza moczowego w porównaniu z próbkami pobranymi od osób zdrowych. Ekspresja OGT wzrastała, natomiast MGEA5 malała wraz ze stopniem złośliwości histologicznej nowotworu. Wyniki te wskazują, że analiza poziomu mrna dla OGT w moczu może być wykorzystana jako marker diagnostyczny raka pęcherza moczowego [28]. Sugeruje się również, że OGT może być brana pod uwagę jako potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej. Zmniejszony poziom O-GlcNAcylacji spowodowany inhibicją OGT jest skorelowany ze zmniejszeniem wzrostu, inwazji oraz przerzutowania nowotworów [21, 26]. Wpływ O-GlcNAcylacji na szlaki przekazywania sygnałów W komórkach nowotworowych często dochodzi do zaburzeń szlaków przekazywania sygnałów, które związane są z regulacją wzrostu, przeżycia i proliferacji komórek. Przykładami szlaków, których elementy ulegają regulacji przez O-GlcNAcylację są m.in. szlak kinaz aktywowanych mitogenami (ang. mitogen-activated protein kinases - MAPK), szlak kinazy mtor (ang. mammalian target of rapamycin kinase) oraz szlak kinazy aktywowanej 5 AMP (ang. 5 adenosine monophosphate-activated protein kinase - AMPK). Ze względu na udział tych szlaków w procesie nowotwotworzenia mogą być one potencjalnym celem terapii przeciwnowotworowej [1, 29]. Szlak MAPK uczestniczy w regulacji wzrostu, różnicowania i przeżycia komórki. Wpływa również na proces apoptozy i przerzutowania komórek nowotworowych. Jego nadmierna aktywacja jest obserwowana w wielu typach nowotworów [30]. Wysokie stężenie glukozy lub glukozaminy w komórce prowadzące do hiper-o-glcnacylacji przyczynia się do aktywacji kinaz z rodziny MAPK. Fosforylacji i aktywacji podlegają m.in. p38 (ang. p38 mitogen activated protein kinase), Erk1/2 (ang. extracellular signalregulated kinases 1/2 - p44/42), MKK3/6 (ang. mitogen-activated protein kinase kinase 3/6) oraz MEKK1/2 (ang. mitogen-activated protein kinase kinase 1/2). Efektem aktywacji tych białek jest wzmożona aktywacja całego szlaku

10 74 O-GlcNAcylacja w nowotworach MAPK [31]. Zaobserwowano, że wyciszenie ekspresji OGT przyczynia się do spadku aktywności szlaku MAPK w skutek zmniejszenia fosforylacji kinaz Erk1/2 [32, 33]. Głównym regulatorem metabolizmu i wzrostu komórki jest szlak mtor. Szlak ten może być aktywowany w wyniku działania czynników wzrostu, insuliny, czy też substancji odżywczych. Najlepiej poznanym mechanizmem aktywacyjnym mtor jest kaskada kinaz PI3K/Akt (ang. phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B). Kinazy te mogą ulegać O-GlcNAcylacji przyczyniając się do regulacji aktywności szlaku mtor [34]. Podczas stymulowania komórki insuliną OGT przemieszcza się w okolice błony komórkowej, po czym łączy się z cząsteczkami fosfatydyloinozytolo-3,4,5- trifosforanu (ang. phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate - PIP3) i ulega fosforylacji przez receptor insuliny, który posiada aktywność kinazy tyrozynowej. OGT wówczas przyłącza resztę N-acetyloglukozaminy do Akt, blokując tym samym fosforylację treoniny 308 przeprowadzaną przez PDK1 (ang. phosphoinositide-dependent kinase 1). Fosforylacja Thr308 jest niezbędna do aktywacji Akt, tak więc jej brak skutkuje zahamowaniem przekazywania sygnału w komórce [35] Szlak kinazy AMPK odpowiada za utrzymanie równowagi energetycznej w komórce. Jest on aktywowany wzrostem stosunku AMP/ATP i przyczynia się do zwiększenia katabolizmu i zmniejszenia anabolizmu w komórce [36]. Traktowanie adipocytów 3T3L1 glukozaminą, która powodowała zwiększenie aktywności HBP, szlaku którego końcowym produktem jest UDP-GlcNAc stanowiąca substrat dla OGT, wpłynęło pozytywnie na wzrost aktywności kinazy AMPK. Z drugiej strony, zmniejszenie poziomu reszt O-GlcNAc w komórkach przyczyniło się do obniżenia aktywności AMPK. Eksperyment ten dowiódł, że O-GlcNAcylacja wywiera znaczący wpływ na aktywność AMPK [37]. Ostatnie badania Bullen i wsp. [38] potwierdziły, że podjednostki α i γ AMPK są O-GlcNAcylowane. O-GlcNAcylacja podjednostki γ1 znacząco zwiększa aktywność AMPK [38].

11 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 75 Wpływ O-GlcNAcylacji na aktywność czynników transkrypcyjnych Proces transkrypcji genów regulowany jest, między innymi, przez szereg czynników transkrypcyjnych, które mogą ulegać różnym typom modyfikacji potranslacyjnych, w tym również modyfikacji przez reszty O-GlcNAc. O-GlcNAcylacja czynników transkrypcyjnych może oddziaływać na ich aktywność transkrypcyjną poprzez zmianę ich stabilności, wewnątrzkomórkowej lokalizacji, zdolności do wiązania się z DNA, czy też interakcji z innymi białkami. Duża liczba czynników transkrypcyjnych ulega O-GlcNAcylacji, ale tylko niektóre z nich w sposób istotny mają wpływ na proces nowotworzenia. Do czynników tych zaliczamy m.in. NF-κB (ang. nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells), YY1 (ang. yin yang 1), p53, c-myc (ang. myelocytomatosis), FoxO1 (ang. forkhead box protein O1), FoxM1 (ang. forkhead box protein M1) [39, 40]. NF-κB jest dimerem białkowym, składającym się z dwóch podjednostek: p65 (RelA) oraz p50. Występuje we wszystkich komórkach zwierząt i bierze udział w odpowiedzi komórki na bodźce stresowe, a ponadto reguluje proliferację limfocytów T i produkcję cytokin [41]. W cytoplazmie występuje w formie nieaktywnej transkrypcyjnie w połączeniu z inhibitorem IκB (ang. inhibitor of kappa B), który uniemożliwia transport NF-κB do jądra komórkowego. NF-κB może być aktywowany przez O-GlcNAcylację w dwojaki sposób. Pierwszy z nich to O-GlcNAcylacja Ser733 w kinazie IKKβ (ang. IκB kinase β), która staje się aktywna i fosforyluje IκB. Fosforylowany IκB odłącza się od sekwencji lokalizacji jądrowej NF-κB, a następnie ulega ubikwitynozależnej degradacji w proteasomie. Dzięki temu NF-κB może ulec translokacji do jądra komórkowego, gdzie działa jako czynnik transkrypcyjny. Drugim sposobem jest O-GlcNAcylacja samej cząsteczki NF-κB. W warunkach wysokiego stężenie glukozy, reszty O-GlcNAc przyłączane są do Thr322 i Thr352 podjednostki p65 czynnika transkrypcyjnego NF-κB. Nie zaobserwowano występowania O-GlcNAcylacji w podjednostce p50 [42, 43]. W badaniach na komórkach gruczolakoraka trzustki wykazano, że podstawienie Thr322 oraz Thr352 resztą alaniny wpływa na obniżenie zdolności komórek do wzrostu. Niemniej jednak, konieczne są dalsze badania nad wpływem O-GlcNAcylacji NF-κB na rozwój nowotworów [44].

12 76 O-GlcNAcylacja w nowotworach Białko YY1 jest czynnikiem transkrypcyjnym o strukturze palca cynkowego, który reguluje transkrypcję wielu genów, przez co wpływa na wzrost oraz różnicowanie komórek. Może zachowywać się zarówno jako aktywator, jak i represor transkrypcji. Podczas fazy G1 cyklu komórkowego YY1 tworzy kompleks z białkiem supresorowym Rb (ang. retinoblastoma). W kompleksie tym YY1 nie jest zdolny do wiązania się z DNA. O-GlcNAcylacja białka YY1 powoduje jego odłączenie od Rb, dzięki czemu białko to może wiązać się z DNA i pełnić funkcję regulatora ekspresji genów. W warunkach niskiego stężenia glukozy białko YY1 nie ulega O-GlcNAcylacji, co wpływa na zwiększenie liczby powstających kompleksów YY1-Rb. Widać więc, że O-GlcNAcylacja odgrywa ważną rolę w regulacji aktywności tego czynnika transkrypcyjnego, jednakże dokładny mechanizm przyłączenia reszt O-GlcNAc do YY1, jak i sposób, w jaki wpływa to na rozpad kompleksu YY1-Rb nie został jak do tej pory wyjaśniony [45, 46]. p53 jest najbardziej znanym białkiem supresorowym, którego gen ulega mutacji w ponad 50% nowotworów. Aktywność p53 kontrolowana jest przez różne modyfikacje potranslacyjne. Podczas działania na komórkę rozmaitych czynników stresowych, takich jak uszkodzenie DNA czy hipoksja, poziom p53 jest regulowany przez ubikwityno-zależną degradację w proteasomie, która zależna jest od fosforylacji Thr155. Fosforylacja w tej pozycji może być blokowana poprzez O-GlcNAcylację Ser149, co skutkuje zwiększoną stabilnością i aktywnością p53. Mogłoby to sugerować, że O-GlcNAcylacja p53 prowadzi do wzrostu aktywności supresorowej tego białka, a w konsekwencji do apoptozy. Aczkolwiek pojawiły się doniesienia o zwiększeniu pro-onkogennej aktywności O-GlcNAcylowanego p53. Dokładny mechanizm aktywacji p53 przez O-GlcNAcylację nie został jak dotąd poznany [47, 48]. Białko c-myc jest czynnikiem transkrypcyjnym, który jest wytwarzany w małych ilościach w większości prawidłowych komórek. Natomiast do jego nadmiernej ekspresji dochodzi w komórkach silnie proliferujących i komórkach nowotworowych. Pod wpływem czynników wzrostu dochodzi do fosforylacji Ser62 białka c-myc, co skutkuje wzrostem aktywności tego czynnika transkrypcyjnego. Fosforylacja Ser62 jest rozpoznawana przez kinazę GSK3β (ang. glycogen synthase kinase 3 beta), która fosforyluje Thr58 w pobliżu domeny transaktywacyjnej c-myc, co prowadzi do inaktywacji i w konsekwencji

13 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 77 do degradacji tego białka. Dowiedziono, że Thr58 może ulegać również O-GlcNAcylacji. O-GlcNAcylacja Thr58 sama w sobie nie zwiększa stabilności c-myc, lecz blokuje fosforylację Thr58 przez GSK3β, co zapobiega degradacji tego białka. Skutkuje to zwiększeniem aktywności c-myc oraz może prowadzić do nowotworzenia [49-51]. FoxO1 jest ważnym czynnikiem transkrypcyjnym mającym wpływ na regulację aktywności genów związanych z procesem apoptozy, cyklem komórkowym, metabolizmem komórki oraz odpowiedzią komórki na stres oksydacyjny. Ekspresja FoxO1 jest zwiększona w wielu typach nowotworów, wskazując na ważny udział tego czynnika w procesie nowotworzenia [52]. Kinaza Akt, aktywowana insuliną, fosforyluje Thr24, Ser256 oraz Ser319 FoxO1, co prowadzi do zmiany jego wewnątrzkomórkowej lokalizacji z jądrowej na cytoplazmatyczną. W cytoplazmie FoxO1 ulega ubikwitynozależnej degradacji [53]. Przy wysokim stężeniu glukozy w komórce, FoxO1 ulega O-GlcNAcylacji, która prowadzi do wzrostu aktywności tego czynnika transkrypcyjnego. Zaobserwowano, że modyfikacja ta może zachodzić w czterech różnych miejscach łańcucha polipeptydowego FoxO1, aczkolwiek tylko przyłączenie reszty O-GlcNAc do treoniny w pozycji 317 (Thr317) wpływa na zwiększenie aktywności transkrypcyjnej FoxO1 [54, 55]. Lynch i wsp. [21] zaobserwowali, że inhibicja aktywności OGT w komórkach raka prostaty PC3-ML skutkowała zwiększeniem degradacji FoxO1. Natomiast zwiększenie ekspresji OGT prowadziło do wzrostu aktywności FoxO1 [21]. FoxM1 jest czynnikiem transkrypcyjnym, którego głównym zadaniem jest regulacja cyklu komórkowego i proliferacji komórek. Oprócz tego, może również brać udział w naprawie DNA, różnicowaniu komórek, przerzutowaniu komórek nowotworowych, angiogenezie, czy też apoptozie. Ekspresja FoxM1 w komórkach prawidłowych kształtuje się na bardzo niskim poziomie, natomiast w komórkach silnie proliferujących oraz komórkach nowotworowych dochodzi do nadekspresji FoxM1 [56, 57]. Białko FoxM1 może ulegać O-GlcNAcylacji, aczkolwiek konkretne miejsca przyłączenia reszt O-GlcNAc nie zostały jak dotąd poznane. Zauważono, że obniżenie ekspresji OGT w komórkach raka piersi przy użyciu interferencji RNA powoduje znaczny spadek poziomu FoxM1. Obniżenie poziomu FoxM1 wpływa na zmniejszenie aktywności białka Skp2 (ang. S-phase kinase-associated protein 2) wchodzącego w skład

14 78 O-GlcNAcylacja w nowotworach kompleksu SCFSKP2 (ang. Skp, Cullin, F-box containing complex) mającego aktywność ligazy ubikwitynowej E3. Kompleks ten jest zaangażowany w degradację białka p27kip1 (ang. cyclin-dependent kinase inhibitor 1B) będącego inhibitorem cyklu komórkowego. Dochodzi więc do progresji cyklu komórkowego i wzrostu nowotworu [58]. Zaobserwowano również, że hipo-o- GlcNAcylacja w komórkach raka piersi i raka prostaty, prowadząca do spadku poziomu FoxM1, prowadziła do zmniejszenia zdolności komórek do przerzutowania oraz zahamowania angiogenezy. Było to związane ze spadkiem ekspresji metaloproteinazy 2 i 9 (ang. matrix metaloproteinases 2 and 9 MMP-2, -9) [21, 58]. Wpływ O-GlcNAcylacji na cykl komórkowy Zaobserwowano, że O-GlcNAcylacja wywiera istotny wpływ na progresję cyklu komórkowego w komórkach nowotworowych. Znaczący wzrost poziomu O-GlcNAcylacji białek ma miejsce we wszystkich fazach cyklu komórkowego, oprócz fazy S, w której dochodzi do spadku O-GlcNAcylacji. Natomiast poziom O-GlcNAcylacji pod koniec fazy M i po całkowitym zakończeniu cyklu komórkowego pozostaje, jak do tej pory, niezbadany. W zależności od fazy cyklu komórkowego O-GlcNAcylowane są różne białka, jednak przede wszystkim modyfikacji tej ulegają cykliny D, E, A, B oraz różnego typu kinazy. Generalnie, ogólny wzrost O-GlcNAcylacji jest skorelowany z progresją cyklu komórkowego oraz wzmożoną proliferacją komórek nowotworowych [59]. Większość komórek w organizmie człowieka znajduje się w fazie spoczynkowej (G0). Wejście w fazę G1, czyli pierwszą fazę cyklu komórkowego wymaga obecności zewnątrzkomórkowych sygnałów mitotycznych, które prowadzą do aktywacji szlaków kinaz MAPK i PI3K oraz do ekspresji cykliny D1, kluczowego regulatora fazy G1. Olivier-Van Stichelen i wsp. [60] zaobserwowali, że zablokowanie aktywności OGT przy użyciu inhibitora tego enzymu (Ac-5SGlcNAc) lub zmniejszenie ekspresji OGT w wyniku interferencji RNA, skutkowało zmniejszeniem aktywności kinaz MAPK i PI3K, co prowadziło do zmniejszenia ekspresji cykliny D1 i zahamowania proliferacji komórek. Ta sama grupa zaobserwowała, że podobny wpływ na zatrzymanie cyklu komórkowego w punkcie kontrolnym G0/G1 miało zmniejszenie aktywności szlaku HBP, w którym powstaje substrat dla OGT.

15 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 79 Natomiast zahamowanie aktywności OGA, a co za tym idzie wzrost O-GlcNAcylacji białek, prowadziło do przyspieszenia wejścia w fazę G1. Doniesienia te sugerują istotny udział O-GlcNAcylacji w przejściu komórki z fazy G0 do fazy G1 [60]. Faza S jest fazą cyklu komórkowego, podczas której DNA ulega replikacji. Punkt kontrolny G1/S odpowiada za sprawdzenie czy DNA nie jest uszkodzony. Tutaj, odwrotnie niż w fazie G0 i G1, obserwuje się spadek aktywności OGT oraz większą ekspresję i aktywność OGA, a co za tym idzie zmniejszenie ogólnego poziomu O-GlcNAcylacji. W fazie S obserwujemy spadek O-GlcNAcylacji histonów, co umożliwia dostęp do DNA dla kompleksu prereplikacyjnego. Ponadto zmniejsza się O-GlcNAcylacja kompleksów MCM3, 6 i 7 (ang. minichromosome maintenance). Poprzez regulację aktywności helikazy kompleksy te spełniają istotną rolę w procesie replikacji DNA [61, 62]. Dodatkowo, w fazie S dochodzi do zwiększonej ekspresji cykliny E aktywującej kinazę Cdk2 (ang. cyclin dependent kinase 2), która fosforyluje kompleksy MCM, co prowadzi do wzrostu ich aktywności [63]. Po fazie S następuje faza G2, w której komórka rośnie i przygotowuje się do wejścia w fazę M. Punkt kontrolny G2/M odpowiada za sprawdzenie czy DNA został całkowicie zreplikowany i czy nie jest uszkodzony. Istotną rolę odgrywają tutaj kompleksy: cyklina A-kinaza Cdk1/2 oraz cyklina B-kinaza Cdk1. Nie pozwalają one wejść komórce w fazę M, gdy materiał genetyczny zawiera uszkodzenia [64]. W fazie G2 ponownie dochodzi do znacznego wzrostu poziomu O-GlcNAcylacji, który niezbędny jest do przejścia z fazy G2 do M. W fazie M, OGT i OGA tworzą kompleks razem z kinazą Aurora B i białkową fosfatazą 1 (ang. protein phosphatase 1 - PP1). Kompleks ten odpowiada za utrzymanie stabilności ciałka pośredniego. Co ciekawe, zarówno wyciszenie ekspresji OGT, jak i OGA skutkuje zmniejszeniem ekspresji cykliny B1, co wskazuje na to, że odpowiedni poziom obu tych enzymów jest niezbędny dla prawidłowej progresji cyklu komórkowego [59, 65].

16 80 O-GlcNAcylacja w nowotworach O-GlcNAcylacja a metabolizm komórek nowotworowych Cechą charakterystyczną komórek nowotworowych jest zwiększone zapotrzebowanie na glukozę wynikające z intensywnej glikolizy. W komórkach prawidłowych podstawowym źródłem energii jest fosforylacja oksydacyjna, natomiast w komórkach nowotworowych dochodzi do glikolizy beztlenowej, w której powstający pirogronian zamiast trafiać do mitochondriów, gdzie ulegałby przekształceniu w acetylo-coa, jest przekształcany w mleczan. Istotnym jest fakt, że glikoliza w komórkach nowotworowych zachodzi nawet w obecności tlenu. Zjawisko to nazywane jest efektem Warburga. Nasilona glikoliza jest korzystna dla komórek nowotworowych ponieważ produkty pośrednie tego procesu zasilają szlaki biosyntezy nukleotydów, aminokwasów i lipidów. Zwiększona produkcja prekursorów do biosyntezy tych cząsteczek pozwala na szybki wzrost i proliferację komórek nowotworowych [66, 67]. Uważa się, że istotną rolę w zmianie metabolizmu komórek nowotworowych odgrywa proces O-GlcNAcylacji poprzez modyfikację czynników transkrypcyjnych, regulację aktywności enzymów metabolicznych oraz poprzez wpływ na szlaki sygnalizacyjne związane z onkogenezą [68, 69]. Cząsteczka UDP-GlcNAc, będąca substratem dla OGT, jest końcowym produktem szlaku biosyntezy heksozamin. Komórki nowotworowe cechują się zwiększonym zapotrzebowaniem na glukozę i glutaminę oraz nasilonym pobieraniem tych substratów, ze względu na zwiększoną liczbę ich transporterów na powierzchni komórki. Zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia glukozy i glutaminy przyczynia się do pobudzenia szlaku biosyntezy heksozamin, co w konsekwencji prowadzi do hiper-o-glcnacylacji [70]. Nasilenie glikolizy w komórkach nowotworowych może być związane z O-GlcNAcylacją, a co za tym idzie aktywacją czynników transkrypcyjnych regulujących ekspresję genów kodujących enzymy glikolityczne, a także może wynikać z O-GlcNAcylacji samych enzymów. Badania wskazują, że wszystkie enzymy zaangażowane w glikolizę mogą być modyfikowane przez przyłączenie reszt O-GlcNAc, aczkolwiek tylko w przypadku trzech z nich stosunkowo dokładnie opisano wpływ tej modyfikacji na ich aktywność. Enzymami tymi są fosfofruktokinaza 1 (ang. phosphofructokinase 1 - PFK1), izoforma M2 kinazy pirogronianowej (ang. pyruvate kinase isoform M2 - PKM2) oraz heksokinaza (ang. hexokinase - HK) [71-74].

17 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 81 PFK1 katalizuje kluczowy etap w glikolizie, w którym fruktozo-6-fosforan zostaje ufosforylowany do fruktozo-1,6-bisfosforanu. Aktywna forma PFK1 tworzy oligomery w wyniku działania modulatora jakim jest fruktozo-2,6- bisfosforan (F-2,6-BP), a kluczową rolę w tej allosterycznej aktywacji odgrywa reszta seryny w pozycji 529 (Ser529) łańcucha polipeptydowego. O-GlcNAcylacja Ser529 PFK1 w komórkach nowotworowych prowadzi do zahamowania oligomeryzacji PFK1, a w konsekwencji do inhibicji aktywności tego enzymu. Powoduje to powstanie zwiększonej liczby produktów pośrednich glikolizy, które wywierają wpływ na aktywację szlaków bocznych glikolizy. Nadmiernej aktywacji ulega szlak pentozofosforanowy (ang. pentose phosphate pathway - PPP), co prowadzi do zwiększonej biosyntezy nukleotydów. Dodatkowo NADPH powstający w PPP wspomaga utrzymanie glutationu (GSH) w formie zredukowanej, przyczyniając się tym samym do wzrostu ochrony komórki przed stresem oksydacyjnym. Aktywacji ulega również szlak biosyntezy heksozamin, w którym powstaje UDP-GlcNAc będący substratem dla OGT. Przyczynia to się tym samym do zwiększenia procesu O-GlcNAcylacji białek w komórkach nowotworowych. Należy tutaj zaznaczyć, że zwiększona O-GlcNAcylacja PFK1 jest charakterystyczna tylko dla komórek nowotworowych, ale nie dla komórek prawidłowych o wysokim indeksie proliferacyjnym [74]. PKM2 jest enzymem charakterystycznym dla komórek nowotworowych, podczas gdy izoforma PKM1 (ang. pyruvate kinase isoform M1) ulega ekspresji głównie w komórkach dobrze zróżnicowanych. PKM2 katalizuje przemianę fosfoenolopirogronianu do pirogronianu. PKM2 wykazuje niską aktywność enzymatyczną w porównaniu do PKM1. Ta niska aktywność powoduje zmniejszenie wytwarzania pirogronianu w komórkach nowotworowych, natomiast sprzyja pobudzeniu aktywności szlaków bocznych glikolizy dzięki zwiększonej ilości produktów pośrednich. O-GlcNAcylacja PKM2 dodatkowo obniża aktywność tego enzymu zwiększając tym samym ilość powstających produktów pośrednich glikolizy. Do tej pory nie ustalono dokładnego miejsca przyłączenia reszty O-GlcNAc do PKM2 [19, 74]. O-GlcNAcylacji ulega również heksokinaza, która w przeciwieństwie do wcześniej omówionych enzymów, ulega aktywacji wskutek przyłączenia reszt O-GlcNAc. HK katalizuje pierwszy etap glikolizy, zwiększając tym samym ilość

18 82 O-GlcNAcylacja w nowotworach substratów dla PPP i HBP, które już i tak występują w dużych ilościach ze względu na zaburzenie funkcji PFK1 i PKM2. Widać więc, że wzrost O-GlcNAcylacji w komórkach nowotworowych jest nie tylko skutkiem zmiany metabolizmu komórki, lecz powoduje również przyśpieszenie rozwoju nowotworów poprzez regulację aktywności kluczowych enzymów metabolicznych [71, 75]. Wiele czynników transkrypcyjnych odgrywających ważną rolę w zmianie metabolizmu komórek nowotworowych ulega modyfikacji przez reszty O-GlcNAc. Ważniejszymi czynnikami transkrypcyjnymi wpływającymi na metabolizm komórki, które ulegają O-GlcNAcylacji są c-myc, NF-κB oraz ChREBP (ang. carbohydrate responsive element-binding protein). O-GlcNAcylacja wpływa na ich aktywność i stabilność [29]. Białko c-myc wpływa na glikolizę poprzez zwiększenie ekspresji białka wiążącego motywy polipirymidynowe (ang. polypyrimidin tract binding protein - PTB) oraz heterogennej jądrowej nukleoproteiny A1 i A2 (ang. heterogeneus nuclear ribonucleoprotein A1/A2 - hnrnp A1/A2), które sprzyjają zwiększonemu wytwarzaniu izoformy M2 kinazy pirogronianowej (PKM2) [76]. Uczestniczy również w transaktywacji dehydrogenazy A kwasu mlekowego (ang. lactate dehydrogenase-a - LDH-2), co zwiększa produkcję kwasu mlekowego [77]. c-myc przyczynia się również do zwiększonego napływu glukozy do wnętrza komórki poprzez zwiększenie ekspresji transportera glukozy GLUT1 (ang. glucose transporter 1) [78] oraz pobudzenia metabolizmu glutaminy poprzez zwiększenie ekspresji transporterów dla glutaminy oraz mitochondrialnej glutaminazy [79]. NF-κB może ulegać aktywacji przez O-GlcNAcylację w dwojaki sposób. Reszty O-GlcNAc mogą modyfikować podjednostkę p65 czynnika transkrypcyjnego NF-κB lub pośrednio wpływać na aktywację NF-κB poprzez O-GlcNAcylację kinazy IKKβ [44]. Przy braku p53, czynnik transkrypcyjny NF-κB powoduje zmniejszenie ekspresji genów mitochondrialnych, co przyczynia się do zmniejszenia fosforylacji oksydacyjnej i przełączenia metabolizmu komórkowego na glikolizę beztlenową [80]. Aktywacja NF-κB powoduje również zwiększenie ekspresji transportera glukozy GLUT3 (ang. glucose transporter 3) na powierzchni komórek skutkując tym samym

19 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 83 zwiększeniem napływu glukozy do wnętrza komórki, a co za tym idzie pobudzeniem glikolizy beztlenowej [43]. Czynnik transkrypcyjny ChREBP odgrywa kluczową rolę w pobudzeniu biosyntezy nukleotydów i kwasów tłuszczowych w komórkach nowotworowych. Hiper-O-GlcNAcylacja stabilizuje i powoduje zwiększenie aktywności ChREBP, co prowadzi do zwiększenia ekspresji genów kodujących enzymy metaboliczne, takich jak wątrobowa kinaza pirogronianowa (ang. liver pyruvate kinase - L-PK), karboksylaza acetylo-coa (ang. acetyl-coa carboxylase - ACC) oraz syntaza kwasów tłuszczowych (ang. fatty acid synthase - FAS) [81]. Zmniejszenie aktywności ChREBP prowadzi do zmiany metabolizmu komórki z glikolizy beztlenowej z powrotem na fosforylację oksydacyjną, co skutkuje zmniejszeniem proliferacji komórek nowotworowych i spowolnieniem wzrostu nowotworu [82]. O-GlcNAcylacja a progresja nowotworów Angiogeneza jest jednym z charakterystycznych procesów w czasie rozwoju nowotworu i polega na wytwarzaniu nowych naczyń krwionośnych z już istniejących. Przyczynia się to nie tylko do zaspokojenia potrzeb komórek nowotworowych na tlen i substancje odżywcze, ale także zwiększa zdolność komórek nowotworowych do przerzutowania [83]. O-GlcNAcylacja może wpływać na angiogenezę poprzez modyfikację czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. vascular endothelial growth factor - VEGF) oraz czynnika wzrostu fibroblastów (ang. fibroblast growth factor - FGF). Zmniejszenie poziomu O-GlcNAcylacji w komórkach raka prostaty PC3-ML, wywołane wyciszeniem ekspresji OGT, spowodowało spadek ekspresji VEGF, a w konsekwencji zahamowanie procesu angiogenezy [21, 84]. Istotną rolę w regulacji angiogenezy odgrywają cytoplazmatyczne metaloproteinazy. Zmniejszony poziom O-GlcNAcylacji wpływa negatywnie na ekspresję MMP-2 i MMP-9. Z kolei inhibicja OGA powoduje wzrost aktywności MMP-2 i -9 [25].

20 84 O-GlcNAcylacja w nowotworach Ryc. 3. Różnice w metabolizmie komórek prawidłowych i komórek nowotworowych. Uważa się, że istotną rolę w zmianie metabolizmu komórek nowotworowych odgrywa proces O-GlcNAcylacji poprzez modyfikację czynników transkrypcyjnych oraz regulację aktywności enzymów metabolicznych. O-GlcNAcylcja PFK i PKM2 zmniejszaja aktywność tych enzymów, natomiast O-GlcNAcylacja HK zwiększa. Prowadzi to do zwiększenia powstawania G-6-P oraz F-6-P, które są substratami dla szlaków bocznych glikolizy. O-GlcNAcylacji mogą ulegać również onkogeny takie jak NF-κB, ChREBP czy c-myc. Modyfikacja ta w pływa na ich stabilność i aktywność [wg [75]; zmieniono]. Fig. 3. Differences in metabolism between normal and cancer cells. It is suggested that O-GlcNAcylation promotes cancer cell metabolic reprogramming by the modification of transcription factors and the regulation of metabolic enzymes activity. O-GlcNAcylation reduces PFK and PKM activity and increases HK activity leading to the increased levels of glycolytic intermediates G-6-P and F-6-P. O-GlcNAcylation regulates also the stability and activity of oncogenes such as NF-κB, ChREBP and c-myc (modified after [75]).

21 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak 85 Hiper-O-GlcNAcylacja w komórkach nowotworowych jest również czynnikiem przyczyniającym się do procesu przerzutowania nowotworów. Ważnym procesem prowadzącym do przerzutowania jest przejście epitelialnomezenchymalne (ang. epithelial-mesenchymal transition - EMT), w wyniku którego komórki epitelialne nabierają fenotypu mezenchymalnego. Przejście to jest charakterystyczne dla nowotworów złośliwych, a w jego trakcie dochodzi do zmniejszenia ilości E-kadheryny (marker epitelialny) w błonie komórkowej, natomiast zwiększa się ilość wimentyny (marker mezenchymalny) [85, 86]. O-GlcNAcylacja wpływa na zmniejszenie ilości E-kadheryny w błonie komórkowej poprzez blokowanie interakcji tego białka z jego partnerami, czyli białkiem p120 oraz β-kateniną. Dodatkowo, O-GlcNAcylacja wpływa na stabilizację Snail1 (ang. snail family zinc finger 1), czynnika transkrypcyjnego będącego represorem transkrypcyjnym E-kadheryny [87]. NF-κB, który ulega O-GlcNAcylacji w czasie rozwoju nowotworów, może wywierać pośredni wpływ na wzrost przerzutowania komórek nowotworowych poprzez jego wpływ na stabilizację Snail1 [24]. Podsumowanie O-GlcNAcylacja jest powszechną i dynamiczną modyfikacją białek cytoplazmatycznych i jądrowych, która jest włączona w regulację przekazywania sygnału, cyklu komórkowego, metabolizmu oraz procesów transkrypcji i translacji. Cechą charakterystyczną komórek nowotworowych jest zwiększenie poziomu O-GlcNAcylacji, wynikające przede wszystkim z deregulacji ekspresji enzymów związanych z tą modyfikacją. Hiper-O- GlcNAcylacja wpływa na proliferację, przeżycie i metabolizm komórek nowotworowych, jak również zwiększa ich zdolność do inwazji i metastazy. Wyniki szeregu badań wskazują, że analiza poziomu ekspresji enzymów zaangażowanych w proces O-GlcNAcylacji może zostać wykorzystana w diagnostyce nowotworów, a O-GlcNAc transferaza może być brana pod uwagę jako potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej.

22 86 O-GlcNAcylacja w nowotworach Piśmiennictwo 1. Hanover JA, Krause MW, Love DC. The hexosamine signaling pathway: O-GlcNAc cycling in feast or famine. Biochim Biophys Acta. 2010; 1800: Slawson C, Hart GW. O-GlcNAc signalling: implications for cancer cell biology. Nat Rev Cancer. 2011; 11: Comer FI, Hart GW. O-Glycosylation of nuclear and cytosolic proteins. Dynamic interplay between O-GlcNAc and O-phosphate. J Biol Chem. 2000; 275: Hart GW, Slawson C, Ramirez-Correa G, Lagerlof O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annu Rev Biochem. 2011; 80: Vocadlo DJ. O-GlcNAc processing enzymes: catalytic mechanisms, substrate specificity, and enzyme regulation. Curr Opin Chem Biol. 2012; 16: Egloff S, Murphy S. Cracking the RNA polymerase II CTD code. Trends Genet. 2008; 24: Butkinaree C, Park K, Hart GW. O-linked beta-n-acetylglucosamine (O-GlcNAc): Extensive crosstalk with phosphorylation to regulate signaling and transcription in response to nutrients and stress. Biochim Biophys Acta. 2010; 1800: Wells L, Kreppel LK, Comer FI, Wadzinski BE, Hart GW. O-GlcNAc transferase is in a functional complex with protein phosphatase 1 catalytic subunits. J Biol Chem. 2004; 279: Hu P, Shimoji S, Hart GW. Site-specific interplay between O-GlcNAcylation and phosphorylation in cellular regulation. FEBS Lett. 2010; 584: Zeidan Q, Hart GW. The intersections between O-GlcNAcylation and phosphorylation: implications for multiple signaling pathways. J Cell Sci. 2010; 123: Lazarus MB, Nam Y, Jiang J, Sliz P, Walker S. Structure of human O-GlcNAc transferase and its complex with a peptide substrate. Nature. 2011; 469: Hurtado-Guerrero R, Dorfmueller HC, van Aalten DM. Molecular mechanisms of O-GlcNAcylation. Curr Opin Struct Biol. 2008; 18: Iyer SP, Hart GW. Roles of the tetratricopeptide repeat domain in O-GlcNAc transferase targeting and protein substrate specificity. J Biol Chem. 2003; 278: Wrabl JO, Grishin NV. Homology between O-linked GlcNAc transferases and proteins of the glycogen phosphorylase superfamily. J Mol Biol. 2001; 314: Gao Y, Wells L, Comer FI, Parker GJ, Hart GW. Dynamic O-glycosylation of nuclear and cytosolic proteins: cloning and characterization of a neutral, cytosolic beta-n-acetylglucosaminidase from human brain. J Biol Chem. 2001; 276:

23 Piotr Ciesielski, Anna Krześlak Li J, Huang CL, Zhang LW, Lin L, Li ZH, Zhang FW, Wang P. Isoforms of human O-GlcNAcase show distinct catalytic efficiencies. Biochemistry (Mosc). 2010; 75: Keembiyehetty CN, Krzeslak A, Love DC, Hanover JA. A lipid-droplet-targeted O-GlcNAcase isoform is a key regulator of the proteasome. J Cell Sci. 2011; 124: Krześlak A, Forma E, Bernaciak M, Romanowicz H, Bryś M. Gene expression of O-GlcNAc cycling enzymes in human breast cancers. Clin Exp Med. 2012; 12: Champattanachai V, Netsirisawan P, Chaiyawat P, Phueaouan T, Charoenwattanasatien R, Chokchaichamnankit D i wsp. Proteomic analysis and abrogated expression of O-GlcNAcylated proteins associated with primary breast cancer. Proteomics. 2013; 13: Gu Y, Mi W, Ge Y, Liu H, Fan Q, Han C i wsp. GlcNAcylation plays an essential role in breast cancer metastasis. Cancer Res. 2010; 70: Lynch TP, Ferrer CM, Jackson SR, Shahriari KS, Vosseller K, Reginato MJ. Critical role of O-Linked β-n-acetylglucosamine transferase in prostate cancer invasion, angiogenesis, and metastasis. J Biol Chem. 2012; 287: Kamigaito T, Okaneya T, Kawakubo M, Shimojo H, Nishizawa O, Nakayama J. Overexpression of O-GlcNAc by prostate cancer cells is significantly associated with poor prognosis of patients. Prostate Cancer Prostatic Dis. 2014; 17: Krześlak A, Wójcik-Krowiranda K, Forma E, Bieńkiewicz A, Bryś M. Expression of genes encoding for enzymes associated with O-GlcNAcylation in endometrial carcinomas: clinicopathologic correlations. Ginekol Pol. 2012; 83: Ma Z, Vocadlo DJ, Vosseller K. Hyper-O-GlcNAcylation is anti-apoptotic and maintains constitutive NF-κB activity in pancreatic cancer cells. J Biol Chem. 2013; 288: Zhu Q, Zhou L, Yang Z, Lai M, Xie H, Wu L i wsp. O-GlcNAcylation plays a role in tumor recurrence of hepatocellular carcinoma following liver transplantation. Med Oncol. 2012; 29: Mi W, Gu Y, Han C, Liu H, Fan Q, Zhang X, Cong Q, Yu W. O-GlcNAcylation is a novel regulator of lung and colon cancer malignancy. Biochim Biophys Acta. 2011; 1812: Shi Y, Tomic J, Wen F, Shaha S, Bahlo A, Harrison R i wsp. Aberrant O-GlcNAcylation characterizes chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2010; 24: Rozanski W, Krzeslak A, Forma E, Brys M, Blewniewski M, Wozniak P, Lipinski M. Prediction of bladder cancer based on urinary content of MGEA5 and OGT mrna level. Clin Lab. 2012; 58: Li Z, Yi W. Regulation of cancer metabolism by O-GlcNAcylation. Glycoconj J. 2014; 31:

24 88 O-GlcNAcylacja w nowotworach 30. Leelahavanichkul K, Amornphimoltham P, Molinolo AA, Basile JR, Koontongkaew S, Gutkind JS. A role for p38 MAPK in head and neck cancer cell growth and tumor-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Mol Oncol. 2014; 8: Kneass ZT, Marchase RB. Protein O-GlcNAc modulates motility-associated signaling intermediates in neutrophils. J Biol Chem. 2005; 280: Goldberg H, Whiteside C, Fantus IG. O-linked β-n-acetylglucosamine supports p38 MAPK activation by high glucose in glomerular mesangial cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2011; 301: E Ding F, Yu L, Wang M, Xu S, Xia Q, Fu G. O-GlcNAcylation involvement in high glucose-induced cardiac hypertrophy via ERK1/2 and cyclin D2. Amino Acids. 2013; 45: Slawson C, Copeland RJ, Hart GW. O-GlcNAc signaling: a metabolic link between diabetes and cancer? Trends Biochem Sci. 2010; 35: Yang X, Ongusaha PP, Miles PD, Havstad JC, Zhang F, So WV i wsp. Phosphoinositide signalling links O-GlcNAc transferase to insulin resistance. Nature. 2008; 451: Fay JR, Steele V, Crowell JA. Energy homeostasis and cancer prevention: the AMP-activated protein kinase. Cancer Prev Res (Phila). 2009; 2: Luo B, Parker GJ, Cooksey RC, Soesanto Y, Evans M, Jones D, McClain DA. Chronic hexosamine flux stimulates fatty acid oxidation by activating AMPactivated protein kinase in adipocytes. J Biol Chem. 2007; 282: Bullen JW1, Balsbaugh JL, Chanda D, Shabanowitz J, Hunt DF, Neumann D, Hart GW. Cross-talk between two essential nutrient-sensitive enzymes: O-GlcNAc transferase (OGT) and AMP-activated protein kinase (AMPK).J Biol Chem. 2014; 289: Ozcan S, Andrali SS, Cantrell JE. Modulation of transcription factor function by O-GlcNAc modification. Biochim Biophys Acta. 2010; 1799: Fardini Y, Dehennaut V, Lefebvre T, Issad T. O-GlcNAcylation: A New Cancer Hallmark? Front Endocrinol (Lausanne). 2013; 4: Dolcet X, Llobet D, Pallares J, Matias-Guiu X. NF-kB in development and progression of human cancer. Virchows Arch. 2005; 446: Yang WH, Park SY, Nam HW, Kim do H, Kang JG, Kang ES i wsp. NFkappaB activation is associated with its O-GlcNAcylation state under hyperglycemic conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105: Kawauchi K, Araki K, Tobiume K, Tanaka N. p53 regulates glucose metabolizm through an IKK-NF-kappaB pathway and inhibits cell transformation. Nat Cell Biol. 2008; 10: Ma Z, Vocadlo DJ, Vosseller K. Hyper-O-GlcNAcylation is anti-apoptotic and maintains constitutive NF-κB activity in pancreatic cancer cells. J Biol Chem. 2013; 288: