LIDIA CYBULSKA, EWA KAPIŃSKA, JOANNA WYSOCKA, KRZYSZTOF RĘBAŁA, ZOFIA SZCZERKOWSKA

Transkrypt

1 ANNALES ACADEMIAE MEDICAE STETINENSIS ROCZNIKI POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE 2007, 53, SUPPL. 2, LIDIA CYBULSKA, EWA KAPIŃSKA, JOANNA WYSOCKA, KRZYSZTOF RĘBAŁA, ZOFIA SZCZERKOWSKA Badanie polimorfizmu czterech loci STR chromosomu X w populacji Polski północnej Population study of four X-chromosomal STR loci from the northern part of Poland Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Gdańsku ul. Dębowa 23, Gdańsk Kierownik: dr hab. n. med. Zbigniew Jankowski Summary Introduction, materials and methods: The allele frequencies of four short tandem repeats (STR) loci specific to the human X chromosome (DXS101, DXS7423, DXS8377 and phosphoribosyltransferase HPRTB) were analyzed by means of a multiplex PCR reaction in a sample of 200 unrelated individuals residing in the northern part of Poland. The separation and detection of PCR products were performed by capillary electrophoresis on the 3130 Genetic Analyzer. Testing for HardyWeinberg equilibrium (HWE) showed no significant deviation for these loci. Results: Statistical parameters such as: heterozygosity observed, mean exclusion chance, power of discrimination in males and power of discrimination in females showed that the examined multiplex is useful in forensic and paternity testing applications. K e y w o r d s: multiplex PCR population database of four X-STR loci forensic genetics. Streszczenie Wstęp: W pracy przedstawiono dane populacyjne w zakresie mikrosatelitarnych loci sprzężonych z chromosomem X: 2 markery o trójnukleotydowych powtórzeniach: DXS101 i DXS8377 oraz 2 o czteronukleotydowych powtórzeniach: HPRTB i DXS7423. Materiał i metody: Materiał biologiczny stanowiła pełna krew lub wymazy z jamy ustnej, pochodzące od 200 niespokrewnionych osób (kobiet i mężczyzn) z obszaru Polski północnej. Izolację DNA i pomiar jego stężenia przeprowadzono opisanymi uprzednio metodami. Reakcję kompleksowego PCR przeprowadzono przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych starterów (5-FAM i 5-), o sekwencjach dostępnych w bazie danych (www. chx-str.org, i w piśmiennictwie. Rozdział i detekcję produktów amplifikacji prowadzono drogą elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Jako standardu wewnętrznego użyto GeneScan-500 ROX. Częstość alleli każdego locus obliczano oddzielnie dla kobiet i dla mężczyzn. Drogą sekwencjonowania skonstruowano drabinę alleli oraz przedstawiono propozycję ich nazewnictwa zgodnie z wytycznymi komisji ISFH. Wyniki: Uzyskane wyniki opracowano statystycznie, obliczając: heterozygotyczność obserwowaną, siłę dyskryminacji u kobiet i u mężczyzn oraz teoretyczną szansę wykluczenia. Parametry statystyczne wskazują na dużą przydatność wymienionego multipleksu do badań genetycznych w medycynie sądowej. H a s ł a: hemogenetyka X-STR polimorfizm. Wstęp Oznaczanie polimorficznych loci X-STR stanowi jedną z nowszych metod analizy genetycznej stosowanej w medycynie sądowej, szczególnie wówczas, gdy markery autosomalne nie dostarczają jednoznacznych wyników dla ustalenia pokrewieństwa.

2 Badanie polimorfizmu 4 loci STR chromosomu X w populacji Polski północnej 171 W takich przypadkach badania wymagają poszerzenia zakresu analizowanych markerów o dodatkowe polimorficzne loci, m.in. sprzężone z chromosomem X. Jednocześnie zastosowanie nowych markerów genetycznych w praktyce sądowo-medycznej wymaga opracowania baz danych populacyjnych zawierających częstości alleli oraz ustalenia parametrów statystycznych oceniających ich przydatność w praktyce. W oparciu o przeprowadzone badania opracowano własną bazę populacyjną i przeprowadzono analizę statystyczną. Materiał i metody Badaniu poddano DNA 200 dorosłych niespokrewnionych mieszkańców Polski północnej (100 kobiet i 100 mężczyzn). Do izolacji wykorzystano krew oraz wymazy z jamy ustnej pobrane w Zakładzie Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Gdańsku do rutynowych badań w dochodzeniu ojcostwa oraz w sprawach identyfikacyjnych. Zastosowano komercyjny zestaw do izolacji genomowego DNA z materiału biologicznego Sherlock AX (A&A Biotechnology) oraz metodę nieenzymatycznej ekstrakcji [1]. Ilość DNA oceniano metodą spektrofotometryczną. Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu termocyclera GeneAmp PCR System 9700 (Applera, USA). Mieszanina reakcyjna o całkowitej objętości 25 µl zawierała: 1030 ng genomowego DNA, fluorescencyjnie znakowane startery o odpowiednich sekwencjach i stężeniu (tab. 1), 1,5 mm MgCl 2, 5 nmol dntp, 2U termostabilnej polimerazy AmpliTaq Gold (Applera, USA). Amplifikację prowadzono w następujących warunkach: 10 min wstępna denaturacja w 94ºC; 8 cykli: denaturacja 1 min w 94ºC, przyłączanie (hybrydyzacja) 1 min w 6259ºC (temp. zmniejsza się o 1ºC na każde dwa cykle), wydłużanie (elongacja) 1 min w 72ºC; 24 cykli: denaturacja 1 min w 94ºC, przyłączanie (hybrydyzacja) 1 min w 58ºC, wydłużanie (elongacja) 1 min w 72ºC, końcowe wydłużanie (elongacja) 30 min w 72ºC. Rozdział i detekcję produktów amplifikacji prowadzono drogą elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze 3130 Genetic Analyzer (Applera, USA), stosując polimer POP-4. Pozytywną kontrolę stanowiły komercyjne próbki o znanych allelach: K562 (Promega) i NA9947A (Applera, USA) [2]. Jako standard wewnętrzny wykorzystano DNA Size Standard GeneScan-500 ROX. Wyniki analizowano za pomocą programu GeneScan Analysis Software 3.7 (Applera, USA) oraz programu do obliczeń statystycznych PowerStats 1.2. Z badanych prób o wyróżniającej się wielkości fragmentów, drogą sekwencjonowania [3] skonstruowano drabinę alleli oraz przedstawiono propozycję ich nazewnictwa zgodnie z wytycznymi komisji ISFH [4] (ryc. 1). Ryc. 1. Elektroforegram drabiny alleli badanego multipleksu STR-X Fig. 1. Electrophoregrams of the allelic ladder investigated of multiplex X-STR Dokonano oceny rozkładu częstości alleli w badanej populacji. Dodatkowo obliczono wybrane parametry statystyczne, takie jak: heterozygotyczność obserwowana, siłę dyskryminacji u kobiet i u mężczyzn oraz teoretyczną szansę wykluczenia [5, 6]. Porównano również rozkłady częstości alleli między badaną populacją a innymi europejskimi populacjami. T a b e l a 1. Informacje o analizowanych loci T a b l e 1. Characteristics of multiplex PCR systems Locus Obserwowane allele Observed alleles Wielkości fragmentów Fragment length Parametr Label Kolejność primerów Primer sequences Genotyp standardowego DNA Genotype of standard DNA K A DXS101 DXS7423 DXS8377 HPRTB FAM 5 -actctaaatcagtccaaatatct-3 5 -aaatcactccatggcacatgtat-3 5 -tagcttagcgcctggcacata-3 5 -gtcttcctgtcatctcccaac-3 5 -cacttcatggcttaccacag-3 5 -gacctttggaaagctagtgt-3 5 -atgccacagataatacacatcccc-3 5 -ctctccagaatagttagatgtagg

3 172 LIDIA CYBULSKA, EWA KAPIŃSKA, JOANNA WYSOCKA, KRZYSZTOF RĘBAŁA, ZOFIA SZCZERKOWSKA T a b e l a 2. Rozkład częstości alleli dla 4 loci STR chromosomu X w badanej populacji z terenu Polski północnej (n = 200) T a b l e 2. Allele frequencies for 4 Xchromosomal STR markers in northern Poland (n = 200) DXS101 DXS7423 DXS8377 HPRTB Allele M F C M F C M F C M F C ,11 0,09 0,27 0,09 0, , ,060 0,265 0,165 0, , ,070 0,267 0,183 0, ,34 0,42 0,13 0,100 0,335 0,425 0,125 0,093 0,337 0,423 0, ,007 0,05 0,10 0,11 0,17 0,13 0,07 0,06 0, , ,055 0,130 0,105 0,095 0,095 0, ,053 0,107 0,077 0,117 0, ,10 0,34 0,30 0,14 0,06 0,390 0, ,113 0,374 0, M mężczyzna / male; F kobieta / female; C łącznie / total Wyniki Częstość alleli i parametry statystyczne obliczone w populacji Polski północnej dla 4 mikrosatelitarnych markerów chromosomu X przedstawiono w tabeli 2. Częstość alleli każdego locus obliczano oddzielnie dla kobiet i dla mężczyzn. We wszystkich analizowanych loci nie stwierdzono istotnych różnic statystycznych w rozkładach częstości alleli między grupami kobiet i mężczyzn (0,4 < p < 0,9). Na rycinie 2 przedstawiono wyniki elektroforegramów w 2 przykładowych próbkach DNA kobiety i mężczyzny. W analizowanym materiale, w żadnym locus nie obserwowano przypadków mutacji.

4 Badanie polimorfizmu 4 loci STR chromosomu X w populacji Polski północnej 173 a) miejsc genowych chromosomu X: 2 markerów o trójnukleotydowych powtórzeniach: DXS101 i DXS8377 oraz 2 o czteronukleotydowych jednostkach repetytywnych: HPRTB i DXS7423. Na podstawie uzyskanych wyników obliczono parametry statystyczne i wykazano wysoką przydatność loci STR-X w medycynie sądowej zarówno w dochodzeniu ojcostwa, jak i w badaniach identyfikacyjnych, co przedstawiono w tabeli 3. T a b e l a 3. Parametry statystyczne charakteryzujące badany multipleks T a b l e 3. Statistical parameters of investigated multiplex Locus H o PD F PD M MEC DXS101 DXS7423 DXS8377 HPRTB 0,897 0,758 0,930 0,720 0,959 0,846 0,981 0,875 0,848 0,684 0,907 0,760 0,853 0,727 0,902 0,751 b) H O heterozygotyczność obserwowana / observed heterozygosity; PD F siła dyskryminacji u kobiet / power of discriminating females; PD M siła dyskryminacji u mężczyzn / power of discriminating males; MEC teoretyczna szansa wykluczenia / theoretical chance of exclusion Powyższe parametry, a szczególnie wysoka wartość siły dyskryminacji, mieszcząca się w granicach 0,6840,981, a także wysoki stopień heterozygotyczności: 0,7200,930, wskazują na dużą przydatność badanych loci w praktyce laboratoryjnej. Wnioski Ryc. 2. Elektroforegramy badanego multipleksu STR-X: (a) heterozygotyczna próbka DNA kobiety w: DXS101 (FAM), DXS7432 (), DXS8377 () i HPRTB (); (b) hemizygotyczna próbka DNA mężczyzny w: DXS101 (FAM), DXS7432 (), DXS8377 () i HPRTB () Fig. 2. Electrophoregrams of the multiplex assays: (a) heterozygotic female with the STRs DXS101 (FAM), DXS7432 (), DXS8377 () and HPRTB (); (b) hemizygotic male for DXS101 (FAM), DXS7432 (), DXS8377 () and HPRTB () Dyskusja W pracy zastosowano stosunkowo prostą metodę równoczesnego określenia alleli 4 loci chromosomu X. W praktyce laboratoryjnej dostępne są komercyjne zestawy dla kompleksowej reakcji PCR kilku loci tego chromosomu. Autorzy niniejszej pracy w typowaniu alleli STR-X, w oparciu o dane z piśmiennictwa [7, 8, 9, 10], sporządzili własny zestaw umożliwiający jednoczesną amplifikację interesujących W oparciu o wyniki badań sformułowano następujące wnioski: 1. Zastosowana w pracy metoda kompleksowej reakcji PCR wykazała korzystne zróżnicowanie w zakresie 4 mikrosatelitarnych markerów chromosomu X. 2. Analizowana populacja pozostaje w równowadze z prawem HardyWeinberga, w żadnym loci nie wykryto mutacji. 3. Wykazane częstości alleli poszczególnych loci nie odbiegają od wykazanych w innych populacjach europejskich. 4. Obliczone parametry statystyczne wskazują na przydatność zastosowanego multipleksu w praktyce sądowej, szczególnie wówczas, gdy markery autosomalne nie dostarczają jednoznacznych informacji w ustaleniu pokrewieństwa. Piśmiennictwo 1. Lahiri D.K., Bye S., Nurnberg J.I., Hodes M.E., Crisp M. : A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested. J. Biochem. Biophys. Methods, 1992, 25, Szibor R., Edelmann J., Hering S., Plate I., Wittig H., Roewer L. et al. : Cell line DNA typing in forensic genetics the necessity of reliable standards. Forensic Sci. Int. 2003, 138, 3743.

5 174 LIDIA CYBULSKA, EWA KAPIŃSKA, JOANNA WYSOCKA, KRZYSZTOF RĘBAŁA, ZOFIA SZCZERKOWSKA 3. Rębała K., Szczerkowska Z. : Identyfikacja bardzo krótkiego allela YCAII w populacji północnej Polski. Arch. Med. Sądowej Kryminol. 2004, 54, Lincoln P.J. : DNA recommendations further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems. Forensic Sci. Int. 1997, 87, Desmarais D., Zhong Y., Chakraborty R., Perreault C., Busque L. : Development of a highly polymorphic STR marker for identity testing purposes at the human androgen receptor gene (HUMARA). J. Forensic Sci. 1998, 43, Szibor R., Krawczak M., Hering S., Edelman J., Kuhlisch E., Krause D. : Use of X-linked markers for forensic purposes. Int. J. Legal Med. 2003, 117, Toni Ch., Presciuttini S., Spinetti I., Domenici R. : Population data of four X-chromosome markers in Tuscany, and their use in a deficiency paternity case. Forensic Sci. Int. 2003, 137, Zarrabeitia M.T., Amigo T., Sanudo C., Zarrabeitia A., Gonzalez-Lamuno D., Rancho J.A.: A new pentaplex system to study short tandem repeat marker of forensic interest on X chromosome. Forensic Sci. Int. 2002, 129, Edelman J., Szibor R. : DXS101: a highly polymorphic X-linked STR. Int. J. Legal Med. 2001, 114, Edelmann J., Deichsel D., Hering S., Plate I., Szibor R. : Sequence variation and allele nomenclature for the X-linked STRs DXS9895, DXS8378, DXS7132, DXS6800, DXS7133, GATA172D05, DXS7423 and DXS8377. Forensic Sci. Int. 2002, 129, Komentarz Przedstawiona praca należy do klasycznych opracowań metodyczno-epidemioloigicznych, charakterystycznych dla współczesnej hemogenetyki. Autorzy podjęli próbę oceny częstości występowania alleli 4 loci STR specyficznych dla ludzkiego chromosomu X w badaniach populacyjnych dla ludności Polski północnej. Przedstawiono własną modyfikację metody amplifikacji oraz przygotowano bazę dancyh dotyczących badanych parametrów. Jednakże, jak się wydaje, dane oparte o badania 200 pacjentów są niewystarczające dla szerszego wnioskowania. dr hab. n. med. Krzysztof Borowiak