AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH. Krystyna Skalicka - Woźniak

Transkrypt

1 ZAŁĄCZNIK 2 AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH Krystyna Skalicka - Woźniak Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej Uniwersytet Medyczny w Lublinie Lublin 2015

2 2

3 SPIS TREŚCI I. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe 4 II. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 4 III. Osiągnięcia wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) 5 a) tytuł osiągnięcia naukowego 5 b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa 5 c) omówienie celu naukowego i osiągniętych wyników 8 IV. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych 32 a) osiągnięcia naukowo-badawcze przed uzyskaniem stopnia doktora nauk farmaceutycznych 32 b) osiągnięcia naukowo-badawcze po uzyskaniu stopnia doktora nauk farmaceutycznych 34 c) współpraca z jednostkami naukowymi w kraju i za granicą 44 d) kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi oraz udział w takich projektach 46 e) międzynarodowe i krajowe nagrody oraz odznaczenia związane z działalnością naukową 47 f) recenzowanie publikacji w czasopismach międzynarodowych i krajowych 47 g) staże w zagranicznych lub krajowych ośrodkach naukowych lub akademickich 48 h) promotorstwo i opieka nad naukowymi pracami studenckimi 48 i) bibliometryczne podsumowanie osiągnięć naukowych 48 3

4 I. POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE stopień magistra farmacji z wyróżnieniem, Akademia Medyczna w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej. Praca magisterska wykonana w Katedrze i Zakładzie Botaniki Farmaceutycznej. Tytuł pracy Analiza flawonoidów w liściach Rosa eglanteria L. Promotor: dr Renata Nowak 2002 Prawo wykonywania zawodu farmaceuty wydane przez Lubelską Okręgową Izbę Aptekarską stopień doktora nauk farmaceutycznych z wyróżnieniem, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej. Praca wykonana w Katedrze i Zakładzie Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych. Tytuł pracy Badania związków biologicznie czynnych w owocach Peucedanum alsaticum L. i Peucedanum cervaria (L.) Lap. Promotor: Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak praca nagrodzona Nagrodą Prezesa Rady Ministrów w roku ukończone z wynikiem bardzo dobrym menadżerskie studia podyplomowe dla sektora B+R Kompetencje dla Współpracy Nauki i Biznesu. Polska Fundacja Ośrodków Wspomagania Rozwoju Gospodarczego OIC Poland. Projekt współfinansowany przez UE w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Pozostałe posiadane dyplomy oraz świadectwa ukończenia specjalistycznych szkoleń przedstawione są w Załączniku 7, pkt. III q. II. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH asystent w Katedrze i Zakładzie Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2009 do chwili obecnej adiunkt w Katedrze i Zakładzie Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2010 do chwili obecnej kierownik Pracowni Roślin Leczniczych przy Katedrze i Zakładzie Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 4

5 III. OSIĄGNIĘCIA WYNIKAJĄCE Z ART. 16 UST. 2 USTAWY Z DN. 14 MARCA 2003 R. O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ.U. NR 65, POZ. 595 ZE ZM.) a) tytuł osiągnięcia naukowego Optymalizacja wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej do izolacji kumaryn i terpenoidów oraz badanie aktywności biologicznych kumaryn Uzyskane osiągnięcia naukowe stanowiące podstawę habilitacji zostały przedstawione w monotematycznym cyklu ośmiu prac (7 prac oryginalnych i jedna praca przeglądowa) i jednego rozdziału w książce międzynarodowej, opublikowanych w latach Łączny współczynnik oddziaływania (IF) wymienionych prac wynosi: , łączna punktacja KBN/MNiSW wynosi: 200 pkt. b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa H.1. J.J. ŁUSZCZKI, M. ANDRES-MACH, M. GLENSK, K. SKALICKA-WOŹNIAK: Anticonvulsant effects of four linear furanocoumarins, bergapten, imperatorin, oxypeucedanin, and xanthotoxin, in the mouse maximal electroshock-induced seizure model: a comparative study. Pharmacol. Rep., 2010, 62, (IF=2.50; KBN/MNiSW=20) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem współautorem koncepcji pracy, wykonałam izolację imperatoryny i bergaptenu do dalszych badań, wraz z oznaczeniem ich czystości, uczestniczyłam w badaniach farmakologicznych, opracowaniu wyników i przygotowaniu manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 40%. H.2. K. SKALICKA-WOŹNIAK, K. GŁOWNIAK: Pressurized liquid extraction of coumarins from fruits of Heracleum leskowii with application of solvents with different polarity under increasing temperature. Molecules, 2012, 17, (IF=2.428; KBN/MNiSW=25) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem autorem koncepcji pracy, zaplanowałam doświadczenia, wykonałam procedury ekstrakcyjne, zoptymalizowałam warunki rozdzielenia, wykonałam oznaczenia ilościowe, opracowałam wyniki, zredagowałam pracę i przygotowałam ją do druku (autor do korespondencji). Mój udział procentowy szacuję na 90%. H.3. K. SKALICKA-WOŹNIAK, M. WALASEK, A. LUDWICZUK, K. GŁOWNIAK: Isolation of terpenoids from Pimpinella anisum essential oil by high-performance counter-current chromatography. J. Sep. Sci., 2013, 36, (IF=2.594; KBN/MNiSW=30) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem autorem koncepcji pracy, zoptymalizowałam metodę izolacji i opracowałam wyniki, brałam udział w interpretacji i opracowaniu wyników metodą GC- MS, przygotowałam manuskrypt do publikacji (autor do korespondencji). Mój udział procentowy szacuję na 70%. 5

6 H.4. M. KIEŁBUS, K. SKALICKA-WOŹNIAK, A. GRABARSKA, W. JELENIEWICZ, M. DMOSZYNSKA-GRANICZKA, A. MARSTON, K. POLBERG, P. GAWDA, J. KLATKA, A. STEPULAK: 7-substituted coumarins inhibit proliferation and migration of laryngeal cancer cells in vitro. Anticancer Res., 2013, 33, (IF=1.872; KBN/MNiSW=20) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem współautorem koncepcji pracy, zoptymalizowałam i przeprowadziłam izolację umbeliferonu metodą wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej, uczestniczyłam w badaniach farmakologicznych, opracowaniu wyników. Mój udział procentowy szacuję na 30%. H.5. K. SKALICKA-WOŹNIAK, M. WALASEK: Preparative separation of menthol and pulegone from peppermint oil (Mentha piperita L.) by high-performance counter-current chromatography. Phytochem. Lett., 2014, 10, (IF=1.542; KBN/MNiSW=20) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem autorem koncepcji pracy, zaplanowałam doświadczenia, brałam udział w procedurze izolacji i interpretacji GC-MS, opracowałam wyniki, zredagowałam pracę i przygotowałam ją do druku (autor do korespondencji). Mój udział procentowy szacuję na 80%. H.6. K. SKALICKA-WOŹNIAK, M. ZAGAJA, K. GŁOWNIAK, J.J. LUSZCZKI: Purification and anticonvulsant activity of xanthotoxin (8-methoxypsoralen). Centr. Eur. J. Biol., 2014, 9, (IF=0.633; KBN/MNiSW=15) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem współautorem koncepcji pracy, zoptymalizowałam metodę wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej do izolacji ksantotoksyny, przeprowadziłam analizę, uczestniczyłam w badaniach farmakologicznych, opracowaniu wyników, przygotowałam manuskrypt do publikacji (autor do korespondencji). Mój udział procentowy szacuję na 80%. H.7. K. SKALICKA-WOŹNIAK, I. GARRARD: Counter-current chromatography for the separation of terpenoids: a comprehensive review with respect to the solvent systems employed. Phytochemistry Rev., 2014, 13, (IF=2.894; KBN/MNiSW=35) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem autorem koncepcji pracy, opracowałam tabele, wybrałam odpowiednie pozycje literaturowe, współtworzyłam manuskrypt do publikacji (autor do korespondencji). Mój udział procentowy szacuję na 80%. H.8. K. SKALICKA-WOŹNIAK, T. MROCZEK, E. KOZIOŁ: High-performance countercurrent chromatography separation of Peucedanum cervaria fruit extract for the isolation of rare coumarin derivatives. J. Sep. Sci., 2015, 38, (IF=2.594; KBN/MNiSW=30) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem autorem koncepcji pracy, zaplanowałam doświadczenia, wykonałam izolację związków, opracowałam wyniki, zredagowałam pracę i przygotowałam ją do druku (autor do korespondencji). Mój udział procentowy szacuję na 65%. 6

7 H.9. K. SKALICKA-WOŹNIAK, K. GŁOWNIAK: Coumarins analytical and preparative techniques. W: Handbook of Chemical and Biological Plant Analytical Methods [Red.] K. Hostettmann, Chichester, United Kingdom, 2014, John Wiley & Sons Limited, (KBN/MNiSW=5) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na tym, iż jestem autorem koncepcji pracy, zebrałam literaturę, opracowałam i przygotowałam rozdział do druku. Mój udział procentowy szacuję na 90%. Ponadto, wyniki badań wchodzące w skład ww. cyklu zaprezentowałam na konferencjach naukowych zagranicznych i krajowych w postaci wykładów na zaproszenie i wystąpień referatowych wymienionych poniżej oraz w postaci posterów. Wygłoszone wykłady oraz referaty W.1. K. SKALICKA-WOŹNIAK. High-performance counter-current chromatography in separation of coumarins. Pharmacological activity of purified compounds. Nieformalne Spotkanie Komitetu ds. Produktów Leczniczych Roślinnych Europejskiej Agencji Leków. Kraków, Poland, wykład plenarny W.2. K. GŁOWNIAK, J. ŁUSZCZKI, K. SKALICKA-WOŹNIAK. Research and application of medicinal plants in phytotherapy. XVIII th International Congress of the Polish Pharmacological Society. Kazimierz Dolny, Poland, Pharm. Rep., 2013, 56, s. 12 wykład plenarny W.3. K. SKALICKA-WOŹNIAK, K. GŁOWNIAK. Counter-current chromatography in separation of active compounds. International Conference on Natural Products Utilization: from plants to pharmacy shelf. Bansko, Bulgaria , s. 30 wykład plenarny W.4. K. GŁOWNIAK, K. SKALICKA-WOŹNIAK. Application of counter-current chromatography for the isolation of coumarins from Polish medicinal plants from the Apiaceae family. The First Mediterranean Symposium on Medicinal and Aromatic Plants (MESMAP-2013). Gazimagosa, Turkish Republic of Northern Cyprus, wykład plenarny W.5. K. SKALICKA-WOŹNIAK, J. ŁUSZCZKI, K. GŁOWNIAK. Zastosowanie chromatografii przeciwprądowej w izolacji substancji aktywnych biologicznie. XXII Naukowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego: Farmacja - nauka - społeczeństwo. Białystok, , s. 355 prezentacja ustna w języku polskim W.6. K. SKALICKA-WOŹNIAK, K. GŁOWNIAK. Chromatografia przeciwprądowa w izolacji związków aktywnych z ekstraktów roślinnych. X Konferencja Chromatograficzna "Chromatografia - niezbędne narzędzie w nauce i technice". Lublin, , s wykład plenarny w języku polskim 7

8 Badania naukowe, opisane w wymienionych publikacjach, prowadziłam w oparciu o środki finansowe uzyskane z Uniwersytetu Medycznego w Lublinie (działalność statutowa) oraz grantu z Narodowego Centrum Nauki N N Podczas realizacji ww. badań wykorzystywałam aparaturę naukową otrzymaną w ramach projektu finansowanego ze środków Unii Europejskiej (Europejskiego Funduszu Społecznego), zatytułowanego: "Wyposażenie innowacyjnych laboratoriów prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymi w terapii chorób cywilizacyjnych i nowotworowych" w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej Oś priorytetowa I. Nowoczesna Gospodarka. Działanie I.3. Wspieranie Innowacji. c) omówienie celu naukowego i osiągniętych wyników 1. CEL NAUKOWO - BADAWCZY Nadrzędnym celem badań, prowadzonych przeze mnie w ciągu ostatnich kilku lat, było zastosowanie wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej do izolacji substancji aktywnych biologicznie z materiału roślinnego. Badania dotyczyły dwóch grup metabolitów wtórnych: kumaryn, które pozyskiwałam z roślin z rodziny Apiaceae oraz terpenoidów, izolowanych z olejków eterycznych otrzymywanych z dwóch gatunków roślin z rodziny Apiaceae i Lamiaceae. Moje zainteresowania naukowe skrystalizowały się w toku przygotowania pracy doktorskiej, kiedy to poszukiwałam wydajnych i efektywnych metod do izolacji kumaryn. Już wtedy zauważyłam wyraźną potrzebę nie tylko kompleksowej optymalizacji nowoczesnych metod ekstrakcji tej grupy związków, ze szczególnym uwzględnieniem ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikami - ASE), ale przede wszystkim zastosowania bardziej wydajnych technik separacyjnych, które z łatwością przełożone mogą być ze skali laboratoryjnej na przemysłową. Techniką taką jest niewątpliwie chromatografia przeciwprądowa. Swoje pierwsze doświadczenia związane z jej zastosowaniem zdobywałam w wiodącym ośrodku naukowym na świecie: Brunel Institute of Bioengineering, Uniwersytet Brunel w Londynie. Zdobyłam tam nie tylko niezbędną teoretyczną wiedzę dotyczącą samej techniki, ale przede wszystkim doświadczenie w jej zastosowaniu praktycznym. Zachęciło mnie to do aplikowania o grant naukowy, jaki pozyskałam w roku 2010 (projekt NCN, N N ). Celem projektu było zastosowanie chromatografii przeciwprądowej w izolacji kumaryn i określenie ich aktywności przeciwdrgawkowej. Wtedy też, ze środków pochodzących na realizację projektu, zakupiłam jedyny jak dotąd w Polsce wysokosprawny chromatograf przeciwprądowy Spectrum HPCCC, Dynamic Extractions Ltd. Aparat ten następnie wykorzystałam do realizacji zamierzonego celu, jakim było opracowanie efektywnych procedur izolacji substancji czynnych z roślin, w ilościach wystarczających do 8

9 prowadzenia dalszych badań farmakologicznych określających kierunki ich aktywności, ze szczególnym uwzględnieniem działania przeciwpadaczkowego kumaryn. Jak wiadomo kumaryny są związkami o szerokim zakresie aktywności biologicznych. Istnieje wiele badań potwierdzających ich wielokierunkowe działanie, także na centralny układ nerwowy. Doniesienia literaturowe dotyczące aktywności przeciwdrgawkowej imperatoryny wyraźnie wskazywały na jej ogromny potencjał terapeutyczny. Związek ten wykazywał silną aktywność przy niskich dawkach oraz duży synergizm działania z tradycyjnymi lekami przeciwpadaczkowymi, przy czym był pozbawiony działań niepożądanych. Interesującym dla mnie zagadnieniem było dalsze przebadanie analogów strukturalnych furanokumaryn, celem poznania zależności jaka istnieje pomiędzy strukturą chemiczną związków a siłą ich działania. Wiele jest także przesłanek potwierdzających działanie przeciwnowotworowe kumaryn. Tutaj uwagę swoją zwróciłam w kierunku kumaryn prostych. Z danych literaturowych wynika, iż kumaryny proste podstawione w pozycji C 7 wykazują działanie hamujące proliferację komórek nowotworowych w kulturach in vitro. Moim celem była więc ocena wpływu zarówno umbeliferonu (7-hydroksykumaryna), jak i jego analogów: skoparonu (6,7- dimetoksykumaryna) i herniaryny (7-metoksykumaryna), na proliferacje komórek raka krtani - jednego z częściej występujących typów raka u ludzi na świecie o ogromnym potencjale przerzutowym. Zaplanowane przeze mnie i przeprowadzone badania miały charakter badań z zakresu analizy fitochemicznej związków czynnych z grupy kumaryn i terpenoidów oraz badań wybranych obszarów aktywności biologicznych kumaryn. Badania fitochemiczne dotyczyły: optymalizacji metody przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikami w izolacji kumaryn z roślin z rodziny Apiaceae wraz z doborem optymalnych warunków rozdzielenia metodą HPLC (H.2.; H.9.) optymalizacji procesów izolacji kumaryn z roślin z rodziny Apiaceae, występujących w ekstraktach zarówno jako związki dominujące, jak i związki występujące w niewielkich ilościach, z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej (H.4.; H.6.; H.8.) oceny możliwości zastosowania techniki wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej do szybkiej i efektywnej izolacji teprenoidów z olejków eterycznych (olejki: anyżowy oraz miętowy) (H.3.; H.5.; H.7.) Badania biologiczne obejmowały: badanie aktywności przeciwpadaczkowych kumaryn (H.1.; H.6.) badanie aktywności cytostatycznych i przeciwnowotworowych kumaryn (H.4.) 9

10 2. WPROWADZENIE W TEMATYKĘ BADAWCZĄ Z uwagi na to, iż chromatografia przeciwprądowa jak dotąd jest techniką mało w Polsce rozpowszechnioną, zanim dokładniej przedstawię opublikowane wyniki moich badań naukowych, chciałabym na wstępie przybliżyć jej podstawy teoretyczne oraz szereg zalet, które sprawiły, iż do dnia dzisiejszego metoda ta zachęca mnie do kontynuowania badań w tym zakresie Podstawy teoretyczne Chromatografia przeciwprądowa (CCC, counter-current chromatography) jest formą ekstrakcji typu ciecz-ciecz, gdzie zarówno faza stacjonarna jak i ruchoma, są fazami ciekłymi. Ponieważ nie ma tutaj fazy stałej, retencja związków zależy wyłącznie od ich współczynnika podziału i rozpuszczalności (Garrad, 2005). Związki rozdzielane z mieszaniny eluują z kolumny zgodnie z ich współczynnikiem podziału K D, który definiowany jest jako stosunek zawartości danej substancji w fazie stacjonarnej do jej zawartości w fazie ruchomej. Substancje mające większe powinowactwo do fazy ruchomej (niska wartość K D) wymywane są wcześniej, podczas gdy te o powinowactwie większym do fazy stacjonarnej (wysoka wartość K D) eluują później. Czas retencji związku możliwy jest do wyliczenia z zastosowaniem prostych obliczeń matematycznych (Guzlek i wsp., 2010). Obecnie wyróżnić możemy dwa rodzaje ekstrakcji typu ciecz - ciecz: chromatografię podziałową pola odśrodkowego (centrifugal partition chromatography, CPC) oraz chromatografię przeciwprądową CCC. Pierwsza wykorzystuje stałe pole grawitacyjne wytworzone przez obrót wokół jednej osi. Separacja odbywa się w tzw. kartridżach lub dyskach, a w całym systemie panuje układ równowagi hydrostatycznej. Druga natomiast oparta jest na zmiennym polu grawitacyjnym wytworzonym przez ruch obrotowy wokół dwóch osi rotacji (ruch planetarny). Tutaj, do zatrzymania na kolumnie ciekłej fazy stacjonarnej wykorzystane są zarówno siła odśrodkowa, jak i grawitacyjna. Druga, niemieszająca się z pierwszą faza ciekła, będąca fazą ruchomą, przepuszczana jest przez kolumnę wchodząc w kontakt z fazą stacjonarną (Garrad, 2005; Marston i Hostettmann, 2006). W chromatografii przeciwprądowej wykorzystuje się długie kolumny wykonane z Teflonu (politetrafluoroetylen), spiralnie i wielowarstwowo owinięte na bębnie, który obraca się zarówno wokół własnej osi, jak i wokół osi centralnej, ze stałą prędkością kątową (Rys. 1). Tak wywołany ruch, zwany ruchem planetarnym, zapewnia występowanie przemiennych stref mieszania i osiadania na całej długości kolumny (Sutherland i wsp., 2000; Ito, 2005). Ruch planetarny powoduje powstanie ruchu hydrodynamicznego układu dwufazowego wewnątrz wirującej, wielowarstwowej kolumny. 10

11 A) B) Rys. 1. Ruch planetarny, jaki wykonuje kolumna wielokrotnie nawinięta na rotor A) (Ito, 2005). B) (Sutherland i wsp., 2000). Kolumna najpierw wypełniana jest ciekłą fazą stacjonarną, a następnie wprawiana jest w ruch. Po osiągnieciu żądanej prędkości obrotowej na kolumnę wprowadzana jest faza ruchoma. Ze względu na różnicę gęstości między fazą ruchomą i stacjonarną, faza ruchoma wędruje w kierunku wylotu kolumny, wypierając pewną ilość fazy stacjonarnej. Równowaga hydrodynamiczna układu osiągnięta jest w momencie, gdy nie obserwuje się już dalszego wycieku fazy stacjonarnej. Kolumna obraca się wokół własnej osi, a także wokół osi centralnej, wykonując ruch planetarny. Siła odśrodkowa wytworzona przez ten obrót ułatwia utrzymanie ciekłej fazy stacjonarnej wewnątrz kolumny, podczas gdy faza ruchoma nieustannie przez nią przepływa. Stosunek przyspieszenia dośrodkowego promienia rotora do przyciągania ziemskiego (g=9.81ms -2 ) określana jest jako wartość g (Guzlek i wsp., 2010). Popularne szybkie chromatografy typu HSCCC wytwarzają średnią wartość ok. 80g, podczas gdy nowoczesne wysokosprawne chromatografy typu HPCCC generują wartość średnią ok 240g. 11

12 Dzięki temu możliwe jest zastosowanie kolumn o większej średnicy i zatrzymanie większej objętości fazy stacjonarnej na kolumnie, a co za tym idzie znaczne polepszenie parametrów separacji i wyraźne skrócenie czasu analizy. Szybka chromatografia przeciwprądowa (high-speed counter-current chromatography HSCCC), wprowadzona na rynek na początku lat 80., początkowo była ignorowana, głównie ze względu na bardzo długi czas potrzebny do izolacji związków oraz zawodność dostępnej aparatury. Wiele wysiłku włożono w to, by stworzyć chromatograf umożliwiający usprawnienie opracowanej metody, którą równie szybko, co powtarzalnie przenieść można na większą skalę. Obecnie, obok chromatografów typu HSCCC dostępne są także wysokosprawne chromatografy typu HPCCC (high-performance counter-current chromatography) pozwalające na diametralne skrócenie czasu izolacji z kilku godzin nawet do 20 minut. Z uwagi na szeroki wybór dostępnych aparatów i kolumn możliwe jest prowadzenie analiz zarówno w skali analitycznej, jak również półpreparatywnej i preparatywnej. Komercyjnie dostępne są także aparaty przeznaczone do izolacji na skalę przemysłową Zalety chromatografii przeciwprądowej Brak adsorbentu niweluje ryzyko jakim jest adsorpcja nieodwracalna. Przy stosowaniu klasycznego frakcjonowania ekstraktu z użyciem fazy stałej np. żelu krzemionkowego, część związków nieodwracalnie wiąże się z sorbentem lub w kontakcie z fazą stałą może ulec denaturacji, hydrolizie lub zmienić konfigurację (Sutherland i wsp., 1998). Chromatografia przeciwprądowa zapewnia też większą powierzchnię aktywnej fazy stacjonarnej. W kolumnie wypełnionej adsorbentem (np. kolumna do HPLC) znaczną część objętości zajmuje szkielet złoża, co fizycznie ogranicza ilość wprowadzanej aktywnej fazy stacjonarnej i wpływa na jakość separacji (Ito, 2005). Możliwość niemal całkowitego odzyskania zadozowanej próbki (Ito, 2005). Możliwość prowadzenia analiz zarówno w normalnym, jak też odwróconym układzie faz (Hostettmann i Marston, 2001). Ekonomiczność metody. Wykorzystywane rozpuszczalniki nie muszą być wysokiej czystości, jak się to ma w przypadku HPLC, aparaturę cechuje także długa żywotność i stosunkowo mała awaryjność (Marston i Hostettmann, 2006). Selektywność i powtarzalność metody dającej możliwość rozdzielenia związków, które w przypadku chromatografii ciało stałe-ciecz posiadają podobne czasy retencji (Marston i Hostettmann, 2006). 12

13 Brak konieczności wcześniejszego oczyszczania próbki. Istnieje możliwość zadozowania surowego, nieoczyszczonego ekstraktu. Możliwość przeniesienia optymalnych warunków separacji ze skali analitycznej na skalę preparatywną czy przemysłową. Możliwe jest rozdzielenie związków w tym samym czasie, z zachowaniem tej samej rozdzielczości, kiedy zarówno objętość kolumny, jak i prędkość przepływu fazy ruchomej zwiększymy nawet 850 razy (Wood i wsp., 2007). Istnieje szereg parametrów wpływających na właściwą separację w chromatografii przeciwprądowej. Najważniejszym krokiem jest dobór odpowiedniego układu dwufazowego, zapewniającego właściwe rozdzielenie analitów. Zazwyczaj stosuje się mieszaniny kilku rozpuszczalników o różnej polarności, co teoretycznie umożliwia dobór odpowiedniego układu, pozwalającego na izolację interesującego związku. Ponieważ kombinacji takich jest nieskończenie wiele, poszukiwanie optymalnego układu jest procesem długotrwałym i opartym na tzw. metodzie prób i błędów (Garrard, 2005). Bardzo ważna jest retencja fazy stacjonarnej na kolumnie. Im więcej fazy stacjonarnej zatrzymanej jest na kolumnie, tym lepsze jest rozdzielenie związków. W znacznej mierze parametr ten zależny jest od tego, jak szybko po zmieszaniu wybranych rozpuszczalników układ osiągnie stan równowagi i uformują się dwie niemieszające się warstwy. Istotna jest także szybkość przepływu fazy ruchomej oraz szybkość obrotów rotora. Wraz ze wzrostem szybkości przepływu fazy ruchomej ilość fazy stacjonarnej na kolumnie maleje liniowo, a to prowadzić może do pogorszenia się rozdzielania. Mniejsza szybkość przepływu zapewnia lepszą retencję fazy stacjonarnej na kolumnie i lepsze rozdzielenie pików, jednak przy dłuższym czasie analizy. Zbyt niska prędkość obrotów rotora sprawia, że na kolumnie zatrzymana jest mała ilość fazy stacjonarnej, a co za tym idzie obniża się rozdzielczość pików. Z drugiej strony zbyt wysoka prędkość obrotów prowadzi do nadmiernego poszerzenia pików, co wynika z nadmiernej pulsacji w kolumnie będącej efektem zbyt wysokiego ciśnienia. Ważne są także inne czynniki: lepkość fazy ruchomej, różnica gęstości między fazami układu dwufazowego, parametry aparatu, takie jak wartość siły odśrodkowej, promienia obrotu, długość i objętość kolumny. Objętość dozowanej próbki nie powinna przekraczać 5% całkowitej pojemności kolumny. Zbyt duża ilość skutkować będzie wyraźnym pogorszeniem rozdzielenia związków (Wood i wsp., 2003; Ito, 2005). 3. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ 3.1. Optymalizacja warunków ekstrakcji kumaryn Zanim podjęłam się wykorzystania omówionej techniki do izolacji związków o charakterze kumaryn, postanowiłam rozpocząć swoje badania od doboru optymalnych warunków do ich ekstrakcji z matrycy roślinnej. Dobór odpowiednich metod ekstrakcji jest 13

14 niezwykle ważnym zagadnieniem w fitochemii. Odpowiednio dobrana metoda gwarantuje maksymalny odzysk badanych substancji aktywnych w możliwie krótkim czasie i przy niskich nakładach finansowych. Przez lata metodą z wyboru do izolacji kumaryn z materiału roślinnego była tradycyjna ekstrakcja w aparacie Soxhleta, a stosowanym rozpuszczalnikiem - eter naftowy (Głowniak, 1988). Pewne modyfikacje, jak np. niewielki dodatek modyfikatora organicznego np.: eter naftowy + dichlorometan (7:3), pozwolił na znaczne obniżenie czasu ekstrakcji (Wolski i wsp., 1997). Prowadzono też próby wyodrębniania pochodnych kumaryn z zastosowaniem metanolu oraz roztworów wodnych metanolu (Bourgaud i wsp., 1994; Govindarajan i wsp., 2007). Ekstrakcja metodą Soxhleta, wprowadzona pod koniec XIX wieku, jest nadal w wielu laboratoriach najczęściej stosowaną metodą ekstrakcji ciecz ciało stałe. Często jest techniką wiodącą, do której porównywane są inne, nowe technologie ekstrakcyjne (Luque de Castro i Garcia-Ayuso, 1998). Metoda wymaga użycia dużej ilości rozpuszczalników organicznych, a wyczerpująca ekstrakcja prowadzona jest przez bardzo długi czas. Pojawiła się więc konieczność zbadania wpływu nowoczesnych metod ekstrakcyjnych na odzysk pochodnych kumaryn. Szeroko zakrojone badania mające na celu wybór najodpowiedniejszej metody ekstrakcji zespołu furanokumaryn zainicjowane zostały przez Waksmundzką-Hajnos i wsp. (2004a, 2004b). Celem izolacji kompleksu pochodnych kumaryn z owoców pasternaku zastosowali oni eter naftowy, jako rozpuszczalnik podstawowy, potem jednak, do izolacji bardziej hydrofobowych kumaryn i pozostałości furanokumaryn, ten sam materiał roślinny poddano ekstrakcji metanolem (Waksmundzka-Hajnos i wsp., 2004b). Przebadano trzy różne techniki ekstrakcyjne: tradycyjną metodę ekstrakcji w aparacie Soxhleta, ciśnieniową ekstrakcję cieczową (przyspieszoną ekstrakcję rozpuszczalnikami - ASE) oraz ekstrakcję wspomaganą ultradźwiękami. W przypadku zastosowania ekstrakcji wspomaganej mikrofalami (MAE) użyto 80% r-r metanolu. Wykazano, iż ciśnieniowa ekstrakcja cieczowa była techniką zdecydowanie efektywniejszą od metody Soxhleta dla większości badanych furanokumaryn (wyjątek ksantotoksyna) i dawała najlepsze odzyski bardziej hydrofobowych związków jak bergapten, imperatoryna i felopteryna. Metoda ASE była także najwydajniejsza w przypadku ekstrakcji bergaptenu, izopimpineliny i imperatoryny z owoców Angelica officinalis (Waksmundzka-Hajnos i wsp., 2004a). Metoda ASE jest obecnie jedną z najpopularniejszych technik stosowanych w ekstrakcji różnorodnych związków, nie tylko z matrycy roślinnej (Runnqvist i wsp., 2010). W porównaniu do klasycznej ekstrakcji w aparacie Soxhleta, wyczerpująca ekstrakcja osiągnięta może być w dużo krótszym czasie, przy użyciu niewielkiej ilości rozpuszczalników i ich zdecydowanie lepszej penetracji w głąb matrycy. Pierwszym celem mojej pracy był więc dobór optymalnych warunków ekstrakcji metodą ASE, w tym dobór odpowiedniego rozpuszczalnika, który przy optymalnej temperaturze ekstrakcji zapewni najlepszy odzysk związków kumarynowych. Dotychczas brak było 14

15 podobnych kompleksowych badań. Jako matrycę roślinną wybrałam owoce Heracleum leskowii Grossh. (Apiaceae), które, jak pokazały moje wcześniejsze badania, zawierają szereg kumaryn o zróżnicowanej polarności. Zastosowałam rozpuszczalniki o różnej polarności: typowe dla ekstrakcji furanokumaryn czyli eter naftowy, ale też dichlorometan i metanol. Ekstrakcje prowadziłam w różnych temperaturach: 80, 90, 100 i 110 C przy ciśnieniu 100 barów i czasie statycznym 10 minut. Dodatkowo zaproponowałam metodę HPLC w układzie gradientowym metanol woda, którą oceniłam pod kątem selektywności, liniowości, dokładności i powtarzalności, osiągając bardzo dobre parametry. Największą wydajność ekstrakcji dla umbeliferonu, angelicyny i ksantotoksyny zaobserwowałam po zastosowaniu metanolu jako ekstrahenta. Był on także generalnie nieznacznie lepszy do izolacji bergaptenu (główny związek) i izopimpineliny, jednak i tak największy odzysk obu związków zanotowałam po zastosowaniu dichlorometanu w temp. 110 C. Imperatoryna i izopimperatoryna bardzo dobrze ekstrahowane były metanolem, jednak nieznacznie lepsze wyniki osiągnęłam po zastosowaniu dichlorometanu. Zdecydowanie najgorszym ekstrahentem był popularnie stosowany eter naftowy (H.2.). Kolejnym etapem moich badań było określenie właściwej temperatury ekstrakcji, co w przypadku ASE jest niezwykle ważne, gdyż wyraźnie wpływa na wzrost odzysku ekstrahowanych związków. Niektóre substancje charakteryzują się termolabilnością i mogą ulegać degradacji, z drugiej strony zbyt niska temperatura zdecydowanie obniża wydajność ekstrakcji. Najczęściej stosowaną temperaturą jest 100 C, co zapewne spowodowane jest zapewnieniem właściwej równowagi pomiędzy dobrą efektywnością ekstrakcji, przy stosunkowo umiarkowanej koekstrakcji związków balastowych (Runnqvist i wsp., 2010). W prowadzonych przeze mnie badaniach wzrost temperatury z 80 do 110 C powodował wzrost zawartości kumaryn, co najwyraźniej zaobserwować można było, gdy ekstrahentem był dichlorometan. Ekstrakcja nim w temp. 110 C dała największe odzyski w przypadku isopimpineliny, bergaptenu, imperatoryny i izoimperatoryny. Dla kumaryn o większej polarności jak umbeliferon, ksantotoksyna i angelicyna najefektywniejsza okazała się ekstrakcja metanolem w niskiej temperaturze 80 C (H.2.). Opracowane przeze mnie badania są pierwszymi, traktującymi bardzo dogłębnie temat optymalizacji nowoczesnej metody ekstrakcji, jaką jest wspomagana ekstrakcja cieczowa ASE dla kumaryn, pod kątem zastosowanego rozpuszczalnika i temperatury. Zaproponowana przeze mnie metoda HPLC charakteryzuje się także wysokimi parametrami walidacyjnymi, zapewnia bardzo dobrą separację oznaczanych kumaryn i z powodzeniem wykorzystywana może być do monitorowania ich obecności w ekstraktach roślinnych. Wyniki badań opublikowane zostały na łamach Molecules (H.2.) oraz zaprezentowane na konferencji międzynarodowej. 15

16 Tematyka analizy fitochemicznej i preparatyki kumaryn zainteresowała mnie na tyle, iż postanowiłam zebrać wszelkie dane literaturowe, nie tylko na temat wspomnianych metod ekstrakcji, ale także analizy metodami TLC, HPLC, czy zastosowania metod spektralnych w identyfikacji kumaryn. Sporo uwagi poświęciłam też dotychczas stosowanym technikom ich izolacji z ekstraktów roślinnych. Efektem mojej pracy było opracowanie rozdziału zatytułowanego Coumarins analytical and preparative techniques, który opublikowany został w obszernym, trzytomowym podręczniku Handbook of Chemical and Biological Plant Analytical Methods pod redakcją Prof. Kurta Hostettmanna (H.9.) i stanowi kompendium wiedzy na temat doboru właściwej metody w analizie fitochemicznej kumaryn Izolacja kumaryn metodą chromatografii przeciwprądowej z roślin z rodziny Apiaceae Nadrzędnym celem moich badań było zastosowanie chromatografii przeciwprądowej do izolacji związków kumarynowych zarówno tych będących w badanych ekstraktach związkami dominującymi, ale także i tych występujących w niewielkim stężeniu, a posiadających interesujące aktywności farmakologiczne Izolacja ksantotoksyny Moim celem badawczym była izolacja ksantotoksyny, która w prowadzonych przeze mnie badaniach skriningowych przedstawionych w dalszej części referatu, wykazała potencjalną aktywność przeciwpadaczkową. Do izolacji ksantotoksyny z materiału roślinnego wybrałam owoce Pastinaca sativa L. (Apiaceae) - rośliny używanej w europejskiej, jak i polskiej medycynie tradycyjnej (Jędrzejko i wsp., 2011). Wzmianki o zastosowaniu pasternaku w leczeniu padaczek można znaleźć w zielnikach pochodzących z XVI i XVII wieku (Amin i wsp., 2008). Dane te zostały uwzględnione w obszernym opracowaniu pod kierunkiem Adamsa i wsp. (2012), którzy opisali ponad 160 gatunków roślin stosowanych w leczeniu padaczki, uwzględnione w dziewięciu najważniejszych europejskich zielnikach z tego okresu. Stwierdzono, że większość ze wspomnianych roślin nie została dokładnie przebadana pod kątem ich potencjalnego działania przeciwpadaczkowego według współczesnych standardów. Nadal nie ma dostatecznych informacji wskazujących na to, które składniki odpowiedzialne są za wykazywaną aktywność (Amin i wsp. 2008). Analiza HPLC ekstraktu dichlorometanowego z owoców Pastinaca sativa L. wykazała, iż ksantotoksyna jest jedną z dominujących substancji, dlatego też został on przeznaczony do dalszej izolacji tego związku na skalę półpreparatywną metodą wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej. Po wyliczeniu współczynnika poddziału K D ksantotoksyny dla szeregu układów dwufazowych, za najodpowiedniejszy uznałam mieszaninę heptanu, octanu etylu, metanolu i wody w stosunki 1:1:1:1 (v/v). W tym wypadku wartość współczynnika 16

17 podziału K D dla ksantotoksyny wynosiła 0,92. Optymalne warunki separacji dobrałam początkowo w skali analitycznej (przy każdorazowym dozowaniu do kolumny 33 mg ekstraktu rozpuszczonego w 1 ml wybranego układu dwufazowego), a następnie przeniosłam je na skalę półpreparatywną, dozując 200 mg ekstraktu rozpuszczonego w 6 ml układu dwufazowego. Czynnik skalujący obliczony został jako stosunek objętości kolumny analitycznej do preparatywnej (równy 6), a następnie wartość ta użyta została do zwiększenia szybkości przepływu fazy ruchomej oraz objętości dozowanej próbki. W takim wypadku czas separacji i jej wydajność pozostają takie same. Izolację prowadziłam w układzie faz odwróconych, gdzie górna faza organiczna układu dwufazowego stanowiła fazę stacjonarną. Każdorazowo w wyniku rozdzielania 200 mg ekstraktu otrzymywałam 7,2 mg czystego związku (H.6.). Opracowana przeze mnie metoda po raz pierwszy pozwala na tak szybką i efektywną izolację ksantotoksyny. Zgodnie z danymi literaturowymi poprzednio była ona wyizolowana z owoców Cnidium monnieri (L.) Spreng. (Apiaceae) przy użyciu szybkiej chromatografii przeciwprądowej HSCCC z zastosowaniem elucji gradientowej a cały proces trwał kilka godzin (Liu i wsp., 2004; Li i Chen, 2005). W swojej pracy po raz pierwszy do izolacji ksantotoksyny wykorzystałam wysokosprawny chromatograf przeciwprądowy nowej generacji. Pozwoliło to na wyraźne skrócenie czasu izolacji do 25 minut, bez konieczności stosowania elucji gradientowej Izolacja umbeliferonu Kolejnym, interesującym mnie zagadnieniem, była możliwość zastosowania metody chromatografii przeciwprądowej do izolacji kumaryn prostych, które nie występują w ekstrakcie jako składniki dominujące. Takim związkiem jest umbeliferon (7-hydroksykumaryna), który zidentyfikowany został przeze mnie w metanolowym wyciągu z owoców Heracleum leskowii Grossh. Związek ten zainteresował mnie także dlatego, iż w literaturze znaleźć można przesłanki dotyczące potencjalnej aktywności przeciwnowotworowej kumaryn prostych podstawionych w pozycji C 7, niewiele jest jednak danych potwierdzających te badania. Po przeanalizowaniu szeregu ekstraktów otrzymanych z roślin z rodziny Apiaceae, do dalszej separacji wybrałam wspomniany metanolowy ekstrakt z owoców Heracleum leskowii. Umbeliferon, o czystości 99%, wyizolowałam z zastosowaniem mieszaniny heptan, octan etylu, metanol, woda (1:2:1:2). Optymalne warunki rozdzielenia dobierałam, wykonując analizę w skali analitycznej, a następnie przeniosłam je na skalę półpreparatywną, zwiększając sześciokrotnie zarówno objętość dozowanej próbki, jak i szybkość przepływu fazy ruchomej. Izolację prowadziłam w układzie faz odwróconych przy maksymalnej prędkości obrotów wynoszącej 1600 rmp. Celem doboru optymalnego układu dwufazowego początkowo przetestowałam polecaną w literaturze mieszaninę HEMWat w stosunku (2:3:2:3) (Guzlek i wsp., 2010). Niestety nie pozwoliła ona na wydajne oddzielenie umbeliferonu od pozostałych 17

18 związków obecnych w badanym ekstrakcie, dlatego też celowe dla mnie było zastosowanie własnych modyfikacji. Ostatecznie po zastosowaniu zmodyfikowanych warunków i zadozowaniu 180 mg ekstraktu otrzymałam 1,8 mg czystego związku, a czas pojedynczej separacji wynosił 20 minut (H.4.) Optymalizacja metod izolacji innych kumaryn potencjalnie aktywnych biologicznie Badania nad izolacją kumaryn z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej postanowiłam kontynuować na jednym z ekstraktów otrzymanych z owoców Peucedanum cervaria (L.) Lap. Rośliny należące do rodzaju Peucedanum (Apiaceae) od wieków znajdują zastosowanie w medycynie tradycyjnej w leczeniu bólu gardła czy schorzeń nerek. Były także skuteczne w terapii padaczki, bólach stawów, schorzeniach dróg oddechowych i pokarmowych (Hisamoto i wsp., 2004; Morioka i wsp., 2004; Sarkhail, 2004; Adams i wsp., 2009). Dotychczas oznaczono i wyizolowano szereg związków aktywnych, często występujących jedynie w rodzaju Peucedanum, pośród których dominującymi były olejki eteryczne, kumaryny czy związki fenolowe. Z uwagi na to postanowiłam kontynuować swoje badania w kierunku izolacji kumaryn z owoców Peucedanum cervaria. Do badań przeznaczyłam ekstrakt dichlorometanowy, w którym odnotowałam występowanie szeregu związków o charakterze kumaryn, zarówno dominujących, jak i tych występujących w niewielkich ilościach, a których dokładna identyfikacja w mieszaninie nie była możliwa z uwagi na brak odpowiednich wzorców. Poszukując najodpowiedniejszych warunków do ich izolacji techniką chromatografii przeciwprądowej przebadałam szereg dwufazowych układów będących mieszaniną heptanu bądź heksanu, octanu etylu, metanolu i wody (HEMWat), alkany zastępowałam eterem naftowym, czy też podjęłam się zbadania przydatności mieszanin chloroformu, metanolu i wody. Ostatecznie zdecydowałam się na zastosowanie wspomnianej mieszaniny HEMWat w stosunku 2:1:2:1 do izolacji trzech mniej polarnych związków oraz w stosunku 3:2:3:2 do izolacji związku o widmie UV-DAD typowym dla furanokumaryn, który w ekstrakcie występował w niewielkich ilościach. Retencja fazy stacjonarnej na kolumnie wynosiła odpowiednio 80 i 81%. Separacje prowadziłam w układzie faz odwróconych. Optymalne warunki, podobnie jak w przypadku wcześniej omówionych izolacji, dobierałam początkowo w skali analitycznej a następnie przenosiłam je na skalę półpreparatywną. Zoptymalizowałam także wpływ wzrostu stężenia dozowanej próbki na jakość separacji. W zakresie stężeń mg/ml rozdzielenie związków było zadowalające. Przy dalszym wzroście stężeń zaobserwowałam wytrącanie się osadu w próbce, która miała być dozowana do kolumny, dlatego też stężenie 80 mg/ml uznałam ze optymalne do prowadzonych badań. 18

19 Struktury wyizolowanych związków określiłam przy użyciu techniki HPLC/DAD/ESI- TOF-MS, GC-MS oraz jedno- i dwuwymiarowej NMR we współpracy z dr. hab. Tomaszem Mroczkiem z Katedry i Zakładu Farmakognozji UM w Lublinie. W efekcie przeprowadzonych eksperymentów w czasie krótszym niż 40 minut, po zadozowaniu każdorazowo 500 mg surowego ekstraktu, wyizolowałam trzy pochodne dihydrooroselolu: (8S,9R)-9-(3- metylbutenoyloksy)-o-acetyl-8,9-dihydrooroselol, (8S,9R)-9-(2-metyl-Z-butenoyloksy)-Oacetyl-8,9-dihydrooroselol (edultyna) 4,6 mg mieszaniny obu związków w stosunku 11:89 i 3,7 mg (8S,9R)-9-acetoksy-O-(2 -metylbutyryl)-8,9-dihydrooroselolu. Po zmianie układu na bardziej polarny wyizolowałam dodatkowo furanokumarynę w ilości 1,2 mg, którą zidentyfikowałam jako oksypeucedaninę. Trzy pochodne dihydrooroselolu po raz pierwszy wyizolowane zostały z zastosowaniem chromatografii przeciwprądowej oraz po raz pierwszy zidentyfikowane w badanym gatunku. Oksypeucedanina po raz pierwszy wyizolowana została w tak krótkim czasie (H.8.). Pomimo tego, iż otrzymane pochodne dihydrooroselolu są związkami znanymi, są jednak niezwykle rzadkie i po raz pierwszy określiłam dla nich konfigurację względną, łącznie z dwuwymiarowym rezonansem NMR. Z uwagi na to, iż pochodne dihydrooroselolu wykazują interesującą aktywność przeciwnowotworową (Mizuno i wsp., 1994), istotne jest opracowanie wydajnych i efektywnych metod ich izolacji. Stąd też dalsze, niezbędne badania w tym kierunku będą przeze mnie kontynuowane Zastosowanie wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej w izolacji terpenoidów Drugą grupą związków, która interesowała mnie od początku mojej pracy badawczej są terpenoidy. Jest to jedna z większych i bardziej zróżnicowanych grup metabolitów wtórnych, licząca ponad związków, a każdego roku naukowcy oznaczają kolejne nowe substancje. Terpenoidy wykazują szereg interesujących właściwości biologicznych. Monoi seskwiterpeny, będące głównymi składnikami olejków eterycznych, odpowiedzialne są głównie za ich działanie przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe czy antyoksydacyjne. Ginsenozydy saponiny triterpenowe, wyraźnie obniżają produkcję beta-amyloidu, który kumuluje się w mózgu osób cierpiących na chorobę Alzheimera. Ginkgolidy cykliczne diterpeny izolowane z Ginkgo biloba znane są z ich wyraźnego działania neuroprotekcyjnego (Yoo i Park, 2012). Wprowadzone do terapii leki: przeciwmalaryczny (artemizynina) oraz przeciwnowotworowy (paklitaksel - Taxol R ) są także związkami naturalnymi o strukturze terpenoidowej (Medhi i wsp., 2009; Xiang i wsp., 2009). Różnorodność struktur terpenoidów sprawia, iż są one przedmiotem zainteresowań, głównie ze względu na ich komercyjne zastosowanie. Posiadają one ogromny potencjał terapeutyczny i mogą być prekursorami do modelowania struktur nowych leków o wysokiej aktywności, a minimalnych działaniach niepożądanych. Niestety w większości przypadków 19

20 występują one w roślinach w niewielkich ilościach i zapewne wiele z nich nadal jest nieodkrytych. Istnieje więc ogromna potrzeba dalszego opracowywania metod ich izolacji i oczyszczania, celem pozyskania związków do badań podstawowych, jak i klinicznych (Kuttan i wsp., 2011). Literatura podaje przykłady zastosowania różnych technik izolacyjnych tej grupy związków, w tym także zastosowania chromatografii przeciwprądowej. O ile każdego roku publikowanych jest szereg prac prezentujących izolacje terpenoidów metodami chromatografii typu ciecz-ciecz, o tyle nie było do tej pory opracowania podsumowującego te wyniki. Dlatego też postanowiłam podjąć się przygotowania artykułu przeglądowego traktującego wspomniany problem, głównie w odniesieniu do układów rozpuszczalników stosowanych w technice chromatografii przeciwprądowej. W tym celu przestudiowałam ponad 3500 prac opublikowanych w ciągu ostatnich 30 lat, traktujących o zastosowaniu chromatografii przeciwprądowej i jej techniki siostrzanej chromatografii podziałowej pola odśrodkowego (CPC). Na podstawie przeglądu dostępnego piśmiennictwa zebrałam 150 różnych mieszanin dwufazowych stosowanych w izolacji terpenoidów wraz z odpowiednimi związkami, które wyizolowane zostały w postaci czystej. Całość przedstawiona została w postaci tabeli i pogrupowana pod kątem przynależności związków do odpowiednich grup chemicznych. Służyć może ona innym fitochemikom, jako punkt wyjściowy do poszukiwania optymalnego układu dwufazowego przydatnego w izolacji teprenoidów. We wspomnianej pracy przeglądowej omówiłam teoretyczne podstawy techniki, przedstawiając jej zalety, wady oraz liczne dostępne modyfikacje stosowane w separacji produktów naturalnych. Wyraźnie podkreśliłam też fakt, iż chromatografia przeciwprądowa, jako technika ciecz-ciecz, pozwala na niemal nieskończoną ilość możliwych kombinacji w doborze układów dwufazowych i może być stosowana do izolacji związków zarówno wysoce polarnych, jak i tych charakteryzujących się bardzo niską polarnością. Omówiłam szeroko dobór odpowiednich bezwodnych układów dwufazowych dla związków wysoce lipofilnych, jako przykład podając likopen o wartości logp około 17,6 (Wei i wsp., 2001). Szczegółowo przedstawiłam też szereg stosowanych modyfikacji, które miały na celu usprawnienie procesu, jak np. (i) zastosowanie układu trójfazowego w izolacji trzech strukturalnie zbliżonych triterpenów (Hamzaoui i wsp., 2013), (ii) wykorzystanie olejku słonecznikowego, który w połączeniu z etanolem wykorzystany został do izolacji solanesolu, niecyklicznego alkoholu terpenowego, stosowanego jako dodatek do żywności w związku z wykazanym działaniem przeciwnowotworowym (Zhao i Du, 2007), (iii) czy dodatek kwasów, co pozwoliło na skuteczną izolację saponin triterpenowych z ekstraktu charakteryzującego się niezwykle wysoką zawartością cukrów (Shirota i wsp., 2008). Przedstawiłam nowe podejście do izolacji ginsenozydów, ze szczególnym uwzględnieniem problemu, jakim jest formowanie się emulsji w czasie ich izolacji metodą chromatografii typu ciecz-ciecz, czy stosowanie układów 20

21 z pominięciem popularnych chlorowcopochodnych, które jednak wykazują działanie toksyczne (Cheng i wsp., 2010; Qi i wsp., 2010; Wang i wsp., 2010; Shehzad i wsp., 2013). Szczególną uwagę zwróciłam także na możliwość jednoczesnej izolacji saponin, wysoce różniących się polarnością, dzięki zastosowaniu trójstopniowej elucji gradientowej (Zhang i wsp., 2013). Uwypukliłam przydatność chromatografii przeciwprądowej w izolacji terpenoidów występujących w bardzo niewielkich ilościach w materiale roślinnym (np. kwas ursolowy w liściach Diospyros kaki, saponiny pochodne platykozydu z Platycodii radix), jak i tych strukturalnie bardzo do siebie zbliżonych (triterpeny pentacykliczne: kwas barbinerwowy i jego epimer kwas rutangenikowy, różniące się jedynie konfiguracją grupy hydroksylowej przy węglu C 3) (Fan i He 2006; Ha i Kim 2009; Ha i wsp., 2011). Omówiłam także problem izolacji ksantanolidów laktonów seskwiterpenowych o niezwykle obiecujących aktywnościach farmakologicznych. Ze względu na występowanie w ich cząsteczce kilku centrów chiralnych otrzymanie ich na drodze syntezy jest zadaniem niezwykle skomplikowanym, dlatego też metodą z wyboru pozostaje izolacja z materiału roślinnego. Ksantanolidy koekstrahują jednak z chlorofilem i lipidami, a dalsze oczyszczanie nigdy nie jest selektywne i prowadzi do strat związków. W przypadku zastosowania chromatografii przeciwprądowej w jednej analizie możliwe było wyizolowanie trzech czystych pochodnych z ekstraktu surowego (Pinel i wsp., 2007). Omówiona praca przeglądowa, opublikowana w Phytochemistry Reviews (H.7.), stanowi cenne podsumowanie dostępnej literatury na temat zastosowania chromatografii przeciwprądowej w izolacji terpenoidów i jest pierwszym artykułem tego typu. O potrzebie stworzenia takiego opracowania świadczy fakt, iż w przeciągu kilku pierwszych miesięcy od publikacji on-line praca ta była jednym z najczęściej pobieranych artykułów (wg danych Pomimo tego, iż chromatografia przeciwprądowa z czasem staje się coraz bardziej popularna, zauważyłam, iż w aktualnej literaturze nadal niewiele jest przykładów jej zastosowań w izolacji związków lotnych z olejków eterycznych. Olejki eteryczne są złożoną mieszaniną lotnych, naturalnych związków, charakteryzujących się silnym zapachem. Od lat wykorzystywane są ze względu na ich właściwości przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze czy owadobójcze. Obecnie znanych jest ok olejków eterycznych, z czego 300 wykorzystywanych jest komercyjnie w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym, do produkcji kosmetyków czy perfum. Niektóre olejki eteryczne wydają się wykazywać szczególne właściwości lecznicze i są stosowane w leczeniu różnych dysfunkcji narządów i zaburzeń ogólnoustrojowych (Bakkali i wsp., 2008). Duże znaczenie mają także pojedyncze związki terpenowe izolowane z roślin, lub częściej otrzymywane na drodze syntezy chemicznej. W dostępnej literaturze istnieją doniesienia o zastosowaniu chromatografii przeciwprądowej w izolacji kuminaldehydu i p-menta-1,4-dien-7-alu z olejku Cuminum 21

22 cyminum (Chen i wsp., 2011), germakronu i kurdionu z olejku eterycznego z kłączy Curcuma wenyujin (Yan i wsp., 2005), nootkatonu z olejku z Alpinia oxyphylla Miquel. (Xie i wsp., 2009), tlenku kariofylenu, 7,11-dimetyl-3-metylen-1,6,10-dodekatrienu i β-kariofylenu z olejku eterycznego z Flaveria bidentis (Wei i wsp., 2012), β-kariofylenu z olejku z Vetix negundo (Xie i wsp. 2008) czy α-cyperonu z Cyperus rotundus (Shi i wsp., 2009). Dos Santos i wsp. (2009) z olejku eterycznego wydestylowanego z liści Pimenta pseudocaryophyllus wyizolowali chawibetol i metyleugenol, a Yeh i wsp. (2012), stosując izolację olejku z korzeni Angelica sinensis kierowaną bio-aktywnością, otrzymała dwa związki ftalidowe: Z-ligustylid i n-butylidenoftalid, odpowiedzialne za hamujące działanie rozrostu śródbłonka. W większości przedstawionych przypadków przeprowadzenie całego procesu izolacji trwało nawet do 6 godzin. Postanowiłam więc sprawdzić przydatność wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej do izolacji składników olejków eterycznych, a do dalszych badań wybrałam dwa olejki: anyżowy oraz mięty pieprzowej Izolacja terpenoidów z olejku eterycznego anyżowego Pimpinella anisum L. jest rośliną niezwykle popularną i szeroko stosowaną w medycynie. Występuje w stanie naturalnym i uprawiana jest w Europie, Azji i Ameryce Środkowej. Od czasów starożytnych stosowana jest jako roślina olejkowa i przyprawowa, a w medycynie tradycyjnej, farmacji i przemyśle spożywczym wykorzystuje się jej właściwości związane z obecnością olejków eterycznych, jak poprawiające trawienie, mlekopędne, moczopędne czy napotne (Ertan i Bayram, 2010; Karimzadeh i wsp., 2012; Samojlik i wsp., 2012). Wykazano także działanie przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze (Singh i wsp., 2002; Özcan i Chalchat, 2006), a najnowsze badania donoszą o właściwościach przeciwpadaczkowych i neuroprotekcyjnych olejku anyżowego (Karimzadeh i wsp., 2012). Skład chemiczny olejku anyżowego był przedmiotem licznych badań i wykazano wielokrotnie, iż głównymi składnikami są anetol, cis-izoeugenol, linalol i estragol. Substancje te mogą być częściowo odpowiedzialne za szerokie spektrum aktywności farmakologicznej olejku (Samojlik i wsp., 2012; Özcan i Chalchat, 2006), więc dobór odpowiedniej metody ich izolacji jest bardzo ważnym zadaniem analitycznym. Analiza metodą chromatografii gazowej sprzężonej z detektorem MS (GC-MS) olejku eterycznego wydestylowanego z owoców Pimpinella aniusum wykazała obecność 33 związków, spośród których dominującymi były anetol (74,8%), metylchawikol (estragol 7,33%), fenikulina (3,31%), linalol (2,25%), aldehyd p-anyżowy (2,09%), limonen (1,45%), β-kariofylen (1,25%) i p-acetonylanizol (1,14%). Celem izolacji wybranych składników metodą wysokosprawnej chromatografii przeciwprądowej przebadałam szereg układów dwufazowych będących mieszaniną heptanu, octanu etylu, metanolu i wody (HEMWat), każdorazowo 22