Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Rozdzielanie komórek metodą wirowania

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki Rozdzielanie komórek metodą wirowania WSTĘP Krew i jej rola w organizmie Krew jest jedyną tkanką płynną organizmu, krąży w zamkniętym systemie naczyń krwionośnych. Organizm człowieka zawiera 4.5 litra krwi (1/13 wagi ciała). Z fizjologicznego punktu widzenia jest środowiskiem które łączy wszystkie komórki i narządy w jedną funkcjonalną całość. Z histologicznego punktu widzenia krew jest tkanką, której substancję międzykomórkową stanowi osocze, a komórkami są krwinki czerwone (erytrocyty), krwinki białe (leukocyty) dzielące się na granulocyty, limfocyty i monocyty oraz płytki krwi (trombocyty) (Rys.1.). Krew spełnia w ustroju szereg różnorodnych funkcji. Najważniejsze z nich to: 1. Oddychanie: transport tlenu z płuc do tkanek i dwutlenku węgla z tkanek do płuc; 2. Odżywianie: transport wchłoniętego i zmetabolizowanego pożywienia; 3. Wydalanie: transport odpadów metabolizmu do nerek, płuc, skóry i jelit w celu ich wydalenia; 4. Utrzymanie w organizmie prawidłowej równowagi kwasowo-zasadowej; 5. Regulacja równowagi wodnej: krew ma wpływ na wymianę wody pomiędzy płynem krążącym a płynem tkankowym; 6. Regulacja temperatury organizmu przez rozdział ciepła; 7. Obrona przed zakażeniem: krążące białe krwinki i przeciwciała; 8. Hormonalna regulacja metabolizmu i innych funkcji organizmu: transport hormonów. Podstawowe składniki krwi Krew jest tkanką której 80 % stanowi woda, a pozostałe 20 % to składniki organiczne i nieorganiczne. Związki organiczne to białka (albuminy, globuliny, fibrynogen, enzymy), hormony, glukoza i inne węglowodany, mocznik, kwas moczowy, aminokwasy, produkty przemiany hemu oraz inne produkty organiczne przemian wewnątrzkomórkowych. Występuje też dużo lipidów: cholesterol, fosfolipidy, triacyloglicerole, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. Prawie wszystkie lipidy występujące we krwi są związane z białkami osocza, tworząc lipoproteiny i w tej postaci są transportowane. 1

2 Białka osocza dzielą się na trzy zasadnicze grupy: - albuminy: zasadniczą ich funkcją jest wiązanie wody i małocząsteczkowych związków organicznych (hormony) oraz ich transport; - globuliny: w grupie tej występują mukoproteiny i glikoproteiny (połączenia białek z węglowodanami), lipoproteiny (połączenia białek z lipidami), globuliny wiążące jony metali (transferyna wiążąca Fe) oraz immunoglobuliny; - fibrynogen: ma duże znaczenie fizjologiczne, jego przemiana pod wpływem trombiny w fibrynę stanowi istotę krzepnięcia krwi. Osocze z którego usunięto elementy morfotyczne i fibrynogen przez odwirowanie skrzepniętej krwi nazywane jest surowicą. W celu zapobieżenia krzepnięcia krwi dodaje się do niej substancji (szczawiany, cytryniany, fluorki, wersenian - EDTA) wiążących jony wapniowe, albo substancji hamujących przekształcanie protrombiny w trombinę (heparyna). Po odwirowaniu komórek takiej krwi otrzymuje się osocze (szczwianowe, cytrynianowe, wersenianowe, lub heparynowe). Związki nieorganiczne stanowią kationy sodu, wapnia, potasu, magnezu oraz aniony chloru, węgla, fosforu. Wśród kationów najwięcej jest jonów sodowych, potasowych i wapniowych, a wśród anionów jonów chlorkowych i węglanowych. Elementy morfotyczne krwi Komórki krwi (krwinki czerwone, krwinki białe i płytki krwi) tworzone są u ludzi w szpiku kostnym czerwonym, występującym w nasadach kości długich, mostku, miednicy, czaszce i kręgach. Całkowita ilość szpiku w organizmie jest w przybliżeniu wagi wątroby. W pewnych warunkach rolę narządu krwiotwórczego oprócz szpiku może pełnić wątroba i śledziona, a dla limfocytów także węzły chłonne i grasica. Mechanizm powstawania krwinek nie jest jeszcze całkowicie poznany. Prawdopodobnie wszystkie krwinki wywodzą się z jednego rodzaju komórek macierzystych zwanych komórkami pnia. Krwinki czerwone (erytrocyty) Krwinki czerwone mają kształt dwuwklęsłego krążka o średnicy 7.5 µm i grubości µm. Kształt ten zwiększa ich powierzchnię o 1/3 w porównaniu z taką samą objętością w kształcie kuli. Krążą we krwi obwodowej około 120 dni, a czas ich połowicznego rozpadu (T 1/2 ) wynosi 28 dni. Stare komórki usuwane są z obiegu i rozkładane przez śledzionę. Przykładowo, u mężczyzn liczba krwinek czerwonych wynosi około w litrze krwi. Erytrocyty są strukturalnie i metabolicznie wyjątkowe wśród komórek organizmu. Dojrzała krwinka czerwona nie ma jądra, ani cytoplazmatycznych struktur subkomórkowych, gdyż traci ona organelle podczas dojrzewania w szpiku. W związku z zanikiem jądra komórkowego traci zdolność do podziału, natomiast w następstwie utraty mitochondriów zanika zdolność wytwarzania energii, a zanik rybosomów uniemożliwia przeprowadzenie biosyntezy białek. Krwinka czerwona jest więc wysoce wyspecjalizowaną komórką o bardzo ograniczonym zapotrzebowaniu energetycznym, funkcjonującą prawie wyłącznie dzięki glikolizie. Energia zużywana 2

3 przez nią wykorzystywana jest głównie do utrzymania prawidłowego stanu błony komórkowej i gradientu jonów. Jednym z podstawowych zadań erytrocytów w organizmie jest transportowanie tlenu z płuc do wszystkich tkanek organizmu oraz w pewnym stopniu dwutlenku węgla z tkanek do płuc. Funkcja ta spełniana jest dzięki zawartej w nich hemoglobinie, stanowiącej czerwony barwnik krwi. Warunkiem wiązania tlenu przez hemoglobinę jest obecność niebiałkowej grupy hemowej składającej się z części organicznej (porfiryna) i atomu żelaza. Hemoglobina jest głównym składnikiem komórki i stanowi 75 % suchej masy krwinki czerwonej. Krwinki białe (leukocyty) Średnica krwinek białych wynosi 3-20 µm. Ilość ich we krwi obwodowej wynosi około w litrze krwi. Leukocyty dzielą się na granulocyty, limfocyty i monocyty. Granulocyty dzielą się na: - obojętnochłonne (neutrofile): stanowią % wszystkich krążących we krwi krwinek białych; - kwasochłonne (eozynofile): stanowią 2-5 % wszystkich leukocytów; - zasadochłonne (bazofile): 0.5 %. Czas krążenia granulocytów we krwi obwodowej wynosi od kilku do kilkunastu godzin. Granulocyty obojętnochłonne i kwasochłonne mają zdolność do diapedezy, czyli przenikania przez ściany naczyń włoskowatych do tkanek i nie powracają do krwi krążącej. Całkowita pula granulocytów we krwi może się zwiększyć pod wpływem toksyn bakteryjnych lub czynników uwalnianych przez same granulocyty. Powoduje to przejście granulocytów ze szpiku do krążącej krwi, a w ciągu kilku godzin ich liczba we krwi obwodowej może się zwiększyć kilkukrotnie Granulocyty obojętnochłonne i kwasochłonne wykazują zdolność do kierowania się do ognisk zapalnych organizmu, ognisk rozmnażania się bakterii, martwych tkanek i innych ciał obcych na zasadzie chemotaksji. Pożerają, czyli fagocytują one, a następnie trawią w lizosomach i unieczynniają wszelkie zbędne i niekorzystne dla organizmu czynniki. Granulocyty zasadochłonne mają słabiej zaznaczone zdolności do diapedezy, chemotaksji i fagocytozy, zasadniczą ich rolą jest wydzielanie heparyny. Limfocyty wraz z narządami w których powstają (szpik kostny czerwony, grasica, śledziona, węzły chłonne) i naczyniami chłonnymi stanowią tzw. układ limfoidalny, w którym limfocyty krążą pomiędzy krwią i tkankami. Część limfocytów wytwarzanych w szpiku kostnym, kolejno przechodzi do grasicy i węzłów chłonnych, gdzie dzieli się, dojrzewa i zmienia się w grasicozależne limfocyty T odpowiedzialne za reakcje immunologiczne typu komórkowego. Pozostałe limfocyty powstające w szpiku kostnym zatrzymują się w grudkach chłonnych przewodu pokarmowego, dzielą się, dojrzewają i przekształcają w szpikozależne limfocyty B, które wytwarzają immunoglobuliny biorące zasadniczy udział w reakcjach immunologicznych typu humoralnego. Monocyty wykazują zdolność do diapedezy i fagocytozy. Po przejściu z krwi krążącej do tkanek stają się makrofagami, które szybko poruszają się ruchem amebowatym do miejsc uszkodzonych i wykazującymi zdolności żerne, pochłaniając znaczne ilości bakterii i fragmenty martwych tkanek. Zawierają one liczne enzymy, między innymi lipazę i dlatego mogą trawić bakterie mające otoczki lipidowe. 3

4 Płytki krwi (trombocyty) Średnica ich wynosi 2-4 µm, krążą we krwi od 8 do 10 dni. Płytki krwi są wytwarzane w szpiku kostnym w komórkach olbrzymich, zwanych megakariocytami i stanowią fragmenty cytoplazmy tych komórek. Biorą udział w hemostazie, czyli zamykaniu mechanicznych uszkodzeń naczyń krwionośnych. bazofil eozynofil neutrofil limfocyt monocyt erytrocyt trombocyt Rys.1. Elementy morfotyczne krwi Za pomocą wirowania w roztworach Ficoll u można rozdzielić składniki morfotyczne krwi na frakcje wg schematu poniżej: Wirowanie w nieciągłych gradientach Ficoll u pozwala również na rozdział komórek żywych od martwych. W tym celu na warstwę roztworu Ficoll o gęstości d=1.077 g/ml nakłada się zawiesinę komórek w pożywce lub soli fizjologicznej i wiruje. Komórki 4

5 żywe gromadzą się na granicy roztworu Ficoll u i pożywki a martwe komórki osiadają na dnie naczynia. Zwykle w praktyce laboratoryjnej używa się gotowych handlowych preparatów Ficoll u np. Ficoll MSL (Lymphocyte separation medium) firmy EuroBio lub Lymphotest firmy Nyegaaro and Co A/S. Inną metodą rozdziału komórek za pomocą wirowania jest wirowanie różnicowe (elutriacja). System rozdziału komórek za pomocą wirowania różnicowego został opracowany przez Lindahla pod koniec lat pięćdziesiątych zeszłego wieku. Metoda wykorzystuje różnice pomiędzy komórkami co do ich kształtu, wielkości i tzw. gęstości sedymentacyjnej. Zaletą tej metody jest stosunkowo mała inwazyjność w procesy komórkowe w porównaniu np. ze stosowaniem inhibitorów procesów metabolicznych jak inhibitory polimerazy DNA (afidikolina), inhibitorów szlaku biosyntezy aminokwasów (mimozyna), inhibitorów funkcji wrzeciona mitotycznego (nokodazol) itp. Pozwala ona także na otrzymywanie w stosunkowo szybki sposób dużej ilości komórek (cząstek) rzędu komórek o określonych parametrach. Przykładowe zastosowanie elutriacji to otrzymywanie komórek znajdujących się w określonych fazach cyklu komórkowego w celu synchronizacji komórek. Homogenność frakcji komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego jest bardzo wysoka i wynosi zwykle dla komórek G1 ok %, z fazy S 75-85% i fazy G2/M 60-75%. Typowy zestaw do wirowania różnicowego składa się z elementów przedstawionych na rysunku 3 a procedura prowadzenia rozdziału na rysunku 4. Pompa manometr Zbiornik pozywki Nastrzykiwanie próbki Kolektor frakcji Rotor Rys 3. Schemat systemu do wirowania różnicowego 5

6 Zawór obejscia Z pompy Zawór wpustowy próbki Zawór obejscia w polozeniu 1 ciecz kierowana jest na uklad z pominieciem zbiornika na próbke. Zawór wpustowy próbki zamkniety Strzykawka do nanoszenia próbki podlaczona. Zawór obejscia w polozeniu 1 Zawór wpustowy próbki zamkniety Nanoszenie próbki. Zawór obejscia w polozeniu 1 Zawór wpustowy próbki otwarty. Ladowanie próbki na uklad. Zawór obejscia w polozeniu 2. Zawór wpustowy próbki zamkniety. Po zaladowaniu próbki powrót do sytuacji z punktu (a) Rys 4. System do wirowania różnicowego 6

7 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA MATERIAŁY 1. Ludzkie komórki nowotworowe traktowane związkami przeciwnowotworowymi. 2. Ficoll 400: silnie rozgałęziony kopolimer cukru trzcinowego i epichlorohydryny o masie cząsteczkowej 400 tys. g/mol, nie posiadający grup jonowych, rozpuszczalny w wodzie w 50 % (w/v). 3. Roztwory: A. izotoniczny roztwór soli (TBS), ph = 7.4: NaCl (0.14 M) glukoza (5.5 mm) CaCl 2 x2 H 2 O (5?M) MgCl 2 x6 H 2 O (0.1 mm) KCl (0.54 mm) Tris (15 mm) woda destylowana 8.0 g 1.0 g 0.75 mg 20 mg 40 mg 1.7 g do 1000 ml; B. Ficoll 1077: Ficoll 400 sól sodowa kwasu 3,5 bis(acetyloamino)- 2,4,6-trójjodobenzoesowego woda destylowana 5.7 g 9 g do 100 ml; C. Błękit trypanu/erytrozyny: 0.4 % roztwór barwnika w 0.9 % roztworze NaCl. 4. Szkło i aparatura: A. Probówki wirówkowe o pojemności 15 ml; B. Pipety; C. Szkiełka mikroskopowe; D. Wirówka; E. Mikroskop. WYKONANIE 1. Przygotować w probówce warstwę Ficollu i zawiesiny komórek: wlać 2 ml Ficollu 1077 na dno probówki i nawarstwić ostrożnie 2 ml zawiesiny komórek, tak aby uniknąć wymieszania warstw; 2. Wirować w temperaturze pokojowej 30 minut, z przyspieszeniem odśrodkowym równym 400g. 3. Zebrać żywe komórki (warstwa komórek na granicy roztworów) do czystej probówki, rozcieńczyć PBS; 4. Sprawdzić czy na dnie znajdują się martwe komórki. Zebrać komórki martwe na dnie probówki, rozcieńczyć PBS. 7

8 5. Zawiesinę z każdej frakcji (żywe i martwe komórki) zmieszać 1:1 z roztworem błękitu trypanu/erytrozyny; 6. Nanieść na szkiełko podstawowe kroplę wybarwionej zawiesiny i pod mikroskopem policzyć w procentach ilość komórek martwych (zabarwione na niebiesko lub różowo) przypadających na 100 komórek. 7. Określić ilość komórek w poszczególnych frakcjach i całkowitą ilość analizowanych komórek (nakładanych na warstwę Ficoll-u). Liczenie komórek w komorze hemocytometru Przygotować hemocytometr do wprowadzenia próbki (według instrukcji prowadzącego ćwiczenie); Przygotowanie komórek to liczenia: zawiesinę komórek przenieść do probówki Eppendorfa i zmieszać 1:1 z roztworem barwnika (błękit trypanu lub erytrozyna); wymieszać; zawiesinę wybarwionych komórek przenieść do hemocytometru zgodnie z instrukcją prowadzącego ćwiczenie; policzyć; (uwaga: czas jaki upłynie od momentu dodania barwnika nie może być zbyt długi ponieważ z czasem wybarwiane są także żywe komórki); Metodyka liczenia komórek w hemocytometrze: - ustawić obiektyw x10 w mikroskopie; - komorę ustawić tak, aby widoczne było największe pole ograniczone liniami potrójnymi (pole o pow. 1mm 2 ) jak na rysunku; - - liczyć komórki leżące wewnątrz kwadratu (o boku 1/20mm) a także na górnych i lewych liniach ograniczających ( ); nie liczyć komórek znajdujących się na dolnych i prawych liniach ograniczających ( ); pozwoli to uniknąć liczenia tych samych komórek po dwa razy; Obliczenie gęstości komórek: - obliczyć średnią ze zliczeń (ilość policzonych pól zależy od rodzaju siatki i celu dla jakiego oznaczenie jest wykonywane); - gęstość zawiesiny komórek [szt./ml] wyliczyć ze wzoru: c = n / υ, gdzie: c gęstość komórek n ilość zliczonych komórek υ - objętość komory; OPRACOWANIE SPRAWOZDANIA W sprawozdaniu należy podać krótką część teoretyczną, sposób wykonania ćwiczenia wraz ze schematem rozdziału komórek martwych od żywych. Przedstawić 8

9 w formie rysunku % ilość komórek martwych w poszczególnych próbkach. Opisać krótko cechy morfologiczne martwych i żywych komórek zaobserwowane pod mikroskopem. LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA [1] T. Pawlikowski, M. Karasek, M. Pawlikowski, Podręcznik histologii, Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa, 1981 [2] L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1997 [3] J. Kawiak i wsp., Podstawy cytofizjologii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1997 [4] M. Jakóbisiak, Immunologia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1996 [5] W. Bloom, D.W. Fawcett, Histologia, Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa, 1967 [6] M.L. Nucci, A. Abuchowski, W poszukiwaniu preparatów krwiozastępczych, Świat Nauki, 4(80), kwiecień 1998, Pruszyński i S-ka, Warszawa, 1998 [7] Lindahl PE. On conter-streaming centrifugation in the separation of cells and cell fragments. Biochem Biophys Acta 21: , 1956 [8] Marrancino RL and Keng PC. Centrifugal elutriation. W: Cell Cycle- Materials and Methods. (M. Pagano, ed), Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1995, pp