Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Biomateriałów. Rozprawa doktorska RESORBOWALNE MEMBRANY DO STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK

Transkrypt

1 Akademia Górniczo-Hutnicza im. Stanisława Staszica Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Biomateriałów Rozprawa doktorska RESORBOWALNE MEMBRANY DO STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK mgr inż. Małgorzata Krok Promotor: dr hab. inż. Elżbieta Pamuła, Prof. AGH - Kraków

2 I CZĘŚĆ LITERATUROWA WPROWADZENIE CHOROBY PRZYZĘBIA SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA Niechirurgiczne sposoby leczenia Chirurgiczne metody leczenia Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na reperacji Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na regeneracji MEMBRANY WYKORZYSTYWANE DO LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA METODĄ STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR) Wymagania stawiane materiałom membranowym do sterowanej regeneracji tkanek Rodzaje membran stosowanych w technice GTR Membrany nieresorbowane Membrany resorbowalne Materiały membranowe pochodzenia naturalnego Materiały membranowe pochodzenia syntetycznego Membrany gradientowe II TEZA I CEL PRACY III CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA MATERIAŁY I METODY Charakterystyka materiału matrycowego poli(l-laktydu-co-glikolidu) (PLGA) Charakterystyka porogenu poli(glikolidu etylenowego) (PEG) Otrzymywanie membran Charakterystyka membran

3 1.4.1.Grubość i udział objętościowy porów Mikrostruktura Topografia powierzchni Zwilżalność powierzchni Właściwości chemiczne powierzchni Wytrzymałość mechaniczna Szybkość odparowania rozpuszczalnika Badania degradacji Właściwości biologiczne Badania na komórkach osteoblastopodobnych MG Żywotność komórek Poziom tlenku azotu Morfologia komórek Badania z wykorzystaniem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ludzkich fibroblastów Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek Morfologia komórek Badania w kokulturach komórkowych Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek Morfologia Hodowla komórek po obu stronach membrany WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od stężenia PEG Morfologia membran Mikrostruktura Właściwości mechaniczne

4 2.1.4.Dyskusja wyników Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od masy cząsteczkowej PEG Mikrostruktura Grubość membran i procent wypłukania PEG Wpływ odparowania rozpuszczalnika na mikrostrukturę membran Badania FTIR-ATR Dyskusja wyników Badania degradacji membran Ocena makroskopowa Zmiany masy Zmiany ph Kąt zwilżania Wytrzymałość Mikrostruktura i topografia powierzchni SEM AFM Dyskusja wyników Charakterystyka biologiczna membran Badania membran PLGA w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG Żywotności komórek Poziom tlenku azotu Morfologia komórek Dyskusja wyników Badania membran w kontakcie z ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi Proliferacja komórek

5 Różnicowanie i mineralizacja komórek Morfologia komórek Dyskusja wyników Badania w kokulturach komórkowych: ludzkie fibroblasty i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste Proliferacja komórek Różnicowanie i mineralizacja komórek Morfologia komórek Model symulujący warunki panujące w organizmie żywym Dyskusja wyników PODSUMOWANIE I WNIOSKI IV STRESZCZENIE V SUMMARY Spis Tabel: Spis Rysunków: Literatura:

6 W tym miejscu chciałam złożyć serdeczne podziękowania: Prof. dr hab. inż. Elżbiecie Pamule, za nieocenioną pomoc, wiele cennych rad oraz wiedzę przekazaną w czasie studiów doktoranckich. Rodzicom, za to, że zawsze mnie wspierają. Przyjaźń poznaję po tym, że nic nie może jej zawieść, a prawdziwą miłość po tym, że nic nie może jej zniszczyć. - Pauli i Klaudiuszowi 6

7 I CZĘŚĆ LITERATUROWA I CZĘŚĆ LITERATUROWA 1. WPROWADZENIE Zarówno w Polsce jaki i na świecie rośnie zapotrzebowanie na wszelkiego rodzaju implanty do leczenia ubytków tkanki kostnej, również w dziedzinie periodontologii i chirurgii stomatologicznej. Dzieje się tak dlatego, że wydłuża się średnia długość życia ludzi, ale również przyczyniają się do tego zaniedbania higieniczne w obrębie jamy ustnej. W konsekwencji prowadzi to do coraz częstszego występowania różnego rodzaju chorób przyzębia. Obecnie choroby te zostały zaliczone do grupy chorób społecznych; szacuje się, że co trzecia dorosła osoba w Polsce cierpi na choroby przyzębia, w tym również na paradontozę [1]. W zależności od stopnia zaawansowania parodontozy stosuje się różne techniki leczenia, mniej lub bardziej inwazyjne. Jednakże w przypadku znacznego postępu choroby, największą szansą na powodzenie charakteryzują się techniki implantacyjne nazywane sterowaną regeneracją tkanek (GTR, ang. guided tissue regeneration) [2]. Technika GTR opiera się na zastosowaniu materiału w postaci półprzepuszczalnej membrany. Jak wiadomo z doniesień literaturowych komórki tkanki nabłonkowej i tkanki miękkiej proliferują szybciej niż komórki tkanki kostnej, w wyniku czego miejsce ubytku w tkance kostnej zajmuje tkanka miękka, która nie daje dostatecznego wsparcia dla zębów lub w przypadku bardziej zaawansowanego procesu chorobowego uniemożliwia zastosowanie implantów zębów [3, 4, 5]. Zadaniem membrany używanej w GTR, jest stworzenie właściwych warunków poprzez odizolowanie tkanek dziąsła i zapewnienie odpowiedniego czasu niezbędnego do odbudowy tkanki kostnej w pożądanym miejscu. Takie podejście wymaga zastosowania materiału o zdefiniowanej strukturze i właściwościach. Membrana powinna charakteryzować się asymetryczną budową: jedna strona przeznaczona do kontaktu z tkanką miękką powinna sprzyjać adhezji fibroblastów i komórek nabłonkowych, zaś druga strona powinna stymulować adhezję i wnikanie osteoblastów do miejsca ubytku, co w konsekwencji pozwoli na odbudowę nowej, zdrowej tkanki kostnej [5, 6]. Ponadto membrana powinna również umożliwiać wymianę płynów, gazów i składników odżywczych. Jak każdy biomateriał membrana powinna także być nietoksyczna, nie 7

8 I CZĘŚĆ LITERATUROWA wykazywać właściwości alergizujących, być odporna na zasiedlanie drobnoustrojami oraz powinna ulegać biodegradacji i bioresorpcji po spełnieniu swojej funkcji, co wykluczałoby powtórną operację. Obecnie na rynku dostępnych jest kilka różnych typów membran dla GTR. Jednakże materiały te mają liczne wady, do których można zaliczyć trudności w kontrolowaniu ich budowy mikrostrukturalnej, niebiodegradowalność czy odzwierzęce pochodzenie, co stwarza zagrożenia przeniesienia na pacjenta chorób i patogenów. W części literaturowej niniejszej pracy omówiono zagadnienia dotyczące genezy chorób przyzębia, sposobów ich leczenia jak i materiałów wykorzystywanych w technice GTR. 2. CHOROBY PRZYZĘBIA Choroby przyzębia stanowią bardzo poważny problem społeczny. Początkowe ich objawy, tj. krwawienie dziąseł czy nieprzyjemny zapach z ust są często lekceważone. Konsekwencją tego jest rozwijający się stan zapalny. W zależności intensywności stanu zapalnego choroby przyzębia można podzielić na dwie podstawowe grupy: choroby dziąseł zapalenia przyzębia Zarówno choroby dziąseł jak i zapalenia przyzębia są warunkowane przez dużą liczbę patogenów chorobotwórczych, co jest główną przyczyną częstego występowania problemów w obrębie jamy ustnej. Czynniki wywołujące choroby przyzębia można podzielić na te, które są niezależne od człowieka takie, jak choroby dziąseł i przyzębia pochodzenia alergicznego czy urazowego lub będące wynikiem zmian hormonalnych czy obciążeń genetycznych. Częściej jednak obserwuje się zmiany w obrębie przyzębia, które spowodowane są czynnikami zależnymi od działalności człowieka, a konkretnie wynikają one z małego stopnia świadomości, jak ważna jest prawidłowa higiena jamy 8

9 I CZĘŚĆ LITERATUROWA ustnej. Zaniedbania w tej dziedzinie powodują powstanie płytki bakteryjnej i kamienia nazębnego, w którym gromadzą się resztki pokarmu, co z kolei sprzyja rozwojowi bakterii, które są główną przyczyną powstawania stanów zapalnych w obrębie jamy ustnej [7, 8]. Niezależnie od przyczyny występowania chorób przyzębia przebieg każdej choroby jest dość podobny. W pierwszym etapie pojawia się zapalenie dziąseł, wywołane przez bakterie znajdujące się w płytce nazębnej. Płytka bakteryjna i tworzący się kamień nazębny zajmują coraz większy obszar, wbudowując się w ząb oraz gromadząc poniżej linii dziąseł w kieszonkach dziąsłowych. Długotrwałe nieleczone zapalenie dziąseł może doprowadzić do tego, że bakterie zaatakują ozębną (tkankę znajdująca się między kością dziąsła a zębem), w wyniku czego stan zapalny pogłębia się obejmując nie tylko dziąsła, ale również głębiej położone obszary. W kolejnym stadium dochodzi do zniszczenia tkanek przyzębia, a bakterie wzdłuż korzenia zębowego, przedostają się aż do głęboko umiejscowionej tkanki kostnej dziąsła. Zainfekowana kość ulega rozpadowi, co wywołuje zniszczenie nie więzadła zębodołowo-zębowego zębowego i powoduje efekt cofania się kości dziąsła (Rys. 1 B, 2 B) [9]. W wyniku tego procesu zmniejsza się pole kontaktu dziąsło-ząb co prowadzi najpierw do rozchwiania, a w późniejszym etapie do wypadania zębów. Rys. 1 Schemat przedstawiający obszar zdrowy ząb-dziąsło (A.) i obszar objęty chorobą z widocznym cofnięciem kości dziąsła (B.). 9

10 I CZĘŚĆ LITERATUROWA Bardzo poważnym problem w przebiegu chorób przyzębia jest fakt, że choroba ta może przebiegać bezobjawowo, nawet przez kilka lat, aż do momentu kiedy utrata zęba będzie praktycznie nieunikniona. Dlatego bardzo ważnym zagadnieniem jest profilaktyka, ale również opracowywanie nowych metod leczenia chorób przyzębia, które zapobiegną utracie zębów. 3. SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA Leczenie chorób przyzębia zależy od stopnia zaawansowania choroby, jak również od tego czy mamy do czynienia z zapaleniem dziąseł, czy wystąpiło także zapalenie przyzębia. Różnica między tymi dwiema jednostkami chorobowymi wynika z głębokości osadzenia płytki bakteryjnej. W przypadku zapalenia dziąseł płytka bakteryjna znajduje się nad dziąsłem, natomiast jeśli występuje również zapalenie przyzębia, płytka bakteryjna sięga głębiej, poniżej linii dziąseł osadzając się w patologicznej kieszonce dziąsłowej. Doboru metody leczenia dokonuje lekarz na podstawie stopnia zaawansowania choroby oraz wywiadu ogólnego Niechirurgiczne sposoby leczenia W przypadku niewielkiego stopnia zaawansowania choroby zadowalające efekty dają mniej inwazyjne metody leczenia. Podstawowym zabiegiem, mającym działanie lecznicze, ale również profilaktyczne jest usuwanie złogów płytki nazębnej (skaling nad- i poddziąsłowy) jak również polerowanie szyjek i korzeni zębów. W niektórych przypadkach skuteczna jest też farmakoterapia, w której stosuje się np. antybiotyki o działaniu ogólnym lub miejscowym, sole metali ciężkich, witaminy, środki dezynfekujące, ściągające lub/i przeciwzapalne [10]. 10

11 I CZĘŚĆ LITERATUROWA 3.2. Chirurgiczne metody leczenia Leczenie chirurgiczne stosuje się w przypadku bardziej zaawansowanych postaci chorób przyzębia, a ich celem jest: regeneracja ubytków tkanki kostnej przywrócenie fizjologicznych konturów dziąsła odsłonięcie miejsc niedostępnych dla oczyszczenia uzębienia Pierwszą grupą metod chirurgicznych są zabiegi polegające na poszerzeniu dziąsła (metody plastyczne), do drugiej grupy zalicza się metody, których efektem jest redukcja lub eliminacja kieszonek przyzębnych (metody resekcyjne). Jednak najbardziej interesujące, z punktu widzenia skuteczności oraz inżynierii biomateriałów, wydają się być metody regeneracyjne Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na reperacji W przypadku rozległych uszkodzeń tkanek procesy naprawcze przebiegają poprzez wytworzenie tkanki łącznej wypełniającej ubytek, tzw. blizny łącznotkankowej. Proces ten określany jest mianem reperacji, bo umożliwia zachowanie integralności uszkodzonych tkanek, ale nie prowadzi on jednak do przywrócenia ich pełnej funkcjonalności i struktury. Czynnikami sprzyjającymi bliznowaceniu są intensywny stan zapalny, duża wielkość ubytku oraz czynniki osobnicze (np. wiek pacjenta). W wyniku bliznowacenia powstaje tkanka niemalże bezkomórkowa, uboga w naczynia krwionośne zawierająca dużo kolagenu. Powstanie tkanki bliznowatej jest zwykle procesem nieodwracalnym i niekorzystnym, gdyż w jego wyniku nie zostają odtworzone naturalne struktury tkankowe. W przypadku chirurgicznych metod leczenia chorób przyzębia zarówno metody plastyczne jak i resekcyjne przyczyniają się jedynie do reperacji tkanek przyzębia, tj. dochodzi do ustąpienia objawów klinicznych choroby (zapalenia), a w miejscu ubytku powstaje tkanka łączna, wytworzona przez fibroblasty dziąsła. W wyniku tego tworzy 11

12 I CZĘŚĆ LITERATUROWA się tzw. długi przyczep nabłonkowy, będący efektem szybkiego narastania nabłonka dziąsła, który może sięgać aż do dna ubytku kostnego. Reparację można więc zdefiniować jako proces gojenia się rany, w wyniku którego powstają tkanki, których budowa i funkcje nie są identyczne z tkanką zniszczoną (Rys. 2 A C). Wynika z tego, że reparacja nie zapewnia pełnego odtworzenia struktury, ani funkcji utraconych tkanek przyzębia. Rys. 2 Schemat prawidłowego obszaru ząb-dziąsło (A.), obszaru objętego chorobą z widoczna kieszonką dziąsłową i zanikiem kości wyrostka zębodołowego i więzadła zębodołowo-zębowego zębowego (B.) oraz obszaru po leczeniu metodą reparacji (C.) i regeneracji (D.) [12]. 12

13 I CZĘŚĆ LITERATUROWA Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na regeneracji Odzyskanie pełnej funkcji i struktury tkanek przyzębia zapewnia metoda sterowanej regeneracji tkanek GTR (Rys. 2 D). Metoda ta opiera się na zastosowaniu odpowiedniego materiału, w postaci membrany (błony) regeneracyjnej (Rys. 3 A). Membranę wszczepia się pod płat dziąsłowy, tak aby jeden jej koniec opierał się o brzeg zachowanego fragmentu wyrostka zębodołowego, a z drugiej strony przymocowuje do szyjki zęba. Dzięki temu membrana oddziela tkanki dziąsła od powierzchni korzenia zębowego na okres od kilku tygodni do kilku miesięcy. W tym czasie możliwe jest zajście procesu regeneracji, ponieważ wszczepiony materiał uniemożliwia komórkom nabłonka i fibroblastom dziąsła wnikanie do ubytku kostnego i wytworzenie blizny łącznotkankowej. W wyniku tego, dochodzi do aktywacji komórek ozębnej, które zaczynają odtwarzać nowy cement korzeniowy wraz z włóknami kolagenowymi oraz dochodzi do aktywacji komórek osteogennych odtwarzających kość (Rys. 3 B). Dzięki metodzie GTR możliwe jest odtworzenie struktur, które mają znacznie większą odporność na uszkodzenia niż tkanki powstające w trakcie procesu reperacji [11, 12]. GTR jest więc techniką, która umożliwia odtwarzanie funkcji i struktury uszkodzonych tkanek poprzez wykorzystanie naturalnych możliwości tkanek do ich regeneracji i przeciwdziałanie powstawaniu tkanki bliznowatej. Jednakowoż proces regeneracji jest bardzo złożony i aby był możliwy, czyli aby doszło do pełnej regeneracji tkanki kostnej, oprócz wyżej wymienionej membrany, spełniającej funkcje nośnika/aktywatora komórek, muszą zostać spełnione jeszcze dwa warunki. Pierwszym jest obecność komórek osteogennych macierzystych, częściowo zróżnicowanych (preosteoblasty) i komórek zróżnicowanych (osteoblasty), czyli komórek które będą w stanie odtworzyć utracone struktury kostne. Drugim warunkiem koniecznym do zajścia procesu regeneracji są cząstki sygnałowe procesu gojenia, tj. czynniki wzrostu, cytokiny, hormony, witaminy czy białka morfogenetyczne kości (BMP, bone morphogenetic proteins). Razem te trzy czynniki: materiał będący aktywatorem, komórki kościotwórcze i cząstki sygnałowe procesu gojenia, stanowią tzw. triadę Lyncha, która jest konieczna, aby zaszedł proces regeneracji [13, 14, 15]. 13

14 I CZĘŚĆ LITERATUROWA Rys. 3 Schemat umieszczenia membrany GTR pod powierzchnią dziąsła (A.), proces aktywacji osteoblastów (B.) [12]. Rys. 4 Schemat przedstawiający triadę Lyncha [13]. Reasumując choroby przyzębia stanowią rozległy problem społeczny. W leczeniu tych chorób ogromną rolę odgrywa profilaktyka, jednakże z uwagi na to, że choroba w stadium początkowym często jest lekceważona lub przebiega bezobjawowo dochodzi do znacznego jego postępu. W takim wypadku niezbędne jest włączenie 14

15 I CZĘŚĆ LITERATUROWA w proces leczenia zabiegów chirurgicznych. Przeprowadzone badania dowodzą, że najlepsze rezultaty osiągane są przy zastosowaniu metod sterowanej regeneracji tkanek GTR. W metodzie tej wykorzystywane są biomateriały w postaci membran o ściśle zdefiniowanej budowie i właściwościach. W dalszej części rozprawy przedstawiono założenia, metody otrzymywania, charakterystykę właściwości oraz wady i zalety obecnie używanych membran stosowanych w technice GTR. 4. MEMBRANY WYKORZYSTYWANE DO LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA METODĄ STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR) Membrany są szeroko stosowane nie tylko w sterowanej regeneracji tkanek, ale w całej medycynie. Są wykorzystywane m.in. w sztucznych narządach, bioseparatorach, inżynierii tkankowej, w systemach dostarczania leków czy urządzeniach diagnostycznych [16]. Z uwagi na tematykę niniejszej pracy poruszane w tym rozdziale zagadnienia będą dotyczyć membran stosowanych w technice GTR Wymagania stawiane materiałom membranowym do sterowanej regeneracji tkanek Membrany stosowane w technice GTR, w pierwszej kolejności powinny spełniać wymagania stawiane wszystkim biomateriałom. Powinny być biozgodne, umożliwiając integrację materiału z tkankami gospodarza, nie powinny wywoływać stanu zapalnego o dużym nasileniu, a także powinien je cechować brak właściwości alergizujących, kancerogennych i mutagennych [16, 17]. Oprócz tego membranom do GTR stawia się dodatkowe wymagania, które wynikają ściśle z funkcji jaką tak membrana ma pełnić. Jak już wspomniano membrana do GTR ma służyć jako bariera pomiędzy tkanką miękką a tkanką kostną. Z tego stwierdzenia można wnioskować, że materiał taki powinien charakteryzować się odpowiednimi właściwościami mechanicznymi i sztywnością [17, 18]. Membrana nie powinna ulegać zapadaniu do wnętrza ubytku, ponieważ w przeciwnym razie nie zapewni odpowiednich warunków potrzebnych do regeneracji tkanki kostnej. Powierzchnia membrany powinna 15

16 I CZĘŚĆ LITERATUROWA również umożliwiać aktywację i proliferację komórek kościotwórczych z jednej strony, a z drugiej strony zapobiegać wnikaniu do ubytku komórek tkanki miękkiej. Stąd budowa membrany powinna być asymetryczna gładsza ze strony przeznaczonej do kontaktu z tkanką miękką i bardziej porowata od strony tkanki kostnej (Rys. 5). Rys. 5 Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany przeznaczonej do sterowanej regeneracji tkanek. Mikrofotografie SEM pochodzą z badań własnych. Kolejną ważną cechą membrany jest podatność na degradację i resorpcję materiału, z którego jest wytworzona. Nie jest to warunek konieczny, ale pożądany. Wynika to z faktu, że w przypadku materiału niedegradowalnego membrana po spełnieniu swojej funkcji musi zostać usunięta z organizmu. Wiąże się to z koniecznością przeprowadzenia kolejnego zabiegu, a więc z dodatkowymi obciążeniami dla pacjenta oraz podniesieniem kosztów leczenia [6, 19]. W przypadku materiału ulegającego biodegradacji czas jego działania powinien wynosić co najmniej 4 6 tygodni, ponieważ jest to czas, który z powodzeniem umożliwia regenerację periodontologiczną 16

17 I CZĘŚĆ LITERATUROWA [17, 20, 21]. Natomiast produkty degradacji nie mogą być toksyczne, a ich usunięcie z organizmu powinno być możliwe na drodze metabolicznej [22]. Poza tym, uwzględniając cechy technologiczne, aby możliwe było wprowadzenie do masowej produkcji nowego biomateriału, membrana powinna spełniać wymagania takie jak: łatwa i szybka produkcja oraz możliwość dostosowana kształtu i wielkości wyrobu do zapotrzebowania. Co więcej możliwe musi być przeprowadzenia procesu sterylizacji materiału, który nie zmieni jego właściwości, a produkt końcowy powinien być poręczny chirurgicznie i dawać możliwość łatwego zastosowania oraz dopasowania do potrzeb indywidualnego pacjenta [23] Rodzaje membran stosowanych w technice GTR Membrany stosowane w GTR można podzielić na dwie podstawowe grupy. Podział ten oparty został na zdolności materiału do degradacji, stąd możemy wyróżnić: membrany nieresorbowalne membrany resorbowalne Jako osobną grupę materiałów wyróżnia się również: membrany gradientowe (FGM, ang. functional gradient materials) Membrany nieresorbowane Pierwszą handlową membraną, która została wykorzystana do leczenia chorób przyzębia metodą sterowanej regeneracji tkanek była nieresorbowalana membrana z ekspandowanego politetrafluoroetylenu (e-ptfe, Gore-Tex Membrane, W.L. Gore & Assos., Flagstaff, AZ., USA) [5]. Pierwszy raz została ona użyta w 1984 roku, a jej budowa odzwierciedla założenia stawiane membranom do GTR, gdyż posiada ona asymetryczną, porowatą mikrostrukturę [24]. Membrana e-ptfe zbudowana jest z litych węzłów polimerowych połączonych ze sobą włóknami (Rys. 6), a włókna ułożone są tak, że z jednej strony tworzą strukturę o porowatości 90% i grubości około 1 mm, a z drugiej porowatość wynosi 30%, a grubość około 0,15 mm [17]. 17

18 I CZĘŚĆ LITERATUROWA Rys. 6 Mikrostruktura e-ptfe [25]. Membrany e-ptfe są otrzymywane poprzez kontrolowane rozciąganie foli teflonowej oraz wprasowanie jej w matrycę polimerową posiadającą określoną strukturę (np. Dacron lub Nylon ), dzięki czemu w PTFE dochodzi do samorzutnego tworzenia się porów. Obecnie na rynku dostępne są również inne membrany na bazie PTFE np. politetrafluoroetylen o wysokiej gęstości (d-ptfe, Cytoplast TXT-200) (Rys. 7) [17]. Membrany te zostały wprowadzone do użycia w 1993 roku. Posiadają inną budową niż e-ptfe posiadają pory o wielkości 0,2 m [17]. Badania pokazały, że membrany z d-ptfe są w mniejszym stopniu zasiedlane przez drobnoustroje i łatwiejsze do usunięcia po procesie leczenia, niż membrany e-ptfe [17, 26]. Stosowane są również membrany kompozytowe z d-ptfe połączone z siatką tytanową (Cytoplast Ti-250). Modyfikacja ta polega na umieszczeniu siatki tytanowej między dwiema warstwami d-ptfe. Takie rozwiązanie poprawia wytrzymałość membran i ma na celu zapobieganie ewentualnemu zapadaniu się membrany do wnętrza ubytku tkanki kostnej, ponieważ ograniczenie obszaru pod membraną wpływa niekorzystnie na warunki regeneracji [17, 24]. Oprócz siatki wzmacniającej sam tytan w postaci folii jest również stosowany jako materiał membranowy. Tytan jest wykorzystywany jako membrana ze względu na to, że posiada wysoką odporność na zakażenia bakteryjne i w przypadku odsłonięcia implantu w trakcie leczenia, nie wywołuje i nie podtrzymuje infekcji [27]. 18

19 I CZĘŚĆ LITERATUROWA Rys. 7 Biostabilne membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości (d-ptfe, Cytoplast TXT-200) i z d-ptfe wzmocnionego siatką tytanową (Cytoplast Ti-250) przeznaczone do GTR [28]. Zaletą nieresorbowalnych materiałów jest to, że są one uważane za chemicznie obojętne i za biozgodne w kontakcie z żywym organizmem. Posiadają one dobre właściwości barierowe, zapewniając odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyzębia. Wadą tych materiałów jest to, że jeśli w czasie procesu regeneracji dojdzie do odsłonięcia membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowoż, główną wadą nieresorbowanych membran, jak już wspomniano wcześniej, jest fakt, że po spełnieniu swojej funkcji membrana musi zostać usunięta z leczonego miejsca. Wiąże się do z koniecznością nością przeprowadzenie kolejnego zabiegu, w trakcie którego dochodzi do ponownego otworzenia już wygojonej rany. Stanowi to dodatkowe obciążenie dla pacjenta, przedłuża czas leczenia i podnosi jego koszty [6, 19, 29, 30, 31, 32] Membrany resorbowalne Drugą grupą materiałów używanych w GTR, są materiały ulegające degradacji enzymatycznej lub hydrolitycznej. Degradacji enzymatycznej ulegają materiały pochodzenia naturalnego, natomiast degradacja hydrolityczna zachodzi w polimerach pochodzenia syntetycznego. W obu przypadkach zjawiskiem towarzyszącym w czasie rozkładu materiału jest powstanie produktów ubocznych. Produkty te mogą być 19

20 I CZĘŚĆ LITERATUROWA wydzielane poza organizm lub być w nim zatrzymywane. Ważne jest aby produkty degradacji nie wywierały negatywnego wpływu na organizm żywy [33]. Dzięki możliwości degradacji po spełnieniu swojej funkcji membrana zanika. Poprzez zastosowanie membrany z materiału resorbowalnego lub degradowanego można wyeliminować główną wadę materiałów stabilnych, tj. potrzebę powtórnej operacji w celu usunięcia biomateriału. Podział materiałów resorbowalnych na dwie grupy wynika z ich pochodzenia i mechanizmu ich degradacji Materiały membranowe pochodzenia naturalnego Podstawowym materiałem naturalnym, wykorzystywanym do wytworzenia membrany dla GTR jest kolagen, najczęściej typu I. Może to być kolagen pochodzący z ludzkiej skóry (Alloderm, LifeCell, Branchburg, NJ, USA), bądź wyekstrahowany z wołowych ścięgien Achillesa (Cytoplast RTM Collagen, City, State, USA) lub świńskiej skóry (Bio-Gide, Osteohealth, Shirley, NY, USA) [13]. Pochodzenie kolagenu jest różne, natomiast jak wiadomo kolagen jest podstawowym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej, stąd wynikają jego bardzo dobre właściwości biologiczne, zaś membrany kolagenowe charakteryzują się bardzo dobrym powinowactwem do komórek oraz biozgodnością [6, 34, 35]. Na Rys. 8 przedstawiono budowę membrany BioGide. Jak widać membrana ta ma asymetryczną budowę, z jednej strony przeznaczonej do kontaktu z tkanką miękką membrana jest gładsza (Rys. 8 C), a z drugiej bardziej chropowata co sprzyja proliferacji komórek kostnych (Rys. 8 D). Włóknista budowa membran kolagenowych (Rys. 8, 9) przyśpiesza formowanie skrzepu i stabilizuje ranę, oprócz tego stymuluje degranulację płytek krwi, w trakcie której uwalniane są np. czynniki wzrostu, co z kolei może wpłynąć korzystnie na proces regeneracji [37]. Membrany kolagenowe są otrzymywane kilku etapowo. W pierwszym etapie kolagen zostaje rozpuszczony, następnie przygotowany roztwór zostaje zamrożony (-20 ), a ostateczną, włóknistą strukturę otrzymuje się poprzez proces suszenia sublimacyjnego (liofilizacji) i prasowania. Inną metodą może być przędzenie w środowisku 99,5% alkoholu etylowego. Otrzymany produkt poddaje się procesowi płukania i suszenia pod obniżonym ciśnieniem. Następnie kolagen sieciuje się w aldehydzie gluarowym oraz poddaje ponownemu płukaniu i prasowaniu. [36]. 20

21 I CZĘŚĆ LITERATUROWA Rys. 8 Budowa membrany BioGide A. powiększenie 40x B. powiększenie 100x, C. strona gładsza, powiększenie 250x, D. strona bardziej chropowata, powiększenie 10000x [37]. Rys. 9 Budowa membrany Cytoplast RTM Collagen [28]. 21

22 I CZĘŚĆ LITERATUROWA Pomimo wielu zalet, stosowanie membran kolagenowych pociąga za sobą również pewne ograniczenia. Po pierwsze koszty pozyskania surowca kolagenowego są stosunkowo wysokie, a liczba źródeł ograniczona. Jednakże największym problemem wydaje się być fakt, że kolagen jako materiał pochodzenia naturalnego charakteryzuje się zmiennością właściwości oraz budowy, w wyniku czego pojawiają się trudności w kontrolowaniu właściwości mechanicznych i jak czasu degradacji wyrobów finalnych [13]. Badania pokazały, że wytrzymałość membran kolagenowych znacznie spada w momencie, kiedy membrana zaczyna się degradować [6], co może sprzyjać zapadaniu się membrany do wnętrza ubytku i powodować ograniczenie obszaru regeneracji tkanki kostnej. Tę wadę można korygować stosując proces sieciowania struktury kolagenu (cross-linking) za pomocą promieniowania ultrafioletowego czy środków chemicznych tj. aldechydu glutarowego lub związków pochodzenia naturalnego np. genipiny [13, 38, 39, 40]. Sieciowanie poprawia wytrzymałość oraz wydłuża czas resorpcji membrany kolagenowej, nie zmieniając przy tym jej mikrostruktury. Oprócz wyżej wymienionych wad istnieje również ryzyko, że pomimo ostrych wymagań dotyczących przetwarzania i produkcji membran z materiałów pochodzenia naturalnego, nastąpi przeniesienia chorób i patogenów pochodzenia zwierzęcego do organizmu ludzkiego. W niektórych kręgach również względy światopoglądowe (ze względu na pochodzenie kolagenu) mogą powodować ograniczenia w użyciu membran kolagenowych. Z uwagi na wymienione ograniczenia membran pochodzenia naturalnego oczywistą alternatywą wydają się być degradowalne materiały pochodzenia syntetycznego Materiały membranowe pochodzenia syntetycznego Większość syntetycznych membran stosowanych w GTR wytwarzana jest z polimerów należących do grupy poliestrów alifatycznych takich jak: poliglikolid (PGA), polilaktyd (PLA), poli( -kaprolakton) (PCL) czy ich kopolimery. Poliestry alifatyczne są obecnie wykorzystywane w medycynie jako resorbowalne materiały implantacyjne w postaci nici chirurgicznych, śrub czy płytek. Znalazły one również zastosowanie w farmacji jako nośniki leków w systemach kontrolowanego ich uwalniania [19, 22, 33, 41, 42]. Podstawowymi zaletami syntetycznych poliestrów alifatycznych są biozgodność, biodegradacja, brak zagrożeń jakie niesie za sobą wykorzystanie materiałów pochodzenia odzwierzęcego oraz możliwość lepszej kontroli ich struktury i właściwości mechanicznych. Dzięki lepszej powtarzalności procesu otrzymywania 22

23 I CZĘŚĆ LITERATUROWA materiałów możliwe jest również kontrolowanie czasu degradacji i ustalenie po jakim czasie następuje znaczny spadek wytrzymałości, który zagrażałby zapadaniu się materiału do wnętrza ubytku. Pierwszą, obecnie niedostępną komercyjnie degradowalną membraną używaną w GTR była membrana o nazwie handlowej Guidor [17], która została wytworzona z PLA i poddana działaniu acetylocytrynianutributylu, w celu nadania jej większej elastyczności. Membrana ta składa się z dwóch warstw: warstwa zewnętrzna, przeznaczona do kontaktu z dziąsłem, charakteryzuje się dużymi, prostokątnymi porami, natomiast warstwa wewnętrzna, małymi okrągłymi porami które mają na celu opóźnienie penetracji ubytku przez tkankę miękką, przy jednoczesnym umożliwieniu przepływu substancji odżywczych. Między tymi dwiema warstwami znajdują się również bariery tworzące szczeliny, aby umożliwić wzrost tkanki kostnej. Producenci podają, że struktura membrany nie zmienia się przez pierwsze 6 tygodni, mimo degradacji, a całkowita resorpcja materiału zachodzi po upływie roku [43]. Kolejnym przykładem membrany z PLA jest Epi-Guide, która posiada trójwarstwową budowę i różni się porowatością w zależności od strony oraz utrzymuje swoje właściwości przez 5 miesięcy, a całkowitej resorpcji ulega po roku od implantacji [44, 45]. Innym rodzajem membran, ale również z PLA jest membrana Atrisorb. Jest to materiał w postaci żelu składający się z poli(d,l-laktydu) zawieszonego w N-metylo-2- pirolidonie. Grubość membrany wynosi m, a jej czas degradacji wynosi 6-12 miesięcy [46, 47]. Jednym z kopolimerów, używanych do wytwarzania membran do GTR jest kopolimer laktydu z glikolidem (PLGA). Duże zainteresowanie tym materiałem wynika z faktu, że posiada on bardzo dobre właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne. Liczne badania pokazują, że PLGA jest materiałem biozgodnym [22, 48, 49]. Co więcej, PLGA ulega degradacji hydrolitycznej, której produktami są nietoksyczne związki naturalnie występujące w organizmie (kwas mlekowy i glikolowy), które usuwane są z niego w trakcie przemian metabolicznych (cykl Krebsa) [50]. Kolejną zaletą PLGA jest to, że dzięki zmianom udziału laktydu i glikolidu możliwe jest sterowanie właściwościami mechanicznymi oraz kinetyką degradacji [22, 42, 48, 49]. Obecnie na rynku medycznym dostępne są dwie membrany produkowane z PLGA: Vicryl Periodontal Mesh oraz Resolut. Pierwsza zbudowana jest z włókien poliglaktyny 910 (kopolimer glikolidu z laktydem w stosunku 9:1). Membranę Vicryl cechuje brak odpowiedzi 23