BIOTECHNOLOGIA. Zajęcia prowadzone przez Zakład Biologii Molekularnej i Zakład Regulacji Metabolizmu

Transkrypt

1 BIOTECHNOLOGIA Zajęcia prowadzone przez Zakład Biologii Molekularnej i Zakład Regulacji Metabolizmu Materiały do ćwiczeń dla studentów kierunku Biotechnologia w roku akademickim 2009/2010 opracowane przez pracowników Zakładu Biologii Molekularnej i Zakładu Regulacji Metabolizmu. Redakcja: Rafał Derlacz i Joanna Trzcińska-Danielewicz 1

2 Plan ćwiczeń: Dzień pierwszy Ekstrakcja inwertazy z drożdży piekarniczych Immobilizacja inwertazy Hydroliza roztworu sacharozy Izolowanie immunoglobulin Przygotowanie próbek do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS Dzień drugi Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym z SDS Sporządzanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących Oznaczanie cukrów redukujących w pobranych próbkach Dzień trzeci Określenie wydajności reakcji hydrolizy sacharozy opracowanie wyników Analiza stopnia czystości otrzymanego preparatu IgG i wyznaczenie wielkość łańcucha lekkiego i ciężkiego na podstawie obrazu elektroforetycznego Kontakt: Rafał Derlacz Jan Fronk Zakład Regulacji Metabolizmu Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii UW Instytut Biochemii UW Budynek D, II piętro, pokój 209 Budynek D, I piętro, pokój 103 tel tel

3 Regulamin pracowni: 1. W pracowni należy zachować ostrożność, porządek i czystość. 2. W pracowni należy nosić bezpieczne obuwie i fartuch laboratoryjny, a przy pracy z substancjami szkodliwymi rękawiczki gumowe. Okrycia wierzchnie należy pozostawić w szatni wydziałowej. 3. Opuszczając stanowisko pracy należy sprawdzić czy wszystkie niepotrzebne urządzenia elektryczne, gaz i woda zostały wyłączone, drobny sprzęt odłożony na miejsce, a użyte naczynia laboratoryjne umyte i odłożone do suszenia. 4. Studenci nie mogą pracować w pracowni bez opieki pracownika dydaktycznego. 5. W pracowni nie wolno palić tytoniu, spożywać posiłków i napojów, aplikować kosmetyków. Nie używać do celów spożywczych naczyń laboratoryjnych. 6. Odczynniki należy przechowywać w odpowiednim porządku. Nie wolno trzymać żadnych substancji w niepodpisanych opakowaniach. Łatwopalne rozpuszczalniki, a także stężone kwasy i zasady można przechowywać w pracowniach pod wyciągiem tylko w ilościach zaspokajających bieżące potrzeby. 7. Prace z rozpuszczalnikami organicznymi należy prowadzić przy sprawnie działającej wentylacji. Podczas pracy nie wolno używać otwartego ognia. Etanol używany w pracowni jest skażony. 8. Prace z kwasami i zasadami należy prowadzić pod sprawnie działającym wyciągiem chemicznym. 9. Nigdy nie należy pipetować ustami substancji trujących, żrących lub innych szkodliwych dla zdrowia. 10. Odpadów substancji, które mogą stanowić zagrożenie dla środowiska naturalnego nie wolno wylewać do zlewów. Należy je zlewać do szczelnych podpisanych butelek i przechowywać pod wyciągiem. Będą okresowo zbierane do zniszczenia. 11. Odpady innych stężonych substancji można wylewać do zlewu po ich znacznym rozcieńczeniu, obficie spłukując wodą z kranu. 12. Okna w pracowni można tylko uchylać w pozycji pionowej. Nie otwierać ich na oścież. 13. W razie zaistnienia nawet najmniejszego wypadku należy niezwłocznie powiadomić opiekującego się pracownią pracownika dydaktycznego. W opisie ćwiczeń zastosowano następujące symbole: odczynnik gotowy uwaga dotycząca czynności niebezpiecznych 3

4 1. Oczyszczanie frakcji immunoglobulin G (IgG) z surowicy królika Jedną z metod oczyszczania białek jest chromatografia powinowactwa. Jest to szczególny typ chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Pierwsza z nich (tzw. ligand), chemicznie związany z nierozpuszczalnym nośnikiem, specyficznie adsorbuje drugą substancję (substrat). Specyficzne oddziaływanie tych dwóch substancji może mieć różny charakter, na przykład taki, jak między: hormonem a receptorem enzymem a substratem, czy inhibitorem przeciwciałem a antygenem komplementarnymi odcinkami kwasów nukleinowych kwasami nukleinowymi a białkami. Swoistość tego oddziaływania jest niekiedy tak duża, że pozwala na otrzymanie w jednoetapowej procedurze praktycznie czystego preparatu nawet z bardzo złożonych mieszanin, takich jak homogenaty tkankowe. Poza wykorzystaniem naturalnie występujących par substrat-ligand, można tak modyfikować niektóre substancje (np. białka otrzymywane z organizmów transgenicznych), by zyskały one powinowactwo do określonego ligandu. Jako nośniki w chromatografii powinowactwa stosuje się złoża tradycyjnie wykorzystywane do filtracji żelowej, przy czym przed użyciem konieczna jest ich odpowiednia aktywacja, umożliwiająca związanie ligandu. Często ten sam ligand bywa wykorzystywany do izolowania różnych grup substratów. Na przykład złoże ze związanym białkiem A może wiązać większość immunoglobulin klasy G, a do złoża z przyłączonym polinukleotydem poli(u) lub poli(t) mogą wiązać się różne cząsteczki mrna. Związki izolowane przy użyciu chromatografii powinowactwa można eluować zarówno w sposób specyficzny (np. przez użyciu substancji o większym powinowactwie do substancji oczyszczanej niż ligand), jak i niespecyficzny (np. za pomocą buforów o niskim lub wysokim ph, wysokiej siły jonowej, czy związków rozrywających wiązania wodorowe). Całą procedurę chromatografii powinowactwa możemy podzielić na następujące etapy: chemiczne wiązanie ligandu ze złożem (nie jest konieczne, gdy korzysta się już z gotowego złoża z dołączonym ligandem) specyficzne wiązanie substratu do unieruchomionego ligandu usunięcie substancji niezwiązanych i związanych niespecyficznie elucja specyficznie związanego substratu. Poniższe ćwiczenie polega na oczyszczeniu frakcji przeciwciał IgG z surowicy królika przy pomocy chromatografii powinowactwa. Przeciwciała (immunoglobuliny) są to białka wydzielane przez limfocyty B, które mają zdolność do swoistego rozpoznawania i wiązania antygenów (białek, cukrów, lipidów, kwasów nukleinowych), czyli substancji wywołujących odpowiedź immunologiczną organizmu. W zależności od struktury i funkcji przeciwciała można podzielić na pięć klas: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. W surowicy krwi najobficiej występują przeciwciała IgG, które zapewniają odporność organizmu na czynniki infekcyjne dostające się przez krew. Są również jedynymi przeciwciałami zdolnymi do przejścia przez łożysko, zapewniając w ten sposób ochronę immunologiczną płodu. Cząsteczka IgG o masie cząsteczkowej około 150 kda ma kształt litery Y i zbudowana jest z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (m.cz około 25 kda) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (m.cz. około 50 kda). Łańcuchy lekkie i ciężkie są połączone ze sobą 4

5 wiązaniami (mostkami) dwusiarczkowymi. Funkcjonalnie w cząsteczce IgG można wyróżnić dwa rejony Fab rozpoznające antygen i rejon Fc oddziaływujący z innymi składnikami układu odpornościowego (Rys. 1). łańcuch lekki S-S S-S fragmenty Fab mostki dwusiarczkowe S-S S-S łańcuch ciężki fragment Fc Rys. 1 Schemat budowy przeciwciała Różnorodność przeciwciał wytwarzanych przez dany organizm jest ogromna (u człowieka szacuje się ją na ponad 10 8!), ponieważ mają one rozpoznawać/wiązać teoretycznie wszystkie antygeny, z którymi może się on zetknąć w swoim otoczeniu. Odkrycie, jak taka wielka różnorodność przeciwciał zakodowana jest w materiale genetycznym komórki ssaczej zostało wyróżnione Nagrodą Nobla. Co więcej, organizm naturalnie wytwarza wiele różniących się między sobą przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu antygenowi. Dlatego surowice/przeciwciała przeciwko antygenowi otrzymane z krwi jakiegoś organizmu, np. królika, nazywane są poliklonalnymi. Przy użyciu specjalnej techniki (również wyróżnionej Nagrodą Nobla) możliwa jest także produkcja, np. w hodowli komórek mysich, preparatów identycznych (monoklonalnych) przeciwciał przeciwko danemu antygenowi. Ze względu na wybiórcze działanie (rozpoznawanie w zasadzie tylko "swojego" antygenu) przeciwciała są niezastąpionym narzędziem mającym zastosowanie w medycynie przy leczeniu, diagnostyce i profilaktyce oraz w badaniach naukowych. Typowe przykłady zastosowania przeciwciał w leczeniu to podanie surowicy z wysokim mianem odpowiednich przeciwciał, otrzymanej z innego organizmu, przy infekcji tężcem, błonicą, wścieklizną, zapaleniu wątroby typu B czy po ukąszeniu przez żmiję lub podanie stosownych przeciwciał w przypadku ciąży z konfliktem serologicznym (niezgodnością w zakresie czynnika Rh). W diagnostyce obecność stosownych przeciwciał we krwi jest wykorzystywana do oznaczania grup krwi oraz kontaktu osoby z niektórymi czynnikami infekcyjnymi, np. wirusem HIV czy prątkami gruźlicy. Przeciwciałami stwierdza się także obecność pewnych substancji w próbkach, np. hormonów przy testach ciążowych. W profilaktyce, na drodze szczepień ochronnych (np. przeciwko odrze, zapaleniu wątroby typu B czy cholerze) organizm nabywa zdolności wytwarzania odpowiedniej ilości przeciwciał we krwi, których celem w przyszłości będzie zapobieganie tym infekcjom. W badaniach naukowych przeciwciała wykorzystuje się w szeregu technik używanych przy izolacji i charakterystyce białek. 5

6 W poniższym ćwiczeniu do izolowania immunoglobulin G wykorzystuje się kolumnę napełnioną agarozą związaną z białkiem A, które jest składnikiem ściany komórkowej bakterii Staphylococcus aureus. Białko A, choć nie jest fizjologicznym ligandem dla IgG, ma zdolność w neutralnym ph do tworzenia silnych kompleksów z tymi przeciwciałami (poprzez rejon Fc IgG). Kompleksy te można rozdysocjować w kwaśnym ph. Siła wiązania się IgG do białka A w znacznym stopniu zależy od pochodzenia gatunkowego IgG (białko A silnie wiąże się z IgG człowieka, królika, świnki morskiej, świni, psa; słabiej z IgG krowy, kozy, myszy; bardzo słabo z IgG konia, owcy, szczura). Stopień czystości otrzymanego preparatu IgG zostanie oceniony metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodowego (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Elektroforeza to ruch cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. Większość metod elektroforetycznych wykorzystuje specyficzne nośniki bibułę, żele poliakryloamidowe lub agarozowe. Elektroforezę białek prowadzi się z żelach poliakryloamidowych (polyacrylamide gel electrophoresis PAGE). Rozdział białek w polu elektrycznym zależy od ich ładunku i wielkości. Im większe białko tym wolniej porusza się w polu elektrycznym, im bardziej naładowane tym porusza się szybciej. Jeżeli białko w danych warunkach ma ładunek ujemny, to migruje do anody; jeżeli dodatni do katody. Najczęściej stosuje się rozdział białek zależny tylko od ich wielkości. Polega on na rozdziale białek w żelu poliakryloamidowym z SDS (SDS-PAGE). SDS (dodecylosiarczan sodowy) jest detergentem anionowym denaturującym i opłaszczającym białko, w wyniku czego nadaje mu ładunek ujemny. W związku z tym, że w obecności SDS wszystkie białka mają ładunek ujemny, to szybkość migracji w żelu zależy wyłącznie od wielkości białka. Często dodatkowo przeprowadza się redukcję wiązań dwusiarczkowych, w wyniku czego poszczególne łańcuchy polipeptydowe białka migrują oddzielnie. W efekcie, wszystkie białka (łańcuchy polipeptydowe) mają taki sam, liniowy kształt oraz ładunek ujemny, a szybkość ich migracji w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości. W celu otrzymania jak najlepszego rozdziału białek, oprócz dobrania odpowiedniego usieciowania żelu (które zależy od stężenia akryloamidu), należy doprowadzić do sytuacji, w której wszystkie białka w momencie rozpoczęcia rozdziału będą znajdowały się w jednym miejscu - na początku żelu, a nie rozproszone w całej naniesionej objętości do kieszonki. W tym celu przygotowuje się żele składające się z dwóch części( żelu rozdzielającego o stężeniu 8-20% i żelu zagęszczającego, o stężeniu 4% przygotowanych kolejno po sobie. Wówczas przed rozpoczęciem właściwego rozdziału, białka ulegają koncentracji w żelu zagęszczającym. Białka na ogół są bezbarwne. W związku z tym po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego żel trzeba zabarwić, aby uwidocznić obecne w nim białka. W tym celu stosuje się na przykład barwienie błękitem kumasyny lub związkami srebra. SDS-PAGE można także wykorzystać do wyznaczania masy cząsteczkowej analizowanych białek. Droga migracji białka (pojedynczego łańcucha polipeptydowego) w żelu rozdzielającym jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z jego masy cząsteczkowej (małe białka migrują najdalej). W żelu o prawidłowo dobranym usieciowaniu ta zależność jest prostoliniowa. Używając mieszaniny białek o znanych masach cząsteczkowych, tzw. wzorców masy cząsteczkowej, można, w oparciu o ich drogi migracji w żelu, wykreślić krzywą wzorcową (krzywą kalibracyjną dla danego żelu) i na jej podstawie, wyznaczyć masę badanego białka 6

7 (pojedynczego łańcucha polipeptydowego), o migracji mieszczącej się w jej prostoliniowym odcinku (Rys. 2). Rys.2 Wyznaczanie masy cząsteczkowej białka w oparciu o krzywą kalibracyjną żelu SDS-PAGE wg Laemmli ego. Ze szczegółami dotyczącymi elektroforezy SDS-PAGE zapoznają się Państwo na zajęciach z Biologii Molekularnej. Dla tych z Państwa, którzy już teraz są zainteresowani tym zagadnieniem polecamy komentarz do tych zajęć, który można znaleźć na stronie internetowej Zakładu Biologii Molekularnej ( Na rys.3 przedstawiono obraz elektroforetyczny próbek z kolejnych etapów izolacji IgG poddanych elektroforezie SDS-PAGE albumin Łańcuch ciężki IgG Łańcuch lekki IgG Rys.3 Obraz elektroforetyczny próbek z kolejnych etapów izolacji IgG poddanych elektroforezie SDS-PAGE. ścieżka nr 1 mieszanina białek wzorcowych ścieżka nr 2 surowica krwi królika (próbka wyjściowa) ścieżka nr 3 wyciek z kolumny ścieżka nr 4 ostatni etap płukania przed elucją ścieżka nr 5 pierwszy etap elucji ścieżka nr 6 drugi etap elucji ścieżka nr 7 trzeci etap elucji ścieżka nr 8 ostatni etap elucji 7

8 Izolowanie immunoglobulin: Materiał biologiczny: zamrożona surowica krwi królika Odczynniki: 1. Kolumna z białkiem A przyłączonym do agarozy (ok. 0.2 ml złoża). 2. Bufor kolumnowy: 0.5 M NaCl, 50 mm Tris-HCl, ph Bufor elucyjny: 100 mm glicyna-hcl, ph 2.5 Wszystkie odczynniki przechowywać z temp 4 C (lodówka)!!! Wykonanie: UWAGA!!! Kolumna z białkiem A przyłączonym do agarozy jest do wielokrotnego użytku. Należy ją przechowywać w temperaturze 4 C i pamiętać, aby zaraz po zakończeniu elucji wymienić bufor elucyjny na bufor kolumnowy, ponieważ dłuższe działanie niskiego ph może prowadzić do nieodwracalnego zniszczenia złoża. Doświadczenie można prowadzić w temperaturze pokojowej używając schłodzonych buforów i przechowując próbki w lodzie. Wszystkie próbki uzyskiwane w trakcie preparatyki należy przechowywać w lodzie. 1. Z otrzymanej surowicy królika (200 l) pobrać 10 l i zachować do elektroforezy (probówka typu Eppendorf oznaczona nr 1). 2. Resztę surowicy nałożyć na kolumnę ze złożem [1] i zacząć zbierać wyciek do probówki oznaczonej nr Kiedy poziom surowicy zrówna się z górną powierzchnią złoża, nałożyć na kolumnę 10 ml buforu kolumnowego [2] (jednorazowo na kolumnie nie zmieści się taka objętość buforu, więc należy nakładać go porcjami). Kontynuować zbieranie wycieku z kolumny do probówki nr 2, aż do zebrania frakcji o objętości 1 ml. Kolejne porcje wycieku należy odrzucić. Ostatnią porcję wycieku o objętości 1 ml zebrać do probówki nr Po przepłukaniu złoża buforem kolumnowym, frakcję immunoglobulin wymywać czterema porcjami po 200 l buforu elucyjnego [3]. Każdą porcję eluatu zebrać do oddzielnej probówki i zachować do elektroforezy (probówki oznaczone nr 4, 5, 6 i 7). 5. Natychmiast po zakończeniu elucji przemyć złoże buforem kolumnowym [2]. Przemywanie prowadzić do momentu uzyskania wycieku o ph 8.0 (ph kontrolować papierkiem wskaźnikowym). Złoże pozostawić pod 3-4 cm warstwą buforu kolumnowego, kolumnę przechowywać zamkniętą w temperaturze 4 C. Uzyskane podczas preparatyki frakcje (probówki od 1 do 7) zamrozić lub od razu pobrać z nich odpowiednie ilości preparatów i przygotować próbki do elektroforezy wg poniższego przepisu. 8

9 Przygotowanie próbek do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE): Odczynniki: 1. Bufor Laemmli'ego 5x : M Tris-HCl, ph 6.8, 10 % (w/v) SDS, 50 % (w/v) glycerol, 5 % (v/v) -merkaptoetanol, 0.05 % (w/v) błękit bromofenolowy Wykonanie: 1. Do probówki nr 1 z surowicą dodać 490 l buforu kolumnowego [2] (czyli rozcieńczyć 50x) i z tak rozcieńczonej próbki do nowej probówki typu Eppendorf oznaczonej literą S pobrać 16 l. 2. Z probówki nr 2 z wyciekiem pobrać do nowej probówki 10 l i dodać do niej 90 l buforu kolumnowego [2] (czyli rozcieńczyć 10x). Z tak rozcieńczonej próbki do nowej probówki oznaczonej literą W pobrać pobrać16 l. 3. Z probówki nr 3 z ostatnią frakcją buforu kolumnowego do nowej probówki oznaczonej literą P pobrać 16 l. 4. Z probówek 4, 5, 6 i 7 z kolejnymi porcjami eluatu do nowych probówek oznaczonych odpowiednio E1, E2, E3 i E4 pobrać po 16 l. 5. Do próbek S, W, P, E1, E2, E3 i E4 dodać po 4 l buforu Laemmli'ego 5x [1] (jeśli bufor był przechowywany w lodówce, należy rozgrzać go przed dodaniem do próbek). Tak przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze 20 C. 6. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny przygotowanych próbek w 12% żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) Materiał: 12% żel poliakrylamidowy zawierający SDS Odczynniki: 1. Bufor do elektoforezy (ph 8.3): M Tris, M glicyna, 0.1 % (w/v) SDS 2. Mieszanina białek wzorcowych w buforze Laemmli'ego 1x: miozyna m.cz. 200 kda -galaktozydaza m.cz. 116,25 kda fosforylaza b m.cz. 97,4 kda albumina m.cz. 66 kda owoalbumina m.cz. 45 kda anhydraza m.cz. 31 kda inhibitor trypsyny m.cz. 21,5 kda lizozym m.cz. 14,4 kda aprotynina m.cz. 6,5 kda 3. Roztwór do barwienia żelu (do wielokrotnego użycia): 0.2 % (w/v) błękit Coomassie'go R-250 w roztworze woda:metanol:st. kwas octowy 5:5: % (v/v) kwas octowy 9

10 Akrylamid przed polimeryzacją jest silnie trujący. Może się zdarzyć, że pod uszczelką nie akrylamid nie spolimeryzuje całkowicie. W związku z tym pracując z żelem poliakrylamidowym wszystkie czynności należy wykonywać tylko w rękawiczkach. Opary kwasu octowego są trujące. Nigdy nie należy pipetować ustami stężonego kwasu. Odbarwianie żelu przeprowadzać pod włączonym wyciągiem chemicznym. Wykonanie: 1. Z otrzymanego żelu ostrożnie wyciągnąć grzebyk, a następnie trzymając szybki zdjąć klamry i gumową uszczelkę. 2. Umieścić żel w aparacie (szybką z wcięciem do środka aparatu), szybki umocować w aparacie małymi białymi klamrami. Wlać bufor do elektroforezy [1] do dolnego i górnego zbiornika. 3. Kieszonki w żelu przepłukać buforem do elektroforezy [1]. Uwaga!!! Przepłukanie kieszonek żelu, jak i naniesienie próbek (patrz punkt 5 można także przeprowadzić przed umieszczeniem żelu w aparacie do elekrtoforezy. 4. Przygotowane wcześniej próbki do elektroforezy S, W, P, E1, E2, E3 i E4 oraz mieszaninę białek wzorcowych otrzymaną od prowadzących [2] zawierające bufor Laemmli'ego ogrzewać przez 3 minuty w 100 o C. 5. Po zwirowaniu i schłodzeniu do temperatury pokojowej całość próbek nanieść na żel. Koniecznie zapisać kolejność naniesionych próbek 6. Włączyć chłodzenie aparatu do elektroforezy (lekko odkręcić kran) i podłączyć aparat do zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek, elektroda dodatnia od dolnej krawędzi żelu). 7. Elektroforezę prowadzić przy napięciu około 100 V do czasu przesunięcia się barwnika do dolnej krawędzi żelu (około 1.5 godz.). 8. Wyjąć szybki z żelem z aparatu, wyciągnąć przekładki i rozłożyć szybki (delikatnie podważając jedną z nich). Obciąć warstwę żelu zagęszczającego (z kieszonkami). 9. Żel umieścić w naczyniu z roztworem do barwienia żeli [3]. 10. Żel barwić przez 20 minut (lub dłużej) w pudełku na plastikowej tacy. 11. Wyjąć żel z roztworu do barwienia [3] i odbarwiać go poprzez kilkukrotne płukanie w 7% kwasie octowym [4] na gorąco (około C) pod wyciągiem chemicznym. Żel można przechowywać w 7% kwasie octowym. 12. Zanalizować otrzymany obraz elektroforetyczny i na jego podstawie wyznaczyć wielkość łańcucha lekkiego i ciężkiego IgG. Literatura: Smith, W.L. i Rollins, T.E. (1982) Meth. Enzymol. 86, Ostrove, S. (1990) Meth. Enzymol. 182, Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, Hames, B.D., Hooper, N. M., Houghton, J. D. (2001) Krótkie wykłady. PWN Warszawa. 10

11 Document&parentid=566&moduleid=13422&zone=Labsep#content Ćwiczenia z biochemii. PWN, Warszawa 2003 (pod redakcją: L. Kłyszejko- Stefanowicz). Krótkie wykłady: Biochemia. PWN, Warszawa 2004 (autorzy: D. B. Hames i N. M. Hooper). Krótkie wykłady: Immunologia. PWN, Warszawa 2005 (autorzy: P. M. Lydyard, A. Whelan i M. W. Fanger). Rola poszczególnych substancji stosowanych podczas ćwiczenia woda podstawowy rozpuszczalnik stosowany w biologii molekularnej Tris (w formie Tris-HCl, Tris-octan, Tris-glicyna) substancja buforująca, utrzymuje ph roztworu (7-8) glicyna (w formie glicyna-hcl) substancja buforująca, utrzymuje ph roztworu (2-3) NaCl substancja zapewniająca siłę jonową roztworu (także ciśnienie osmotyczne) BiałkoA-agaroza złoże do izolacji IgG SDS mocny anionowy detergent, upłynniający wszystkie błony komórkowe i denaturujący białka, nadający im ujemny ładunek wypadkowy -merkaptoetanol ( -ME) substancja redukująca, m. in. mostki dwusiarczkowe w białkach akryloamid (i N,N'-metylenobisakryloamid) substancje wytwarzające w wyniku polimeryzacji ze sobą usieciowany poliakryloamid nadsiarczan amonowy (APS) przeciwutleniacz używany przy polimeryzacji akryloamidu N,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED) katalizator polimeryzacji akryloamidu i N,N'-metylenobisakryloamidu glicerol substancja obciążająca próbkę do elektroforezy błękit bromofenolowy ciemnofioletowy barwnik migrujący do anody w trakcie SDS PAGE błękit Coomassie'go R-250 barwnik tworzący niebieskie kompleksy z białkami kwas octowy substancja do usuwania nadmiaru barwnika po barwieniu białka w żelu akryloamidowym 11

12 2. Immobilizowane enzymy w biotechnologii. Oznaczanie aktywności inwertazy. Immobilizacja jest techniką, która znacznie ogranicza swobodną dyfuzję cząstek enzymu lub komórek. Metody immmoblizacji enzymów mają zastosowanie w biochemii, biotechnologii, mikrobiologii, inżynierii chemicznej, głównie ze względu na możliwość ich wykorzystania technologicznego i handlowego. Enzymy można immobilizować metodami chemicznymi, np. kowalencyjnie wiążąc z nośnikami rozpuszczalnymi lub nierozpuszczalnymi w wodzie, lub metodami fizycznymi, np. poprzez adsorpcję na nierozpuszczalnych nośnikach, inkluzję w sieci polimerowej czy mikrokapsułkowanie wewnątrz półprzepuszczalnych membran. Stosowana procedura nie powinna wpływać na aktywność biologiczną enzymu. Od rodzaju matrycy i sposobu wiązania zależy ilość, aktywność, stabilność, optimum ph i temperatury działania immobilizowanego enzymu. Przykładem immobilizacji jest wykorzystanie jako złoża kwasu alginowego (Rys. 3) do inkluzji inwertazy, enzymu hydrolizującej sacharozę. Alginian jest to polisacharyd zbudowany z reszt kwasów D-mannuronowego (M) i L-guluronowego (G) połączonych wiązaniami 1,4. Występują w nim bloki składające się z M, z G oraz mieszane: (M M) x (G G) y (M G) z H H COOH O HO H OH H O O HO COOH OH H H H O H H H n Rys. 3 Kwas alginowy Alginian otrzymuje się z wodorostów lub niektórych szczepów bakteryjnych. Ma masę cząsteczkową około , jest nierozgałęziony, długołańuchowy. Rozpuszczony w wodzie daje lepkie roztwory, które można sterylizować (20 min w temp. 121 C). Cechą charakterystyczną alginianu jest jego pęcznienie, a z jonami metali dwu- i trójwartościowych (np. Ca 2+, Zn 2+, Mn 2+, Sr 2+, Ba 2+, Al 3+, Fe 3+, lecz nie z Mg 2+ ) tworzenie żeli. Żel alginianowy jest dość stabilny, obojętny chemicznie i ma strukturę mikroporowatą. W czasie immobilizacji enzymów w żelu alginianowym nie obserwuje się istotnej denaturacji enzymu, ponieważ nie towarzyszą temu procesowi zmiany temperatury i ph. Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności immobilizowanej inwertazy ( -fruktofuranozydazy, EC ) oraz określenie wydajności reakcji hydrolizy sacharozy. Materiał biologiczny: Świeże drożdże piekarnicze Odczynniki: mm pirofosforan sodu (ph 8,5) (50 ml) 2. Alginian sodowy (1,5% zawiesina) (20 ml) 12

13 3. 0,1 M CaCl 2 (50 ml) 4. 0,6 M roztwór sacharozy (50 ml) 5. 2% kwas 3,5-dinitrosalicylowy (DNS) w 0,4 M NaOH (50 ml) 6. 0,05 M bufor octanowy (ph 4,7) (20 ml) 7. Roztwór wzorcowy glukozy (2 mg/ml) (10 ml) Wykonanie: Ekstrakcja inwertazy z drożdży piekarniczych 30 g świeżych drożdży piekarniczych zawiesić w 30 ml 66 mm pirofosforanu sodu (ph 8,5) i pozostawić na noc w 20 C (lub termostacie w 37 C). Odwirować przy 5000 x g przez 20 min. Otrzymany supernatant, zawierający m.in. inwertazę, przechowywać zamrożony w 20 C. Studenci otrzymują przygotowany ekstrakt z drożdży piekarniczych Immobilizacja inwertazy Ekstrakt inwertazy (3 ml) miesza się z 20 ml 1,5% zawiesiny alginianu sodu. Następnie zawiesinę alginian-enzym pipetą dodaje się kroplami do roztworu 0,1 M CaCl 2. Powstające granulki immobilizowanego enzymu o średnicy od 0,1 4 mm pozostawia się na 20 min w roztworze CaCl 2 w celu ich stwardnienia. Następnie zlewa się roztwór CaCl 2, a otrzymane granulki immobilizowanego enzymu przepłukuje wodą destylowaną. Hydroliza roztworu sacharozy Szklaną zlewkę o pojemności 100 ml napełnia się 30 ml roztworu sacharozy (0,6 M) i 15 ml 0,05 M buforu octanowego (ph 4,7), a następnie do roztworu zawierającego substrat reakcji dodaje się około 100 kuleczek alginianu wapniowego z uwięzionym enzymem. Czas 0 doświadczenia liczy się od momentu dodania kulek do roztworu sacharozy. Zawartość zlewki (roztwór zawierający substrat i kulki alginianowe z immobilizowanym enzymem) miesza się przez cały czas trwania doświadczenia przy pomocy mieszadła magnetycznego. Kontrolę przebiegu hydrolizy sacharozy przeprowadzi się przez minut, pobierając do ponumerowanych probówek co 10 minut określone objętości roztworu (1 ml) do oznaczania powstających cukrów redukujących. Należy pamiętać o pobraniu próby w czasie 0. Wszystkie pobrane próby należy natychmiast zamrozić w temperaturze - 20 C. Sporządzanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących Krzywą wzorcową przygotowuje się, dodając do odpowiednio ponumerowanych probówek 0,1 ; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8 ml roztworu wzorcowego glukozy o stężeniu 2 mg/ml. Próby uzupełnia się wodą do objętości 2 ml i dodaje 0,2 ml odczynnika DNS. Następnie próby po wymieszaniu umieszcza się na 5 min we wrzącej łaźni wodnej, po czym chłodzi i mierzy ich absorpcję przy 540 nm. Krzywą wzorcową sporządza się, odkładając na osi 0X ilość glukozy w poszczególnych próbach, a na osi 0Y odpowiadającą im wartość absorbancji. Na podstawie pomiarów absorbancji dla wzorcowych roztworów glukozy (C 6 H 12 O 6, M cz = 180,16 g mol 1 ) wykreślić krzywą wzorcową. Oznaczanie cukrów redukujących w pobranych próbkach Pobrane wcześniej próby rozmrozić. Rozmrożone próbki przechowywać w lodzie. Połowę objętości z każdej pobranej próby należy przenieść do nowej probówki i uzupełnić wodą do 2 ml, dodać 0,2 ml roztworu DNS i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Następnie schłodzić, wymieszać i zmierzyć absorbancję przy 540 nm. W ten sposób śledzi się przebieg hydrolizy sacharozy w czasie. Szybkość tej reakcji zależy od aktywności immobilizowanego enzymu i jego kontaktu z substratem. 13

14 Opracowanie wyników, krzywa hydrolizy sacharozy Z krzywej wzorcowej wyznaczyć zawartość cukrów redukujących (w molach) w poszczególnych próbkach pobranych w czasie trwania reakcji. Z tych wartości wyliczyć całkowite stężenia (mm) sacharozy (C 12 H 22 O 11, M cz = 342,3 g mol 1 ) w zbiorniku w kolejnych czasach (S t ), pamiętając, że z jednej cząsteczki sacharozy powstaje cząsteczka glukozy i cząsteczka fruktozy. Znając początkowe stężenie sacharozy (S 0 ), wykreślić krzywą, informującą o wydajności reakcji. 1 0,8 (S 0 - S t )/S 0 0,6 0,4 0, Czas [min] Krzywa konwersji (przykład) Literatura: Mosbach, K. (red.) (1976) Immobilized Enzymes, Methods Enzymol