(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/18 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 31/404 ( ) A61K 31/4025 ( ) A61K 31/4545 ( ) A61K 31/495 ( ) A61K 31/452 ( ) A61K 31/501 ( ) A61K 31/4439 ( ) A61K 31/5513 ( ) A61K 31/4709 ( ) A61K 45/06 ( ) A61P 15/06 ( ) A61K 38/12 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Zastosowanie antagonistów oksytocyny i/lub wazopresyny we wspomaganym rozrodzie (30) Pierwszeństwo: PL PL US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/04 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/10 (73) Uprawniony z patentu: Ferring B.V., Hoofddorp, NL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 WALDEMAR KUCZYŃSKI, Białystok, PL PIOTR PIERZYŃSKI, Białystok, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP. Z O.O. SKR. POCZT Warszawa 130 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Wynalazek niniejszy dotyczy zastosowania barusibanu lub jego kombinacji z innymi substancjami do wytwarzania leku, którego głównym profilem działania jest blokowanie receptorów dla oksytocyny i/lub wazopresyny w nieciężarnej macicy ssaków, prowadzące do poprawy receptywności macicy na embriotransfer. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania wymienionych powyżej substancji do wytwarzania leku do regulacji czynności skurczowej macicy u osobników przechodzących procedurę sztucznej inseminacji. [0002] Techniki wspomaganego rozrodu są stosowane u ludzi w leczeniu niepłodności i u zwierząt celem wywołania ciąży. Niepłodność, która na świecie dotyka około 10% par u ludzi, można leczyć przez zapłodnienie in vitro i embriotransfer (IVF-ET) lub, w mniej skomplikowanych przypadkach, przez sztuczną inseminację. Powodzenie procedur IVF-ET u ludzi zwykle mieści się w granicach między 10% a 40% ciąż na cykl leczenia, dla inseminacji można osiągnąć poziom 20%. Ogólnie, powodzenie embriotransferu zależy od receptywności macicy, pojęcia definiowanego jako zdolność macicy do zapewnienia optymalnych warunków do zagnieżdżenia i rozwoju zarodka. Podstawowymi elementami receptywności macicy są aktywność skurczowa i stan endometrium. Nasilona kurczliwość macicy podczas embriotransferu, może spowodować wydalenie zarodka z macicy przez pochwę lub jajowody, co może być przyczyną nieskutecznego leczenia lub w tym drugim przypadku przyczyną ciąży pozamacicznej poważnego, potencjalnie niebezpiecznego dla życia, powikłania. Dodatkowo, powodzenie sztucznej inseminacji poza jakością nasienia zależy od intensywności i kierunku fal skurczów macicy, jak też od stanu endometrium. Gdy macica kurczy się od dna do szyjki, wstrzyknięte do macicy podczas zabiegu nasienie zostaje usunięte z macicy, co zaburza skuteczność zabiegu. [0003] U ludzi, cykle, w których zachodzi wewnątrzmaciczne zagnieżdżenie można charakteryzować zmniejszoną aktywnością skurczową macicy. Skurcze macicy wpływają również na zagnieżdżenie zarodka u zwierząt hodowlanych. Wiadomo, że ilość zagnieżdżeń jest ujemnie skorelowana z częstotliwością skurczów macicy. Różnica w powodzeniu transferu pomiędzy kobietami z wysoką i niską kurczliwością macicy może przekraczać 50%. Ponadto, pochodzące z macicy prostaglandyny zmniejszają ukrwienie endometrium, zaburzając podatność macicy. Zastosowanie leków zmniejszających kurczliwość macicy, takich jak beta agoniści, łączy się z częstymi reakcjami niepożądanymi i nie wpływa na ilość powodzeń przy transferze. [0004] Lesny i in., Intl. J. of Obstetrics and Gynaecology 2004, vol. 111, nr 11, str , podaje że, skurcze macicy są istotne przy transporcie nasienia i zagnieżdżeniu zarodka. Zwiększona kurczliwość bruzdy granicznej jest związana bezpośrednio z niepowodzeniem embriotransferu. Dla jej przezwyciężenia zaproponowano leczenie z zastosowaniem antagonisty oksytocyny Atosibanu. [0005] Kerin i in., Lancet, 1981, wol. 2, nr 8249, str , odnosi się do techniki przeniesienia ludzkiego zarodka do macicy. Autorzy sugerują, że leczenie za pomocą swoistych antagonistów oksytocyny powinno przezwyciężyć problemy związane z podwyższonym napięciem macicy. [0006] Celem wynalazku jest dostarczenie leków zwiększających ilość skutecznych zabiegów wspomaganego rozrodu oraz identyfikacja substancji nadających się do zastosowania do wytwarzania takich leków, biorąc pod uwagę, że takie leki powinny być wolne od działań ubocznych charakteryzujących obecnie stosowane leki i dawać poprawę klinicznej skuteczności we wspomaganym rozrodzie. [0007] Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie, określone w załączonych zastrzeżeniach. W szczególności, dotyczy zastosowania barusibanu do wytwarzania leku do poprawy receptywności macicy na embriotransfer lub w sztucznej inseminacji. 1

3 [0008] W szczególe, wynalazek dotyczy zastosowania skutecznej ilości barusibanu do wytwarzania leków stosowanych w zabiegach wspomaganego rozrodu, które mogą być zastosowane przed, w trakcie i po embriotransferze i działają przez poprawę receptywności macicy. Zgodnie z wynalazkiem, Barusiban podaje się dojelitowo lub pozajelitowo w dawce dobowej wynoszącej od 0,01mg do 10g. [0009] Konkretne zastosowanie według wynalazku dotyczy leczenia bezpłodności u ludzi, konkretniej zabiegu embriotransferu, szczególnie transferu świeżych lub mrożonych/rozmrożonych zarodków. Korzystne zastosowanie według wynalazku dotyczy zabiegu zapłodnienie pozaustrojowe - embriotransfer (IVF-ET) lub dotyczy embriotransferu, gdy oocyty lub nasienie składniki zarodka, zostały pobrane od dawcy(ów). Wynalazek konkretnie dotyczy leczenia przeprowadzanego u zwierząt hodowlanych krów, świń, koni, owiec, u których dokonano zabiegu embriotransferu. Wykonanie wynalazku dodatkowo dotyczy zastosowania innych leków, które można stosować we wspomaganym rozrodzie, szczególnie donorów tlenku azotu, substratów syntazy tlenku azotu, progestagenów, antagonistów prostaglandyn, metyloksantyn, beta-agonistów, agonistów prostacykliny. [0010] Szczególnie, leki wytwarzane zgodnie ze zdefiniowanym wynalazkiem, można zastosować w zabiegach wspomaganego rozrodu, konkretniej do regulacji aktywności skurczowej macicy, co poprawia transport nasienia w żeńskich drogach rodnych po sztucznej inseminacji. W szczególnych wykonaniach patentu dotyczy on leczenia przeprowadzanego u ludzi lub leczenia zwierząt hodowlanych krów, świń, owiec, koni, u których przeprowadzono sztuczną inseminację. Wreszcie, dodatkowy przedmiot wynalazku stanowią leki wytwarzane na podstawie powyżej określonego zgłoszenia. [0011] Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie skutecznej ilości barusibanu do wytwarzania leku stosowanego w zabiegach wspomaganego rozrodu, konkretniej w embriotransferze lub sztucznej inseminacji. Leki określone w wynalazku, stosuje się w postaci barusibanu przed i/lub w trakcie i/lub po embriotransferze, jak i przed i/lub w trakcie i/lub po sztucznej inseminacji. Leki te podaje się dojelitowo lub pozajelitowo w dawce dobowej od 0,01mg do 10g. Zastosowanie tych leków dotyczy leczenia bezpłodności u ludzi, szczególnie do zapłodnienia pozaustrojowego i transferu świeżych zarodków lub świeżo mrożonych/rozmrożonych zarodków, w sytuacji gdy obie gamety (oocyt i plemnik) są pobierane od partnerów lub gdy jedna lub obie gamety są pobierane od dawcy(ów). Leczenie barusibanem przeprowadza się również u zwierząt hodowlanych krów, świń, koni, owiec i obejmuje embriotransfer, gdzie zakłada się skuteczne zastosowanie w dawkach od 0,01mg do 10g. [0012] Leczenie barusibanem dotyczy zabiegu sztucznej inseminacji u ludzi i zwierząt hodowlanych krów, świń, koni, owiec, w którym stosuje się go przed i/lub w trakcie i/lub po zabiegu. W takim leczeniu, leki określone w wynalazku stosuje się do regulacji kurczliwości macicy, poprawy transportu nasienia w żeńskich drogach rodnych, gdy przyjmuje się dawkę dobową od 0,01mg do 10g. [0013] Zastosowanie barusibanu do wytwarzania leków stosowanych w zabiegach wspomaganego rozrodu przeprowadza się w połączeniu z zastosowaniem jednej lub kilku substancji spośród następujących: donorów tlenku azotu, substratów syntazy tlenku azotu, progestagenów, antagonistów prostaglandyn, metyloksantyn, beta agonistów, agonistów prostacykliny. [0014] Dobry profil bezpieczeństwa jest jedną z zalet leków zawierających antagonistów oksytocyny, antagonistów oksytocyny i wazopresyny lub antagonistów wazopresyny lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, na przykład atosibanu, barusibanu lub relcovaptanu, szczególnie dzięki wysokiej specyficzności i selektywności tych substancji, zwykle ograniczających działanie tych leków do macicy. 2

4 [0015] Blokowanie receptorów dla oksytocyny i/lub wazopresyny skutkuje poprawą receptywności macicy na kilka sposobów po pierwsze, przez zmniejszenie kurczliwości macicy, po drugie dzięki korzystnemu wpływowi na stan endometrium, który jest osiągany przez zahamowanie miejscowego wydzielania prostaglandyn (których wydzielenie zmniejsza perfuzję endometrium). W przypadku skurczów macicy rozchodzących się z dna do szyjki, zablokowanie receptorów dla oksytocyny i/lub wazopresyny osiągnięte przed, podczas lub po sztucznej inseminacji zapobiegnie wydaleniu wstrzykniętego nasienia z macicy do pochwy. [0016] Kombinacja antagonistów oksytocyny, antagonistów oksytocyny i wazopresyny lub antagonistów wazopresyny lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli z innymi substancjami hamującymi kurczliwość macicy, np. beta agonistami, przejawia działanie hiperaddytywne. Takie działanie można wykorzystać do zmniejszenia dawek substancji aktywnych w kombinacji leków i łączyć będzie się to z nasileniem działania substancji zastosowanych w kompozycji. W związku z tym również zmniejsza to prawdopodobieństwo działań niepożądanych. Donory tlenku azotu, substraty syntazy tlenku azotu, inhibitory prostaglandyn, metyloksantyny, mimetyki prostacykliny lub progestageny są przykładami substancji, które można łączyć z antagonistami oksytocyny lub antagonistami oksytocyny i antagonistami wazopresyny lub antagonistami wazopresyny lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami, poprawiając receptywność macicy i regulując kurczliwość macicy oraz zmniejszając prawdopodobieństwo wystąpienia działań niepożądanych. [0017] Wynalazek zwiększy ilość ciąż po embriotransferze i sztucznej inseminacji. U ludzi stanowi to o bezpośredniej społecznej korzyści dla populacji, dodatkowo powodując zmniejszenie kosztów leczenia bezpłodności. Zastosowanie wynalazku u zwierząt hodowlanych pozwoli na zmniejszenie kosztów rozrodu. [0018] W przeciwieństwie do alternatywnego zastosowania antagonistów oksytocyny ujawnionego w patencie WO , które jest zastrzeżone do zwiększenia płodności i przeżywalności zarodków u zwierząt gospodarskich, osiąganego przez wydłużenie funkcjonowania ciałka żółtego, które dostarcza źródła progesteronu i podtrzymuje ciążę, wynalazek niniejszy dotyczy procedur wspomaganego rozrodu a nie naturalnego porodu. Dodatkowo, wynalazek niniejszy nie dotyczy tworzenia lub podtrzymywania ciałka żółtego, ponieważ w cyklach, w których przenosi się zarodek, ciałko żółte nie jest obecne. Zatem, wzrost ilości ciąż według niniejszego wynalazku osiąga się na drodze innych mechanizmów poprawy receptywności macicy, zarówno w przypadku embriotransferu, jak i sztucznej inseminacji. [0019] Dla lepszego zilustrowania wynalazku, dołączono następujące figury. [0020] Fig. 1 przedstawia wykres aktywności skurczowej macicy uzyskany na drodze przezpochwowej ultrasonografii u pacjentki, której przypadek opisano w przykładzie 1. Kurczliwość macicy na wykresie B i C zaznaczono jasnym kolorem dla lepszej wizualizacji. Do analizy obrazu cyfrowego, ze względu na wymogi wysokiej jakości obrazu, wybrano okres 4 minut z 5 minut całkowitego zapisu. A) Schematyczna prezentacja zasady nieinwazyjnej oceny kurczliwości macicy (wykonane podobnie do Fanchin i n. [Hum. Reprod. 1998;13(7): ]). Opis: U- macica; En endometrium (wewnętrzna warstwa macicy) podczas skurczów macicy, obserwuje się zmiany tekstury i konturów endometrium, My- myometrium (środkowa warstwa macicy, zbudowana z tkanki mięśni gładkich), T badany segment, w którym oceniono ruchy konturu endometrium, reprezentujące aktywność skurczową macicy. B) Wykres przedstawiający aktywność skurczową macicy przed podaniem antagonisty oksytocyny atosibanu (odniesienie). Widoczna jest nadmierna aktywność skurczowa. Legenda: skurcz macicy, 1 min segment przedstawiający 1 min zapisu cyfrowego, T badany segment, w którym oceniono ruchy konturu endometrium odzwierciedlające aktywność skurczową macicy. 3

5 C) Wykres przedstawiający aktywność skurczową macicy w czasie maksymalnego działania antagonisty oksytocyny, atosibanu. Aktywność skurczowa macicy jest wyraźnie zmniejszona. Legenda: t- skurcz macicy, 1 min segment przedstawiający 1 min zapisu cyfrowego, T badany segment, w którym oceniono ruchy konturu endometrium, odzwierciedlające aktywność skurczową macicy. Figura 2, opracowana w oparciu o przykład 2, przedstawia porównanie parametrów ruchliwości ludzkiego nasienia w próbkach kontrolnych i w próbkach poddanych działaniu 3 stężeń atosibanu (odniesienie) (300nM, 1000 nm i 3000 nm). Figura obejmuje 3 wykresy: A wykres przedstawiający procent aktywnie ruchliwych plemników w odniesieniu do eksponowanych na atosiban (0 nm, 300 nm, 1000 nm i 3000 nm) i czasu ekspozycji. B wykres przedstawiający procent ruchliwych plemników w odniesieniu do ekspozycji na atosiban ( 0 nm, 300 nm, 1000 nm i 3000 nm) i czasu ekspozycji. C wykres przestawiający procent nadaktywnych ruchowo plemników w odniesieniu do ekspozycji na atosiban (0 nm, 300 nm, 1000 nm i 3000 nm) i czasu ekspozycji. Nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy grupą kontrolną (0 nm) i grupami eksperymentalnymi (atosiban 300 nm, 1000 nm lub 3000 nm). Spadek ruchliwości plemników w czasie (w 8 i 24 godzinie eksperymentu) zależy od stopniowego zmniejszania rezerwy energetycznej plemników i jest porównywalny we wszystkich ocenianych grupach. W analizie statystycznej (analiza wariancji ANOVA) nie znaleziono żadnych istotnych różnic w parametrach ruchliwości plemników. Legenda: Aktywne % - procent aktywnie ruchliwych plemników, Ruchliwość % - procent ruchliwych plemników; Nad %- procent nadaktywnych ruchowo plemników. [0021] Figura 3, opracowana w oparciu o przykład 2, przedstawia porównanie parametrów ruchomości (szybkość) plemników w próbkach kontrolnych i w próbkach z grup eksperymentalnych (eksponowanych na 3 stężenia atosibanu: 300nM, 1000nM i 3000nM). Figura 3 obejmuje 3 wykresy: A wykres przedstawiający całkowitą prędkość plemników w odniesieniu do ekspozycji na atosiban (odniesienie) (0nM, 300nM, 1000nM i 3000nM) i czasu ekspozycji; B wykres przedstawiający zmiany w prędkości liniowej plemników w odniesieniu do ekspozycji na atosiban ( 0nM, 300nM, 1000nM i 3000nM) i czasu ekspozycji; C- wykres przedstawiający zmiany w amplitudzie wychyleń bocznych główki plemników w odniesieniu do ekspozycji na atosiban (0nM, 300nM, 1000nM i 3000nM) i czasu ekspozycji; Legenda: VSL prędkość liniowa, VCL prędkość całkowita, ALH amplituda wychyleń główki. W analizie statystycznej nie znalezionych żadnych istotnych różnic pomiędzy kontrolą (0nM) i próbkami eksperymentalnymi (atosiban 300nM, 1000nM, 3000nM). [0022] Wyniki biologicznej oceny ruchliwości ludzkiego nasienia, przestawione na Fig. 2 i Fig. 3, dodatkowo odniesione do przykładu 2, potwierdzają, że antagonista oksytocyny i wazopresyny, atosiban, (odniesienie) nie hamuje ruchliwości nasienia ludzkiego in vitro, co potwierdza brak potencjalnego działania toksycznego dla zarodka, co uprawnia jego zastosowanie do wspomaganego rozrodu. [0023] Fig 4 ilustruje zależność między aktywnością skurczową macicy i powodzeniem embriotransferu. W przypadkach wysokiej aktywności skurczowej (>5,0 skurczów/minutę), kliniczny odsetek ciąż osiągał 14%, a w przypadku pacjentek z niską aktywnością skurczową był ponad 3 razy większy, osiągając 53% (figura zgodnie z publikacją Fanchin i in. [Hum. Reprod. 1998;13(7): ]) [0024] Figura 5 przedstawia wykres aktywności skurczowej macicy nieciężarnych kobiet (ocenionej za pomocą pola pod krzywą ciśnienia wewnątrzmacicznego) podczas stymulacji wazopresyną w przypadkach braku i obecności w organizmie antagonisty oksytocyny i wazopresyny, relcovaptanu (odniesienie). 4

6 Opis słupków: [0025] placebo referencyjna aktywność skurczowa macicy (u pacjentek otrzymujących placebo); VAS-1, VAS-2, VAS-3- względna ( w odniesieniu do placebo) aktywność skurczowa macicy u pacjentek, które otrzymały relcovaptan; odpowiednie liczby odpowiadają podaniom wazopresyny. Dane przedstawione na figurze pokazują efekt zablokowania receptorów wazopresyny i oksytocyny (zarówno wazopresyna jak i relcovaptan działają na receptory dla oksytocyny), zmniejszający kurczliwość macicy. Biorąc pod uwagę profil receptorowy relcovaptanu (odniesienie), większe powinowactwo do receptorów wazopresynowych V 1a, w porównaniu do receptorów oksytocynowych, łącznie z faktem, że wyrażanie V 1a jest większe w macicy nieciężarnej w porównaniu do ciężarnej, relcovaptan jest obiecującym kandydatem do zastosowania przed embriotransferem i sztuczną inseminacją (figura według publikacji Bossmar et al. [BJOG 1997, 104; ]). Figura 6 (zgodnie z Pierzynski P i in. [JSGE 2004, 11(6): ]) ilustruje aktywność skurczową ciążowego, ludzkiego myometrium przed i po podaniu antagonisty oksytocyny, barusibanu Legenda P- kurczliwość referencyjna w chlorku potasu (KCl) W płukanie; OT skumulowane serie iniekcji oksytocyny celem stymulacji kurczliwości macicy (powtarzane przed i po podaniu antagonisty oksytocyny), W płukanie, BSB podanie antagonisty oksytocyny, barusibanu W tym badaniu in vitro oceniono wpływ barusibanu na stymulowane oksytocyną skurcze mięśni gładkich macicy. Kurczliwość mięśni gładkich macicy (myometrium) było znacznie zredukowane po podaniu barusibanu oraz obserwowano całkowite zahamowanie aktywności skurczowej w zakresie stężeń oksytocyny występujących u ludzi. W badaniu tym wykazano, że barusiban jest silniejszym inhibitorem skurczów macicy w porównaniu do atosibanu (odniesienie). Mimo fizjologicznych różnic pomiędzy macicą ciężarną i nieciężarną, barusiban jest obiecującym kandydatem do zastosowania w technikach wspomaganego rozrodu, biorąc pod uwagę jego przedłużony okres działania (szacunkowy okres półtrwania pojedynczej dawki 7 godzin). [0026] Wynalazek dotyczy zastosowania barusibanu do wytwarzania leków, zawierających substancje aktywne w dawce dobowej między 0,001mg a 10 mg. Leki te stosuje się w celu poprawy receptywności macicy, osiąganej przez zniesienie wpływu oksytocyny i/lub wazopresyny na myometrium i endometrium (warstwa mięśni gładkich i najbardziej wewnętrzna warstwa macicy, gdzie zagnieżdżenie ma miejsce). Takie działanie powoduje spoczynek macicy (w rozumieniu kurczliwości) i dodatkowo blokuje stymulację syntezy prostaglandyn w macicy (prostaglandyny normalnie zwiększają kurczliwość macicy i zmniejszają perfuzję endometrium). W konsekwencji, środowisko wewnątrzmaciczne zaczyna być bardziej przyjazne zarodkowi, co z kolei przekłada się na wzrost embriotransferów zakończonych sukcesem. Leki opisane w wynalazku, podawane w przypadkach skurczów macicy skierowanych z dna macicy do szyjki macicy, działają przez zapobieganie wydalenia nasienia z macicy przez szyjkę. [0027] Wynalazek nadaje się do zastosowania do poprawy leczenia receptywności macicy w embriotransferze u ludzi i zwierząt hodowlanych. Leczenie za pomocą antagonistów oksytocyny, antagonistów oksytocyny i wazopresyny i antagonistów wazopresyny lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli może obejmować stosowanie leków peptydowych, naśladujących strukturę oksytocyny i wazopresyny, mianowicie barusibanu. Leki peptydowe nie mogą być podawane doustnie z powodu ich trawienia, jednakże takie podanie może być możliwe, gdy zastosuje się specjalne układy uwalniania leku. Peptydowi antagoniści oksytocyny, antagoniści oksytocyny i wazopresyny lub antagoniści wazopresyny, mianowicie barusiban, lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole można podawać dożylnie, domięśniowo, podskórnie lub donosowo. Odpowiednio: nie- 5

7 peptydowy antagonista oksytocyny, antagonista oksytocyny i wazopresyny lub antagonista wazopresyny, na przykład relcovaptan, lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole można podawać również dojelitowo. Leki opisane w wynalazku, zawierające barusiban, będą podawane w dawce dobowej od 0,01mg do 10g, w pojedynczej dawce, powtarzanych dawkach lub jako ciągła/przerywana infuzja. Podawanie leku rozpocznie się najwcześniej na tydzień przed embriotransferem i będzie trwać maksymalnie do 1 tygodnia po transferze. Pozwoli to na zniesienie odruchu skurczowego na wprowadzenie cewnika do transferu, jak też zmniejszy kurczliwość macicy i poprawi receptywność macicy w czasie zagnieżdżania zarodka, które u ludzi zachodzi około tygodnia po transferze. [0028] Inny aspekt wynalazku dotyczy wytwarzania leku stosowanego do regulacji kurczliwości macicy przed, podczas i po sztucznej inseminacji. Barusiban będzie podawany w przypadkach kurczliwości macicy skierowanej od dna macicy do szyjki macicy, co może wydalać nasienie z macicy przez szyjkę. Podawanie leków opisanych w wynalazku będzie zaczynać się najwcześniej na tydzień przed inseminacją i będzie kontynuowane maksymalnie do tygodnia po zabiegu. W przypadku serii inseminacji, leczenie może być kontynuowane maksymalnie do tygodnia po ostatniej inseminacji. Barusiban będzie podawany w dawce od 0,01 mg do 10 g przez 24 godziny dojelitowo lub donosowo, dożylnie, domięśniowo lub podskórnie. Przykładami postaci dawkowania tych leków są tabletki, drażetki, kapsułki, pigułki, zawiesiny, syropy, granulaty i roztwory. Każda jednostka podawania, na przykład tabletka lub łyżeczka roztworu może zawierać, na przykład 0, mg każdego z aktywnych składników. [0029] Leki zawierające barusiban można podawać w kombinacji z innymi lekami, które mogą obniżać kurczliwość macicy, na przykład z donorami tlenku azotu, substratami syntazy tlenku azotu, progestagenami, antagonistami prostaglandyn, metyloksantynami, beta agonistami, antagonistami prostacykliny lub progestagenami. [0030] Kombinacje barusibanu z innymi wspomnianymi powyżej substancjami można podawać dojelitowo lub pozajelitowo w dawkach o odpowiedniej skuteczności w obniżaniu kurczliwości macicy, z możliwym, dodatkowym efektem zmniejszenia reakcji niepożądanych. [0031] Przykład 1. Kliniczne zastosowanie leku zawierającego atosiban antagonistę oksytocyny i wazopresyny, do zwiększenia receptywności macicy na embriotransfer w przebiegu zabiegu wspomaganego rozrodu IVF-ET (zapłodnienie in vitro - embriotransfer) (odniesienie) [0032] Opis kliniczny: 42-letnia kobieta z 15-letnią historią niepłodności, nigdy nie była w ciąży, z negatywnym wywiadem położniczo/ginekologicznym w odniesieniu do klinicznej niepłodności do leczenia. Wstępne wyniki hormonalnych badań laboratoryjnych, podczas miesiączki, były następujące: FSH 5,1 IU/ml (zakres normalny 3,2-10,0), LH 1,8 miu/ml (zakres normalny 1,2-12,5), PRL 23,4 ng/ml (zakres normalny 3,3-24,5), E 2 95,7 pg/ml (zakres normalny 12,0-48,0), T 0,43 (zakres normalny 0,1-0,96 ng /ml). W czasie badania fizykalnego i ultrasonograficznego, wykazano macicę mięśniakowatą i torbiel lewego jajnika. Pacjentka była leczona operacyjnie miesiąc po wizycie wstępnej przez laparotomię i wyłuszczenie mięśniaków i wyłuszczenie torbieli jajnika lewego, bez powikłań. [0033] 7 miesięcy po zabiegu, rozpoczęto swoiste leczenie niepłodności i włączono pacjentkę do programu IVF-ET. Pierwszy program leczenia wykonano we wrześniu 2003, stosując długi protokół stymulacji owulacji. W przebiegu tego leczenia pacjentka otrzymała w całości 44 ampułki rekombinowanego FSH (Gonal 75 IU) i 8 gonadotropiny menopauzalnej HMG (Menogon 75 IU), co wyindukowało wzrost 3 pęcherzyków Graaf a. Po przezpochwowej aspiracji pęcherzyków, zebrano 1 MII oocyt. Z powodu azoospermy u męża pacjentki, dodatkowo potwierdzonej przez biopsję jądra, w zapłodnieniu in vitro zastosowano nasienie od anonimowe- 6

8 go dawcy. Na 3 dzień po zebraniu oocytu, jeden, 4-blastomerowy zarodek przeniesiono do macicy, ze skutkiem negatywnym. [0034] Następny (drugi) program IVF wykonano 3 miesiące później. W przebiegu kontrolowanej stymulacji owulacji podano 74 ampułki rekombinowanego FSH (Gonal 75 IU) i 3 ampułki ludzkiej, menopauzalnej gonadotropiny (Menogon 75IU). W tym cyklu leczenia, potwierdzono wzrost 3 pęcherzyków. Przezpochwowa aspiracja pęcherzyków dostarczyła 3 MII oocyty, które następnie zapłodniono nasieniem anonimowego dawcy. Na trzeci dzień po zebraniu oocytów, dwa 2-blastomerowe zarodki wprowadzono do macicy, ze skutkiem negatywnym. [0035] Trzeci program IVF przeprowadzono po 6 miesiącach, również stosując protokół długiej stymulacji jajników. Podczas tego cyklu leczenia, podano 58 ampułek rekombinowanego FSH (Gonal 75IU) i 2 ampułki menopauzalnej gonadotropiny HMG (Menogon 75IU). W rezultacie zaobserwowano wzrost 8 pęcherzyków. Po przezpochwowej aspiracji pęcherzyków, zebrano 2 MII oocyty, które następnie zapłodniono nasieniem anonimowego dawcy. Dwa, 4-blastomerowe zarodki wprowadzono do jamy macicy, ze skutkiem negatywnym. Miesiąc później wykonano histeroskopię, nakierowaną na dostarczenie danych o możliwej patologii jamy macicy, z wynikiem negatywnym. [0036] Z powodu dużego prawdopodobieństwa niskiego potencjału rozwojowego oocytów pacjentki, po kolejnych 2 miesiącach, podjęto decyzję o zmianie sposobu leczenia na zastosowanie oocytów dawcy. Dawcą oocytów była inna, zdrowa pacjentka leczona w programie IVF z powodu niepłodności męskiej. Po zapłodnieniu in vivo 2 oocytów dawcy nasieniem anonimowego dawcy przeprowadzono embriotransfer z wynikiem negatywnym. Następnie, przez kolejne 7 miesięcy, przeprowadzono 3 kolejne cykle z oocytami dawcy i nasieniem dawcy, z wynikiem negatywnym. [0037] W 8 cyklu leczenia, podjęto decyzję, nakierowaną na poprawę receptywności macicy, o zastosowaniu leku zawierającego atosiban (antagonistę oksytocyny i wazopresyny). Lek podano w infuzji dożylnej, którą rozpoczęto na 60 minut przed transferem i kontynuowano przez 2 godziny po transferze. Na 10 minut przed rozpoczęciem podawania (70 minut przed transferem) przeprowadzono ultrasonografię przezpochwową z 5 minutowym zapisem cyfrowym skurczów macicy. 60 minut przed transferem podano bolus 6,75mg atosibanu, bez działań ubocznych. Natychmiast po tym, podłączono infuzję ciągłą 18mg/godz. atosibanu w pompie i kontynuowano ją przez następne 60 minut. 45 minut po rozpoczęciu infuzji, powtórzono ultrasonografię przezpochwową z cyfrowym zapisem obrazu. Pomiędzy 55 a 60 minutą infuzji, przeprowadzono, pod kontrolą ultrasonografu transfer 2 zarodków. Po transferze, dawka atosibanu została zmieniona na 6 mg/godz. Infuzję zakończono 2 godziny po transferze, całkowita podana dawka wynosiła 37,5 mg. [0038] Opisany powyżej sposób podawania atosibanu dostarczył maksymalnego działania w czasie embriotransferu (sprawdzono, że stałe stężenia atosibanu są osiągane po około 2 godzinach od rozpoczęcia infuzji). Pacjentka pozostawała w pozycji leżącej do godziny po zakończeniu infuzji i ograniczała swoją aktywność w tym dniu. Na wizycie kontrolnej, przeprowadzonej 2 tygodnie po embriotransferze, wykonano test ciążowy z wynikiem pozytywnym. Na następnej wizycie (4 tygodnie po transferze) wewnątrz macicy stwierdzono za pomocą ultrasonografii przezpochwowej normalną ciążę bliźniaczą, pokazano bijące serca płodów w obydwu pęcherzykach ciążowych. [0039] Pozytywny wynik leczenia niepłodności u tej pacjentki, potwierdza korzystny wpływ antagonistów oksytocyny i wazopresyny na zwiększenie receptywności macicy na embriotransfer. Dowód działania atosibanu oparto na jego efekcie obniżającym aktywność skurczową macicy, pokazanym nieinwazyjnie w momencie maksymalnego działania atosibanu, ponieważ podczas transferu niemożliwe jest potwierdzenie in- 7

9 nych aspektów jego działania (jego wpływu na perfuzję endometrium lub miejscowe wytwarzanie prostaglandyn). Analizę kurczliwości macicy wykonano dwoma sposobami, stosując sekwencję obrazów ultrasonograficznych: przez przegląd i manualny zapis skurczów przyspieszonej sekwencji filmu (metoda I) oraz przez analizę cyfrową przemieszczenia konturu endometrium (metoda II, wykonano podobnie do tej zaprezentowanej przez R. Fanchin i in. [Fanchin R i wsp. Hum Reprod 1998;13(7): ]. Analiza kurczliwości macicy wykonana w sytuacji braku jego działania i w sytuacji stabilnych poziomów atosibanu, pokazała znaczące zmniejszenie (metoda I : 15 skurczów/5min przed podaniem atosibanu wobec 8 skurczów/5min po podaniu. Metoda II : 11 skurczów/4min przed podaniem atosibanu wobec 7 skurczów/4min po podaniu). Metodę II przedstawiono na Figurze 1. Zastosowanie leku zawierającego atosiban poprawiło receptywność macicy na kilka sposobów: bezpośrednio przez zmniejszenie aktywności skurczowej macicy, jak też pośrednio przez zmniejszenie pobudzenia kurczliwości macicy i zniesienie efektu zmniejszenia perfuzji macicy, co było spowodowane zahamowaniem wytwarzania/wydzielania prostaglandyn w jamie macicy. [0040] Podsumowując, przypadek ten potwierdza racjonalność zastosowania leków zawierających antagonistów oksytocyny, antagonistów oksytocyny i wazopresyny lub antagonistów wazopresyny lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli w leczeniu poprawiającym receptywność macicy we wspomaganym rozrodzie, szczególnie podczas procedury embriotransferu. Dodatkowo, osiągnięto ciążę u drugiej pacjentki z podobną charakterystyką kliniczną. Przykład 2. Bezpieczeństwo antagonistów oksytocyny we wspomaganym rozrodzie (dla odniesienia) [0041] Jak do tej pory, jedynym zarejestrowanym do stosowania u ludzi antagonistą oksytocyny i wazopresyny jest lek zawierający atosiban. Jest to substancja peptydowa, zarejestrowana do podawania dożylnego w sytuacjach całkowicie różnych od wspomaganego rozrodu w porodzie przedwczesnym, gdzie stosuje się go do wydłużenia ciąży. Kliniczne bezpieczeństwo atosibanu zostało wnikliwie zweryfikowane w badaniach poprzedzających rejestrację. Atosiban jest uważany za wyjątkowo bezpieczny, powodujący minimalne skutki uboczne. Jednakże, nie proponowano żadnego zastosowania we wspomaganiu rozrodu, ponieważ nie wykonano żadnych badań nad embriotoksycznością atosibanu. [0042] Celem weryfikacji embriotoksyczności atosibanu przeprowadzono badania nad wpływem atosibanu na parametry ruchliwości ludzkich plemników (Test biologiczny ruchliwości ludzkich plemników). Zastosowana w badaniu technika jest standardem badania embriotoksyczności w laboratoriach IVF. Wykazano, że technika ta jest porównywalna do testów biologicznych na zarodkach myszy lub królików, które są zwierzęcymi modelami dla embriotoksyczności [Miller, JW et al. Fertil Steril 2001: 76(3), Suppl 1;S104]. Specyficzność i czułość testu ruchliwości ludzkich plemników jest porównywalna do testów przeprowadzanych na zarodkach i aktualnie jest najbardziej popularna z powodu niskiego kosztu i kompleksowości. Wykazano, że gdy konkretny czynnik w środowisku plemników ludzkich powoduje spadek ich ruchliwości, będzie on także embriotoksyczny. [0043] Badanie przeprowadzono na świeżym ludzkim nasieniu pobranym od 15 zdrowych dawców, z idealnym parametrami seminologicznymi. Po wybraniu żywej i ruchliwej populacji (metoda migracji wstępującej), próbki nasienia przenoszono do jałowych probówek Eppendorfa, zawierających Podłoże do Preparowania Ludzkiego Nasienia samo lub z dodatkiem atosibanu w stężeniach 300nM, 1000nM, 3000nM, ostatnie stężenia były 10-krotnie większe od maksymalnych stężeń osiąganych u ludzi w trakcie leczenia przedwcze- 8

10 snego porodu. Ocenę ruchliwości plemników prowadzono za pomocą wspartego komputerem analizatora nasienia Hobson Sperm Tracker w 1, 8 i 24 godzinie ekspozycji na atosiban. [0044] Analizowano następujące parametry: 1. a) procent aktywnie poruszających się plemników (Aktywne %); procent ruchliwych plemników (Ruchliwość %); c) procent nadaktywnie ruchliwych plemników (Hyper %), d) VSL- prędkość liniową, e) VCL całkowitą prędkość, f) ALH amplitudę wychyleń bocznych główki. Wyniki przedstawiono na Figurze 2 i Figurze 3. W analizie statystycznej zastosowano analizę wariancji (ANOVA). Nie znaleziono istotnych różnic pomiędzy próbkami kontrolnymi i próbkami eksponowanymi na atosiban. Potwierdza to brak embriotoksyczności atosibanu, co uprawnia jego stosowanie we wspomaganym rozrodzie. Zastrzeżenia: 1. Zastosowanie barusibanu do wytwarzania leku do poprawy receptywności macicy we wspomaganym rozrodzie. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym wytwarzany lek stosuje się przed, w trakcie i po embriotransferze do jamy macicy. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym barusiban stosuje się w dawce dobowej od 0,01 do 10 g. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym wytwarzany lek jest przeznaczony do leczenia niepłodności u ludzi lub do wspomaganego rozrodu u zwierząt, dotyczącego embriotransferu i/lub sztucznej inseminacji. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym embriotransfer jest transferem świeżych lub mrożonych/rozmrożonych zarodków. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym dotyczy ono procedur zapłodnienia in vitro-embriotransferu (IVF-ET). 7. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym dotyczy ono procedur wspomaganego rozrodu u zwierząt hodowlanych, w których wykonuje się embriotransfer lub sztuczną inseminację. 8. Zastosowanie według zastrz. 4 do 7, w którym zwierzęta hodowlane są z następującej grupy: krowy, świnie, owce i konie. 9. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym barusiban podaje się w kombinacji z zastosowaniem innych leków do leczenia we wspomaganym rozrodzie, z następującej grupy: donory tlenku azotu, substraty syntazy tlenku azotu, progestageny, antagoniści prostaglandyn, metyloksantyny, beta agoniści, agoniści prostacykliny. 9

11 10

12 Ruchliwość % Aktywność % Hiper % 11

13 12

14 % ciąż po embriotransferze skurcz/minutę 13

15 Względna aktywność skurczowa macicy 14

16 15

17 ODNIESIENIA CYTOWANE W OPISIE Lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma jedynie służyć wygodzie czytelnika. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że wyboru odnośników dokonano z wielką starannością, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, a EPO nie bierze żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 16