Laboratorium posiada Certyfikat Systemu Zarządzania Jakością

Transkrypt

1 Wstęp Od początku człowieczeństwa ludzie parali się praktycznym aspektem dziedziczenia, owocem czego są zwierzęta udomowione, a także rośliny uprawne. Człowiek zdawał sobie sprawę z przechodzenia cech rodzicielskich na potomstwo, a nawet instynktownie wyczuwał zasady dziedziczenia, o czym można się przekonać uważnie czytając Biblię (Genesis, rozdział XXX w ), człowiek stawiał sobie również pytanie w jaki sposób odbywa się proces przekazywania i nabywania cech. Jeszcze przed Arystotelesem istniała teoria pangenezy, według której męskie nasienie zawiera w sobie całkowicie ukształtowany model potomny w miniaturze. Rola kobiety (samicy) ograniczyć się miała do środowiska, w którym następował rozwój (a raczej rozrost) organizmu aż do porodu. Pytanie o dziedziczenie stało się istotne zwłaszcza w dobie ewolucjonizmu. Czas na naukę nadszedł dopiero w okresie pozytywizmu, kiedy wykreowano materialistyczne systemy filozoficzne a i postęp techniczny umożliwił podjęcie badań eksperymentalnych. Pierwsze prace naukowe z tego zakresu datują się od 1849 r kiedy to Owen stworzył ideę materialnego substratu dziedziczenia. W 1865 r Mendel opublikował swoją pracę na temat dziedziczenia, jednak spotkała się ona z uznaniem dopiero w czterdzieści lat później, po publikacjach de Vriesa, Corrensa i Tschermaka. W 1873 Darwin precyzując hipotezę pangenezy przyjął, że komórki rozrodcze są pewnego rodzaju ekstraktem całego ciała, uzyskanego z wydzielanych przez wszystkie komórki zarodeczków (gemmul). Takie założenie nie tylko wyjaśniało proces dziedziczenia cech trwałych (gatunkowych), ale i dziedziczenie cech nabytych, które to przekonanie dominowało w tamtych czasach i było motorem teorii ewolucji. Po raz pierwszy Weismann w 1892 r w swej teorii dziedziczenia (nie znając prac Mendla) sformuował i sprecyzował istnienie plazmy zarodkowej (dzisiejsze chromosomy), w której tkwią czynniki dziedziczne (geny), ale które nie dziedziczą cech nabytych ( plazma zarodkowa jakiegoś gatunku nie jest nigdy wytwarzana od nowa, a tylko rośnie ona i pomnaża się nieustannie i ciągnie z pokolenia na pokolenie ). Blastogeneza Weismanna (powstawanie organizmu z substancji zarodkowej) jest więc w pewnym sensie odwrotnością Darwinowskiej pangenezy (powstawania ekstraktu ze wszystkich komórek). W 1910 r Morgan opracował chromosomową teorię dziedziczności, zgodnie z którą cechy podlegające prawom Mendla, ściślej mówiąc geny, mają swoje siedlisko w chromosomach. Jednak jeszcze w podręczniku histologii z 1955 r (PZWL, str. 47) można przeczytać, że badania autorów radzieckich (Makarow, Miczurin i Łysenko) przeczą teorii Morgana o fizycznym istnieniu genów (jako materialnych cząstek warunkujących dziedziczenie) w chromosomach. Ostatnim jakby etapem (a stosunkowo mało znanym) w teorii dziedziczenia jest zapoczątkowane w latach 60-tych przez Lorenca, naturalistyczne i scjentyczne uchwycenie całości bytu w kategoriach biologicznych jako czynnika determinujacego przystosowanie człowieka w tym również twórczości w obszarze kultury ( istnieją struktury genetyczne warunkujące to, co dany osobnik nabywa, to, czego jest w stanie się nauczyć ). Jest to jakby naukowe nawiązanie do myśli Sokratesa cnoty i mądrości nauczyć się niepodobna. Jest ona człowiekowi dana albo też nie. Czym zajmuje się cytogenetyka?. Nazwa jest fuzją słów cytologia i genetyka. Cytologia zajmuje się badaniem komórki; jej morfologią, strukturą wewnętrzną, błoną komórkową, funkcjami metabolicznymi itp. Zainteresowanie komórką wynika z różnych przyczyn, jedną z nich jest dziedziczenie. Genetyka zajmuje się badaniem zmienności i dziedziczności cech organizmów żywych. Cytogenetyka jest nauką łączącą cytologię i genetykę i posługuje się metodami cytologicznymi i koncentruje się na badaniach chromosomów. Cytogenetyka bada liczbę, kształt, budowę a także zachowanie

2 chromosomów podczas podziałów komórkowych. W jej zakres wchodzi między innymi badanie mutacji genomów, kariotypów osobników i ich rodziców. Jest podstawą analizy i teorii dziedziczenia. Historycznie rzecz ujmując, pierwsze przypisanie nieprawidłowości kariotypu do schorzenia należą do Forda, który w latach wykrył to w syndromie Turnera (X0) i Klinefertera (XXY) u ludzi. Prace eksperymentalne nad chromosomami u zwierząt (początkowo u bydła) prowadzone od połowy lat 60-tych doprowadzają do powiązania części zaburzeń niepłodności z występowaniem aberracji chromosomowych. Spowodowało to konieczność wprowadzenia tego typu badań do rutynowej diagnostyki weterynaryjnej. Począwszy od wczesnych lat 70-tych badania cytogenetyczne stanowią już element kontroli zwierząt użytkowych, zwłaszcza samców. Uzyskane w ten sposób informacje pozwalaja na wczesną eliminację osobników ze stwierdzonymi defektami kariotypu. Metody cytogenetyczne pozwalają również na ocenę mutagenności wybranych czynników /biologicznych, fizycznych i chemicznych, w tym zwłaszcza istotne badanie mutagenności leków /i to zarówno in vivo jak i in vitro -taladomid/ z użyciem hodowli komorkowych. Pierwotnie ocena dotyczyła uszkodzeń struktury względnie liczby chromosomów, które można obserwować mikroskopowo, dzisiaj możliwe jest stwierdzenie pojedynczych insercji /wstawiania/ czy delecji /braku/ nukleotydów a nawet mutacji punktowych typu tranzycji czy transwersji w genie czy jego fragmencie. Postęp w zakresie badań sięga analizy poszczególnych genów /BLAD, waver u bydła, RYR1 u świń/. Wymagania sprzętowe, koszt analizy oraz przygotowanie teoretyczne i praktyczne operatora to w warunkach polskich poważne bariery we wprowadzaniu najnowszych tego rodzaju badań do prac rutynowych. W Polsce pionierem badań cytogenetycznych zwierząt jest Sysa (1, 10, 20, 21, 22, 23 ). W 1989 r, głównie w wyniku jego starań, zostało wprowadzone obligatoryjne badanie cytogenetyczne buhajów. Wszystkie organizmy żywe, z wyjątkiem wirusów, zbudowane są z komórek. To truistyczne w dzisiejszych czasach stwierdzenie jest prawdziwe zarówno w stosunku do bakterii jak i wielokomórkowych roślin i zwierząt. Organizm człowieka składa się z około komórek. Wielkość komórek większości zwierząt jest podobna i wynika, jak się później okazało, ze stałego stosunku masy jądra do cytoplazmy. Komórki tworzą wiele zróżnicowanych tkanek (np. skóra, nerwy, krew, kości) a te z kolei organy. Komórki zwierzęce składają się z wielu elementów strukturalnych o różnych funkcjach. Błona komórkowa otacza komórkę i zapewnia trwałość środowiska dla składowych elementów komórki (protoplazma, mitocondria, rybosomy, aparat Golgiego, centriole, lizosomy, jądro itp.) W jądrze znajduje się jąderko, /które zanika w trakcie podziałów komórkowych/, nukleoplazma, mikrotubule wrzeciona podziałowego a także chromosomy, które widzialne są w mikroskopie świetlnym tylko w mejozie i mitozie. Jądro otoczone jest błoną jądrową, która zanika podczas mitozy i mejozy umożliwiając migrację chromosomów.

3 Mitoza (kariokineza), czyli podział pośredni prowadzący do powstania dwóch oddzielnych komórek, umożliwia rozplem komórek somatycznych, które dzięki temu procesowi ciągle zachowują typową liczbę chromosomów a do każdej komórki trafia identyczny zestaw genów. Podział komórek jest cykliczny: Mitoza Początek interfazy Mitoza G 1 Interfaza Koniec interfazy G 2 S Interfaza niekiedy nazywana jest spoczynkową. Termin ten nie jest szczęśliwy, ponieważ większość życia komórki związana z pełnią metabolizmu zawiera się w tym okresie. Tylko niewielki okres czasu przypada na mitozę. Niektóre komórki żyją rok a nawet dłużej nim przejdą przez mitozę. Początek interfazy oznaczany w skrócie G 1 (od ang. gap = przerwa) następuje natychmiast po zakończeniu telofazy, kiedy chromatyna jest jeszcze pojedyncza i trwa do rozpoczęcia replikacji. Okres replikacji oznaczany jest literą S (synthesis DNA). Replikacja zaczyna się w wielu punktach chromosomu jednocześnie, tworząc nową nitkę siostrzaną a podczas mitozy te dwie chromatydy tworzą widoczne w mikroskopie ramiona, które rozdzielają się w centromerze i migrują do przeciwległych biegunów. Okres czasu po replikacji oznacza się G 2 (druga przerwa) i trwa aż do rozpoczęcia mitozy. Mitoza dzielona jest na cztery fazy: po interfazie jako pierwsze stadium mitozy wyróżnia się profazę (pro - przed czymś) podczas której chromatyna zaczyna się kondensować. Precyzyjne określenie czasu rozpoczęcia profazy jest trudne do ustalenia. Każdy chromosom podzielony jest na dwie części, część starą i nową. We wczesnej profazie chromosomy są długie i nie można ich rozróżniać. W końcu profazy, chromosomy są dostatecznie krótkie aby widzieć je oddzielnie, ale tylko u zwierząt posiadających niewiele chromosomów można je odróżniać. Określenie czasu przejścia profazy w następny etap zwany metafazą (meta - pomiędzy, środek) jest określany jako moment gromadzenia się chromosomów w strefie równikowej. Rozdzielanie się centromerów na dwa oddzielne ciała wskazuje koniec metafazy i początek anafazy (ana -skierowany ku górze). W stadium tym chromosomy w zależności od położenia centromeru mają kształt litery I, J lub V i każdy chromosom homologiczny migruje do oddzielnego bieguna komórki. Telofaza ((telo - koniec) jest stanem mitozy, kiedy chromosomy osiągają bieguny. Zbijają się tak, że nie jest możliwe ich rozróżnienie. Komórka zaczyna się przewężać i następuje formowanie się dwóch oddzielnych. Utworzenie błony pomiędzy dwoma komórkami prowadzi do przejścia nowo powstałych komórek w fazę G 1. Czas trwania poszczególnych faz niech zilustruje przykład komórek mysich w hodowli komórkowej, a więc w warunkach intensywnego podziału: G 1 S G 2 Profaza Metafaza Anafaza Telofaza Ogółem 9,5 h 7,5 h 1 h ,5 18,7 h Mejoza, czyli podział redukcyjny prowadzący do powstania komórek o zredukowanej (haploidalnej) liczbie chromosomów. Mejozę można prosto zdefiniować jako dwa następujące podziały jądra poprzedzone jedną replikacją. Podział redukcyjny jest konieczny ponieważ [podczas zapłodnienia ga-

4 meta męska i żeńska zlewają się (fuzja) w jedną komórkę z jednym jądrem. Gdyby nie było podziału redukcyjnego, każde pokolenie zdwajałoby liczbę chromosomów. Profaza pierwszego podziału mejotycznego (M-1) dzieli się na szereg etapów i rozpoczyna się od stanu zwanego leptotenem, kiedy chromosomy mają wygląd cienkich nici. W okresie tym sieć chromatynowa zaczyna przyjmować postać nici. Często małe, ciemno barwiące się punkty chromomery są widoczne wzdłuż nici. Niektórzy cytologowie identyfikują tą fazę jako preleptoten. Synteza nowego DNA, w odróżnieniu od mitozy, zachodzi w późnej interfazie, ale przeciąga się aż do pachytenu. Chromosomy w leptotenie zwykle mają wygląd pojedynczego pasma a ich podwojenie może być stwierdzone tylko biochemicznie. Chromosomy w tej fazie nie są przypadkowo rozrzucone w jądrze lecz poprzez końce telomeryczne przyczepione do otoczki jądrowej tworząc formę opisywaną jako bukiet. Koniec leptotenu i początek następnej fazy nazywanej zygotenem to formowanie par chromosomów homologicznych nazywane tworzeniem synapsów. Proces ten zwykle zaczyna się w jednym z końców chromosomów i opisowo można powiedzieć, że jest to zamykanie suwaka. Parowanie jest bardzo dokładne w odcinkach homologicznych. Synapsy powstają w wyniku parowania i jest to bardzo bliski kontakt odcinków homologicznych co jest zauważalną strukturą w mikroskopie (zarównoświetlnym jak i elektronowym). Rejony te nazywamy kompleksami synaptemalnymi. W okresie tym postępuje dalsze skracanie nici chromosomowych. Kiedy zakończone jest parowanie chromosomów rozpoczyna się faza nazywana pachytenem. Podczas dalszej kondensacji chromosomy przyjmują postać grubych nici, a całość grubych i sparowanych nici chromosomowych opisywana jest pod nazwą biwalentów. Każdy biwalent złożony jest z czterech chromatyd. W tym okresie zachodzi wymiana odcinków chromosomowych pomiędzy chromosomami homologicznymi (crossing-over). Miejsce gdzie zachodzi fuzja i wymiana jest widoczne w mikroskopie świetlnym i nosi nazwę chiazmy. Każda chiazma wygląda jak skrzyżowanie torów kolejowych. Wymiana następuje pomiędzy niesiostrzanymi chromatydami. Diploten oznacza podwójne nici chromosomowe, a zaczyna się, kiedy biwalenty zaczynają się rozdzielać. W okresie tym crossing-over widoczny jest w postaci chiazm. Takie chromosomy przyjmują różne kształty w zależności od ilości zaszłych crossing-over np. X-kształtne, o wyglądzie łańcuszka lub koła. Biwalenty nadal skracają się niemniej we wczesnym diplotenie mają postać skręconą (krętą). Pod koniec diplotenu ich obraz staje się wyraźniejszy. Zmniejsza się również ilość chiazm. Kończenie przejawia się w miarę rozpadu kompleksu synaptemalnego i przesuwania się chiazm od centromerów do telomerów. Jest to proces mechaniczny pozwalający chromatydom z crossing-over rozwikłać się poprzez rozszczepienie końców chromosomów. Diakineza jest momentem końcowym diplotenu. Chromosomy osiągają swoje maksimum kondensacji i rozmieszane są na obwodzie jądra. Profaza przechodzi następnie kolejno w metafazę I, anafazę I i telofazę I (podobnie jak w mitozie). Po tym następuje okres zwany interkinezą poprzedzający profazę II, metafazę II, anafazę II i telofazę II. Chromosomy po raz pierwszy obserwował Nägeli w 1842 r (w 1848 r Hofmeister dostrzegł i narysował te twory w komórce pyłku trzykrotki). Nazwał je cytoblastami przejściowymi. Nazwa ta zawierała podstawową ich właściwość, otóż w mikroskopie świetlnym, można je obserwować tylko w niektórych komórkach i w pewnym czasie. Pod koniec XIX wieku nitkowate chromosomy badane były przez Waltera Flemminga. Zaobserwował on podział wzdłużny chromosomów oraz ich migrację do oddzielnych biegunów. Proces ten nazwał on mitozą (mitos oznacza nitkę). W 1888 r Waldeyer pierwszy użył nazwy chromosomy (chromo oznacza barwiący się, a some ciało). W ostatnim dziesięcioleciu XIX wieku, podczas badań nad tworzeniem się jaj i plemników, odkryto specjalny typ podziałów

5 komórkowych i nazwano go mejozą. Na przełomie wieków zaobserwowano podczas mejozy łączenie się chromosomów w pary. Była to analogia do praw Mendla, który postulował istnienie w każdym organizmie par genów. W 1902 r McClung oraz w 1905 Wilson stwierdzili, że płeć jest związana z chromosomami. Był to pierwszy fakt pozytywnego związku chromosomów z dziedziczeniem i rozwinięcia teorii, że są one nośnikiem dziedziczności (Morgan). Dzisiaj ogólnie przyjęty jest pogląd, iż konfiguracja I-rzędowa DNA stanowi o treści kodowanej informacji, chociaż wiadomym jest, że o ekspresji genu nie decyduje tylko sam zapis genetyczny a bardzo złożone mechanizmy na poziomie molekularnym, powodujące nierzadko dość istotne zmiany w porównaniu do zapisu źrodłowego /cdna bardzo rzadko jest kolinearne z relatywnym odcinkiem DNA, - w zasadzie tylko przy transkrypcji RNA/. W ramach informacji genowej zawarte są również elementy sterujące ekspresją genu (promotor, leader, enhancer, terminator, kodony inicjacyjne, terminalne). Otwarta ramka odczytu /ORF/ genów (dokładnie cistronów) Eukaryota rozmieszczona jest wprawdzie na nici DNA liniowo, ale zwykle nie stanowi ciągłego zapisu na DNA a jest przerywana przez introny czyli sekwencje kodonów nieinformatywnych (gen nieciągły). Te fragmenty cistronu, które składają się na informację o kodowanym peptydzie stanowią jego egzon (ekson). Całość informacji genetycznej organizmu nosi nazwę genomu. Charakterystyczną cechą konformacji DNA jest spiralna budowa nici DNA i tworzenie kompleksów ze struktualnymi białkami histonowymi oraz niehistonowymi. W wyniku wieloletnich wysiłków w rozszyfrowaniu jego budowy proponuje się pięć poziomów uorganizowania się włókna DNA: 1. heliks DNA (postać A, B oraz pośrednie), skok 3,4 nm, średnica 2 nm. 2. włókno nukleosomowe (elementarne, nukleofilament, włókno 10 nm). 3. włókno 30 nm (solenoid) jest dobrze widoczne w mikroskopie elektronowym. 4. chromatyna interfazowa, o współczynniku upakowania wynoszącym od 100 do 1000 (średnio 680), zakotwiczona w blaszce jądrowej i macierzy wewnętrznej. 5. chromatyna metafazowa. Formą natywną większości chromatyny jest włókno o 30 nm /solenoid/. Uważa się, że tylko taka postać jest aktywna w procesie transkrypcji. Wielopoziomowa spiralizacja tego kompleksu obserwowana w stadiach podziałowych komórki prowadzi do skupień nici chromatynowych /chromonem/ w struktury nazywane chromosomami. Stopień skondensowania chromatyny wyrazić można poprzez tzw. współczynnik upakowania /stosunek długości wyprostowanej nici DNA do długości struktury/. Współczynnik ten we włóknie chromatyny o 30 nm wynosi 40, w chromatynie interfazowej a w chromosomach metafazowych osiąga wartość a nawet może osiągać W tym stanie największy ludzki chromosom o długości 10 µm zawiera 7,3 cm DNA. Upakowanie chromatyny interfazowej nie jest jednolite. Heterochromatyna czyli rejony w stanie permanentnego skondensowania /zarówno chromatyna konstytutywna jak i fakultatywna, ta ostatnia obecna tylko u niektórych osobników danego gatunku lub w pewnych komórkach danego organizmu powstała w wyniku funkcjonalnej kondensacji euchromatyny np. chromosom X w postaci ciałka Barra/ ma współczynnik zbliżony do chromosomów metafazowych natomiast euchromatyna /wykorzystywana w procesie transkrypcji/ jest bardzo rozluźniona. Najbardziej typowy kształt i budowa chromosomu osiągana jest w metafazie mitozy. W chromosomie wyróżnić można: 1. centromer rozdzielający chromosom na dwa ramiona, które zgodnie z nomenklaturą międzynarodową oznaczane są jako p- ramię krótsze, oraz q- ramię dłuższe. Strukturalnie jest to przewężenie pierwotne, w postaci włókna chromatyny o 10nm /nukleosomy/ z satelitarnym DNA, połączonym

6 swoiście z grupą białek, z których część tworzy trójblaszkowy kinetochor, gdzie w mitozie lub mejozie przyczepiane są mikrotubule wrzeciona podziałowego. Ich liczba zależy od rozmiaru chromosomu i u ssaków waha się w granicach konstytutywną (konstytucyjna) heterochromatynę widoczną najczęściej wokół centromerów, NOR oraz w obrębie telomerów. Jest ona obecna w tych samych miejscach homologicznych chromosomów we wszystkich komórkach organizmu. Zbudowana jest z satelitarnego DNA, który nie ulega ekspresji (chromatyna genetycznie nieaktywna) a cechą charakterystyczną jest późne replikowanie w fazie S. 3. przewężenia wtórne (NOR, organizator jąderkowy), zawierający cistrony dla rybosomowego RNA. Nie występują w każdym chromosomie (tabela 1). Niekiedy umieszczone są terminalnie i odcinają od ramienia chromosomu drobny jego fragment, który nazywany jest satelitą (trabant). Takie chromosomy określane są symbolem SAT. 4. telomery, czyli krańce chromosomów, zawierające specjalne sekwencje nukleotydów pozwalające na pełne odtworzenie nici DNA podczas replikacji (przy braku takowych przy każdej replokacji, dochodziłoby do skracania DNA o kilka sekwencji), a także funkcjonujące jako czapeczki ochronne, zapobiegające połączeniu dwóch chromosomów. Wielkość, długość chromosomu, relacja długości jego ramion oraz położenie centromeru stanowią o jego cechach morfologicznych branych pod uwagę w klasyfikacji. Zasadniczo ze względu na ich budowę wyróżnia się: chromosomy homologiczne chromosomy metacentryczne o stosunku ramion q/p zbliżonym do wartości równej p q chromosomy submetacentryczne o stosunku ramion q/p zbliżonych do 1,5-2,0 centromer chromosomy akrocentryczne o jednym ramieniu zdecydowanie krótszym lub prawie niedostrzegalnym. chromosomy telocentryczne, w których centromer znajduje się na końcu ramion /chromosomy o jednym ramieniu/. chromatydy siostrzane Ryc.1 Wszystkie komórki somatyczne posiadają identyczny zestaw chromosomów (jak wszędzie, i tu istnieją wyjątki np. erytrocyty ssaków nie posiadają chromosomów). W organizmach diploidalnych (Eukaryota) występują dwa zespoły chromosomów homologicznych, co oznacza, że każdy chromosom występuje w postaci pary identycznych (pod względem budowy morfologicznej i kolejności genów allelicznych) chromosomów (z wyjątkiem chromosomów płci), jeden z nich pochodzi od ojca a

7 drugi od matki. W zestawie chromosomów znajdują się zwykle dwa (w niektórych organizmach zwierzęcych brak jest chromosomu Y - Protenor, Fumea) chromosomy determinujące płeć genetyczną (allosomy, heterosomy) oraz pozostałe chromosomy (autosomy). Ciekawostką jest, że obecność chromosomów płci nie zawsze determinuje płeć np. u żółwi decydująca jest również temperatura, u minoga płeć zmienia się z wiekiem, a u robaka Bonellia zapłodnione jajo przekształci się w samca tylko w obecności samicy. Chromosomy homologiczne w trakcie podziału mejotycznego koniugują ze sobą tworząc dostrzegane w mikroskopie kompleksy synaptonemalne, co świadczy o ich jednorodności. U większości ssaków do koniugacji dochodzi również pomiędzy chromosomami płci X i Y świadczącego o istnieniu na nich regionów pseudoautosomalnych (27, 31), czyli informacji genetycznej nie związanej z determinacją cech płciowych. W okresie podziałowym każdy z chromosomów replikuje tworząc chromosomy (chromatydy) siostrzane, które w anafazie rozdzielane są pomiędzy dwie nowopowstające komórki. Chromosomy jednej komórki różnią się między sobą rozmiarami. Jeśli różnice te są wyraźne to można je rozpoznawać i klasyfikować. Większość rodzin, ale zwłaszcza gatunki, posiadają charakterystyczny dla siebie garnitur chromosomowy z ustaloną liczbą i strukturą chromosomów (kariotyp). Obraz kariotypu w postaci np. fotografii nosi nazwę kariogramu. W zestawie chromosomów ptaków i ssaków znajdują się dwa chromosomy determinujące płeć genetyczną oraz pozostałe chromosomy. Umownie u ssaków przyjmuje się nazywanie chromosomu żeńskiego jako X a męskiego jako Y. Samica ssaka ma zawsze dwa takie same chromosomy X i X (gamety samic posiadają więc zawsze chromosom X - homogametyczność). Samce ssaków są więc heterogametyczne, posiadają bowiem obydwa rodzaje allosomów X i Y. U ptaków, gadów i niektórych motyli sytuacja jest odwrotna, samice są heterogametyczne (ZW), a samce homogametyczne (ZZ). W komórkach somatycznych zawarta jest podwójna (diploidalna) liczba chromosomów -2n, natomiast w komórkach rozrodczych jest zredukowana o połowę -n (haploidalność). Zestawienie liczby chromosomów oraz obszarów NOR dla wybranych gatunków zwierząt: gatunek 2n liczba NOR Numery chromosomów z NOR Muszka owocowa 8 Żaba trawna 26 Żółw (Gopherus agassizi) 52 Boa 36 Kura 78 Gołąb skalny 80 Koń , 28, 31 Osioł , 21, 24, 29 Świnia , 10 Gusiec 34 Dzik europejski 36 (38) rob (15 ;17) Bydło , 3, 6, 11, 28 (29?) Zebu , 3, 4, 11, 28 Owca , 2, 3, 6, 21

8 Koza , 3, 5, 6, 28 Żyrafa 30 Jeleń europejski 70 największe autosomy Jeleń błotny 66 4, 5 Jeleń pamasowy 68 3, 4 Kot Pies , 8, 14, 16, 19, 21, 32, 37, X, Y Lis pospolity , 9, 13 Lis polarny , 17, 18, 20, 22 Chomik , 5, 6, 9, 11 Świnka morska , 3, 4, 6, 7, 9, 17, ryjówka aksamitna ramiona oznaczane są literami Mysz , 15, 16, 18, 19 tab. 1 NF=40 X, Y1, Y 2 Niekiedy podczas (anafazy II) mejozy dochodzi do błędnego rozdzielenia ilości chromosomów (nondysjunkcja), w wyniku czego powstają gamety o niezbalansowanym kariotypie. Wskutek tworzenia zygot przez takie gamety powstają osobniki o zmniejszonej lub zwiększonej liczbie chromosomów w stosunku do liczby diploidalnej (wyjścowej). Euploidalność jest rodzajem mutacji prowadzącej do zmienienia diploidalnej liczby chromosomów: Organizmy o zredukowanej liczbie chromosomów do 1n (haploidalność) nazywamy monoploidami. Znanym przykładem organizmu haploidalnego jest truteń (n), powstaje bowiem z niezapłodnionych jaj. Wśród haploidów rozróżnia się haploidy właściwe, czyli zawierające genom o liczbie 1n, oraz haploidy rzekome, powstające na skutek dzieworództwa organizmów poliploidalnych. Np. liczba chromosomów pszenicy (2n) wynosi 14 (Triticum monoccum). Liczba 7 chromosomów jest haploidem właściwym. Znane są jedna tetraploidy pszenicy z 28 chromosomami (T. durum, T. polonicum) a nawet heksaploidy z 42 chromosomami (T. vulgare, compactum, spelta). U tego ostatniego 1n wynosi 21 i jest to przykład haloidalności rzekomej. Organizmy o zwielokrotnionej liczbie chromosomów nazywami poliploidami. Wśród poliploidów wyróżniamy: triploidy, tetraploidy, pentaploidy, heksaploidy itd. Poliploidy z kolei dzielimy na: Autoploidy, czyli zwiększenie liczby chromosomów nastąpiło w obrębie normalnie diploidalnego gatunku, wszystkie genomy są identyczne. Zjawisko często obserwowane wśród roślin, w obrębie okrytonasiennych gatunki poliploidalne przeważają. Zwykle powstają, gdy chromosomy podzielą się lecz nie podzieli się komórka.. Sztucznie wywoływana np. przez kolchicynę. Formy poliploidalne są zwykle mniej płodne, co wynika prawdopodobnie z tworzenia się tetrawalentów (lub nawet większych( podczas mejozy. Istnieje jednak wiele form o nie zmniejszonej płodności. Alloploidy, genomy pochodzą od różnych gatunków i tworzą się w wyniku krzyżowania międzygatunkowego. Genomy znacznie różnią się między sobą. Organizmy takie na skutek powstałych zaburzeń podczas mejozy są niepłodne lub o bardzo małej płodności.

9 U ssaków euploidalność nie została dotąd opisana, chociaż mozaicyzm typu 2n/4n lub 2n/6n został stwierdzony u cieląt z hypertrofią mięśniową (w liniach selekcjonowanych na produkcję mięsną). Aneuploidalność jest rodzajem mutacji prowadzącej do zmiany liczby chromosomów w obrębie schematu 2n. Monosomia to brak jednego chromosomu, nullisomia to brak dowolnej pary chromosomów. Organizm trisomiczny oprócz dwu kompletnych genomów, posiada dodatkowy chromosom dowolnej pary, tetrasomia to dodatkowa dowolna para chromosomów. Jeśli oraganizm zawiera dwa dodatkowe chromosomy, z których każdy należy do innej pary, to nazywamy go podwójnie trisomicznym. 1. Ocena kariotypu, międzynarodowe zasady, symbole omówienie charakterystycznych cech kariotypu bydła, owcy, kozy, świni, konia, psa, kury, innych ptaków domowych, zwierząt laboratoryjnych /mysz, szczur, chomik, krolik/. międzynarodowa standaryzacja kariotypów zwierząt domowych. Po wprowadzeniu pierwszych metodyk badań kariogramów, autorzy publikacji cytogenetycznych posługiwali się własnymi wersjami ich interpretacji. Dodatkowo, wskutek niejednolitego nazewnictwa publikacje takie były co najmniej niejednoznaczne. W latach 60-tych niektórzy autorzy próbowali wprowadzić jednolite systemy. W 1964 r Levan (2) i współ. opracowali system klasyfikacji chromosomów w oparciu o indeks centromerowy w tradycyjnie barwionych chromosomach /alternatywny był system opisany przez Hsu i Benirschke/. Został on później przyjęty na pierwszej międzynarodowej konferencji w 1976 r w Reading jako obowiązujący /bydło, owce, kozy, konie, świnie, psy, koty i kroliki/. Jednak identyfikacja chromosomów o zbliżonych długościach pozostawała nadal niepewna (7). Prawdziwym przełomem w klasyfikacji chromosomów było wprowadzenie do barwień metod pozwalających na wyodrębnienie różnorodnych wzorów prążkowych (3, 4, 5). Wzory prążkowe zostały już uwzględnione na następnych sesjach dotyczących standaryzacji kariotypów (nie we wszystkich elementach doszło od razu do ostatecznego rozstrzygnięcia np. 17 i 18 chromosom bydła, chromosom 9 i X u świń). Kariotyp owcy precyzowano w 1985 i 1994 r, świni w 1988, bydła i kozy w 1989 a konia w Oprócz standaryzacji kariotypów wprowadzono również jednolitą nomenklaturę w zakresie: używanych skrótów i symboli z ktorych poniżej zaprezentowano przykłady: X, Y, - allosomy, liczby stanowią numery autosomów (np u bydła od 1 do 29), znak / stanowi rozgraniczenie pomiędzy komórkami w przypadku mozaikowatości, znak? jest informacją o wątpliwej identyfikacji, cen oznacza centromer, del oznacza delecję, mos oznacza mozaikowatość, q oznacza ramię długie a qter koniec ramienia dugiego itd. oznaczania aberracji liczbowych Należy zapisać ogólną liczbę chromosomów, (łącznie z heterochromosomami) następnie umieścić przecinek i po nim podać układ allosomów np. 61,XXY. Autosomy wymienia się w przypadku ich anomalii. Brakujący poprzedza się znakiem -, dodatkowy znakiem + np. 61,XY, +12. Konstytucję chromosomów różnych linii komórkowych podaje się w kolejności cyfr i liter niezależnie od częstotliwości występowania komórek poszczególnych linii. Linie komórkowe oddzielone są linią ukośną / np. - mos45, X/46, XY lub u bydła - chi60,xx/60,xy strukturalnych,

10 symbole strukturalnych nieprawidłowości stawia się przed nawiasem w którym zapisana jest informacja o zmienionym chromosomie np. 59, XY,-1, -29, + rob(1q29p) oznaczania miejsc pęknięć (których efektem mogą być delecje lub insercje), są to dość specjalistyczne pojęcia, w których oprócz wskazania typu zmiany należy podać również jej umiejscowienie na chromosomie (nazwy prążków). wprowadzono symbole chromosomów mejotycznych P I - profaza I, profaza pierwszego podziału mejotycznego M II - metafaza II, metafaza drugiego podziału mejotycznego I - uniwalent II - biwalent III - triwalent itp. pac - pachyten itd. kody technik prążkowych przyjęto w kodzie trzyliterowym. Pierwsza oznacza typ prążków, druga technikę ich otrzymywania a trzecia rodzaj barwienia np. w odniesieniu do prążków G: G - prążki G GAS - prążki G uzyskane techniką ASG GT - prążki G uzyskane trypsynowaniem GTG - prążki G uzyskane trypsynowaniem i barwieniem roztworem Giemsy itp. Standaryzacją objęto nie tylko kariotypy zwierząt użytkowych ale np. myszy czy nawet ryjówki (Międzynarodowy Komitet Badań Chromosomów Sorex araneus -ISACC). Wybrane przykłady standardowej klasyfikacji chromosomów: a/ bydło Prawidłowy kariotyp bydła domowego, podobnie jak cała rodzina Bovidae, posiada 60 chromosomów, w tym 58 autosomów i dwa chromosomy płci. Wszystkie autosomy są akrocentryczne (lub subtelocentryczne) i różnią się jedynie długością ramion. Przyjęto oznaczanie numerem 1 chromosomu najdłuższego a dalej stosownie do długości ramion. Po dokładnej analizie okazało się, że pierwotne ustalenia nie są najdokładniejsze o czym świadczy prezentowana tabela: Relatywna długość chromosomów bydła domowego No chromosomu % dług w No chromosomu % dług w No chromosomu % dług w No chromosomu % dług w stosunku do No 1 stosunku do No 1 stosunku do No 1 stosunku do No ± 1, ± 1, ± 1, ± 0, ± 1, ± 1, ± 0, ± 0, ± 1, ± 0, ± 1, ± 1, ± 1, ± 1, ± 1, ± 1, ± 0, ± 0, ± 0, ± 0, ± 1, ± 1, ± 0,7 X 92 ± 2, ± 1, ± 0, ± 0,7 Y 31 ± 1, ± 0, ± 1, ± 0,7 Tab. 2

11 Z uwagi na konsekwencje nie można już zmienić nazw chromosomów. Szczególnie duże różnice zostały podkreślone. Jak się okazuje najmniejszy chromosom 29 nie jest najmniejszy. Chromosomy płci u bydła są bardzo łatwo wyodrębniane z uwagi na ich strukturę submetacentryczną. Chromosom X jest zbliżony wielkością do grupy największych autosomów, natomiast Y należy do najmniejszych w całym kariotypie. W chwili obecnej w stosunku do bydła najczęściej stosuje się barwienie prążkowe typu G-, R-, a rzadziej C-. Zgodnie z przyjętymi standardami na konferencji w Reading przyjmuje się identyfikację chromosomów bydlęcych na podstawie prążków G. Wzór ten jest stały i nie zależy od stosowanych technik przygotowawczych barwienia (jak trypsynizacja czy denaturacja roztworem soli), chociaż zależy od stopnia kondensacji chromatyny. Zwłaszcza ostatnia para nie jest łatwa do identyfikacji w komórkach o małym stopniu despiralizacji (7). Schemat układów prążków G- u bydła domowego /Bos taurus L./(6), (dziesięć pierwszych przykładowo opisano) z typowym wybarwieniem, zgodnie z przyjętym standardem. wyraźny pozytywny prążek w 1/3 dalszej części środkowy rejon negatywny (nie barwiący się) X Ryc. 2 No chromosomu Cechy identyfikujące 1 najdłuższy chromosom, prążek negatywny w rejonie środkowym, wąski prążek pozytywny w rejonie terminalnym. 2 co najmniej sześć prążków pozytywnych, prążek negatywny w rejonie środkowym i distalnym. 3 w rejonie okołocentromerowym prążek negatywny, w rejonie środkowym dwa

12 prążki pozytywne. 4 prążek pozytywny w rejonie centromeru, prążek negatywny w środku oraz dwa w odcinku końcowym. Podobny do No 6. 5 układ symetryczny. Dwa prążki pozytywne w centrum oraz po jednym na każdym z końców. 6 podobny do No 4, ale brak końcowego prążka pozytywnego. 7 dwa pozytywne prążki w części centromerowej, szeroki prążek negatywny w części środkowej oraz prążek pozytywny w części końcowej. 8 okolica centromeru pozytywna, w drugiej połowie szeroki prążek negatywny 9 część proksymalna ciemniejsza niż distalna. W środku prążek pozytywny 10 odcinek końcowy pozytywny, dwa prążki pozytywne w części proksymalnej, przy centromerze prążek negatywny. Prążki R- (oranż akrydyny, bromodeoksyurydyna) obserwowane są w mikroskopie fluorescencyjnym jako jasno-zielone i czerwone pasma na chromosomach. Identyfikacja jest szczególnie prosta w odniesieniu do chromosomów wydłużonych (7). Ten sposób barwienia był proponowany na II Konferencji Standaryzacji Kariotypów Zwierząt Domowych w Jouy-en-Josas (Francja, 1990 r) jako mający zastąpić prążkowanie metodą G-. W barwieniu metodą prążków C-, zabarwieniu ulegają obszary heterochromatyny konstytutywnej zlokalizowanej w rejonach centromerowych we wszystkich autosomach. Na chromosomie Y obszar ten znajduje się w środkowej części ramion krótkich, a na X jest słabo widoczny na bliższej części ramion krotkich. Z uwagi na podobny rozkład prążków, technika ta nie jest w pełni użyteczna u tego gatunku (bywa używana w badaniu polimorfizmu heterochromatyny konstytutywnej). Barwienie azotanem srebra pozwala na wykrywanie miejsc jąderkotwórczych na chromosomach (nucleolar organizer regions -NORs). U bydła znajdują się one na chromosomach 2, 3, 4, 11 i 28. Stwierdza się tu znaczną heterogenność w ekspresji tych regionów nawet na homologicznych chromosomach pochodzących jednak z innych metafaz. b/ świnia domowa schemat układu prążków G- u świni domowej (6). Ten schemat zostanie zastąpiony (1988)

13 sm st X m t Ryc. 3 Zgodnie z założeniami przyjmuje się podział autosomów w zależności od położenia centromeru na cztery morfologiczne grupy: metacentryczne (m), submetacentryczne (sm), subtelocentryczne (st) i telocentryczne (t). W każdej grupie nadawane są kolejne numery w zależności od wielkości chromosomu. W zasadzie nie obserwuje się różnic w obrazie prążkowym G pomiędzy chromosomem 9 i X. c/ konie schemat układu prążków G- u konia.

14 w bardziej współczesnych klasyfikacjach chromosom ten dołączony jest do grupy sm X Y Ryc. 4 Autosomy konia są podzielone zgodnie z pozycją centromeru na cztery grupy (m, sm, st i t) a następnie numerowane zgodnie z wielkością. Największy autosom oznaczony jest No 1 należy do grupy sm, stąd dalsze chromosomy tej grupy oznaczane są kolejnymi cyframi, pomimo, iż są mniejsze od chromosomu metacentrycznego No 5. Chromosomy telocentryczne oznaczane są końcowymi numerami. Podstawowym celem analizy kariotypu jest ustalenie liczby chromosomów, stwierdzenie ewentualnego występowania komórek aneuploidalnych lub poliploidalnych, a także ocena występowania niektórych aberracji struktury jak minucje, pęknięcia, obecność chromosomów pierścieniowych czy dwucentromerowych, fragmentów acentrycznych, translokacji pericentrycznych, robertsonowskich. Cały szereg anomalii struktury nie jest jednak wykrywalny bez użycia barwienia prążkowego /inwersje pery- i paracentryczne, delecje, część translokacji/. zmienność kariotypu bydła domowego, fuzje centromerowe.

15 Translokacją nazywamy przemieszczenie części lub nawet całego chromosomu w obręb innego niehomologicznego chromosomu (zwykle bez utraty informacji genetycznej). Wymienione odcinki nie muszą być jednakowej długości i wówczas przy większych ich różnicach możemy rozpoznać zmianę w mikroskopie. Aberracja może być heterozygotyczna, bądź homozygotyczna. Translokacje są przekazywane w stosunku 1:1 a więc jak prosta dominująca cecha (Ryc. 11). Po raz pierwszy translokacje u bydła zostały opisane przez Knudsena (26, 29) oraz Gustavssona i Rockborna (8). Najszersze opracowanie i wyjaśnienie należy do Gustavssona (11). Pierwsze informacje dotyczyły translokacji typu 1/29, później stwierdzane były i inne typy, niemniej do roku 1990 nie stwierdzono ich w stosunku do chromosomów par 10, 15, 17, 19, 22 i 26 (7). W obecnym czasie opisano już translokacje wszyskich chromosomów. W zależności od układu chromosomu po translokacji, można wśrod nich spotkać; a/ fuzje centryczne (translokacja typu Robertsona - rob) - nazywamy proces w którym nastąpiło połączenie dwóch heterologicznych chromosomów poprzez centromer i utworzenie jednego chromosomu metacentrycznego a przez to i zmniejszenie ogólnej liczby chromosomów (2n-1). Postać heterozygotyczna pojawia się jeśli aberracja dotyczy jednego chromosomu z każdej pary (np. 1/29, 1, 29), a homozygotyczna w przypadku zaangażowania dwóch chromosomów każdej pary (np. 1/29, 1/29). C A B C D E F Schemat translokacjii 1:29(rob) A B C D E F C liniami przerywanymi oznaczono miejsca pęknięć chromosomow. C - centromer Ryc 5. (cyt. za Sysą i wspł)(10) T W 1 29 rob (1;29) T W Translokacja Robertsona 1/29 stanowi zdecydowanie najczęściej spotykaną i opisywaną w literaturze. Częstość występowania zjawiska zależy w dużym stopniu od rasy i niekiedy przekracza nawet 50% (British White) a niekiedy jest mniejsza niż 1% (ncb. np. w Polsce) (9) lub nawet nie stwierdzona została wcale (HF). Pierwszy przypadek translokacji u bydła w Polsce opisał Sysa w 1976 r. (23). W T A B C D E F W T A B C D E F p C q

16 Istnieją dwie hipotezy na pochodzenie tej anomali (7): - powracająca mutacja. Jak dotąd brak jasnych dowodów na poparcie tej teorii. Pomimo znacznej ilości zbadanych zwierząt brak jak dotąd opisu translokacji de novo (do 1990). Ogólnie, znany jest również fakt częstszego pojawiania się translokacji pomiędzy chromosomami zawierającymi fragmenty NORs. Chromosomy te pozostają przy jąderku podczas profazy mejozy co opóźnia ich wchodzenie w proces replikacji a jednocześnie poprzez ich bliskość prawdopodobieństwo zrekombinowania takich chromosomów jest większe. W przypadku translokacji 1/29 u bydła sytuacja ta jednak nie zachodzi, bowiem obydwa chromosomy nie zawierają regionów jąderkotworczych (7). Nie stwierdzono również podobieństwa odcinków satelitarnych w rejonach centromerów tych chromosomów, co mogłoby sprzyjać fuzji. - wspólne pochodzenie rozprzestrzenionej mutacji. Wiele danych wskazuje za hipotezą wspólnego źródła i dalszego rozpowszechnienia anomalii. Translokacja 1/29 jest fuzją monocentryczną, co potwierdza prążkowanie C- (tylko jeden blok heterochromatyny konstytutywnej w rejonie centromeru) oraz obraz kompleksow synaptonemalnyvh, a to sugeruje dawne utworzenie aberracji. Jakby potwierdzeniem tego jest dicentryczna fuzja opisana u kóz czy myszy, która sugeruje niedawne ich powstanie (cyt. za 7) a także dicentryczność w przypadku innych typów translokcji Robertsona u bydła (np. 9/23 opisana przez Cribiu) (40). Poza tym prawdopodobieństwo formowania się de novo identycznych translokacji jest bardzo niskie i uchodzić może za unikalny przypadek a nie za istotny proces tworzenia nowych nosicieli. Fakt, iż translokacje te utrzymują się w stadach a nawet w niektórych populacjach stanowią dość poważny udział procentowy może sugerować pewien korzystny ich wpływ, zwłaszcza w specyficznych warunkach środowiskowych. Część autorów (Gustavsson, Ford cyt. za 7) uważa jednak, iż warunek ten był spełniony w bardzo odległych czasach, kiedy presja środowiska była odmienna od panującej w chwili obecnej (wyniki badań prymitywnego, nieselekcjonowanego bydła N Guni o dużej frakcji nosicieli translokacji 1/29, zdaje się potwierdzać tą teorię). Oprócz translokacji 1/29 znanych jest obecnie u bydła co najmniej 40 innych jej form. Niektóre z nich bywają na pewnym obszarze dość rozpowszechnione np. fuzja 5/21 u bydła czarnego japońskiego objęła 23,6% populacji. W Polsce stwierdzona została także translokacja 5/22 oraz 13/24. Przyjmuje się, iż fuzja 1/29 jest ewolucyjnie wcześniejsza o czym świadczy obecność pojedynczego centromeru w zrekombinowanym chromosomie 1/29. Inne dotąd dokładniej zbadane przypadki translokacji posiadają dwa bloki centromerowe. b/ translokacje wzajemne (rcp - reciprocal) są innym rodzajem przemieszczenia części chromosomów i polegają na obustronnej wymianie odcinków chromosomów pomiędzy dwoma heterologicznymi chromosomami. Bezpośrednią przyczyną musi być pęknięcie dwóch chromosomów i następnie połączenie wolnych końców fragmentów z odrębnymi chromosomami. Translokacje w stanie homozygotycznym wykazują normalną koniugację natomiast jako heterozygoty powodują zaburzenia w rozdziale chromosomów.

17 Cen schemat translokacjii wzajemnej - rcp (cyt. za Sysą i wsp.)(10) Cen P R S T P R S T T T Cen Cen A B rcp (A;B) linie przerywane oznaczają miejsca pęknięć chromosomów P R S 6 7 P R S 6 7 Ryc. 6 Podczas mejozy w heterozygotycznej translokacji typu rcp dochodzi do zaburzeń rozdziału chromosomów. Mechanizm tworzenia przedstawia schemat poniżej:

18 Chromosomy w translokacji heterozygotycznej (figura wyjścowa) A/B B A B/A A/B B/A A B Na wskutek rozchodzenia się chromopowstałej figury mejotycznej, możliwe chromosomów.: figura w ksztacie krzyża powstająca podczas koniugacji w mejozie somów do biegunów (podczas tworzenia się gamet) z tak jest formowanie się gamet o 6-ciu możliwych kombinacjach Na rysunku zaznaczono strzałkami źródło jednej z trzech możliwych typów kombinacji. Dla jasności schematu dla pozostałych kombinacji strzałek nie umieszczono. typ 1-szy typ 2-gi typ 3-ci zbalansowany niezbalansowany niezbalansowany Ryc. 7. Schemat tworzenia gamet u heterozygotycznego nosiciela translokacji. Do tej pory u bydła opisano niezbyt wiele przypadków translokacji wzajemnej. Wynikać to może z trudności technicznych w wykrywaniu przemieszczeń niewielkich fragmentów chromosomów (za 7) zwłaszcza przy tradycyjnym sposobie oceny kariotypu. Niemniej już w 1979 r Mayer opisał pierwszy przypadek tego typu translokacji u bydła z wymianą pomiędzy 10 i 11 chromosomem (za 32). Oprócz translokacji wzajemnych pomiędzy autosomami, znane są również translokacje autosom-x a nawet autosom-y (za 32). Barwienie prążkowe oraz wprowadzenie komputerowej analizy obrazu do badań rutynowych, zwiększy zapewne wykrywalność translokacji wzajemnych.

19 c/ tandem fuzja translokacje (tan), w której następuje połączenie dwóch chromosomów wskutek pęknięcia jednego z nich w okolicy centromeru a drugiego w rejonie telomeru. W jego wyniku powstaje jeden chromosom o bardzo długich ramionach i jednym centromerze (wydłużenie ramion chromosomu akrocentrycznego). A B C D E F schemat powstawania tandem-fuzjitranslokacji - tan A B C D E F A B tan (A;B) Ryc. 9 (cyt. za Sysą i wspł.)(10) linie przerywane oznaczają miejsca pęknięć chromosomów Do tej pory opisano niewiele przypadków tandem-fuzji-translokacji (za 7, 32). Do bardziej znanych należą opisane w Danii u bydła czerwonego duńskiego przypadki tandem-fuzji chromosomu 1 i 9. Powodowało to obniżenie płodności o ok. 10% (cyt. za 1). d/ inwersje, które są przemieszczeniem materiału genetycznego w obrębie tego samego chromosomu z odwróceniem odcinka chromosomu o Wyróżniamy inwersję pericentryczną, o ile przemieszczenie następuje za centromer, oraz paracentryczną o ile przemieszczenie następuje w obrębie tych samych ramion. W zależności od liczby odwróconych odcinków mówić można o inwersji pojedynczej lub złożonej A B C D E F A B C D E F 1 2 3

20 Inwersje -inv inwersja pericentryczna inwersja paracentryczna A inv A (per) inv A (par) Ryc. 10 Inwersje typu paracentrycznego są niemożliwe do zdiagnozowania bez użycia barwienia prążkowego lub badań kompleksów synaptonemalnych, dlatego w badaniach rutynowych nie są stwierdzane. Do 1992 r stwierdzono 7 przypadków inwersji (cyt. za 32) w tym z zaangażowaniem allosomów. Podczas koniugacji homologicznych chromosomów, z których jeden posiada odcinek zinwertowany, tworzą się pętle inwersyjne. Wielkość tych pętli świadczy o długości odcinka odwróconego. Jeśli podczas tego procesu nie dojdzie do crossing over w obrębie pętli (im dłuższy odcinek tym większa szansa na jego zaistnienie) to powstają gamety o normalnym składzie chromosomowym. Jednak jeśli w obrębie pętli dojdzie do pojedynczego crossing over to w jego wyniku powstaną gamety z deficjencjami lub duplikacjami chromosomów. Gamety takie są niezdolne do zapłodnienia, bądź nieżywotne (niezbalansowany genom).

21 Schemat crossing over w pętli inwersyjnej prowadzący do powstania chromatydy dicentrycznej i fragmentu fragment dicentryczny a C fragment acentryczny Przedstawione powyżej aberracje są istotnym elementem w kształtowaniu się gamety, zygoty a dalej w przeżywaniu płodu czy wartości dojrzałego osobnika. Ma to swój wyraz w obrazie rozrodu zwierząt. Nie zawsze negatywne oddziaływanie jest dotkliwie odczuwane w obrębie pojedynczego gospodarstwa tym niemniej w skali państwa straty z tego tytułu są już poważne. W Szwecji tylko z powodu występowania translokacji 1/29 oceniono straty na 2 mln koron (9 mld zł) a Polska posiada więcej krów. obniżenie płodności nosicieli fuzji robertsonowskich. U myszy i czowieka fuzje centryczne powodują niepłodność samców. Zjawisko to zostało wyjaśnione w wyniku badań kompleksów synaptonemalnych. Okazało się, iż powstały triwalent jest dodatkowo związany z biwalentem X-Y co powoduje osłabienie spermatogenezy. U bydła, żadne z badań nie wykazało istnienia kompleksów chromosomów zrekombinowanych z allosomami (27, 31,) i to nie tylko w przypadku ustalonej translokacji 1/29, ale również w translokacji 4/8 powstałej de novo (31). Wyjaśnia to dlaczego u buhajów nosicieli translokacji spermatogeneza jest prawidłowa. Świtoński stwierdził podobne zjawisko u lisów, u samców których nie obserwuje się nawet obniżenia płodności (33). Obecność u bydła translokacji 1/29 w zbalansowanym kariotypie nie daje widocznych fenotypowo zmian u ich nosicieli (Istnieją wprawdzie prace donoszące o zwiększonej produkcji mięsa u buhajów heterozygotycznych, ale nie zostały one później potwierdzone). Ponadto Gustavsson (11, 13) badając nasienie buhajów nosicieli translikacji 1/29 nie stwierdził zmian w ruchliwości i objętości, chociaż koncentracja plemników była nieco obniżona w porównaniu do nasienia buhajów nie obarczonych wadą. Frank i współ. (cyt za Sysą) stwierdzili, że nasienie buhajów nosicieli translokacji źle

22 poddaje się mrożeniu (za 1). Libido pozostawało na podobnym poziomie. Natomiast stwierdzono redukcję płodności u nosicieli heterozygotycznych (11, 12). Współczynnik powtarzalności był większy nawet o 7,02% (13) u buhajów i 5,8 % u ich córek. Wytłumaczenie tego zjawiska jako zaburzeń w tworzeniu zygoty przedstawił Gustavsson już w 1969 r (11).

23 Organizm heterozygotyczny rob 1/29 tworzy następujące typy gamet: Heterozygota 1/ Mejoza (anafaza II) Gametogeneza u nosicieli translokacji 1/29 może przebiegać nieprawidłowo ponieważ dwa związane chromosomy (1/29) tworzą z ich homologami triwalenty, które można obserwować podczas profazy I (od zygotenu do diakinezy) w postaci tzw. kompleksów synaptonemalnych. Jeśli segregacja zachodzi w sposób prawidłowy (disjunkcja) to do jednego bieguna wędruje chromosom zrekombinowany a do przeciwnego bieguna odchodzą chromosomy wolne. Natomiast w przypadku nierównomiernego rozdziału (nondisjunctio) formowane gamety są disomiczne bądź nullisomiczne. powstałe gamety Powstałe gamety w połączeniu z gametami normalnego osobnika tworzą oprócz zygot normalnych także zygoty o niezbalansowanym materiale genetycznym (monosomia, trisomia). ryc. 14. Kompleks synaptonemalny. Świtoński (27) zygota nosiciel o zbalansowanym kariotypie zygota normalna trisomia monosomia trisomia monosomia Ryc. 11 ( za Popescu (7)

24 U osobników posiadających chromosom zrekombinowany (1/29) z uwagi na zbalansowanie materiału genetycznego, nie dochodzi do zaburzeń w rozwoju zygoty, ani później w rozwoju osobniczym. Zygota monosomiczna tworzy się wskutek zapłodnienia normalnego jaja hypomodalnym plemnikiem, natomiest trisomia jest efektem zapłodnienia hypermodalnym plemnikiem. Nieprawidłowe zygoty zamierają zwykle we wczesnych okresach zarodkowych. Letalność zarodków o niezbalansowanym kariotypie może być potwierdzona faktem niestwierdzenia ani jednego przypadku monosomii bądź trisomii tych chromosomów, pomimo zbadania wielkiej ilości zwierząt dorosłych. Natomiast badanie 6-8 dniowych embrionów, których ojcem był nosiciel translokacji 1/29, wykazuje istnienie zygot o przewidywanym składzie chromosomowym (30). Na 42 zbadanych embrionów u trzech (7,14%) z nich stwierdzono kariotyp niezbalansowany. Podobne wyniki otrzymał Popescu (2/52) i autorzy szwedzcy (2/38) (za 30). Daje to w sumie 5,30% zarodków o niezbalansowanym kariotypie. Natomiast u 11/42 (26,20%) stwierdzono kariotyp 1/29. Normalny kariotyp stwierdzony był u 66,66% embrionów. W badaniach spermatogonii buhajów z translokacją 1/29 stwierdzono 30,2% niezbalansowanych kariotypów (z czego aż w 81,8% była mniejsza liczba chromosomów) w 109 przebadanych metafazach (39). W badaniach Forda i Evansa % nondysjunkcji wynosił 54,6, Logua 45,1 a w badaniach Gustavssona 51,5% (cyt za 39). Żeby nie być jednostronnym dodać należy, że opisano większą produkcję mleka u krów nosicielek translokacji (37, 38). Na tej podstawie sądzić można, iż takie krowy mają większe szanse na pozostanie w rozrodzie a nawet zostanie dawczyniami zarodków co z kolei może doprowadzić do dryftu w kierunku zwiększenia ilości zrekombinowanych chromosomów. 1. Polimorfizm chromosomów. Cechy morfolologiczne chromosomów danego gatunku (kariotyp) są zwykle niezmienne i w oparciu o tę zasadę skonstruowano międzynarodowe systemy standaryzacyjne kariotypów. Polimorfizm obserwuje się najczęściej w przypadkach aberracji chromosomowych, które w części zostały powyżej przedstawione. Jednak przynajmniej u części gatunków obserwowany jest polimorfizm fizjologiczny u pewnej grupy osobników. Polimorfizm taki polega na zmienności struktury chromosomów (zmienne obszary prążkowania, wielkości obszarów heterohromatynowych czy jąderkotwórczych - NOR) a także na zmienności liczby chromosomów (np. u lisa, wywołane przez translokacje Robertsona) lub obecnością chromosomów B zwanych nadliczbowymi lub dodatkowymi. Chromosomy B składają się przede wszystkim z heterochromatyny, są zazwyczaj niewielkie i przeważnie nie posiadają efektu fenotypowego i nie są niezbędne do życia (co nie oznacza, że są obojętne dla wzrostu i rozwoju organizmu, jest jakby odpowiednikiem plazmidów w komórkach bakteryjnych), nie są przekazywane zgodnie z prawami Mendla (nie rekombinują z chromosomami A, nie podlegają dysjunkcji, replikacja przebiega przy końcu fazy S, czyli charakterystycznie dla chromatyny konstytutywnej) a liczba ich jest zmienna dla gatunku, populacji a nawet pomiędzy komórkami jednego osobnika. Jeśli chodzi o ich wielkość to dzielone są na trzy grupy: 1. mniejszych od najmniejszych chromosomów A np. lis pospolity, torbacze (Shoinobates volans, Echymipera kalabu, Reithrodontomys megalotis, oraz dwa brazylijskie gatunki Proechimys i Oryzomys 2. równe wielkości najmniejszych chromosomów A np. Rattus rattus (szczur czarny), Crocidura suaveolens, Dicrostonyx torquatus, Tscherskia triton).