Zakład Wirusologii Ogólnej Instytut Mikrobiologii Wydział Biologii UW ul. Miecznikowa Warszawa

Transkrypt

1 Zakład Wirusologii Ogólnej Instytut Mikrobiologii Wydział Biologii UW ul. Miecznikowa Warszawa

2 Zakład Wirusologii Ogólnej Instytutu Mikrobiologii UW Struktura Zakładu Dr Monika Radlińska kierownik (+22) Prof. dr hab. Andrzej Piekarowicz (prof. emerytowany) (+22) Dr Monika Adamczyk Popławska (+22) Dr Agnieszka Kwiatek (+22) Mgr Aneta Kłyż (+22) Doktorant: Mgr Michał Lower

3 Gdzie jesteśmy.. IV piętro budynku A Wydziału Biologii ul. Miecznikowa 1 Pokoje: A, A Studenci nie mają wyodrębnionej oddzielnej Sali, ale we wspólnych z pracownikami laboratoriach, zajmują samodzielne stanowiska pracy.

4 Zajęcia dydaktyczne Przedmiot obowiązkowy dla IIIr kierunku Biotechnologia (wykład i ćwiczenia): Biologia Molekularna Wyspecjalizowane zajęcia fakultatywne: Wirusologia Molekularna (ćwiczenia + wykład) Wykłady monograficzne: Wirusologia Molekularna Wirusologia Lekarska Zastosowanie wirusów w inżynierii genetycznej Pracownie: licencjacka, specjalizacyjna i magisterska Seminaria

5 Pracownia Licencjacka Prace licencjackie wykonywane w Zakładzie mają charakter eksperymentalny bądź teoretyczny. Prace doświadczalne to najczęściej wyodrębnione zadania dużych projektów badawczych prowadzonych przez naszych pracowników. Praca laboratoryjna na tym etapie edukacji stanowi przygotowanie do bardziej samodzielnej pracy w ramach eksperymentów pracowni magisterskiej. Prace teoretyczne mogą dotyczą tematyki badań prowadzonych w Zakładzie Wirusologii, ale jesteśmy otwarci na propozycje studentów, którzy chcieliby pogłębić wiedzę na interesujące ich tematy szeroko pojętej biologii molekularnej, mikrobiologii i wirusologii.

6 Warunki przyjęcia na studia licencjackie Jako kryterium będą brane pod uwagę oceny z egzaminów z Mikrobiologii, Biochemii i Genetyki. Idealny kandydat nie będzie miał oceny niedostatecznej z jakiegokolwiek przedmiotu z II roku studiów. Na rok akademicki 2013/14 planujemy przyjęcie 3-4 osób.

7 Techniki badawcze Podstawowe i zaawansowane techniki biologii molekularnej i mikrobiologii Techniki biologii molekularnej DNA i RNA: - izolacja i analiza DNA i RNA, - klonowanie, zastosowanie różnych wektorów - elektroforeza (agaroza, poliakryloamid), - amplifikacja DNA metodą PCR - Southern blotting - izolacja RNA, RT-PCR - Mikromacierze ekspresyjne Białka: - nadprodukcja i izolacja białek, - oczyszczanie białek w kolumnach metalopowinowactwa, - chromatografia jonowymienna - sączenie molekularne białek (filtracja żelowa) - analizy ilościowe białek - techniki badania aktywności białek - elektroforeza białek (PAGE) - Western blotting, - opóźniona migracja kompleksów białkowych w żelach - metody wykrywania i badania oddziaływań pomiędzy białkami (technika Phage display, system dwuhybrydowy) Techniki mikrobiologiczne: - prowadzenie hodowli bakteryjnych, - przygotowanie komórek kompetentnych, - transformacja bakterii - metodologia pracy z bakteriami chorobotwórczymi z rodzaju Neisseria i Haemophilus - namnażanie, mianowanie i oczyszczanie bakteriofagów wirulentnych i łagodnych - transfekcja - izolacja materiału genetycznego wirusów Analizy bioinformatyczne: - wykorzystanie różnych programów komputerowych do symulacji klonowania i rysowania map graficznych - wykorzystanie baz danych do poszukiwania podstawowych informacji o białku i genie - wykonywanie przyrównania sekwencji aminokwasowej (ang. alignment) i drzew filogenetycznych

8 Modele badawcze Bakterie Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Bakteriofagi HP1 Fagi N. gonorrhoeae Fagi α - Proteobakterii

9 Zadanie badawcze: Wyjaśnienie mechanizmów warunkujących niezwykłą zmienność genetyczną obserwowaną u bakterii patogennej Neisseria gonorrhoeae (czynnik etiologiczny rzeżączki) Rezultat: Wskazanie potencjalnych celów działania szczepionek i leków nowej generacji Systemy naprawcze zapobiegające mutacjom wynikającym z deaminacji 5-metylocytozyny do tyminy Użycie, jako antygenowych składników szczepionki, białek kodowanych przez bakteriofagi nitkowate Molekularne mechanizmy procesów odpowiedzialnych za utrzymanie stabilności genetycznej Zmienność versus naprawa DNA Zmienność fazowa Korekta błędów poreplikacyjnych

10 Dr Monika Adamczyk-Popławska Tematyka badawcza Określenie molekularnych mechanizmów zmienności bakterii z rodzaju Neisseria Określenie związku pomiędzy hiperzmiennością genetyczną a fizjologicznym brakiem metylacji DNA typu Dam u N. gonorrhoeae. Zbadanie zjawiska fenotypowego przełączenia w systemach restrykcji-modyfikacji, którego efektem jest zmiana wzoru metylacji genomu, jako potencjalnego mechanizmu kontroli interakcji pomiędzy patogenną bakterią, jaką jest N. gonorrhoeae, a gospodarzem (człowiek). Systemy odpowiedzialne za procesy regulujące zmienność są unikatowe u tej bakterii dlatego mogą być potencjalnymi celami inhibitorów i innych leków nowej generacji

11 Tematyka badawcza Badanie bakteryjnych systemów naprawy DNA zapobiegających mutacjom wynikającym z deaminacji 5-metylocytozyny do tyminy Dr Agnieszka Kwiatek Dokładne zbadanie funkcji biologicznych białek należących do tych systemów. Określenie ich wpływu na patogenność N. gonorrhoeae. Identyfikacja i analiza biochemiczna mechanizmów regulujących ekspresję genów w/w systemów. Zróżnicowanie tego typu systemów u różnych gatunków bakterii.

12 Prof. Andrzej Piekarowicz Tematyka badawcza Interakcje pomiędzy bakteriami i ich wirusami (bakteriofagami) Bakteriofagi Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis i ich wykorzystanie do skonstruowania szczepionki przeciwko N. gonorrhoeae. Właściwości bakteriofagów H. influenzae (w tym HP1); rola moronów w biologii wirusów bakteryjnych

13 Dr Monika Radlińska Tematyka badawcza Badanie interakcji pomiędzy bakteriami i ich wirusami (bakteriofagami) Poznanie różnych aspektów biologii bakterii i ich wirusów w celu uzyskania nowych narzędzi mogących mieć zastosowanie w biologii molekularnej i medycynie molekularnej. Identyfikowanie białek enzymatycznych biorących udział w strategiach obronnych (gospodarz) i inwazyjnych (fagi) oraz testowania praktycznego wykorzystania elementów funkcjonalnych badanych mechanizmów.

14 Dr Monika Radlińska Tematyka badawcza Identyfikacja determinantów specyficzności metylotransferaz DNA Badanie właściwości biochemicznych metylotransferaz DNA i określanie ich specyficzności. Naturalna wymiana domen determinujących specyficzność systemów restrykcji-modyfikacji jako mechanizm zwiększający potencjał obronny bakterii przed obcym DNA. Inżynieria genetyczna specyficzności metylotransferaz DNA i endonukleaz restrykcyjnych (badanie oddziaływań DNA-białko, uzyskanie enzymów o nowych właściwościach).

15 Przykładowe prace licencjackie Teoretyczne Wirusy zapalenia wątroby-charakterystyka molekularna i epidemiologiczna Bakteriofagi jako alternatywa dla antybiotyków Eksperymentalne Wpływ niespecyficznej metylacji adeniny na fitness szczepu Escherichia coli Konstrukcja wektorów samobójczych do inaktywacji genu ngoaxivv kodowego przez Neisseria gonorrhoeae

16 Wybrane tematy prac licencjackich Anna Kolczyńska (2012) Wirusy zapalenia wątroby-charakterystyka molekularna i epidemiologiczna Magdalena Santorska (2012) Charakterystyka molekularna i epidemiologiczna wybranych ludzkich wirusów onkogennych oraz ich rola w procesie onkogenezy Karolina Ościk (2012) Bakterofagi jako alternatywa dla antybiotyków - medycyna, przemysł, rolnictwo Mateusz Zięcina (2012) Wejście filowirusów do komórki gospodarza Oliwia Miszczuk (2012) Próba klonowania genu feta z Neisseria gonorrhoeae FA1090, kodujacego receptor sideroforów Paulina Cichosz (2012) Wpływ niespecyficznej metylacji adeniny na fitness szczepu Escherichia coli Patryk Reniewicz (2011) Konstrukcja wektorów samobójczych do inaktywacji genu ngoaxivv kodowego przez Neisseria gonorrhoeae Anna Puławska (2011) Konstrukcja i testowanie prototypowych wektorów dla szczepionek nowej generacji docelowych opartych o szczep Escherichia coli. Paulina Mrozek (2011) Aktywność enzymu HaeIV i jego pochodnej HaeIV_S2 wobec substratów z różną liczbą miejsc docelowych. Milena Bażlekowa (2010) System naprawy DNA Very Short Patch repair. Uzyskanie konstruktów do badania komplementacji funkcji białka V.EcoKDcm przez endonukleazę V.NgoAXIII. Martyna Ciężkowska (2010) Bakteriofag Mu. Przemysław Gaweł (2009) Rola systemu restrykcji i modyfikacji NgoAV z Neisseria gonorrhoeae w globalnej ekspresji genów: konstrukcja mutanta NgoAV minus. Mateusz Dworecki (2009) Nowe odkryte wirusy odpowiedzialne za infekcje układu oddechowego człowieka.

17 Przykładowe prace magisterskie Kamila Litewiak (2012) Wpływ białka MutL Escherichia coli na aktywność i specyficzność endonukleaz V.NgoAXIII i V.NgoAXIV Neisseria gonorrhoeae FA1090 należących do systemu naprawy DNA Very Short Path repair Anastasiya Trybunko Klonowanie genu drg z patogennego szczepu Neisseria gonorrhoeae FA 1090 i wstępna charakterystyka jego produktu Milena Bażlekowa (2012) Charakterystyka in vitro endonukleazvsr Neisseria meningitidis FAM18 Kryspin Andrzejewski (2011) Drobnoustroje chorobotwórcze dla człowieka w kleszczach Ixodes ricinus występujących na terenach parków miejskich Warszawy Joanna Wronowska (2010) Badanie komplementacji funkcji białek MutL i MutS kodowanych przez Escherichia coli przez białka MutL i MutS kodowane przez Neisseria gonorrhoeae FA1090. Małgorzata Klein (2010) Zmienność fazowa systemu restrykcji i modyfikacji NgoAV związana z traktem homopolimerycznym obecnym w genie hsds. Marek Drożdż (2009) Wstępna charakterystyka metylotransferaz DNA kodowanych w profagach Mu-podobnych. Magdalena Pelc (2009) Wstępne określenie biologicznej roli białek V.NgoA302, MutL i MutS kodowanych przez Neisseria gonorrhoeae FA1090. Marcin Piechocki (2009) Analiza funkcjonalna sekwencji profagów typu ssdna występujących w genomie Neisseria gonorrhoeae. Katarzyna Bandyra (2009) Badanie aktywności i specyficzności endonukleaz V.NgoA1175 i V.NgoA302 oraz wpływu na nie białek MutL i MutS należących do systemu naprawy DNA Very Short Patch repair kodowanego przez Neisseria gonorrhoeae FA1090. Zuzanna Tracz (2009) Charakterystyka holiny bakteriofaga HP1: właściwości lityczne oraz topologia w bakteryjnej błonie komórkowej. Ewa Szczęsna (2009) Analiza funkcjonalności wybranych białek profaga Ngo 6. Magdalena Zabłocka (2009) Strukturalna i funkcjonalna charakterystyka mutantów bakteriofaga HP1c1 w genie orf14. Anna Nowicka (2009) Wstępna charakterystyka potencjalnego systemu toksyna - antytoksyna kodowanego przez sekwencję profagową Ngo. 1 z Neisseria gonorrhoeae FA1090. Milena Ostrysz (2008) Kinetyka reakcji metylacji DNA katalizowanej przez metylotransferazę NgoPII i jej zmutowane warianty.

18 Publikacje z udziałem studentów Drozdz M, Piekarowicz A, Bujnicki JM, Radlinska M. Novel non-specific DNA adenine methyltransferases. Nucleic Acids Research 2012, 40(5): Adamczyk-Poplawska M, Lower M, Piekarowicz A. Deletion of one nucleotide within the homonucleotide tract present in the hsds gene alters the DNA sequence specificity of type I restriction-modification system NgoAV Journal of Bacteriology,193: Kwiatek A, Luczkiewicz M, Bandyra K, Stein DC, Piekarowicz A. Neisseria gonorrhoeae FA1090 carries genes encoding two classes of Vsr endonucleases JBacteriol.192(15): Adamczyk-Poplawska M, Lower M, Piekarowicz A. Characterization of the NgoAXP: phasevariable type III restriction-modification system in Neisseria gonorrhoeae FEMS Microbiol Lett.;300(1): Zaleski P, Wojciechowski M, Piekarowicz A. The role of Dam methylation in phase variation of Haemophilus influenzae genes involved in defence against phage infection Microbiology 151(Pt 10): Kwiatek A, Kobes M, Olejnik K, Piekarowicz A. DNA methyltransferases from Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae FA1090 associated with mismatch nicking endonucleases Microbiology.150(Pt 6):

19 A później Wypromowaliśmy tylko w ostatnich latach co najmniej kilkunastu studentów. Nasi absolwenci znajdują zatrudnienie zgodne z ich wykształceniem, bez trudu wygrywają konkursy na studia doktoranckie w kraju i za granicą.

20 Oxford Cambridge A później Jacobs University Bremen Georg-August-Universität Göttingen IIMCB IBB Instytut im. Nenckiego Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

21 Najważniejsze odkrycia po roku Wykazanie możliwości zmiany specyficzności MTaz w wyniku ukierunkowanej mutagenezy genu kodującego białko 2. Wykazanie zmienności fazowej systemów RM typu I jako mechanizmu zwiększającego potencjał obronny bakterii 3. Zidentyfikowanie wielospecyficznych endonukleaz Vsr z systemu VSP naprawiających mylnie sparowane zasady T:G. 4. Odkrycie u N. gonorrhoeae sekwencji profagów zintegrowanych z chromosomem, które można uaktywnić i otrzymać aktywne biologicznie fagi droga do otrzymania szczepionek przeciwko tym bakteriom 5. Wykrycie enzymów nowego typu systemu restrykcji-modyfikacji (typ IIB) posiadających wszystkie aktywności w postaci pojedynczej poliproteiny i wycinających małe fragmenty DNA.

22 Prace opublikowane od roku prac oryginalnych Aktualnie prowadzone projekty badawcze: 2 granty MNiSW + czekamy na wyniki projektów złożonych w ostatnich konkursach

23 Publikacje od roku 2000 Drozdz M, Piekarowicz A, Bujnicki JM, Radlinska M. Novel non-specific DNA adenine methyltransferases. Nucleic Acids Research 2012, 40(5): Dziewit L, Kuczkowska K, Adamczuk M, Radlinska M, Bartosik D. Functional characterization of the type II PamI restriction-modification system derived from plasmid pami7 of Paracoccus aminophilus JCM FEMS Microbiol Lett. 2011, 324(1):56-63 Raczkowska A, Brzóstkowska M, Kwiatek A, Bielecki J, Brzostek K. Modulation of inv gene expression by the OmpR two-component response regulator protein of Yersinia enterocolitica. Folia Microbiol (Praha). 2011, 56(4):313-9 Adamczyk-Poplawska M, Lower M, Piekarowicz A. Deletion of one nucleotide within the homonucleotide tract present in the hsds gene alters the DNA sequence specificity of type I restriction-modification system NgoAV. Journal of Bacteriology 2011;193(23): Dziewit L, Kuczkowska K, Adamczuk M, Radlinska M, Bartosik D. Functional characterization of the type II PamI restriction-modification system derived from plasmid pami7 of Paracoccus aminophilus JCM FEMS Microbiol Letters 2011;324(1): Raczkowska A, Brzóstkowska M, Kwiatek A, Bielecki J, Brzostek K. Modulation of inv gene expression by the OmpR two-component response regulator protein of Yersinia enterocolitica. Folia Microbiol (Praha). 2011;56(4): Adamczyk-Poplawska M, Markowicz S, Jagusztyn-Krynicka EK. Proteomics for development of vaccine. J Proteomics. 2011;74(12): Kwiatek A, Luczkiewicz M, Bandyra K, Stein DC, Piekarowicz A. Neisseria gonorrhoeae FA1090 carries genes encoding two classes of Vsr endonucleases. J Bacteriol. 2010;192(15): Adamczyk-Poplawska M, Lower M, Piekarowicz A. Characterization of the NgoAXP: phase-variable type III restriction-modification system in Neisseria gonorrhoeae. FEMS Microbiol Lett. 2009;300(1): Tchernaenko V, Radlinska M, Lubkowska L, Halvorson HR, Kashlev M, Lutter LC. DNA bending in transcription initiation. Biochemistry. 2008;47(7): Kwiatek A, Piekarowicz A. The restriction endonuclease R.NmeDI from Neisseria meningitidis that recognizes a palindromic sequence and cuts the DNA on both sides of the recognition sequence. Nucleic Acids Res. 2007;35(19):

24 Publikacje od roku 2000 cd Ma CH, Kwiatek A, Bolusani S, Voziyanov Y, Jayaram M. Unveiling hidden catalytic contributions of the conserved His/Trp-III in tyrosine recombinases: assembly of a novel active site in Flp recombinase harboring alanine at this position. J Mol Biol. 2007;368(1): Du Q, Livshits A, Kwiatek A, Jayaram M, Vologodskii A. Protein-induced local DNA bends regulate global topology of recombination products. J Mol Biol. 2007;368(1): Piekarowicz A, Kłyz A, Majchrzak M, Adamczyk-Poplawska M, Maugel TK, Stein DC. Characterization of the dsdna prophage sequences in the genome of Neisseria gonorrhoeae and visualization of productive bacteriophage. BMC Microbiol. 2007;7:66. Kwiatek A, Piekarowicz A. The restriction endonuclease R.NmeDI from Neisseria meningitidis that recognizes a palindromic sequence and cuts the DNA on both sides of the recognition sequence. Nucleic Acids Res. 2007;35(19): Piekarowicz A, Majchrzak M, Kłyz A, Adamczyk-Popławska M. Analysis of the filamentous bacteriophage genomes integrated into Neisseria gonorrhoeae FA1090 chromosome. Pol J Microbiol. 2006;55(4): Radlinska M, Kondrzycka-Dada A, Piekarowicz A, Bujnicki JM. Identification of amino acids important for target recognition by the DNA:m5C methyltransferase M.NgoPII by alanine-scanning mutagenesis of residues at the protein-dna interface. Proteins. 2005; 58(2): Pawlak S, Radlinska M, Chmiel A, Bujnicki JM, Skowronek K Inference of relationships in the twilight zone of homology using a combination of bioinformatics and site-directed mutagenesis: a case study of restriction endonucleases Bsp6I and PvuII. Nucleic Acids Res. 2005; 33(2): Chmiel AA, Radlinska M, Pawlak SD, Krowarsch D, Bujnicki JM, Skowronek KJ. A theoretical model of restriction endonuclease NlaIV in complex with DNA, predicted by fold recognition and validated by site-directed mutagenesis and circular dichroism spectroscopy. Protein Eng Des Sel. 2005; 18(4): Zaleski P, Wojciechowski M, Piekarowicz A. The role of Dam methylation in phase variation of Haemophilus influenzae genes involved in defence against phage infection. Microbiology. 2005;151(Pt 10): Radlińska M, Piekarowicz A, Galimand M, Bujnicki JM. Cloning and preliminary characterization of a GATC-specific beta2-class DNA:m6A methyltransferase encoded by transposon Tn1549 from Enterococcus spp. Pol J Microbiol. 2005;54(3):

25 Publikacje od roku 2000 cd Kwiatek A, Kobes M, Olejnik K, Piekarowicz A. DNA methyltransferases from Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae FA1090 associated with mismatch nicking endonucleases. Microbiology. 2004;150(Pt 6): Zaleski P, Piekarowicz A. Characterization of a dam mutant of Haemophilus influenzae Rd. Microbiology. 2004;150(Pt 11): Adamczyk-Popławska M, Kondrzycka A, Urbanek K, Piekarowicz A. Tetra-amino-acid tandem repeats are involved in HsdS complementation in type IC restriction-modification systems. Microbiology. 2003;149(Pt 11): Tchernaenko V, Radlinska M, Drabik C, Bujnicki J, Halvorson HR, Lutter LC. Topological measurement of an A-tract bend angle: comparison of the bent and straightened states. J Mol Biol (3): Bujnicki JM, Feder M, Radlinska M, Blumenthal RM. Structure prediction and phylogenetic analysis of a functionally diverse family of proteins homologous to the MT-A70 subunit of the human mrna:m(6)a methyltransferase. J Mol Evol. 2002; 55(4): Bujnicki JM, Radlinska M, Zaleski P, Piekarowicz A. Cloning of the Haemophilus influenzae Dam methyltransferase and analysis of its relationship to the Dam methyltransferase encoded by the HP1 phage. Acta Biochim Pol. 2001; 48(4): Radlinska M, Bujnicki JM. Site-directed mutagenesis defines the catalytic aspartate in the active site of the atypical DNA: m4c methyltransferase M.NgoMXV. Acta Microbiol Pol. 2001; 50(2): Radlinska M, Bujnicki JM. Cloning of enterohemorrhagic Escherichia coli phage VT-2 dam methyltransferase. Acta Microbiol Pol; 2001; 50(2): Piekarowicz A, Kłyz A, Kwiatek A, Stein DC. Analysis of type I restriction modification systems in the Neisseriaceae: genetic organization and properties of the gene products. Mol Microbiol. 2001;41(5): Bujnicki JM, Radlinska M. Cloning and characterization of M.LmoA118I, a novel DNA:m4C methyltransferase from the Listeria monocytogenes phage A118, a close homolog of M.NgoMXV. Acta Microbiol Pol. 2001; 50(2): Radlinska M, Drabik CE, Tong WS, Lutter LC. Generating tandem repeats by cloning with double initiator fragments. Biotechniques (2):340-5, 347

26 Publikacje od roku 2000 cd Bujnicki JM, Radlinska M, Rychlewski L. Polyphyletic evolution of type II restriction enzymes revisited: two independent sources of second-hand folds revealed. Trends Biochem Sci. 2001; 26(1):9-11. Bujnicki JM, Feder M, Radlinska M, Rychlewski L. mrna:guanine-n7 cap methyltransferases: identification of novel members of the family, evolutionary analysis, homology modeling, and analysis of sequence-structure-function relationships. BMC Bioinformatics. 2001;2(1):2. Bujnicki JM, Radlinska M, Rychlewski L. Atomic model of the 5-methylcytosine-specific restriction enzyme McrA reveals an atypical zinc finger and structural similarity to betabetaalphame endonucleases. Mol Microbiol. 2000; 37(5):1280-1

27 Podręcznik Andrzej Piekarowicz Podstawy Wirusologii Molekularnej Wydawnictwo Naukowe PWN, 2004 ISBN: