PL B1. Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga, specyficzne szczepy bakteriofagowe oraz ich zastosowanie

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 7/00 ( ) A61K 35/76 ( ) A61K 35/66 ( ) A61K 39/112 ( ) C12R 1/42 ( ) (54) Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga, specyficzne szczepy bakteriofagowe oraz ich zastosowanie (73) Uprawniony z patentu: PROTEON PHARMACEUTICALS SPÓŁKA AKCYJNA, Łódź, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 05/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/14 (72) Twórca(y) wynalazku: JAROSŁAW DASTYCH, Łódź, PL JAROSŁAW DZIADEK, Łódź, PL ELŻBIETA FORNAL, Łódź, PL ANNA RUMIJOWSKA-GALEWICZ, Łódź, PL ARKADIUSZ WOJTASIK, Łódź, PL EWELINA WÓJCIK, Majków Mały, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Andrzej Witek

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga specyficznego wobec wybranego szczepu bakterii i szczepy bakteriofagowe uzyskane tym sposobem oraz zastosowanie bakteriofagów do wytwarzania preparatu do zapobiegania i zwalczania zakażeń zwierząt hodowlanych, zwłaszcza drobiu, patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów. Celem wynalazku jest dostarczenie technologii produkcji preparatu przeciwbakteryjnego nadającego się do stosowania jako dodatek paszowy dla drobiu i trzody chlewnej, który jednocześnie byłby specyficzny wobec patogennych szczepów Salmonella ssp. wywołujących zachorowania na salmonellozę, zwłaszcza u ludzi. Preparat powinien spełniać rygorystyczne wymogi bezpieczeństwa określone dla dodatków paszowych. Obowiązujący od 1 stycznia 2006 w krajach Unii Europejskiej zakaz stosowania antybiotyków w paszach dla zwierząt wytworzył ogromne zapotrzebowanie na niezawierające antybiotyków dodatki paszowe o działaniu przeciwbakteryjnym. Celem wynalazku jest dostarczenie preparatu, który mógłby zastąpić stosowane dotychczas antybiotyki. Nieoczekiwanie preparat taki udało uzyskać się w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga specyficznego wobec wybranego szczepu bakterii, charakteryzujący się tym, że a) uzyskuje się kolekcję szczepów bakteriofagowych zawierającą szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego szczepu bakterii, b) prowadzi się hodowlę wybranego szczepu bakterii na jałowym medium hodowlanym, c) próbki hodowli nanosi się na specjalną wielodołkową płytkę pomiarową, dodaje się zawiesiny badanego szczepu bakteriofaga w różnych stężeniach i inkubuje się w temperaturze 37 C przez co najmniej 4 godziny, d) do próbek hodowli dodaje się rezaurynę i kontynuuje się inkubację bez dostępu światła w temperaturze 37 C przez co najmniej 3 godziny, e) kontroluje się barwę lub fluorescencję hodowli i szczep bakteriofagowy zawarty w hodowli która zachowała barwę niebieską lub nie wykazała istotnego wzrostu fluorescencji w porównaniu z próbą kontrolną identyfikuje się jako szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego szczepu bakterii, przy czym jako próbę kontrolną stosuje się jałową próbę poddaną takiej samej inkubacji, f) namnaża się zidentyfikowany szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego szczepu bakterii. Korzystnie wybranym szczepem bakteryjnym jest szczep S. enterica serovar Enteritidis. Ujawniony sposób nadaje się do łatwego i szybkiego skriningu dużych kolekcji bakteriofagowych oraz pozwala na łatwe określanie miana (siły litycznej) testowanych fagów co ma istotne znaczenie w zastosowaniach przemysłowych. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bakteriofagów do wytwarzania preparatu do zapobiegania i zwalczania zakażeń zwierząt hodowlanych, zwłaszcza drobiu, patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów, przy czym wytwarzany preparat jest przeznaczony do podawania zagrożonym zwierzętom wraz pokarmem lub wodą w odstępach od jednego do siedmiu dni. Korzystnie, wytwarzany preparat zapewnia co najmniej 200-krotne zmniejszenie poziomu zakażenia przez tydzień po zaprzestaniu podawania. Korzystnie, zwalczanym zakażeniem jest zakażenie drobiu patogennymi szczepami Salmonella sp., a do wytwarzania preparatu stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej ujawnione w niniejszym zgłoszeniu szczepy zdeponowane dnia 7 czerwca 2011 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1). Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep bakteriofaga nadający się do zapobiegania lub zwalczania zakażeń patogennymi szczepami Salmonella sp. wybrany z grupy obejmującej: PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1). Preparat według wynalazku opiera się na naturalnych składnikach ekosystemu i nie działa w niekorzystny sposób na organizmy inne niż ściśle określone bakterie patogenne. Podczas gdy dostępne na rynku substytuty antybiotyków opierają się na substancjach, które tak jak np. kwasy organiczne, modulują niespecyficznie florę bakteryjną, zapobiegając do pewnego stopnia wzrostowi niepo-

3 PL B1 3 żądanych mikroorganizmów, to preparat według wynalazku gwarantuje, iż selektywnie ograniczane są wyłącznie patogenne szczepy Salmonella ssp. Nieoczekiwanie okazało się również, że preparat według wynalazku nie utrzymuje się w organizmie człowieka lub zwierzęcia jeśli nie występuje Salmonella ssp. W szczególnej realizacji preparat nadaje się do stosowania w produkcji zwierzęcej, zwłaszcza do zwalczania zakażenia Salmonellą u drobiu. Ujawnione w niniejszym zgłoszeniu szczepy bakteriofagowe zostały zidentyfikowane dzięki sposobowi według wynalazku. Nieoczekiwanie posiadają one szeroką swoistość polegającą na lizie co najmniej 4 określonych serotypów Salmonella, jak również są stabilne w chłodniczych warunkach przechowywania co najmniej przez 3 miesiące. Ponadto mogą być one z sukcesem namnażane w skali przemysłowej bez utraty aktywności i nie są specyficzne wobec probiotycznych bakterii Lactobacillus. W celu lepszego wyjaśnienia wynalazku został on zilustrowany na załączonych figurach przedstawiających: Figura 1: profile restrykcyjne dla wybranych bakteriofagów; Figura 2: wykresy monitorowanych parametrów przeprowadzonych doświadczeń; Figura 3: przykładowy obraz płytek ELISA tuż po dodaniu mieszaniny reakcyjnej oraz po trzech godzinach inkubacji. Gęstość optyczna OD 600 użytej zawiesiny szczepu S. enterica ser. Enteritidis ATCC wynosząca 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 i 2.0 odpowiadała odpowiednio gęstości komórek 8 x 10 5, 1.05 x 10 6, 7.0 x 10 6, 3.5 x 10 7, 1.4 x 10 8 i 3.8 x 10 8 ; Figura 4: wyniki badania stabilności temperaturowej wybranych bakteriofagów prowadzone w ciągu trzech miesięcy w trzech różnych warunkach temperaturowych; Figura 5: wyniki badania cytotoksyczności preparatu bakteriofagowego metodą czerwieni obojętnej. Preparat zawierający sterylną mieszaninę bakteriofagów dodawano na 24 h do hodowli mysich fibroblastów 3T3, po czym oceniano żywotność komórek za pomocą testu wychwytu czerwieni obojętnej; Figura 6: wykrywanie pałeczek Salmonella w przeprowadzanym eksperymencie; Figura 7: poziom CFU Salmonella w narządach wewnętrznych i jelitach 21-dnowych kurcząt. Niniejszy opis został uzupełniony również o poniższe przykłady, które służą lepszemu zilustrowaniu istoty przedmiotowego wynalazku. Przykłady te nie powinny być jednak utożsamiane z pełnym zakresem wynalazku. P r z y k ł a d 1. Izolacja i charakterystyka bakteriofagów Stworzenie banku szczepów (serowarów) Salmonella najczęściej izolowanych od ludzi i zwierząt hodowlanych Na wstępie przygotowano kolekcję 108 szczepów Salmonella ssp. składającą się z najczęściej izolowanych serowarów (Tabela 1). Szczepy te są wykorzystywane w badaniach specyficzności oczyszczonych bakteriofagów. Kolekcja obejmuje zarówno szczepy wzorcowe dostępne w publicznych repozytoriach jak też izolaty pozyskane dzięki współpracy z firmą VETLAB, Brudzew i z Sanepidem. T a b e l a 1. Serowary Salmonella enterica i ich źródło. Lp. Serowar Liczba szczepów Źródło Berta 1 VetLab 2 Brandenburg 1 Sanepid 3 Coeln 1 VetLab 4 Colindale 1 VetLab 5 Derby 1 VetLab 6 Enteritidis ATCC Sanepid VetLab 7 Gallimarum Pullorum VetLab 8 Hadar 2 1 VetLab Sanepid

4 4 PL B1 cd. tabeli Heidelberg 1 VetLab 10 Infantis 6 1 VetLab Sanepid 11 Mbandaka 1 VetLab 12 Moscow 1 VetLab 13 Newport 5 VetLab 14 Paratyphi 1 ATCC 15 Senfenberg 1 VetLab 16 Typhi 1 ATCC 17 Typhimurium 1 ATCC 1 Sanepid 10 VetLab 18 Virchow 9 Vetlab Izolacja z próbek środowiskowych bakteriofagów aktywnych względem wybranych serowarów wzorcowych szczepów Salmonella ssp. Bakteriofagi zostały wyizolowane z próbek otrzymanych z Głównej Oczyszczalni Ścieków w Łodzi oraz oczyszczalni ścieków w Tuszynie. Badania potwierdziły, że najbogatszym źródłem wirusów są próbki pobrane z etapu separacji piasków (piaskownik), jednego z procesów oczyszczania ścieków. Ponadto, bakteriofagi pozyskano z odchodów kurzych, dostarczonych przez prywatnego hodowcę oraz firmę VetLab, specjalizującą się w badaniu czystości mikrobiologicznej ferm. Izolację przeprowadzono z wykorzystaniem szczepów wzorcowych Salmonella enterica serowary: Typhimurium, Enteritidis i Typhi oraz kilku szczepów środowiskowych. Do tej pory najlepiej scharakteryzowano kilkanaście wybranych bakteriofagów (Tabela 2.). T a b e l a 2. Otrzymane bakteriofagi i ich gospodarze. Lp. Bakteriofag Źródło Gospodarz 1 1st1 oczyszczalnia S. enterica ser. Typhimurium LT2 2 1sent3 oczyszczalnia 3 1sent4 oczyszczalnia 4 3sent1 oczyszczalnia 5 4sent1 Prywatna ferma 6 6sent1 Prywatna ferma S. enterica ser. Enteritidis ATCC senti VetLab S. enterica ser. Enteritidis 65/S/10 8 8sent65 VetLab 9 8sent1748 VetLab S. enterica ser. Enteritidis styp4 VetLab 11 2styp5 VetLab 12 6styp1 Prywatna ferma S. enterica ser. Enteritidis Wszystkie bakteriofagi wykorzystywane do dalszych eksperymentów zostały oczyszczone metodą pasaży do pojedynczej łysinki na płytkach z podłożem Luria-Bertani (LB). Procedura ta wymagała przynajmniej 5-krotnego pasażowania.

5 6styp1 2styp1 2styp4 8sent sent65 6sent1 5sent1 4sent1 3sent1 1sent4 1sent3 1st1 PL B1 5 Dla wyizolowanych wirusów, metodą płytkową, wstępnie określono specyficzność determinując zdolność lityczną wyizolowanych bakteriofagów wobec 17 wybranych szczepów S. enterica, w tym 7 wybranych różnych serowarów, 9 szczepów serowaru Enteritidis izolowanych od ludzi lub zwierząt hodowlanych oraz szczepów będących gospodarzami pozyskanych bakteriofagów (Tabela 3.). Dla potwierdzenia wyników, badanie specyficzności wyizolowanych bakteriofagów powtórzono 3-krotnie. T a b e l a 3. Specyficzność wybranych bakteriofagów na wybranych szczepach wzorcowych i środowiskowych. Bakteriofag Serowary S. enterica Typhimurium LT Typhimurium Typhi ATCC Paratyphi A ATCC Infantis Brandenburg Hadar Enteritidis D ATCC Enteritidis Enteritidis 65/S/ Enteritidis nb nb Enteritidis 1014/S/09 K nb nb Enteritidis 1192/S/09 K nb nb Enteritidis 1250/S/ nb nb Enteritidis 1446/S/09 K nb nb Enteritidis 1535/S/ nb nb Enteritidis 2050/S/09 K nb nb nb nie badane Otrzymane bakteriofagi, namnożone na szczepie gospodarza, zatężono za pomocą PEG8000. Tak przygotowane próbki poddano procesowi izolacji genomowego DNA badanych bakteriofagów - jest to procedura z wykorzystaniem cyrkoniowych kuleczek o średnicy 0,1 mm, a także z zastosowaniem ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi oraz komercyjnych systemów do izolacji genomowego DNA. Uzyskane DNA wykorzystywane jest w celu (1) analizy restrykcyjnej (trzy niezależne eksperymenty przy użyciu enzymu EcoRI) generującej różne profile restrykcyjne dla różnych bakteriofagów co stanowi wstępną charakterystykę genetyczną bakteriofagów (Fig. 1). Dokładniejsza charakterystyka genetyczna uzyskiwana jest na podstawie sekwencjonowania genomów bakteriofagów z naszej kolekcji, wykonywanego z użyciem technik sekwencjonowania nowej generacji, zleconego firmie Macrogen. Analiza wyników takiego sekwencjonowania przeprowadzana jest przez nasz zespół naukowy. Udało się ustalić, że pozyskane do tej pory sekwencje genomowego DNA wykazują wysoką homologię względem bakteriofagów z bardzo dobrze poznanej rodziny T5 i są bakteriofagami litycznymi. P r z y k ł a d 2. Produkcja preparatu Ustalenie i optymalizacja warunków namnażania bakteriofagów w hodowli komórek bakteryjnych Salmonella ssp. w skali laboratoryjnej Optymalizację przeprowadzono z wykorzystaniem szczepu Salmonella enterica ser. Enteritidis ATCC Optymalizacji poddano następujące parametry hodowli: objętość inoculum hodowli bak-

6 6 PL B1 teryjnej i bakteriofagów, czas czystej hodowli i inkubacji hodowli zainfekowanej, temperaturę hodowli, stopień napowietrzania, ph podłoża, oraz warunki indukcji cyklu litycznego. Optymalną objętość inoculum hodowli bakteryjnej oceniono na 2 x 10 9 CFU na 0,5 l podłoża hodowlanego. Zoptymalizowaną hodowlę prowadzono do gęstości optycznej OD 600 = 0,5, co osiągano w czasie 3 godzin. Optymalną temperaturą wzrostu hodowli bakteryjnej okazało się 37 C. Zoptymalizowany stopień napowietrzania hodowli osiągnięto przy 220 rpm w wytrząsarce firmy New Brunswick. Optymalny wzrost hodowli obserwowano na podłożu LB o ph = 7,0. W prowadzonym procesie optymalizacji zaobserwowano, że optymalnym inoculum bakteriofagowym jest dodatek 10% objętości faga o mianie 10 9 (50 ml na 500 ml hodowli), a optymalny wyjściowy stosunek bakteriofagów do komórek bakteryjnych oceniono na 25 do 1. Przeprowadzone badania wykazały także, że wyizolowane bakteriofagi mają charakter lityczny i nie ma konieczności indukcji u nich cyklu litycznego. Odzyskiwanie bakteriofagów prowadzono z wykorzystaniem ultrawirowania na ultrawirówce typu Beckman L-80. Hodowle bakteryjne zainfekowane bakteriofagami po odpowiedniej inkubacji (patrz powyżej) wstępnie odwirowywano przy obrotach 3700 g przez 30 min. Następnie supernatant przenoszono do probówek wirowniczych typu Beckman i wirowano przez 2 godz. przy obrotach g. Procedura ta pozwoliła na równoczesne oczyszczenie i zagęszczenie preparatów fagowych. Optymalizacja hodowli wzorcowych szczepów Salmonella spp w skali 10 litrów W kolejnym etapie badań opracowano metodę namnażania bakteriofagów z wykorzystaniem 10 litrowego fermentera (robocza objętość 8 litrów). W tym celu przygotowywano 8 litrów podłoża LB, które następnie sterylizowano przez 20 min w 120 C. Przed zaszczepieniem podłoże napowietrzano do momentu uzyskania natlenia na poziomie 90% - 100%; temperatura podłoża: 37 C. Tak przygotowane podłoże zaszczepiano 200 ml inoculum szczepu Salmonella Enteritidis 65. Inoculum stanowiła 16-godzinna hodowla bakteryjna o gęstości optycznej około OD 600 = 5 (4,5-5 x 10 9 CFU/ml). Po zaszczepieniu pobierano próbkę w celu pomiaru gęstości optycznej wyjściowej hodowli Salmonella Enteritidis 65 (OD 600 ). Dokonano pomiaru podstawowych parametrów hodowli oraz uzyskiwanej ilości namnażanych cząstek fagowych (Tabela 4 i 5). Hodowlę prowadzono w fermentorze ze stałym napowietrzaniem 1,3 lpm (objętość powietrza dostarczonego do pożywki w ciągu 1 minuty) i mieszaniem 50 rpm. Po 40 minutach zwiększano szybkość mieszania z 50 do 100 rpm. W trakcie namnażania bakterii co 30 minut pobierano próby w celu określenia wartości gęstości optycznej hodowli (OD 600 ). PO uzyskaniu przez hodowlę bakteryjną gęstości optycznej o wartości OD 600 = 0,48-0,55 do podłoża dodawano zawiesiny fagowej - bakteriofag 3sent1, o znanym mianie w następujących ilościach: ml w przypadku pierwszego doświadczenia, ml w przypadku drugiego doświadczenia oraz ml w przypadku trzeciego i czwartego. Od tego momentu hodowlę prowadzono przez 4 h, przy stałym napowietrzaniu i mieszaniu (j.w.); w celu śledzenia zmian gęstości optycznej hodowli oraz kinetyki namnażania bakteriofagów próby pobierano co godzinę. Podczas procesu monitorowano następujące parametry hodowli: ph, po 2 (stopień natlenienia podłoża mierzony w %) i temperaturę podłoża oraz obroty mieszadła. Wyk o- rzystując oprogramowanie rejestrujące przebieg procesu odnotowano wszystkie monitorowane parametry (Fig. 2), z wyjątkiem pierwszego doświadczenia, w którym z powodów technicznych nie udało się uruchomić oprogramowania rejestrującego przebieg procesu. Podczas prowadzonych doświadczeń obserwowano postępujący spadek poziomu rozpuszczonego tlenu w podłożu (wzrost zużycia tlenu przez komórki bakteryjne był wynikiem namnażania się bakterii) oraz ni e- wielkie wahania ph w zakresie 7,2-6,7. Bez względu na użytą objętość zawiesiny fagowej (od 200 do 800 ml, miano 1,3-2,3 x 10 9 PFU/ml) uzyskiwano wysokie miana namnożonego bakteriofaga na poziomie 10 9 PFU/ml. T a b e l a 4. Parametry namnażania bakteriofaga 3sent1 w 10 litrowej hodowli szczepu Salmonella Enteritidis 65. Stosowane objętości [ml] Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3 Doświadczenie 4 Inokulum bakteryjne 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml Zawiesina fagowa 800 ml 700 ml 200 ml 200 ml OD 600

7 PL B1 7 Początek procesu 0,097 0,089 0,070 0,070 Przed dodaniem zawiesiny fagowej 0,488 0,501 0,501 0,535 1 h namnażania bakteriofaga 0,589 0,720 0,856 0,477 2 h namnażania bakteriofaga 0,150 0,286 0,632 0,198 3 h namnażania bakteriofaga 0,110 0,210 0,372 0,160 4 h namnażania bakteriofaga 0,068 0,182 0,320 0,166 T a b e l a 5. Liczba namnożonych cząstek fagowych 3sent1. Gęstość zawiesiny fagowej [PFU/ml] Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3 Doświadczenie 4 Wyjściowa zawiesina fagowa 2,32x10 9 PFU/ml 1,17x10 9 PFU/ml 1,33x10 9 PFU/ml 1,44x10 9 PFU/ml 1 h namnażania bakteriofaga 6,20x10 9 PFU/ml 1,05x10 9 PFU/ml 1,42x10 9 PFU/ml 4,94x10 9 PFU/ml 2 h namnażania bakteriofaga 5,54x10 9 PFU/ml 4,32x10 9 PFU/ml 5,98x10 9 PFU/ml 3,90x10 9 PFU/ml 3 h namnażania bakteriofaga 6,26x10 9 PFU/ml 3,84x10 9 PFU/ml 5,72x10 9 PFU/ml 5,80x10 9 PFU/ml 4 h namnażania bakteriofaga 7,94x10 9 PFU/ml 4,16x10 9 PFU/ml 4,26x10 9 PFU/ml 3,16x10 9 PFU/ml Podczas prowadzonych doświadczeń obserwowano postępujący spadek poziomu rozpuszczonego tlenu w podłożu (wzrost zużycia tlenu przez komórki bakteryjne był wynikiem namnażania się bakterii) oraz niewielkie wahania ph w zakresie 7,2-6,7. Po 4 h namnażania bakteriofaga wsad fermentora wirowano 30 minut w 4 C przy 4500 rpm/min. Ponieważ zastosowane parametry nie pozwalają na dokładne oddzielenie biomasy od cieczy pohodowlanej w następnym etapie supernatant zawierający cząstki fagowe poddawano dwukrotnej mikrofiltracji z zastosowaniem sytemu membranowego do filtracji stycznej w celu oddzielenia pozostałej nie odwirowanej biomasy i sterylizacji preparatu. WNIOSKI: Przeprowadzone procesy biotechnologiczne pozwoliły na opracowanie wstępnych parametrów namnażania cząstek bakteriofagowych z wykorzystaniem bioreaktora w skali 10 litrów: Objętość podłoża - 8 litrów; Objętość inoculum Salmonella Enteritidis 65 (OD 600 =5; 4,5-5 x 10 9 CFU/ml) ml; Objętość zawiesiny fagowej (rzędu 10 9 PFU/ml) ml; Czas namnażania cząstek bakteriofagowych - 3 godziny; Wirowanie - 30 minut w 4 C przy 4500 rpm/min; Dwukrotna mikrofiltracja (membrana o wielkości por 0,22 ( m); Mianowanie uzyskanego preparatu bakteriofagowego; Opracowanie technologii procesu produkcji i oczyszczania zawiesiny bakteriofagowej Etapy produkcji 1. Hodowla w bioreaktorze Pierwszym etapem linii produkcyjnej jest namnożenie liczby cząstek bakteriofagowych specyficznie niszczących komórki bakteryjne szczepów Salmonella ssp.. Dokonuje się to poprzez zaszczepienie hodowli bakteryjnej w bioreaktorze (warunki omówione wcześniej) zawiesiną cząstek bakteriofagowych, które w trakcie procesu hodowli namnażają się w komórkach bakteryjnych doprowadzając do ich lizy. Każdy z trzech bakteriofagów namnażany jest w osobnej hodowli. W naszych badaniach do tej pory stosowany był klasyczny bioreaktor 10-litrowy (8 litrów objętości roboczej). W celu przeprowadzenia takiej hodowli stosuje się wcześniej przygotowane: (1) inoculum oraz (2) zawiesinę bakteriofagów dodawane po uzyskaniu przez hodowlę bakteryjną gęstość optyczną OD 600. PO dodaniu zawiesiny bakteriofagowej hodowlę prowadzi się 3 h do 4 h, a proces ten pozwala na uzyskanie wysokiego miana namnożonego bakteriofaga na poziomie 10 9 PFU/ml. Po zakończonym procesie namnożenia hodowla przenoszona jest w sposób sterylny za pomocą pompy perystaltycznej do dalszego etapu procesu produkcji. W linii produkcyjnej planuje się wykorzystanie bioreaktorów 100-litrowych lub nowoczesnych jednorazowych toreb hodowlanych (do 15 litrów), które coraz częściej z powodzeniem zastępują klasyczne bioreaktory.

8 8 PL B1 2. Usuwanie biomasy Hodowla bakteryjna podczas procesu w bioreaktorze nie ulega całkowitej lizie dlatego wymagany jest etap oddzielenia biomasy od cieczy pohodowlanej zawierającej cząstki bakteriofagowe. W tym celu hodowla trafia w pierwszym etapie do wirówki, a następnie poddawana jest dwukrotnie mikrofiltracji za pomocą systemu do filtracji stycznej z użyciem membrany o wielkości por 0,22 m. Taka procedura zapewnia uzyskanie sterylnej zawiesiny bakteriofagów przy bardzo niewielkim spadku miana cząstek fagów. Po zakończonym procesie filtracji hodowla przenoszona jest w sposób sterylny za pomocą pompy perystaltycznej do dalszego etapu procesu produkcji. W przyszłości planuje się rozbudowę tego etapu procesu poprzez zakupienie dodatkowych systemów co pozwoliłoby na przeprowadzenie obróbki materiału uzyskanego z jednej hodowli w bioreaktorze bez potrzeby czyszczenia i sterylizacji używanego sprzętu w trakcie tego etapu. 3. Zatężanie produktu (opcjonalnie) W zależności od zapotrzebowania na produkt, zawiesina bakteriofagowa może być zatężana 10-krotnie co pozwala na zwiększenie stężenia cząstek fagowych w danej objętości. Do tego celu używany jest system do filtracji stycznej z zastosowaniem membrany ultrafiltracyjnej 30 lub 50 kda (w zależności od użytego faga). Proces ten pozwalana na 7,5-krotne zatężenie miana cząstek bakteriofagowych. 4. Usuwanie ewentualnych zanieczyszczeń endotoksyną W celu wyeliminowania obecności pozostałości endotoksyny będącej efektem lizy komórek bakteryjnych zaindukowanej przez bakteriofagi w trakcie procesu biotechnologicznego, planuje się wykorzystanie specjalnych kolumn z odpowiednim złożem do wyłapywania endotoksyn o wielkości i przepustowości odpowiedniej do objętości preparatu zawierającej cząstki bakteriofagowe. 5. Przygotowanie produktu w fazie płynnej Na tym etapie przeprowadza się łączenie uzyskanych w opisanych powyżej etapach różnych bakteriofagów poprzez wymieszanie zawiesin tak aby każdy z nich w końcowym produkcie charakteryzował się zbliżoną wartością miana. Do preparatu wybierane są bakteriofagi charakteryzujące się zdolnością lizy największego spektrum szczepów bakteryjnych Salmonella spp. z posiadanej kolekcji. Preparat taki następnie jest porcjowany. Proces przeprowadza się w ścisłych warunkach jałowych i dodatkowo podczas porcjowania uzyskaną ostatecznie zawiesinę poddaje ponownej sterylizacji poprzez jednorazowe filtry do mikrofiltracji (0,22 m). 6. Mikroenkapsulacja (opcjonalnie) W zależności od tego czy wymagany jest produkt w postaci płynnej czy stałej planuje się wprowadzenie technologii mikroenkapsulacji mającej na celu zamknięcie cząstek bakteriofagowych w kapsułkach alginianowych. Celem tego etapu jest stworzenie łatwo przyswajalnych kapsułek bezpiecznie przechodzących przez układ pokarmowy i stopniowe uwalnianie zamkniętych bakteriofagów w miejscu docelowym bez podrażniania całego organizmu. P r z y k ł a d. 3. Badania efektywności i bezpieczeństwa preparatu Badania in vitro Opracowanie i optymalizacja wysokowydajnej, zautomatyzowanej kolorymetrycznej metody pomiarowej aktywności preparatu bakteriofagów W celu opracowania metody pomiarowej siły litycznej bakteriofagów wykorzystano dostępny komercyjnie odczynnik pod nazwą alamarblue. Jest to barwnik wskaźnikowy, który pozwala na szybki i dokładny, ilościowy pomiar proliferacji oraz cytotoksyczności za pomocą reakcji barwnej. Łatwy w użyciu odczynnik, wykorzystuje metodę opartą na zjawisku reakcji redukcji-oksydacji (REDOX), podczas której rezazuryna zmienia barwę z niebieskiej (niefluorescencyjnej) na czerwoną (fluorescencyjną) pod wpływem utleniania, spowodowanego metaboliczną aktywnością w komórkach. Zmiana barwy jest łatwo dostrzegalna gołym okiem. Zmianę barwy można też zmierzyć spektrofotometrycznie lub fluorymetrycznie. Nietoksyczny dla komórek, jest wyjątkowo przydatny w obserwacji różnicowania między innymi komórek w hodowlach bakteryjnych. Test ten przystosowano do wykonywania na 96-dołkowych płytkach ELISA. Opracowano dwie metody pomiarowe z zastosowaniem alamarblue. W pierwszej metodzie oceniano siłę lityczną bakteriofagów. W pomiarach wykorzystywano tzw. roztwór mieszaniny roboczej (przygotowywanej tuż przed dodaniem do dołków na płytce ELISA) alamar- Blue + 20% jałowy roztwór Tween 80 (3 części alamarblue + 1 część 20% jałowego r-ru Tween 80) dodawanej do dołków zawierających zawiesinę badanych szczepów Salmonella o odpowiedniej gęstości komórek oraz do dołków zawierających zarówno zawiesinę szczepu Salmonella o odpowiedniej gęstości komórek z dodatkiem zawiesiny badanych bakteriofagów o odpowiednim mianie.

9 PL B1 9 Pozwoliło to na wizualne określenie zdolności litycznej cząstek bakteriofagów względem badanych szczepów Salmonella. Niebieskie zabarwienie dodanego do hodowli mieszaniny reakcyjnej alamar- Blue + 20% jałowy roztwór Tween 80 (3 części alamarblue + 1 część 20% jałowego r-ru Tween 80) świadczy o braku wzrostu badanego szczepu Salmonella i wysokiej zdolności litycznej bakteriofaga dodanego w odpowiednim stężeniu. Zmiana barwy niebieskiej na czerwoną mieszaniny reakcyjnej alamarblue + 20% jałowy roztwór Tween 80 (3 części alamarblue + 1 część 20% jałowego r-ru Tween 80), zachodząca pod wpływem utleniania, spowodowanego metaboliczną aktywnością w komórkach świadczy o wzroście komórek Salmonella i o braku lub niskiej zdolności litycznej badanego bakteriofaga w stosunku do danego szczepu Salmonella. Poniżej zamieszczony jest szczegółowy protokół eksperymentalny umożliwiający ilościową ocenę siły litycznej bakteriofagów oraz rysunek przedstawiających wynik wybranego takiego eksperymentu przeprowadzonego dla bakteriofaga 3sent1 względem szczepu Salmonella enterica ser. Enteritidis ATCC (Fig. 3). 1. Do dołków pierwszego rzędu w kolumnach od 1 do 12 dodać po 100 ul zawiesiny szczepu Salmonella spp. o odpowiedniej gęstości optycznej (OD 600 ) odpowiadającej odpowiedniej liczbie jednostek koloniotwórczych (CFU na 1 ml) 1. Szczegółowo: zawiesiny o gęstościach optycznych 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 i 2.0 odpowiednio do dołków 1 i 7, 2 i 8, 3 i 9, 4 i 10, 5 i 11 oraz 6 i Do dołków pierwszego rzędu w kolumnach od 1 do 6 dodać po 100 ul zawiesiny bakteriofaga o gęstości 6,5 x Stosunek objętościowy bakterii do zawiesiny cząstek fagowych wynosi 1:1. 3. Analogicznie do dołków w drugim rzędzie dodać po 75 l hodowli o odpowiedniej gęstości oraz po 125 l zawiesiny bakteriofagów. Stosunek objętościowy bakterii do bakteriofagów wynosi 1:1,5. 4. Analogicznie do dołków w trzecim rzędzie dodać po 50 l hodowli o odpowiedniej gęstości oraz po 150 l zawiesiny bakteriofagów. Stosunek objętościowy bakterii do bakteriofagów wynosi 1:3. 5. Przygotować układ kontrolny, w kolumnach od 7 do 12 w rzędach od 1 do 3 zamiast zawiesiny bakteriofaga dodać jałowe podłoże LB, co stanowi kontrolę wzrostu szczepu Salmonella o określonych gęstościach. Dodatkowo, w kolumnie 3, rząd 6, 7 i 8 nanieść zawiesinę bakteriofaga - kontrola jej jałowości oraz w kolumnie 7, w rząd 7 i 8 nanieść podłoże LB - kontrola jałowości podłoża stosowanego do rozcieńczenia hodowli w układzie badanym oraz kontrolnym. 6. Płytki ELISA przykryć jałowymi pokrywkami i inkubować przez 4 h w temp. 37 C. Po tym czasie, do wszystkich dołków dodać po 50 l mieszaniny alamarblue + 20% Tween Ze względu na wrażliwość mieszaniny na działanie promieni słonecznych, płytki zakryć folią aluminiową i poddawać dalszej inkubacji w temp. 37 C przez 3 h. Wizualnej obserwacji dokonywać co 30 minut. 1 Zależność pomiędzy wartością gęstości optycznej OD 600 a wartością CFU określać doświadczalnie w kilku niezależnych eksperymentach. 2 Przygotowywać tuż przed dodaniem do dołków na płytce ELISA (3 części alamarblue + 1 część 20% jałowego r-ru Tween TM 80). Zmodyfikowany protokół pomiarowy umożliwia ocenę aktywności protekcyjnej bakteriofagów przed wzrostem bakterii Salmonella Enteritidis. Zmiana barwy niebieskiej na czerwoną mieszaniny reakcyjnej alamarblue + 20% Tween80, zachodząca pod wpływem utleniania, spowodowanego metaboliczną aktywnością w komórkach świadczy o wzroście hodowli. Niebieskie zabarwienie dodanego do hodowli mieszaniny reakcyjnej alamarblue + 20% jałowy roztwór Tween80 świadczy o protekcyjnym charakterze użytej zawiesiny fagowej, która uniemożliwiała rozwój komórek S. Enteritidis. Szczegółowy opis postępowania: 1. Przygotować podłoże LB, porozlewać po 20 ml do stożkowych, płaskodennych kolbek Erienmayera o pojemności 100 ml i wysterylizować w autoklawie. 2. Zaszczepić 20 ml jałowego podłoża LB, hodowlę inkubować przez noc w temp. 37 C na wytrząsarce (rpm=150). Tak przygotowaną zawiesinę, przechowywać w lodówce (temp. 4 C) nie dłużej niż 1 tydzień i traktować jako inokulum do bieżących posiewów.

10 10 PL B1 3. Pobrać 20 l inokulum szczepu S. Enteritidis i zaszczepić nim 20 ml jałowego podłoża płynnego LB (w kolbach Erlenmayera o pojemności 100 ml). Hodowlę inkubować przez 1 godzinę w temp. 37 C na wytrząsarce (rpm=150). 4. Przygotowaną hodowlę rozcieńczyć w taki sposób, aby uzyskać zawiesiny, w których ilość komórek w 1 ml wynosić będzie odpowiednio: 2000, 200 i 20 komórek. Używać do doświadczeń z zawiesiną fagową o charakterze protekcyjnym. 5. Do płytki jałowej płytki titracyjnej, 96-dołkowej do dołków w kolejnych kolumnach nanieść zawiesiny komórek S. Enteritidis, charakteryzujących się różnymi gęstościami (100 l) i dodać zawiesiny fagowej (100 l). 6. Przygotować układ kontrolny - kontrolę wzrostu bakterii będą stanowić hodowle bakteryjne o różnych gęstościach, kontrolę jałowości preparatu fagowego będzie stanowić badana zawiesina fagowa, a kontrolę jałowości używanego podłoża będzie stanowić podłoże LB. 7. Płytkę titracyjną przykryć wieczkiem i inkubować w temp. 37 C przez 4 godziny. 8. Płytkę titracyjną przykryć wieczkiem i inkubować w temp. 37 C przez 4 godziny. 9. Płytkę titracyjną przykryć wieczkiem i zabezpieczyć folią aluminiową przed dostępem światła, a następnie inkubować w temp. 37 C przez 4 godziny. Po 4 godzinach inkubacji dokonać odczytu. Badanie stabilności temperaturowej bakteriofagów Analiza stabilności temperaturowej przechowywania bakteriofagów była prowadzona przez 3 miesiące w trzech różnych temperaturach: -20 C, +4 C oraz w temperaturze pokojowej. Stabilność ta była mierzona poprzez określanie miana fagów metodą płytkową na początku eksperymentu, po miesiącu oraz po trzech miesiącach przechowywania w w/w temperaturach. Bakteriofagi były zawieszone w podłożu LB po uprzednim namnożeniu i oczyszczeniu od komórek bakteryjnych. Wyniki badań wskazują, że niektóre bakteriofagi z posiadanej kolekcji, a mianowicie 3sent1, 8sent65 i 8sent1748 (Fig. 4), utrzymują swoje miano na poziomie rzędu wielkości w ciągu trzech miesięcy w temperaturze przechowywania -20 C lub +4 C w przeciwieństwie do innych fagów np.: 1st1 czy 2styp5 (Fig. 4), co jest istotne z punktu widzenia trwałości produktu. Badanie bezpieczeństwa preparatu bakteriofagowego Oznaczanie poziomu endotoksyn Oznaczanie stężenia endotoksyny (LPS) głównego składnika ściany komórkowej bakterii Gram- -ujemnych dokonano za pomocą testu LAL (Limulus Amebocyte Lysate). W tym celu użyto gotowych zestawów do kolorymetrycznego pomiaru poziomu i aktywności LPS: 1. Zestaw firmy Genscript (ToxinSensor LAL Endotoxin Assay Kit). 2. Zestaw firmy LONZA (QCL-1000 Endpoint chromogenie LAL Assay). W testach tych LAL reaguje z endotoksyną znajdującą się w badanych próbkach wytwarzając produkt, który następnie reaguje z chromogennym substratem umożliwiając ilościowy pomiar spektrofotometryczny. Natężenie barwy jest wprostproporcjonalne do stężenia endotoksyny. Badaniu zostały poddane próbki zawierające fagi, pobrane w poszczególnych fazach procesu technologicznego (analiza efektywności ultrawirowania - próby A1-A2, analiza efektywności procesu zatężania przy użyciu membran: 100 kda - próby B1-B5, oraz 50 kda - próby C1-C7). Uzyskane wyniki wskazują na obecność znaczących ilości LPS w próbach po etapie zatężenia bakteriofagów (Tabela 6). T a b e l a 6. Wyniki wykrytego stężenia LPS w analizowanych próbach. Nr próbki Opis Stężenie LPS EU/ml A1 Próba zawierająca osad (bakteriofagi) po ultrawirowaniu zawieszony w buforze SM A2 Próba zawierająca supernatant po ultrawirowaniu B1 Próba wyjściowa - ciecz pohodowlana zawierająca bakteriofagi po oddzieleniu bakterii i sterylizacji B2 Preparat zatężony 10-krotnie (retentat) B3 Przesącz (parmeat) ciecz która przedostała się przez membranę zatężającą >10 6 >

11 PL B1 11 B4 B5 C1 C2 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbierana jako permeat Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbierana jako retentat Próba wyjściowa ciecz pohodowlana zawierająca bakteriofagi po oddzieleniu bakterii i sterylizacji Przesącz (permeat) ciecz która przedostała się przez membranę zatężającą 55 0, C3 Preparat 10-krotnie zatężony (retentat) 1,36 x C4 C5 C6 C7 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbierana jako retentat (pierwszy zbiór 100 ml) Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbierana jako retentat (drugi zbiór 200 ml) Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbierana jako retentat (trzeci zbiór 200 ml) Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbierana jako retentat (czwarty zbiór 200 ml) 25 1,69 x ,32 x ,05 x cd. tabeli 6 Badanie cytotoksyczności Badanie przeprowadzono metodą wychwytu czerwieni obojętnej. Test przeprowadzono na płytkach 96-dołkowych przy użyciu linii komórkowej 3T3. Komórki 3T3 to mysie nietransformowane fibroblasty standardowo wykorzystywane do badania toksyczności in vitro. Badaniom poddano preparat zawierający mieszaninę trzech różnych bakteriofagów w serii 4 rozcieńczeń, pomiary wykonano w duplikatach oraz w 5 niezależnych powtórzeniach. Na podstawie uzyskanych absorbancji wyliczano procent żywotności porównując absorbancję uzyskaną w próbach badanych i w próbie kontrolnej tj. komórkach inkubowanych w medium hodowlanym (Fig. 5). Test cytotoksycznosci przy użyciu linii komórkowej 3T3. 1. W każdej studzience płytki 96 pozycyjnej umieścić fibroblastów 3T3 w standardowym medium hodowlanym i hodować przez 24 h w inkubatorze (37 C; 5% CO 2 ). 2. Następnie zastąpić medium hodowlane preparatem rozcieńczonym w medium preparatem bakteriofagowym i hodować przez kolejne 24 h (37 C; 5% CO 2 ). 3. Po inkubacji usunąć medium z preparatem bakteriofagowym, przepłukiwać monowarstwę fibroblastów PBS i inkubować ją z roztworem czerwieni obojętnej w PBS przez 3 h (37 C; 5% CO 2 ). 4. Po usunięciu roztworu czerwieni obojętnej i przepłukaniu PBS komórki lizować, a ilość pochłoniętego barwnika oznaczać kolorymetrycznie. Uzyskane wyniki wskazują, że nawet w wysokich stężeniach preparat nie wykazuje działania cytotoksycznego co oznacza, że nie należy oczekiwać wystąpienia ostrej toksyczności przy zastosowaniu preparatu in vivo w dawkach sięgających co najmniej 10 8 bakteriofagów. Badania in vivo Efektywność i bezpieczeństwo stosowania prototypowego preparatu bakteriofagowego w protekcji przed salmonellozą u kurcząt brojlerów Badania zostały przeprowadzone we współpracy z Uniwersytetem Warmińsko-Mazurskim i firmą VETLAB. Cel: Ocena możliwości zastosowania bakteriofagów w protekcji przed zakażeniami salmonellozą u kurcząt brojlerów. Do infekcji kurcząt użyto szczep Salmonella enterica ser. Enteritidis 65/S/10 pozyskany od firmy VETLAB, natomiast do przygotowania preparatu fagowego wykorzystano 3 bakteriofagi: 3sent1, 8sent65 i 8sent1748 wyizolowane z różnych szczepów Salmonella enterica (Tabela 3) i charakteryzujące się szerokim spektrum specyficzności względem różnych serowarów Salmonella oraz względem badanych szczepów serowaru Enteritidis. Na podstawie specyficzności tych trzech bakteriofagów można założyć specyficzność kompletnego preparatu (Tabela 7). Preparat fagowy został przygotowany w ten sposób, że każdy z trzech bakteriofagów poddano zoptymalizowanej procedurze namnaża-

12 12 PL B1 nia, a następnie zmieszano uzyskane zawiesiny fagowe tak aby każdy z nich w końcowym produkcie charakteryzował się zbliżoną wartością miana. Przygotowano mieszaniny o dwóch różnych stężeniach bakteriofagów: wysokim wynoszącym 2,0 x 10 8 PFU/ml oraz niskim wynoszącym 2,0 x 10 6 PFU/ml. Następnie mieszaniny rozporcjowano i poddano sterylizacji poprzez mikrofiltrację. Zastosowany preparat sprawdzony pod względem czystości mikrobiologicznej nie wykazywał obecności bakterii. T a b e l a 7 Specyficzność preparatu założona na podstawie specyficzności fagów wchodzących w jego skład. Serowar Szczep 3sent1 8sent1748 8sent65 PREPARAT Typhimurium LT Typhi ATCC Paratyphi A ATCC Infantis Brandenburg Hadar Enteritidis D ATCC /S/ /S/09 K /S/09 K /S/ /S/09 K /S/ /S/09 K Ferma K K Ferma K K Ferma K K Ferma K K Ferma K K Ferma K K Ferma K K Ferma K K Pac K-parter Pac K-piętro Woź K Woź K Woź K /S/ /S/

13 PL B1 13 cd. tabeli /S/ /S/ /S/ /S/ /S/09 B /S/ /S/ /S/ /S/ /S/ /S/ /S/09 K /S/ /S/09 K /S/09 K /S/09 K /S/09 K /S/09 K /S/09 K /S/09 K /S/09 MEK /S/09 K /S/ /S/ /S/09 MEK /S/ /S/ /S/09 K /S/09 MEK /S/09 K /S/09 MEK /S/ /S/09 NWJ /S/09 MEK /S/09 NWJ /S/09 NWJ / / /S/

14 14 PL B1 Przebieg doświadczenia Do badań użyto 150 kogutków Ross 308 podzielonych losowo na 5 równych grup utrzymywanych w odizolowanych od siebie pomieszczeniach - boksach. Kurczęta żywione były standardowymi mieszankami pełnoporcjowymi produkcji Agrocentrum Kolno. Warunki utrzymania kurcząt były zgodne z zaleceniami producenta materiału hodowlanego. Kurczęta umieszc zone w boksie 1, 2 i 3 zostały zakażone pałeczkami Salmonella Enteritidis w 4 dniu życia dawką 1 x 10 5 CFU na sztukę (Tabela 8). Natomiast kurczęta z boksu 1 i 2 nie zostały zakażone pałeczkami Salmonella. Preparat bakteriofagowy podawany był kurczętom umieszczony w boksie 1 (niskie stężenie 2,0 x 10 6 PFU/ml oznaczone jako F N ), 2 i 5 (wysokie stężenie 2,0 x 10 8 PFU/ml oznaczone jako F W ). Preparat bakteriofagowy podawano kogutkom przez pierwsze 14 dni życia 1 raz dziennie. Kurczętom w boksie 4 i 5 nie podawano preparatu bakteriofagowego. Okres odchowu kurcząt wynosił 21 dni, a w jego trakcie padło tylko 5 ptaków z różnych boksów (Tabela 8). Ponieważ wykryta śmiertelność kurcząt była minimalna i nie była zależna od określonej grupy ptaków, więc nie mogła być wynikiem podawania preparatu. T a b e l a 8 Schemat podawania bakterii i bakteriofagów oraz przeżywalność ptaków. Boks Zakażenie Salmonella Zastosowanie bakteriofagów Przeżywalność kurcząt 1 1 x 10 5 CFU na sztukę 2,0 x 10 6 PFU/ml 30/ x 10 5 CFU na sztukę 2,0 x 10 8 PFU/ml 29/ x 10 5 CFU na sztukę - 28/ /30 5 2,0 x 10 8 PFU/ml 28/30 Wykrywanie pałeczek Salmonella Pobieranie próbek na obecność pałeczek Salmonella odbywało się w następujący sposób (Fig. 6): Badano odchody przez 21 dni eksperymentu, Badano ściółkę gdzie pobierano wymazy podeszwowe w 3, 15 i 21 dobie życia ptaków, Badano Brojlery 21-dniowe gdzie sprawdzano wątrobę, śledzionę oraz jelita, Badano boksy przed wstawieniem piskląt gdzie pobierano wymazy ze ścian, karmideł, kwoki poideł i podłogi - kontrola, Badano pisklęta 1-dniowe gdzie sprawdzano narządy wewnętrzne, jelita i mekonium - kontrola. Pobrane próbki poddano badaniu na obecność pałeczek Salmonella w akredytowanym laboratorium VETLAB, Brudzew. Laboratorium to, w 2008 roku otrzymało zatwierdzenie nr GIWhig /08 Głównego Lekarza Weterynarii do wykonywania badań w kierunku obecności pałeczek Salmonella metodą bakteriologiczno-jakościową. W wyniku badania nie stwierdzono obecności pałeczek Salmonella w badanych próbkach narządów wewnętrznych i jelit piskląt kurzych 1-dniowych, wyściółki z mekonium oraz wymazów czystościowych z boksów przed zasiedleniem. Brak pałeczek Salmonella lub różny poziom ich wykrywania w przypadku analizy odchodów z 21 dni eksperymentu oraz podeszwy w 3, 15 i 21 dobie życia (Tabela 9), a także narządów wewnętrznych 21-dniowych Brojlerów (Fig. 7) był zależny od badanego boksu kurcząt. Mianowicie, u kurcząt w boksie 4 i 5 zgodnie z oczekiwaniem nie wykryto bakterii. U kurcząt w boskie 3, zakażonych pałeczkami Salmonella, którym nie podawano preparatu, pałeczki wykrywane są od 6 doby. Natomiast u kurcząt zakażony pałeczkami Salmonella z boksu 1 i 2 gdzie podawano faga widoczne jest zahamowanie namnażania bakterii do momentu zaprzestania podawania preparatu. Co ważne liczba wykrywanych pałeczek w narządach i jelitach 21-dniowych ptaków jest bardzo niska w stosunku do kurcząt, którym nie podawano preparatu, a więc bakteriofagi zapobiegają namnażaniu się bakterii, a tym samym pojawianiu się ich w odchodach eksperymentalnie zakażonych ptaków. Można więc zaobserwować, że bakteriofagi zmniejszają około 200-krotnie poziom zakażenia nawet tydzień po zaprzestaniu ich stosowania.

15 PL B1 15 T a b e l a 9. Poziom obecności pałeczek Salmonella w odchodach podczas eksperymentu. Doba Zakażenie Obecność pałeczek Salmonella Dodatek faga Boks 1 Boks 2 Boks 3 Boks 4 Boks 5 F N+/S+ F W+/S+ F-/S+ F-/S- F W+/S Tak Tak 3 2,5 x Tak Tak Tak ,0 x Tak Tak ,3 x Tak Tak ,0 x Tak Tak 12-3,0 x ,5 x Tak Tak 14-2,0 x ,5 x Tak 15 4,1 x ,0 x ,5 x Nie Nie 17 2,1 x ,0 x Nie 21 5,0 x ,2 x ,3 x Nie - oznacza, że nie wykryto pałeczek Salmonella, +" oznacza, że wykryto pałeczki Salmonella ale trudno było określić ich miano. Wykrywanie obecności bakteriofagów. Próbki poddawane badaniom na obecność bakteriofagów pobierano z odchodów przez 21 dób eksperymentu oraz z wymazów czystościowych z boksów przed zasiedleniem, przed zakażeniem oraz dobę i tydzień po zakończeniu podawania bakteriofagów. Nie wykryto bakteriofagów w narządach wewnętrznych. Zaobserwowano, że brak bakteriofagów lub różny poziom ich wykrywania w odchodach ptaków (Tabela 10) oraz podeszwy (Tabela 11) był zależny od badanego boksu kurcząt. Mianowicie, w przypadku kurcząt z boksów 1, 2 i 5, którym podawano preparat, obserwowano obecność bakteriofagów w odchodach, jednak liczba ich zmniejszała się wraz z zaprzestaniem podawania, a w przypadku boksu 2 i 5, gdzie użyto większego stężenia bakteriofagów, fagi nie były już wykrywane. Warto dodać, że w odchodach ptaków z boksu 5 wykrywano o wiele mniejszą liczbę bakteriofagów niż w przypadku boksu 2, co może wynikać z braku pałeczek Salmonella, a więc możliwości namnażania bakteriofagów. Doba T a b e l a 10. Poziom miana bakteriofagów w odchodach ptaków. Boks 1 F N+/S+ Boks 2 F W+/S+ Miano bakteriofagów Boks 3 F-/S+ Boks 4 F-/S Boks 5 F+/S ,8 x ,6 x ,0 x ,5 x ,0 x ,2 x ,0 x ,2 x ,7 x ,0 x

16 16 PL B1 T a b e l a 11. Poziom miana bakteriofagów w analizowanych wymazach podeszwowych. Doba Boks 1 F N+/S+ Boks 2 F W+/S+ Miano bakteriofagów Boks 3 F-/S+ Boks 4 F-/S- Boks 5 F+/S- Doba po zakończeniu podawania faga (15) 1,0 x ,0 x ,4 x 10 3 Tydzień po zakończeniu podawania faga (21) 6,5 x Konkluzje z badań nad działaniem preparatu na brojlery Na podstawie przeprowadzonych testów możemy stwierdzić, że preparat jest bezpieczny i efektywny. 1. Preparat jest bezpieczny dla drobiu. 2. Bakteriofagi przechodzą przez układ pokarmowy i dostają się do odchodów i ściółki. 3. Bakteriofagi nie dostają się do narządów wewnętrznych ptaków. 4. Bakteriofagi znikają po zaprzestaniu podawania preparatu. 5. Bakteriofagi zapobiegają pojawianiu się bakterii w odchodach eksperymentalnie zakażonych ptaków. 6. Bakteriofagi zmniejszają 200 krotnie poziom zakażenia tydzień po zaprzestaniu ich stosowania. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga specyficznego wobec wybranego szczepu bakterii, znamienny tym, że a) uzyskuje się kolekcję szczepów bakteriofagowych zawierającą szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego szczepu bakterii, b) prowadzi się hodowlę wybranego szczepu bakterii na jałowym medium hodowlanym, c) próbki hodowli nanosi się na specjalną wielodołkową płytkę pomiarową, dodaje się zawiesiny badanego szczepu bakteriofaga w różnych stężeniach i inkubuje się w temperaturze około 37 C przez co najmniej 4 godziny, d) do próbek hodowli dodaje się rezaurynę i kontynuuje się inkubację bez dostępu światła w temperaturze około 37 C przez co najmniej 3 godziny, e) kontroluje się barwę lub fluorescencję hodowli i szczep bakteriofagowy zawarty w hodowli która zachowała barwę niebieską lub nie wykazała istotnego wzrostu fluorescencji w porównaniu z próbą kontrolną identyfikuje się jako szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego szczepu bakterii, przy czym jako próbę kontrolną stosuje się jałową próbę poddaną takiej samej inkubacji, f) namnaża się zidentyfikowany szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego szczepu bakterii. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wybranym szczepem bakteryjnym jest szczep S. enterica srovar Enteritidis. 3. Zastosowanie bakteriofagów do wytwarzania preparatu do zapobiegania lub zwalczania zakażeń zwierząt hodowlanych, zwłaszcza drobiu, patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów, przy czym wytwarzany preparat jest przeznaczony do podawania zagrożonym zwierzętom wraz z pokarmem lub wodą w odstępach od jednego do siedmiu dni. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wytwarzany preparat zapewnia co najmniej 200-krotne zmniejszenie poziomu zakażenia przez tydzień po zaprzestaniu podawania. 5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że zwalczanym zakażeniem jest zakażenie drobiu patogennymi szczepami Salmonella sp., a do wytwarzania preparatu stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej: PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1). 6. Szczep bakteriofaga nadający się do zapobiegania lub zwalczania zakażeń patogennymi szczepami Salmonella sp. wybrany z grupy obejmującej: PCM F/00069 (szczep 8sent1748),PCM F/00070 (szczep 8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1) i wykazujący stabilność w chłodniczych warunkach przechowywania co najmniej przez 3 miesiące.

17 PL B1 17 Rysunki

18 18 PL B1

19 PL B1 19

20 20 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)