Azot pozabiałkowy Mocznik

Transkrypt

1 ROZDZIŁ 17 zot pozabiałkowy Mocznik Barbara Posielężna Dorota Polańska U zdrowych dorosłych osób ilość spożytego azotu jest równa ilości azotu wydalonego. Nadmiar przyjętego azotu w stosunku do wydalonego (dodatni bilans azotowy) występuje w okresie wzrostu i w ciąży. Związki azotowe występujące w osoczu krwi dzielimy na azot białkowy oraz azot pozabiałkowy zwany azotem resztkowym RN (ang. rest nitrogen). W warunkach fizjologicznych stężenie RN w osoczu krwi wynosi 11,4-28,6 mmol/l (16,0-40,0 mg/dl) w tym: 30-40% RN - stanowi azot mocznika, 20% RN azot kwasu moczowego, 20% RN azot aminokwasów, 5% RN azot kreatyniny, 1-2% RN azot kreatyny, 0,2% RN azot amoniaku. Wzrost azotu pozabiałkowego w osoczu krwi (hiperazotemia) może być spowodowany: przyczynami przednerkowymi (gorączka, choroby nowotworowe, rozległe oparzenia, dieta bogatobiałkowa i bogatopurynowa), 245

2 znacznym upośledzeniem czynności nerek. Obniżenie azotu pozabiałkowego w osoczu krwi (hipoazotemia) występuje w ciężkich chorobach wątroby i w nerczycy. Oznaczanie stężenia azotu pozabiałkowego w osoczu krwi przeprowadza się: metodą kolorymetryczną Nesslera Odbiałczone osocze mineralizujemy stężonym kwasem siarkowym w obecności katalizatora (SeO 2 ). Powstaje siarczan amonowy, z którego w reakcji z NaOH powstaje amoniak: SeO 2 zot organiczny + H 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH Na 2 SO 4 + 2H 2 O + 2NH 3 moniak w środowisku alkalicznym reaguje z jodkiem rtęciowo-potasowym (odczynnik Nesslera), tworząc jodek oksyaminortęciowy o zabarwieniu czerwonym: Hg Hg 2K 2 (HgI 4 ) + 3KOH + NH 4 OH 7KI + 3H 2 O + O NH 2 I Hg Hg metodą Kjedahla w aparacie Parnasa-Wagnera Odbiałczone osocze wirujemy i uzyskany supernatant w specjalnych kolbach Kjedahla poddajemy mineralizacji stężonym kwasem siarkowym (VI), w obecności katalizatora (miedziowego lub selenowego). Podczas łagodnego ogrzewania zawartości kolby, z azotu zawartego w związkach pozabiałkowych powstaje siarczan (VI) amonu. Następnie przeprowadza się destylację w aparacie Parnasa-Wagnera. Z powstałego (NH 4 ) 2 SO 4 pod wpływem stężonego NaOH uwalniany jest amoniak: (NH 4 ) 2 SO 4 + NaOH Na 2 SO 4 + 2NH 3 + 2H 2 O Uwolniony amoniak wiąże się z mianowanym H 2 SO 4 : NH 3 + H 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 Nadmiar niezwiązanego kwasu siarkowego (VI) miareczkujemy mianowanym roztworem NaOH. Z ilości zużytego do miareczkowania roztworu mianowanego NaOH, oblicza się ilość azotu pozabiałkowego w badanej próbce osocza. Metoda Kjedahla jest metodą referencyjną oznaczania azotu pozabiałkowego. Wykorzystywana jest również przy standaryzacji metod ilościowego oznaczania białek. Wolne aminokwasy pochodzące z egzogennych białek pokarmowych lub z degradacji endogennych białek, są katabolizowane najpierw poprzez usunięcie alfa-aminowego azotu w reakcji transaminacji lub w deaminacji oksydacyjnej. Fosforan pirydoksalu (PLP) jest istotną 246

3 częścią miejsca katalitycznego aminotransferaz. Podczas transaminacji przyłączony koenzym jest przenośnikiem grupy aminowej (pridoksamina). Transaminacja obejmuje wzajemne przemiany pary α-aminokwasu i α-ketokwasu przy udziale swoistych aminotransferaz, w nowy α-aminokwas i α-ketokwas. W większości tkanek ssaków występują dwie transaminazy: transaminaza alaninowa (transaminaza alanina-pirogronian) i transaminaza glutaminianowa (transaminaza glutaminian-α-ketoglutaran). Katalizują one przeniesienie grup aminowych z aminokwasów tworząc alaninę z pirogronianu i glutaminian z α- ketoglutaranu. zot aminowy większości aminokwasów ulegających transaminacji (z wyjątkiem lizyny, treoniny, proliny i hydroksyproliny) jest przenoszony na α-ketoglutaran z utworzeniem kwasu glutaminowego (Glu): α-ketoglutaran α-aminokwas glutaminian α-ketokwas Może odbywać się to dwoma drogami. Drogą pośrednią polegającą na odłączeniu grupy aminowej z aminokwasu (proces dwuetapowy): najpierw utlenienie jej do grupy iminowej, a następnie spontaniczna hydroliza powstałego iminokwasu do ketokwasu i przeniesienie grupy GDH glutminian + ND + α-ketglutaran + NDH + H + + NH 3 aminowej na inny ketokwas (ale w ten sposób nie powstaje wolny amoniak). Droga bezpośrednia uwolnienie amoniaku w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę kwasu glutaminowego (GDH), której kosubstratem jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy α-ketoglutaran ND + lub jego fosforan ND(P) +. Większość grup aminowych aminokwasów przenoszona jest na kwas alfa-ketoglutarowy, co prowadzi do powstania kwasu glutaminowego, a ten z kolei ulega deaminacji oksydacyjnej do α-ketoglutaranu i amoniaku. glutaminian α-aminokwas α-ketokwas Uwolnienie azotu aminowego w formie amoniaku jest katalizowane przez swoiste dehydrogenazy np. dehydrogenazę glutaminianową (GDH). glutaminian + ND(P) + GDH α-ketoglutaran + ND(P)H + H + + NH 3 Reakcja ta jest katalizowana przez dehydrogenazę glutaminianową (GDH) i może zachodzić w obie strony. Reakcja w kierunku tworzenia amoniaku zachodzi tylko w wątrobie. glutaminian + ND + GDH α-ketoglutaran + NDH + H + + NH 3 α-ketoglutaran α-aminokwas 247

4 α-ketoglutaran α-aminokwas We wszystkich tkankach pozawątrobowych reakcja ta przebiega w lewo, czyli w kierunku wiązania amoniaku i tworzenia kwasu glutaminowego. Jest to reakcja aminacji redukcyjnej α-ketoglutaranu: glutaminian α-ketokwas glutaminian + ND(P) + GDH α-ketoglutaran + ND(P)H + H + + NH 3 ktywność dehydrogenazy glutaminianowej (GDH) w wątrobie jest regulowana α-ketoglutaran + NDH + H + + NH 3 allosterycznie: GDH hamowana przez TP, GTP i NDH, aktywowana przez DP. glutaminian + ND + Przekształcenie zatem α-aminowego azotu aminokwasów w amoniak w wyniku działania aminotransferazy glutaminianowej i dehydrogenazy glutaminianowej zwane jest transdeaminacją. moniak powstający w organizmie jest dla niego bardzo toksyczny. Dlatego tkanki przekształcają go w grupę amidową nietoksycznej glutaminy (Gln) (reakcja amidacji kwasu glutaminowego). Reakcja wymaga dużego stężenia TP, bowiem energia z hydrolizy wysokoenergetycznego wiązania jest niezbędna do utworzenia wiązania amidowego glutaminy. ph 5 Fe CB Fe(CB) 3 3+ CTB glutaminian + NH 3 + TP syntetaza glutaminianowa glutamina + DP + Pi W warunkach prawidłowych amoniak występuje w postaci zjonizowanej i nie zagraża OUN. Gdy dojdzie do wzrostu stężenia amoniaku (hiperamonemii), przechodzi on do mózgu i w astrocytach (w których jest wysokie stężenie TP), zachodzi reakcja amidacji kwasu glutaminowego katalizowana przez syntetazę glutaminianową i powstaje glutamina. Glutamina opuszcza astrocyt na drodze dyfuzji ułatwionej i trafia do neuronu, gdzie działa enzym glutaminaza. 248 glutaminaza glutamina glutaminian + NH 3 Dochodzi do rozpadu glutaminy na kwas glutaminowy (który może być ponownie wykorzystany jako neurotransmiter) i na amoniak, który może w neuronach wchodzić w reakcję aminacji redukcyjnej. W hiperamonemii mamy większe nasilenie reakcji wiązania amoniaku przez α-ketoglutaran, skutkiem tego dochodzi do wyciągania α-ketoglutaranu z cyklu Krebsa i ograniczonej dostęności związków pośrednich dla cyklu Krebsa. Glutamina jest więc rezerwuarem kwasu glutaminowego, który jest substratem do syntezy hamującego neuroprzekaźnika w synapsach kwasu γ-aminomasłowego (GB).

5 Glutamina z krwią wędruje do wątroby, gdzie ulega deaminacji, a uwolniony amoniak jest przekształcany w cyklu mocznikowym w nietoksyczny mocznik. Najważniejszymi źródłami amoniaku w organizmie są: mięśnie szkieletowe, jelito, nerki. W pracującym mięśniu szkieletowym zużywana jest energia z TP. Kinaza adenylowa (miokinaza) katalizuje przemianę TP i MP w DP. Dzięki temu możliwe jest: wykorzystanie fosforanu bogatoenergetycznego z DP do syntezy TP, refosforylacja MP powstałego z TP, wykorzystanie zwiększającego się stężenia MP jako sygnału do tworzenia TP. MP ulega cyklicznym przemianom w cyklu purynowym. MP ulega deaminacji, uwalnia się amoniak i powstaje IMP. Następnie IMP przyłącza grupę aminową z asparaginianu (sp) przy udziale GTP w reakcji katalizowanej przez syntetazę adenylobursztynianową. Powstaje adenylobursztynian, z którego pod wpływem liazy adenylobursztynianowej, uwalnia się fumaran i powstaje MP. Cykl się zamyka, utworzone zostało MP i uwolnił się amoniak. Fumaran natomiast wchodzi do cyklu Krebsa, gdzie ulega hydratacji, powstaje jabłczan. Drugim źródłem amoniaku w organizmie jest jelito. moniak może powstawać w świetle jelita i w ścianie jelita (w enterocytach). W świetle jelita obecne są bakterie, które uwalniają amoniak z licznych związków znajdujących się w jelicie takich jak: aminokwasy, kwas moczowy, mocznik. W ścianie jelita obecny jest enzym glutaminaza, który katalizuje jednokierunkową reakcję hydrolizy wiązania amidowego glutaminy. Glutaminaza jest enzymem, który usuwa azot amidowy w reakcji deamidacji glutaminy. Powstaje kwas glutaminowy i amoniak. moniak żyłą wrotną dostaje się do wątroby. Żyła wrotna jest jedynym miejscem gdzie fizjologicznie jest wysokie stężenie NH 3. Trzecim źródłem wolnego amoniaku w organizmie jest nerka. W kanaliku nerkowym enzym glutaminaza uwalnia amoniak i kwas glutaminowy z glutaminy. moniak w sposób bierny dyfunduje do wnętrza kanalika, łączy się z jonem wodorowym (który zakwasza organizm). Powstaje jon amonowy NH + 4, który usuwany jest jako chlorek amonu. Wydalanie amoniaku do moczu ułatwia utrzymanie równowagi kwasowo-zasadowej w organizmie. moniak jest produkowany stale w tkankach i we krwi obwodowej. Jest obecny w śladowych ilościach (10-20 µg/dl), ponieważ jest szybko usuwany z krążenia przez wątrobę i 249

6 przekształcany w glutaminian, glutaminę lub w mocznik. Wzrost stężenia wysoce toksycznego amoniaku we krwi to hiperamonemia, która prowadzi do: 1. Występowania amoniaku w postaci niezjonizowanej i jego przenikania do OUN (bariera krew- mózg staje się dla niego przepuszczalna). W astrocytach w reakcji katalizowanej przez mitochondrialny enzym syntetazę glutaminianową, glutaminian wiąże amoniak wiązaniem amidowym, dzięki energii z hydrolizy TP do DP i P i powstaje glutamina. 2. Obniżenia stężenia kwasu glutaminowego i wzrostu stężenia glutaminy (która w nadmiernym stężeniu też jest toksyczna). Glutamina jest uwalniana z astrocytów przez transporter PT-1 (transporter dla aminokwasów będących toksynami) do części presynaptycznej neuronów. Zaburzenia uwalniania glutaminy z astrocytów powodują wzrost osmolalności wnętrza astrocytów, co prowadzi do obrzęku mózgu, śpiączki i zgonu. W neuronach dzięki glutaminazie dochodzi do hydrolitycznego usunięcia azotu amidowego. 3. Spadek stężenia kwasu glutaminowego w OUN zaburza syntezę hamującego neuroprzekaźnika kwasu γ-aminomasłowego (GB), co prowadzi do zaburzeń neuroprzekaźnictwa. 4. Spadek stężenia α-ketoglutaranu w mózgu, który jest prekursorem kwasu glutaminowego (w reakcji aminacji redukcyjnej), powoduje zahamowanie cyklu Krebsa i brak TP. Syntetaza glutaminianowa i glutaminaza katalizują wzajemną przemianę wolnego jonu amonowego i kwasu glutaminowego do glutaminy i rozpad hydrolityczny do jonu amonowego i glutaminianu. Najczęstszą przyczyną hiperamonemii u noworodków i dzieci są zaburzenia syntezy mocznika, na skutek bloków metabolicznych enzymów cyklu mocznikowego. Zatrucie toksycznym amoniakiem spowodowane jest najczęściej upośledzeniem funkcji wydalniczej wątroby lub nerek. Marskość wątroby, zespolenie żyły wrotnej z żyłą czczą, ostra niewydolność wątroby, zatrucie (rozpuszczalnikami organicznymi lub grzybami), zespół Rey`a (stłuszczenie wątroby z encefalopatią u dzieci), defekty enzymatyczne cyklu mocznikowego (u dzieci) to przyczyny wątrobowe hiperamonemii. Znaczne obciążenie białkiem przewodu pokarmowego (np. masywne krwawienia żołądkowojelitowe), zakażenia, spożycie alkoholu, hipokalcemia, leczenie środkami moczopędnymi i zaburzone wydalanie nerkowe - to przyczyny pozawątrobowe hiperamonemii. W warunkach fizjologicznych prawidłowe wydalanie amoniaku z moczem wynosi

7 mmol/dobę. Choroby przebiegające ze wzrostem wydalania amoniaku to: kwasica metaboliczna (biegunka, ketonemia w cukrzycy lub w głodzie), niedobór sodu lub potasu. Spadek wydalania amoniaku występuje: w alkalozie metabolicznej, w kłębkowym zapaleniu nerek z uszkodzeniem części dystalnej nefron i w chorobie ddisona. Mocznik biosynteza, enzymy, przedziały komórkowe Synteza mocznika (cykl mocznikowy, cykl ornitynowy, ureogeneza) zachodzi w wątrobie. Jest główną drogą usuwania toksycznego amoniaku. Zachodzi ona w dwóch przedziałach komórkowych w mitochondriach i w cytozolu. W cyklu mocznikowym głównymi donorami azotu jest amoniak i asparaginian. Reakcja kondensacji CO 2, amoniaku i TP prowadzi do utworzenia karbamoilofosforanu. Jest ona katalizowana przez mitochondrialną syntetazę karbamoilofosforanową I. Jest to enzym ograniczający szybkość cyklu mocznikowego. Jest on aktywny tylko w obecności allosterycznego aktywatora N-acetyloglutaminianu, który zwiększa powinowactwo syntetazy karbamoilofosforanowej do TP. Drugi enzym mitochondrialny transkarbamoilaza ornitynowa katalizuje przeniesienie reszty karbamoilowej z karbamoilofosforanu na ornitynę i powstaje L-cytrulina. Dalsze etapy syntezy mocznika zachodzą w cytozolu, Cytozolowa syntetaza argininobursztynianowa, katalizuje reakcję łączenia L-asparaginianu z L-cytruliną poprzez grupę aminową asparaginianu i powstaje argininobursztynian. Do przebiegu tej reakcji niezbędna jest energia pochodząca z hydrolizy TP. L-asparaginian jest dawcą drugiego atomu azotu mocznika. Kolejny enzym cytozolowy liaza argininobursztynianowa (zwana argininobursztyniazą) katalizuje rozszczepienie argininobursztynianu. Dochodzi do zatrzymania azotu w argininie i uwolnienia szkieletu asaparginianu w postaci fumaranu. W wyniku hydrolitycznego rozszczepienia grupy guanidynowej argininy, w reakcji katalizowanej przez arginazę uwalnia się mocznik ornityna, która powraca do cyklu. Fumaran przyłącza czasteczkę wody i tworzy L-jabłczan, który ulega ND + zależnemu utlenieniu do szczawiooctanu. Następnie szczawiooctan ulega transaminacji i odtwarza się asparaginian. Dieta bogatobiałkowa, głód i glikokortykosterydy stymulują biosyntezę mocznika i zwiększony wychwyt aminokwasów przez wątrobę. Zasadnicze zmiany w diecie zwiększają znacznie stężenia enzymów cyklu mocznikowego. Podczas głodowania dochodzi do wzrostu stężenia enzymów ureogenezy, ze względu na konieczność przekształcania dużych ilości toksycznego amoniaku powstałego przy zwiększonej degradacji białek. Podwyższone stężenie mocznika w surowicy występuje dopiero przy upośledzeniu funkcji nerki poniżej 25%. 251

8 Prawidłowe wydalanie mocznika wynosi g/dobę. W stanie równowagi azotowej organizmu wydalane jest około 14 g/dobę azotu mocznika. Stężenie mocznika w surowicy krwi zależy od: ilości białka w diecie, czynności wydalniczej nerek, tempa metabolizmu białek ustrojowych, czynności wątroby i narządów dokrewnych. Wzrost stężenia mocznika we krwi występuje w: upośledzonej filtracji kłębuszkowej: ostra niewydolność nerek, w przewlekłych chorobach nerek, zmniejszonym przepływie krwi przez nerki (wstrząs, zastoinowa niewydolność krążenia), zwiększonym katabolizmie białek dieta wysokobiałkowa, utrata masy mięśniowej, reabsorbcja białek po krwawieniu z przewodu pokarmowego, sterydoterapia, gorączka, nadczynność tarczycy, po podaniu leków (antybiotyki nefrotoksyczne), odwodnieniu. Zespół objawów towarzyszących niewydolności nerek to mocznica, z powodu wysokiego stężenia mocznika we krwi, który nie jest toksyczny. Obniżenie stężenia mocznika we krwi występuje w: ciężkich chorobach wątroby (zatrucie czterochlorkiem węgla, chloroformem, ostry zanik wątroby, wirusowe zapalenie wątroby), trakcie stosowania androgenów, przy diecie niskobiałkowej, głodzeniu, przewodnieniu. Około 90% mocznika jest wydalane z moczem, pozostałe 10% z potem lub trafia do przewodu pokarmowego. Mocznik ulega całkowitej filtracji do przesączu pierwotnego. W wyniku biernej dyfuzji w kanalikach nerkowych 40% mocznika ulega resorbcji i sekrecji. Procesy te pozostają w równowadze dynamicznej. Mocznik odgrywa też istotną rolę w rozcieńczaniu i zagęszczaniu moczu poprzez zwiększanie molalności rdzenia nerki (wzmacniacz przeciwprądowy). Przepuszczalność ścian kanalików dla mocznika jest różna. Dobrze przepuszczalne są ściany cewki bliższej, pętli Henlego i cewki dalszej. Nieprzepuszczalne są ściany cewki zbiorczej. Powoduje to uwięzienie mocznika w miąższu nerki i ciągłą cyrkulację w rdzeniu nerki wywołaną utrudnieniem jego ucieczki przez ścianę cewek dalszych. 252

9 Wydalanie mocznika z moczem jest wprost proporcjonalne do przesączania kłębuszkowego (GFR), ale stężenie mocznika we krwi nie jest dobrym markerem oceny GFR. Oznaczanie stężenia mocznika w surowicy krwi jest przydatne w różnicowaniu spadku wielkości przesączania kłębuszkowego poprzez zastosowanie współczynnika mocznik/kreatynina (prawidłowo wynosi 12 20). minokwasy Stanowią około 20% azotu pozabiałkowego. Oznaczanie azotu -aminowego za pomocą reakcji z ninhydryną pozwala oceniać pulę wolnych aminokwasów. W warunkach fizjologicznych w moczu występują śladowe ilości aminokwasów, ponieważ ulegają one całkowitemu wchłanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Hiperaminoacydemia zwiększone stężenie aminokwasów w osoczu krwi, Hiperaminoacyduria - zwiększone wydalanie aminokwasów z moczem. Zmiany te mogą być wybiórcze, ograniczone do jednego lub kilku aminokwasów, lub uogólnione. minoacydurie dzielimy ze względu na przyczyny na: Pierwotne: z przelewu występuje blok metaboliczny, skutkiem czego dochodzi do nagromadzenia się w osoczu aminokwasu, który nie ulega przemianie. Zostaje przekroczony próg nerkowy, czyli zdolność reabsorbcji aminokwasu przez kanaliki nerkowe. Dzieje się tak w hiperfenyloalaninemii, tyrozynemii, alkaptonurii, homocystynurii, histydynemii, chorobie z moczem o zapachu syropu klonowego, w defektach cyklu mocznikowego. W wyniku zaburzonego transportu cewkowego cystynuria, choroba Hartnupów, aminoacyduria dikarboksylowa. Wtórne: z przelewu w ciężkich chorobach wątroby (żółty zanik wątroby, marskość wątroby, zatrucie muchomorami, czterochlorkiem węgla), czego wynikiem jest hiperaminoacydemia. W wyniku dysfunkcji transportu kanalikowego na skutek uszkodzenia nerek (zatrucie metalami ciężkimi, zażywanie leków nefrotoksycznych). 253

10 Metoda referencyjna oznaczania stężenia mocznika Metoda enzymatyczna - kinetyczna Zasada metody: glutaminaza glutamina glutaminian + NH 3 Ureaza w sposób swoisty rozkłada mocznik do dwutlenku węgla i amoniaku. Dehydrogenaza glutaminianowa (GDH) katalizuje swoiście redukcyjną aminację -ketoglutaranu do glutaminianu i do swojego działania wymaga udziału NDH +H +. ureaza CO(NH 2 ) 2 +H 2 O CO NH 3 GDH α-ketoglutaran + NDH + H + + NH 3 glutaminian + ND + Ureaza działa jednokierunkowo, a przez odpowiedni dobór reagentów równowaga reakcji dehydrogenazy glutaminianowej zostaje przesunięta całkowicie w prawo i zachodzi w sposób stechiometryczny. Rozkład jednej cząsteczki mocznika jest związany z utlenieniem 2 cząsteczek NDH + H +. Zmniejszanie się ilości formy zredukowanej ND, mierzy się poprzez odczyt spadku absorbancji w czasie 1 min, dla próby badanej i kontrolnej przy długości fali 340 nm. Metoda jest swoista i bardzo czuła. Oprócz stężenia mocznika - często dla celów klinicznych - oznaczany jest we krwi azot mocznika (BUN ang. blood urea nitrogen). Kwas moczowy, kreatyna i kreatynina jako niebiałkowe, azotowe składniki osocza omówione zostały szczegółowo w następnym rozdziale. 254

11 CZĘŚĆ PRKTYCZN ĆWICZENIE 1 Identyfikacja mocznika REKCJ MOCZNIK Z KWSEM ZOTWYM Do 0,5 ml 20% roztworu mocznika dodać 0,5 ml 45% roztworu azotynu sodu oraz kilka kropli 1 M roztworu kwasu siarkowego. Obserwować intensywne wydzielanie się pęcherzyków gazów N 2 i CO 2. REKCJ TWORZENI ZOTNU MOCZNIK Do 2 ml 20% roztworu mocznika dodać kilka kropli stężonego kwasu azotowego. Obserwować wytrącanie się białego osadu azotanu mocznika. HYDROLIZ MOCZNIK Osad azotanu mocznika zalkalizować 0,5 ml wody wapiennej. Próbkę silnie ogrzać aż do wyczuwalnego zapachu amoniaku. ĆWICZENIE 2 Oznaczanie stężenia mocznika w surowicy oraz w moczu Zasada metody Mocznik jest końcowym produktem katabolizmu białek. Przedstawiona metoda jest metodą kinetyczną, oznaczania mocznika w temperaturze pokojowej. Metoda wykorzystuje dwie sprzężone reakcje. W pierwszej mocznik ulega rozkładowi pod wpływem ureazy do CO 2 i NH 3. W drugiej reakcji alfa-ketoglutaran przyłącza jon amonowy w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę glutaminianową (GDH), która wymaga udziału NDH + H +. Dochodzi do utlenienia NDH + H + do ND +, co obserwujemy spadkiem absorbancji mierzonej przy długości fali = 340 nm. MTERIŁ BDNY Surowica 1 i 2, mocz 100 krotnie rozcieńczony 255

12 ODCZYNNIKI 1. Odczynnik roboczy ( kwas alfa-ketoglutarowy, TRIS, DP, ureaza, NDH, GDH) 2. Wzorzec (40 mg/dl mocznika) WYKONNIE Odmierzyć do probówek wyłącznie odczynnik roboczy: Składnik próby (µl) Próba badana Próba wzorcowa Odczynnik roboczy 1000 µl 1000 µl Wzorzec 40 mg/dl - 10 µl Surowica lub mocz 100x rozc. 10 µl - Do pierwszej probówki dodać wzorzec, wymieszać i inkubować 30sek w temperaturze pokojowej, następnie całość próby przenieść do kuwety. Odczytać absorbancję w czasie zero ( 0 ). Po 60 sekundach zmierzyć ponownie absorbancję absorbancję ( 1 ). Następnie powyższą procedurę przeprowadzić dla próby badanej. OBLICZENI Δ = ( 0-1 ) obliczenie zmiany absorbancji osobno dla próby badanej i wzorcowej 1. Dla stężenia mocznika w surowicy stężenie mocznika. wzorca 40/ mg dl próby badanej 2. Dla stężenia mocznika w moczu (uwzględnia 100x rozcieńczenie moczu) stężenie mocznika 40 mg / dl 100 próby. badanej wzorca Δ próby badanej. różnica absorbancji próby badanej Δ wzorca. różnica absorbancji próby wzorcowej DZM 1000 ml 256

13 ĆWICZENIE 3 Ilościowe oznaczanie mocznika metodą ureazową według Berthelota ZSD METODY Ureaza rozkłada mocznik do dwutlenku węgla i amoniaku. moniak reaguje z kwasem podchlorawym dając chloraminę, która z fenolem i tlenem daje błękitny barwnik indofenolowy. MTERIŁ BDNY Surowica Mocz rozcieńczony 1:100 wodą destylowaną ODCZYNNIKI EDT, nitroprusydek sodu, ureaza - odczynnik 1. Fenol UWG substancja żrąca - odczynnik 2. Roztwór podchlorynu sodu i wodorotlenku sodu - odczynnik 3. Wzorzec mocznika 40 mg/dl = 6,66 mmol/l WYKONNIE Odmierzyć do probówek: Składnik próby (ml) Próba ślepa Próba wzorcowa Próba badana surowica lub mocz - - 0,02 wzorzec - 0,02 - odczynnik 1. 0,20 0,20 0,20 natychmiast wymieszać, inkubować w 37 C przez 10 min. odczynnik 2. 5,0 5,0 5,0 odczynnik 3. 5,0 5,0 5,0 natychmiast wymieszać, inkubować w 37 C przez 15 min. Odczytać absorbancję próby badanej i próby wzorcowej wobec próby ślepej, przy długości fali 546 nm. 257

14 OBLICZNIE WYNIKÓW surowica B W 40 = mg mocznika/dl albo B W 6,66 = mmol mocznika/l mocz B W 40 = g mocznika/l albo gdzie: B W 6,66 = mmol mocznika/l - absorbancja 258