Fluorescencja krwi po wzbudzeniu porfirynowego pasma Soreta

Transkrypt

1 Fluorescencja krwi po wzbudzeniu porfirynowego pasma Soreta Blood Fluorescence after Exitation at Phorfirins Soret Band Grzegorz Głaczyński Instytut Fizyki Uniwersytetu Jagiellońskiego ul. Reymonta 4, Kraków, Polska

2 Podziękowania Pragnę serdecznie podziękować Panu Prof. Dr Hab. Wojciechowi Gawlikowi za poświęcony czas, zaangaŝowanie oraz moŝliwość prowadzenia badań w tak interesującym obszarze nauki, jakim jest fotomedycyna. Panu Dr Krzysztofowi DzierŜędze za Ŝyczliwą pomoc oraz wszystkim, którzy przyczynili się do powstania niniejszej pracy. Grzegorz Głaczyński 2

3 Spis treści: 1. Wstęp Motywacje Cele Problematyka wstępna Zastosowanie światła w biologii i medycynie Fototerapia Przykłady wykorzystania światła w medycynie Terapia fotodynamiczna Diagnostyka fotodynamiczna Fotochemiczne podstawy PDD i PDT Absorpcja...14 Transmitancja...14 Absorbancja Fluorescencja...15 Wydajność kwantowa...16 Wygaszanie fluorescencji Przejścia bezpromieniste Fosforescencja Wysokoreaktywne związki tlenowe...19 II typ fotoreakcji...20 I typ fotoreakcji...21 Tlen singletowy...23 Wydajność kwantowa tlenu singletowego Fotouczulacze Porfiryny i ich pochodne Porfiryny Porfiryny występujące w przyrodzie Porfiryny otrzymywane syntetycznie...27 HpD...28 Photofrin II Kwas aminolewulinowy 5-ALA Pasma absorpcyjne porfiryn Pasmo Soreta Pasmo Q Cechy fotouczulaczy Zastosowanie Dawki Efekty uboczne i przeciwwskazania Efektywność PDT i PDD Krew Budowa Znaczenie i funkcja krwi Hemoglobina...38 Hematoporfiryna Absorpcja i fluorescencja krwi Źródła światła

4 4.1. Znaczenie światła LED diody elektroluminescencyjne Półprzewodniki Złącze pn Charakterystyka Właściwości Diody laserowe Charakterystyka Porównanie LED z diodami laserowymi Diody elektroluminescencyjne 405 nm Widmo diody Moc diody Jednorodność natęŝenia Urologia PDD Diody LED 740 nm Aparatura i pomiar fluorescencji krwi Widmo hemoglobiny spektrometr SM520-USB Aparatura pomiarowa Kamera CCD Dane otrzymywane ze spektrometru Kalibracja układu pomiarowego Kalibracja I długości fali Kalibracja czułości kamery CCD MONOSpectrometr - program do analizy danych Fluorescencja krwi Wpływ rozcieńczalnika na widmo fluorescencji...78 Woda destylowana...78 Krew grupy 0 Rh(-):...78 Krew grupy 0 Rh(+):...79 Sól fizjologiczna...80 Krew grupy 0 Rh(-):...80 Krew grupy 0 Rh(+):...81 PołoŜenie pików...81 Amplitudy pików Wzbudzenie laserem o długości fali 415 nm Podsumowanie Wyniki i wnioski Ulepszenie aparatury Dalsze plany...94 Literatura:

5 ABSTRAKT: Niniejsza praca szczegółowo omawia procesy fizyko-chemiczne problematyki związanej z diagnostyką fotodynamiczną (PDD) oraz terapią fotodynamiczną (PDT). Zaznaczono w niej waŝną rolę fotouczulaczy. Przedstawiono uogólnioną budowę i charakterystykę barwników fotouczulających a takŝe powiązanie z krwią, której podstawowym składnikiem jest hem. Proces fluorescencji zaprezentowano zarówno od strony teoretycznej jak i praktycznej. Przedstawiono widma fluorescencji krwi. Przeanalizowano zastosowania światła z zakresu widzialnego. Uwagę skupiono na diodach elektroluminescencyjnych, które stosowano przy oświetlaniu krwi. Przedstawiono równieŝ inne moŝliwości zastosowania diod LED do celów diagnostycznych i terapeutycznych. ABSTRACT: Physical and chemical processes involved in Photodynamic Diagnosis and Photynamic Theraphy have been described in details. Role of photosensitizers has been pointed out. General structure and characterization of dyes and their connection with blood have been presented in this work. Fluorescence was theoretically described and observed fluorescence spectras of human blood were shown. Various visible light sources from visible range and their possible applications in PDD and PDT were analyzed. This work was focused on electroluminescence light emitting diodes (LEDs), which were used for blood excitation. Other possible use of LED s as a light sources in PDD and PDT had been discussed. 5

6 1. Wstęp Obszar światła widzialnego był od zawsze szczególnie bliski człowiekowi. Badania nad jego wpływem na organizmy Ŝywe prowadzone są od ponad stu lat. Analizuje się interakcje promieniowania z materiałem biologicznym i substancjami fotouczulającymi. Poszukiwania coraz lepszych fotouczulaczy wciąŝ trwają, a ich zastosowanie, szczególnie w onkologii, moŝe zaowocować skuteczniejszą walką z chorobami nowotworowymi. Światło widzialne nie penetruje jednak tkanek głęboko, dlatego badania są skoncentrowane przede wszystkim na leczeniu i badaniu ich powierzchniowych obszarów. Diagnostyka fotodynamiczna (PDD) pozwala natomiast na obserwacje zmian w tkankach oraz związkach, które samoistnie są barwnikami i wykazują fluorescencję. Równocześnie daje moŝliwość badania niektórych biomolekuł, czy wręcz duŝych obszarów po wcześniejszym podaniu fotouczulacza. Coraz powszechniejsze w medycynie jest zastosowanie laserów oraz róŝnego rodzaju lamp oświetlających często wykorzystujących filtry spektralne. W niniejszej pracy zwrócono uwagę na oświetlacze a takŝe zaproponowano inny ich rodzaj jeszcze mało popularne diody elektroluminescencyjne (LED). Cechują się one stosunkowo dobrą monochromatycznością a jednocześnie niską ceną. Zastosowanie takich źródeł światła pozwoliłoby na szersze rozpowszechnienie diagnostyki i terapii fotodynamicznej oraz dalszy rozwój tej dziedziny. Stosowane w medycynie związki fotoczułe, dalej zwane barwnikami, są głównie pochodnymi porfiryny. Idea ich zastosowania związana jest z badaniami nad zaburzonym metabolizmem hemu, mogącym prowadzić do porfirii, choroby zwanej inaczej wampiryzmem [1]. Dolegliwość ta polega na nadwraŝliwości chorych na światło. Hem elementarna część krwi jest głównym przedmiotem zainteresowania w niniejszej pracy. W wyniku oświetlenia odpowiednim światłem obserwuje się fluorescencję, która moŝe pozwolić na zauwaŝenie zmian międzyosobniczych, róŝnic pomiędzy wieloma grupami krwi, a takŝe być moŝe pozwoli na wczesne diagnozowanie róŝnych chorób. Krew przepływając przez cały organizm, jednocześnie ma kontakt z obszarami patologicznymi, jeśli takowe występują. Wiedza, którą być moŝe uda się zdobyć dzięki tym badaniom, pozwoliłaby na łatwą diagnostykę chorób. 6

7 1.1. Motywacje Wykorzystanie wiedzy otrzymanej z analizowanych widm fluorescencyjnych krwi do celów diagnostycznych moŝe zaowocować szybką techniką wykrywania zmian. Natomiast zastosowanie tanich oświetlaczy zbudowanych z diod LED pozwoliłoby na rozpowszechnienie tej metody. Coraz liczniej występujące zmiany nowotworowe mogłyby być wykrywane wcześniej i dzięki temu skuteczniej leczone Cele Problematyka związana z diagnostyką fotodynamiczną jest bardzo interesująca. Badania w tym kierunku powinny być nieustannie rozwijane, a wiedza rozpowszechniana. Praca badawcza, która zaowocowała niniejszą pracą, wiązała się nie tylko z pomiarem widm fluorescencji czy budowaniem układów optycznych, oświetlaczy i ich charakterystyką ale teŝ próbami rozpowszechniania tej dziedziny w coraz szerszych kręgach akademickich i nawiązywania współpracy i proponowania ewentualnego zastosowania odpowiednich źródeł światła Problematyka wstępna Krew, przedmiot zainteresowania w niniejszej pracy, składa się między innymi z hematoporfiryny będącej naturalnym barwnikiem występującym w obrębie ludzkiego organizmu. Cyrkuluje ona w ciele i dociera do wszystkich jego obszarów, równieŝ patologicznych. Kontakt z chorymi miejscami moŝe wpływać na zmiany fluorescencji krwi co było celem badań. Obserwacja fluorescencji wymaga układu zbudowanego ze źródła światła dopasowanego do pasm absorpcyjnych hemu. Tanim oświetlaczem jest dioda elektroluminescencyjna. W tej pracy scharakteryzowano i opisano świecenie tego obiektu. Kolejnym elementem jest spektrometr, który musi być wyposaŝony w wystarczająco czuły detektor by móc rejestrować słabe widmo wyświetlane z krwi. 7

8 2. Zastosowanie światła w biologii i medycynie 2.1. Fototerapia KaŜdy spotkał się z określeniem depresja zimowa, która jest znana w literaturze medycznej jako SAD (seasonal affective disorder). Jest to zaburzenie, będące formą depresji, najczęściej związane z niedostatkiem światła słonecznego. Procesy fizjologiczne odpowiedzialne za ten stan nie są obecnie znane. Podejrzewa się działanie melaniny, która prawdopodobnie wpływa na tzw. zegar biologiczny organizmu ludzkiego. W okresie krótszego dnia powstaje zwiększona ilość melatoniny, co prawdopodobnie jest odpowiedzialne za te stany depresyjne. Czasami wspomina się o odwróconym SAD, który występuje w okresie letnim, dlatego SAD leczy się niczym innym jak światłem. Naświetla się pacjenta przez okres ok. 30 minut światłem 50 krotnie mocniejszym, aniŝeli stosowanym do oświetlania pomieszczeń [2]. Znaczenie promieni słonecznych doceniane jest juŝ od czasów staroŝytnych. Egipcjanie [3], nie bez powodów, czcili boga słońca Ra, staroŝytni Grecy doceniali biologiczną aktywność promieniowania słonecznego, rozumieli zarówno terapeutyczne jak i szkodliwe jego działanie [4,5]. Im równieŝ zawdzięczamy określenie helioterapia, czyli medyczne określenie światłolecznictwa - metody leczenia wykorzystującej naświetlanie organizmu pacjenta światłem naturalnym. Czasy nowoŝytne, a w szczególności koniec XIX wieku, to okres, w którym rozpoczęto badania nad wpływem światła na tkanki biologiczne, jak i zastosowaniem fotouczulaczy. W tym czasie wiedziano, Ŝe światło z zakresu ultrafioletu ma właściwości bakteriobójcze, udowodniono równieŝ, Ŝe ten obszar światła odpowiedzialny jest za oparzenia oraz opaleniznę. Niels Ryberg Finsen z doskonałym rezultatem leczył gruźlicę skórną wykorzystując lampę łukową (tzw. lampa Finsena). XIX wiek przynosi juŝ pierwsze wzmianki o negatywnych interakcjach niektórych podawanych pacjentom leków i roślin a światłem. W tym okresie Baumstark opisywał negatywny wpływ światła na osoby chore na porfirię. Jean Prime opisuje wpływ światła na osoby, którym podawano leki utworzone na bazie substancji fotouczulającej eozyny. 8

9 W 1900 roku Oscar Raab badał zachowanie drobnoustrojów pod wpływem akrydyny jak i jej pochodnych przy naświetlaniu światłem słonecznym. Zaobserwował, Ŝe badane pantofelki (Paramecium) giną, w przeciwieństwie do grupy kontrolnej, na której nie stosował tego fotosensybilizatora. Badanie, po przeprowadzeniu setek eksperymentów, doprowadziły go do wniosku, Ŝe na śmierć osobników bardziej wpływała dawka światła aniŝeli stęŝenie fotouczulacza. Niespełna dwa lata później, w 1902 r. zauwaŝono, Ŝe w reakcjach fototoksycznych niezbędna jest obecność tlenu. W 1911 r. zauwaŝono fotodynamiczne działanie hematoporfiryny. Natomiast w 1924 roku badania Polikarda wniosły waŝną informację. ZauwaŜył on, Ŝe zmiany nowotworowe w postaci guzów, po oświetleniu lampą Wooda (emitującą promieniowanie nadfioletowe), charakteryzują się silniejszą czerwoną fluorescencją aniŝeli pozostałe obszary. Kolejne lata badań przyniosły nowe odkrycia. W obszarach patologicznych zauwaŝono większą ilość endogennych porfiryn, które wykazywały fotouczulenie na światło z zakresu UV. Następowały pierwsze próby wykorzystania kumulacji endogennych porfiryn w obszarach nowotworowych do celów diagnostycznych. Aczkolwiek dopiero szersze wykorzystanie laserów i badania nad pochodnymi hematoporfiryny (HpD - Hematoporphirin Derivatives) szerzej otwarło drogę rozwoju fototerapii. Właściwości lecznicze światła znane są od setek lat, ale obecny rozwój technologiczny pozwala na szczegółowe badanie mechanizmów i procesów mających wpływ na tkankę biologiczną pod wpływem kwantów światła. Poszukuje się równieŝ optymalnych rozwiązań, by uzyskać najbardziej poŝądane efekty leczenia i diagnostyki przy uŝyciu światła Przykłady wykorzystania światła w medycynie Terapia, jak i diagnostyka fotomedyczna nie są jedynymi moŝliwościami oddziaływania kwantów promieniowania świetlnego z obiektami biologicznymi. W zaleŝności od stosowanych gęstości mocy uzyskuje się róŝne efekty oddziaływań światła laserowego z biomateriałami: fotochemiczne, fototermiczne, fotojonizacyjne, fotodysocjacyjne (polegające na rozerwaniu wiązań chemicznych) czy biostymulacyjne (rys. 2.1.) [4,6,7]. 9

10 Rys Wpływ gęstości mocy i szerokości impulsu na ludzką tkankę [4,6]. Coraz powszechniejsze w medycynie jest zastosowanie laserów. Wśród wielu dziedzin najczęściej stosuje się światło (bez wykorzystania fotouczulaczy) w: 2. Chirurgia, wykorzystującej głównie efekty termiczne. Zastosowanie lasera w tej dziedzinie ma szereg zalet. Jest bezkontaktowe (nie wymaga kontaktu z ciałem pacjenta), co wpływa na sterylność zabiegu. Wiązką światła moŝna precyzyjnie manipulować selektywnie niszcząc obszary wymagające leczenia. Przykłady: chirurgia refrakcyjna operacje okulistyczne: modelowanie soczewki, zbiegi na dnie oka, usuwanie jaskry stomatologia chirurgia tkanek miękkich i twardych jamy ustnej usuwanie tkanek prostaty ginekologia sterylizacja onkologia usuwanie zmian nowotworowych laryngologia wycinanie migdałków 3. Światło lasera jest równieŝ wykorzystywane w dermatologii i kosmetyce. Najczęstsze zastosowania to: usuwanie przebarwień skórnych, blizn, tatuaŝy usuwanie owłosienia poprzez niszczenie cebulek włosa zgrzewanie skóry spajanie tkanek bez uŝycia szwów leczenie trądziku ablacja kosmetyczna usuwanie zmarszczek 10

11 4. Właściwości koagulacyjne światła znalazły zastosowanie pulmonologiczne do leczenia guzów tarczycy, i podobnie jak w laryngologii, zmian naczyniowych: naczyniaków, krwiaków, miejsc krwawienia. 5. Fotomedyczne właściwości światła ultrafioletowego wykorzystywane są w terapii Ŝółtaczki u noworodków, czy np. terapii łuszczycy. Ŝółtaczka występująca wśród noworodków wynika z nadmiaru bilirubiny w organizmie pacjenta. Promieniowanie z zakresu nm jest absorbowane, a pochłonięta energia ma wpływ na rozerwanie wiązań wodorowych w bilirubinie, co prowadzi do prawidłowego usuwania jej z ciała pacjenta. terapia leczenia łuszczycy, podobnie jak terapia fotodynamiczna, wymaga substancji endogennej, którą aktywuje się światłem. Metoda znana jest od długiego czasu. W pierwotnej formie stosowano promieniowanie UV i smołę, którą obecnie zastępuje się 8-methoxypsoralenem. Współczesna literatura mówi równieŝ o efektach biostymulacyjnych światła przy niskich gęstościach mocy (LLLT low level laser therapy). Mechanizmy tego procesu są wciąŝ słabo poznana, a efekty prezentowane w publikacjach poddawane wątpliwościom [6,7,8] Terapia fotodynamiczna Terapia fotodynamiczna PDT (photodynamic therapy) jest to metoda leczenia za pomocą podawanych egzogennych fotouczulaczy i naświetlaniu światłem o określonej długości fali, dostosowanym do pasm absorpcyjnych danego fotosensybilizatora. W wyniku złoŝonych procesów fizyko-chemicznych w tkankach, którym został podany zewnętrznie fotouczulacz po naświetleniu a zarazem zaabsorbowaniu odpowiedniej energii przenoszonej przez kwant światła, następuje destrukcja komórek. Pozwala to na selektywne niszczenie zmian patologicznych. Jest to tzw. reakcja fotocytotoksyczna [9]. Fotouczulacze, czyli pochodne związków porfirynowych, dobiera się tak, aby gromadziły się w obszarach chorych, minimalizując w ten sposób ryzyko zniszczenia obszarów zdrowych. 11

12 Największym obszarem zainteresowania cieszy się moŝliwość wykorzystania PDT do leczenia zmian nowotworowych. Aktualne badania w tej dziedzinie koncentrują się na znajdowaniu coraz bardziej selektywnie działających barwników (fotouczulaczy), które nie będą powodowały szkody dla całego organizmu. Wykorzystanie PDT do leczenia zmian nowotworowych pozwala na skuteczne niszczenie obszarów patologicznych, gdyŝ właśnie tam występuje największe stęŝenie fotosensybilizatora, przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonymi zdrowych miejsc. Ograniczeniem jest moŝliwość naświetlania. Zmiany skórne w sposób łatwy moŝna oświetlić. Problem pojawia się w momencie naświetlania wewnątrz organizmu. W niektórych wypadkach moŝna stosować światłowody np. podczas zabiegów przy uŝyciu endoskopów, czy naświetlać podczas operacji na odsłoniętych organach. JednakŜe sporym problemem jest fakt wynikający z charakteru stosowanego światła penetruje tkanki na głębokości rzędu kilku milimetrów [4,6,7,9,10,11] Diagnostyka fotodynamiczna Diagnostyka fotodynamiczna PDD (photodynamic diagnosis) oraz diagnostyka fluorescencji FD (fluorescence diagnosis) [5] polega na określaniu i obserwowaniu obszarów patologicznych najczęściej zmian nowotworowych. Podobnie jak PDT polega na podaniu fotouczulacza, który selektywnie trafia do obszarów chorych i tam się kumuluje. Następnie oświetlając odpowiednim światłem, dostrojonym do pasma absorpcji fotouczulacza, emitowany jest kwant światła o innej długości fali. Fluorescencja ta pozwala na wyznaczenie obszarów zmienionych chorobowo i jednocześnie pozwala na znajdowanie zarówno duŝych obszarów patologicznych, jak i mikrorozsiewów, które często są niewidoczne przy świetle dziennym. Dzięki PDD moŝna określić sposób leczenia, moŝe być to PDT albo inny sposób usunięcia zmian nowotworowych np. chirurgiczny. WaŜnym aspektem, poprawiającym czułość detekcji, jest inna długość fali fluorescencji uczulacza od długości fali światła wzbudzającego. 12

13 2.5. Fotochemiczne podstawy PDD i PDT Najłatwiejszym sposobem opisu zjawisk towarzyszącym zarówno terapii jak i diagnostyki fotodynamicznej jest opis z wykorzystaniem diagramu Jabłońskiego (rys. 2.2.). Rys Diagram Jabłońskiego. Oznaczenia na rysunku: S 0, S 1, S 2 stany singletowe; T 1 stan tripletowy; vr bezpromieniste przejście; ic konwersja wewnętrzna, isc przejście interkombinacyjne; qu przejścia związane ze stratą energii wskutek zderzeń; nr relaksacja bezpromienista; FLUOR fluorescencja, PHOS fosforescencja [5,12,15]. Po naświetleniu fotouczulacza odpowiednią energią, następuje przechwycenie przez substancje fotoczułą kwantu światła. Cząsteczka przechodzi z podstawowego stanu singletowego (S 0 ) do wzbudzonego stanu singletowego (S n ). W przypadku organicznych cząsteczek aromatycznych, czyli równieŝ fotouczulaczy, będących najczęściej pochodnymi porfiryny, energia przejścia do wysokoenergetycznego stanu singletowego (S n ) odpowiada długościom fali mniejszym aniŝeli 300 nm. Przejście stanu S 0 do podstawowego wzbudzonego stanu singletowego odpowiada zakresowi nm. Jak widać, obszar wykorzystywany w fototerapii jest obszarem światła widzialnego, w takich przypadkach najwygodniej jest wyraŝać energię za pomocą długości fali wyraŝonej w nm [4,9,12]. Energia zaabsorbowanych fotonów jest odwrotnie proporcjonalna do długości fali λ: gdzie: E hc λ =, stała Plancka wynosi h=6,625*10-36 [Js] oraz prędkość światła w próŝni c=3*10 8 [m/s] ze 13

14 Absorpcja Absorpcja światła w fotouczulaczu jest związana z przejściem elektronu ze stanu podstawowego (S 0 ) do stanu wzbudzonego (S n ). Fotosensybilizatory mają szerokie pasmo absorpcji wynikające z silnego rozszerzenia oscylacyjnego elektronów. Energia wymagana do absorpcji, czyli wzbudzenia cząsteczki wynosi Ε: ( S ) E( ) E = E n. S 0 Efektywność absorpcji jest ściśle związana z dopasowaniem energii padającej a pasmami absorpcji fotouczulacza. Im lepsze dopasowanie tym większa wydajność zachodzącego procesu. Najlepsze efekty uzyskuje się przy stosowaniu (quasi) monochromatycznego światła [5]. Transmitancja W najprostszych przypadkach, kiedy tylko część natęŝenia światła padającego (I 0 ) zostaje pochłonięta, a część światła przechodzi dalej, mówimy o transmitancji (lub współczynniku transmisji T). MoŜe ona przyjmować wartości od 0 do 1. Transmitancja określa się wyraŝeniem [10,13]: T I I =. 0 Absorbancja Charakteryzując światło pochłonięte wprowadza się wielkość absorbancji (A). W prosty sposób jest powiązana z transmitancją [10,13]: 1 A= log T. 14

15 Fluorescencja Fluorescencję moŝna opisać za pomocą poniŝszych wzorów: S + hν S 0 1 S1 S0+ hν, gdzie S 0,1 oznaczają odpowiednio stan podstawowy i pierwszy wzbudzony stan singletowy, hν energię pochłoniętą i wyemitowaną. Wzbudzone stany singletowe (S n ) są krótkoŝyciowe i po ok s przechodzą do najniŝszego wzbudzonego stanu singletowego (S 1 ) a stamtąd (ze stałą czasową ~ s) do stanu podstawowego. Takim przejściom moŝe towarzyszyć fluorescencja, czyli emisja kwantów o określonej energii, lub bez promieniowania wskutek wewnętrznej konwersji. Zjawisko fluorescencji jest waŝne z punktu widzenia diagnostyki fotodynamicznej. Emisja światła w obszarach zawierających wzbudzany fotouczulacz pozwala na dobre zlokalizowanie i określenie słabo widocznych gołym okiem obszarów zaatakowanych przez chorobę nowotworową. Rys Zwierciadlane odbicie emisji względem absorpcji oraz reguła Franka Condona [5,12-14]. Wiele fotouczulaczy wykazuje symetrie odbicia lustrzanego widma absorpcji względem fluorescencji (po lewej). Reguła Franka Condona (po prawej) mówi, Ŝe przejścia związane ze zmianą stanu elektronu cząsteczki są pionowe, tzn. pojawiają się bez zmian geometrycznych w atomie. Długość fali wyemitowanego światła jest dłuŝsza od długości fali zaabsorbowanej. Jest to tzw. przesunięcie stokesowskie. Ze względu na róŝnice w długościach fali łatwiej moŝna zauwaŝyć obszary fotouczulone, wykazujące fluorescencję [4,9,10,13,15]. 15

16 Wydajność kwantowa Wydajność kwantowa jest to prawdopodobieństwo wystąpienia danego procesu w stosunku do prawdopodobieństw wszystkich procesów zachodzących w danym procesie. W najprostszym przypadku jest to stosunek energii kwantów powstałych w wyniku fluorescencji do całkowitej energii podanej na układ. Przejście fotouczulacza ze stanu wzbudzonego niekoniecznie musi być związane z emisją kwantu światła w wyniku fluorescencji. Wydajność kwantowa przejścia promienistego zaleŝy od kilku procesów: o szybkości f fluor przejścia promienistego S 1 S 0 o konwersji wewnętrznej (internal conversion ic) S 1 S 0 o przejścia interkombinacyjnego (intersystem crossing isc) S 1 T 1 stała kinematyczna dla obu powyŝszych procesów równa jest f icisc Wydajność kwantowa fluorescencji (Q fluor ) wynosi: Q fluor = f f fluor fluor + f Czas Ŝycia (τ) stanu wzbudzonego moŝna określić przez: τ = f fluor 1 + f icisc icisc.. Wygaszanie fluorescencji W przypadku zderzeń atomów fotouczulacza z inną cząsteczką, zwaną wygaszaczem, naleŝy dodatkowo uwzględnić we wzorze na wydajność kwantową stałą szybkości gaszenia (f q ) oraz stęŝenie wygaszacza (q). Wzór na kwantową wydajność fluorescencji przyjmie wówczas następującą postać: Q fluor f fluor = f + f + f q fluor icisc q. 16

17 Proces gaszenia fluorescencji prowadzi do zmniejszenia wydajności kwantowej a jednocześnie skraca czas Ŝycia cząsteczki w stanie wzbudzonym. W obecności wygaszacza wzór na czas Ŝycia wyraŝa się przez: τ = 1 f + f + f q fluor icisc q. Gaszenie fluorescencji moŝe wynikać z dwóch procesów: o zderzeń cząsteczki fotouczulacza z cząstkami wygaszaczy (tzw. dynamiczne gaszenie) o gaszenia statycznego wynikającego z zachodzących reakcji pomiędzy fotouczulaczem i cząsteczkami wygaszacza prowadzących do utworzenia róŝnych kompleksów [5,13,16,17] Zjawisko wygaszania często występuje w roztworach w wyniku działania rozpuszczalnika na fluoryzującą cząsteczką Przejścia bezpromieniste Bezpromieniste przejścia pomiędzy wzbudzonym a podstawowym stanem singletowym powodują zamianę pochłoniętej energii na ciepło. Proces ten jest nieistotny zarówno dla PDD jak i PDT. Cząsteczka fototuczulacza moŝe równieŝ tracić swoją energię wskutek konwersji wewnętrznej wynikającej ze zderzeń z innym cząstkami. Działanie na cząsteczki promieniowaniem elektromagnetycznym z zakresu podczerwieni moŝe wpływać na ich ruch rotacyjny. Rys Przykłady zmian rotacji cząsteczek. Natomiast bezpromieniste przejścia ze wzbudzonego stanu singletowego do wzbudzonego stanu tripletowego (T 1 ) o niŝszej energii, mają istotne znaczenie dla terapii fotodynamicznej. Czas Ŝycia wzbudzonego stanu tripletowego jest znacznie dłuŝszy aniŝeli czas Ŝycia stanu singletowego i jest rzędu 10-6 s. Przejściom tym 17

18 towarzyszy zmiana spinu elektronów. Kolejnym etapem transferu energii moŝe być fosforescencja, lub istotniejszy dla PDT przekaz energii do sąsiadujących w pobliŝu cząsteczek. Energia ze stanu tripletowego jest przekazywana innym cząsteczkom co z kolei prowadzi do uszkodzenia otoczenia na skutek róŝnych procesów fizykochemicznych opisanych w dalszej części [10] Fosforescencja Fosforescencję schematycznie moŝna przedstawić za pomocą poniŝszego równania: S isc 0 + hν S1 T1 S0+ hν PHOS. Rys Przekaz energii fosforescencja. Rys Bezpromieniste przejście pomiędzy stanami singletowymi i trypletowymi (po lewej). Przesunięcie widma fosforescencji w kierunku większych długości fali względem absorpcji i fluorescencji (niŝsze energie). Cząsteczka przebywa w stanie trypletowym dłuŝej niŝ we wzbudzonym stanie singletowym łatwiej traci energię przechodząc bezpromieniście do stanu podstawowego na skutek zderzeń z innymi molekułami. Przejścia o róŝnej multipletowości (interkombinacyjne) czyli T 1 S 0 są formalnie zabronione, dlatego są mniej prawdopodobne, czyli charakteryzują się małą wydajnością kwantową (prawdopodobieństwem zajścia tego procesu). 18

19 Prawdopodobieństwo jest nieco wyŝsze, gdy róŝnice energetyczne pomiędzy tymi stanami są niewielkie lub gdy stany nakładają się. Proces ten znany jest jako fosforescencja jest to jeden z rodzajów luminescencji. Obsadzenie poziomu tripletowego bezpośrednio ze stanu podstawowego jest bardzo trudne, więc cząsteczka najczęściej zostaje wzbudzona do pierwszego stanu singletowego S 1 i z niego przechodzi do stanu tripletowego. Z tego faktu wynika przesunięcie widma fosforescencji w kierunku fal dłuŝszych względem widma absorpcji i widma fluorescencji tej samej cząsteczki. Ze względu na małą wydajność kwantową, widma fosforescencji są trudne do rejestracji i nie wykorzystuje się ich do diagnostyki fotodynamicznej [4,9,13,17] Wysokoreaktywne związki tlenowe W terapii fotodynamicznej najwaŝniejszy jest przekaz energii ze wzbudzonych stanów singletowych do stanu tripletowego. Fosforescencja w tym wypadku odgrywa marginalne znaczenie. Przejście interkombinacyjne, czyli przejście pomiędzy stanem singletowym (S 1 ) a stanem tripletowym (T 1 ), moŝe prowadzić do transferu energii z fotouczulacza do znajdujących się w otoczeniu cząstek. W zaleŝności od ich typu mówimy o I lub II typie fotoreakcji, prowadzących do utworzenia wysokoreaktywnych związków tlenowych. Rys Schemat reakcji odpowiedzialnych za procesy cytotoksyczne I oraz II typ fotoreakcji. 19

20 O typie reakcji decyduje głównie środowisko fotouczulacza, oraz stęŝenie tlenu. Istotne jest równieŝ stęŝenie fotosensybilizatora. Utlenianie tkanek biologicznych wynika głównie z procesów związanych z tlenem molekularnym i jest najistotniejsze w procesie PDT. Według badań, obszary, w których natlenienie jest mniejsze niŝ 50% źle odpowiadają na PDT. Fotoreakcja II typu występuje przy duŝym stęŝeniu tlenu, ale moŝe mu towarzyszyć w mniejszym stopniu fotoreakcja typu I. Ten z kolei przewaŝa w momencie, gdy tlenu brakuje, dlatego często podczas terapii fotodynamicznej stosuje się krótki czas naświetlania i powtarza się go co kilkanaście godzin. Cząsteczki tlenu w tym okresie zostaną uzupełnione. Po wymianie energii fotouczulacza z sąsiedztwem, powraca on do swego stanu początkowego, czyli jest względnie reaktywny. Proces ten jednak nie zachodzi w sposób idealny. Działanie światła przyczynia się do fotodegradacji fotouczulacza (photobleaching) [4,9,18]. II typ fotoreakcji W środowisku utlenionym cząsteczki fotouczulacza, znajdujące się w stanie tripletowym, najczęściej przekazują energię do sąsiadujących cząsteczek tlenu. Stanem podstawowym tlenu jest stan tripletowy, więc transfer energii nie jest zabroniony a multipletowość jest zachowana [15]. Proces oksydacji komórek związany jest głównie z niskimi, metastabilnymi wzbudzonymi stanami singletowymi. Molekuła tlenu w takim stanie charakteryzuje się długim czasem Ŝycia, co wpływa na tendencję do reagowania z innymi cząstkami i utleniania tkanek biologicznych. Tlen cząsteczkowy posiada nisko leŝące singletowe stany wzbudzone. Przejście ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego wymaga jedynie 22,5 kcal/mol (λ=1274 nm bliska podczerwień). Ze względu na małą energię potrzebną do wzbudzenia, reakcja ta w środowisku bogatym w tlen jest uprzywilejowana. W terapii fotodynamicznej największy wpływ niszczący (cytotoksyczny) na komórki ma tlen we wzbudzonym stanie singletowym 1 O 2. Wydajność cytotoksyczna fotoreakcji I typu jest ściśle powiązana ze stęŝeniem tlenu w obszarze naświetlanym. 20

21 Rys Schemat procesów zachodzących w II typie fotoreakcji. Cząsteczka fotouczulacza (FS fotosensybilizator) pochłania kwant energii ( hν ) i przechodzi do stanu wzbudzonego ( 3 FS * ). 1 3 * hν + FS FS W I typie fotoreakcji energia zostaje przekazana do tlenu singletowego, FS + O FS+ O 3 * który oddziałuje z substratem organicznym (SUB) i powoduje przejście fotouczulacza do formy podstawowej. O2 + SUB FS(0) 1 Wzbudzony tlen singletowy jest formą bardzo reaktywną. Jego obecność prowadzi do mechanizmów utleniających, co z kolei prowadzi do obumierania komórek. Cząsteczki fotouczulacza, które przekazały w ten sposób energię, przechodzą do stanu podstawowego, mogą ponownie pochłaniać energię i przekazywać ją dalej wg. wyŝej opisanego schematu. Oprócz tlenu singletowego (znajdującego się w podstawowym stanie tripletowym), w obrębie środowiska fotosensybilizatora mogą znajdować się inne cząsteczki, dla których stanem podstawowym jest równieŝ stan tripletowy. Do najczęściej występujących związków występujących w podstawowym stanie tripletowym (poza O 2 ) moŝna zaliczyć tlenek azotu oraz witaminę A [4,9]. I typ fotoreakcji Mechanizm ten ma miejsce, gdy środowisko fotouczulacza jest ubogie w tlen lub gdy jego stęŝenie gwałtownie spadło w wyniku fotoreakcji II typu. W reakcji następuje transfer elektronu lub wodoru z fotosensybilizatora do elementów tkanki. 21

22 Powstają rodniki nadtlenkowe ( O 2 oraz oksydacyjnych biomolekuł, a w następstwie ich obumarcie. HO ), przyczyniające się do mechanizmów 2 Rys Schemat procesów zachodzących w I typie fotoreakcji. Cząsteczka fotouczulacza (FS fotosensybilizator) pochłania kwant energii ( hν ) i przechodzi do stanu wzbudzonego ( 3 FS * ), co prowadzi do kolejnych procesów. 1 3 * hν + FS FS Wymiana elektronu z substratem ( czyli tkanką, oznaczoną jako SUB) produkuje utleniony substrat. FS + SUB FS + SUB 3 * + Zredukowana o elektron molekuła fotouczulacza (FS - ) reaguje z tlenem powodując powstanie anionu nadtlenkowego O 2 -. Ten z kolei moŝe wytworzyć rodniki hydroksylowe (OH*). FS + O FS+ O 2 2 Barwnik znajdujący się w stanie zbudzonym moŝe równieŝ reagować z rodnikami nadtlenowymi O 2 *, generując aniony nadtlenkowe, a z nich z kolei moŝe powstać rodnik hydroksylowy. FS + O FS + O 3 + * W procesie fotoreakcji I typu zostaje zniszczony substrat organiczny w wyniku fotoutleniania. Proces fotoreakcji II typu ma jednakŝe większe znaczenie dla terapii fotodynamicznej i planuje się ją tak, by obszar naświetlany był dobrze zaopatrzony w tlen co daje lepsze efekty leczenia [4,6,9,18]. 22

23 Tlen singletowy Tlen singletowy, czyli bez niesparowanych elektronów, nie jest formą podstawową, a wzbudzoną. Tlen singletowy jest bardzo reaktywny i silnie reaguje z otoczeniem. Forma singletowa oznaczana jest jako 1 O 2, O :: O lub O= O. Natomiast tripletowa przedstawiana jako 3 O 2, O O lub O O, gdzie kropka oznacza elektron, kreska - dwa elektrony tworzące wiązanie. Opisanie własności tlenu molekularnego wymaga zastosowania teorii kwantowej. Konfiguracja tlenu atomowego to: OY (1 s) (2 s) (2 p ) (2 p ) (2 p ), x y z z czego wynika następujące obsadzenie orbitali tlenu w stanie podstawowym: O2 Y (1 σ g ) (1 σ u ) (2 σ g ) (2 σ u ) (3 σ g ) (1 π u ) (1 π g ). Właściwości tlenu wynikają z obsadzenia sześciu elektronów na orbitalach π. Konfiguracja elektronowa stanu o najniŝszej energii to: O2 Y * ( π x ) ( π y ) ( π * x) ( π * y ). Stan ten określany jest jako 3 G Σ g. Zgodnie z regułą Hunda, niesparowane elektrony występują na dwóch antywiąŝących orbitalach i odpowiadają za właściwości paramagnetyczne. Degeneracja orbitali, jednakowe spiny oraz liczby kwantowe elektronów, powodują, Ŝe zgodnie z zasadą Pauliego muszą one zajmować osobne orbitale. Po oddziaływaniu wzbudzonego fotouczulacza z O 2, spin jednego elektronu ulega odwróceniu, jednocześnie zmienia się jego liczba spinowa, co prowadzi do generacji pary elektronowej na jednym orbitalu. Energia, która zostaje zaabsorbowana powoduje destabilizację tlenu 1 O 2. Tlen singletowy 1 O 2 występuje jako spolaryzowany dwubiegunowy jon. Krótki czas Ŝycia tlenu singletowego, powoduje, Ŝe uszkodzenia w procesie utleniania z 1 O 2 występują jedynie w obszarze o grubości błony komórkowej ok. 0,02 µm. MoŜna przyjąć, Ŝe jest to jedynie obszar, w którym znajduje się cząsteczka fotosensybilizatora. 23

24 Rys Schemat obsadzeń elektronów w stanie podstawowym (1) oraz wzbudzonym (2 i 3). W stanie podstawowym dwa sparowane elektrony znajdują się na π g a w stanie wzbudzonym oznaczane przez 1. Tlen ( 1 ) charakteryzuje się niŝszą energią. Do g wzbudzenia tlenu do tego stanu wymagana jest niewielka energia wynosząca 22,5 kcal/mol (0,98 ev). Stan o większej energii to 1 Σ. W tym stanie występują dwa + g + g sparowane elektrony na dwóch róŝnych orbitalach π g. Energia potrzebna do tego wzbudzenia wynosi 37,5 kcal/mol (1,63 ev). Stan o wyŝszej energii ( 1 Σ ) szybko przechodzi do stanu 1 [9,13,15-17]. + g + g Wydajność kwantowa tlenu singletowego Wydajność kwantowa singletowego tlenu (Q ) jest waŝną własnością kaŝdego fotouczulacza stosowanego w PDT. Wielkość ta zaleŝy od liczby molekuł 1 O 2 wytwarzanych przez kaŝdy foton zaabsorbowany przez cząstkę fotouczulacza [13,15]. Q Q f S =, gdzie: o Q isc wydajność kwantowa procesu przejścia interkombinacyjnego o f isc frakcja uwięzionych przez tlen singletowy stanów tripletowych o S prawdopodobieństwo transferu energii z tripletowego stanu tlenu molekularnego Wszystkie pomiary Q mówią o jakości fotoreakcji II typu [13,15]. isc isc 24

25 3. Fotouczulacze W diagnostyce i terapii fotodynamicznej najistotniejszą rolę odgrywają fotouczulacze aktywowane światłem o charakterystycznej długości fali. Pozwalają na rozpoznawanie i niszczenie zmian nowotworowych, czy innych obszarów chorobowych Porfiryny i ich pochodne Fotouczulacze uŝywane w diagnostyce i terapii fotodynamicznej to najczęściej porfiryny, chloryny i bakteriochloryny oraz ich pochodne. Związki te cechują się płaskimi cząstkami aromatycznymi i szkieletową budową, opartą na czterech symetrycznie ułoŝonych pierścieniach pirolowych, połączonych naprzemiennie pojedynczymi i podwójnymi wiązaniami pomiędzy atomami węgla [1,4,9,19]. Rys Chemiczne struktury (od lewej): porfiryny, chloryny, bakteriochloryny [9] Posiadają odpowiednio 22, 20 i 18 elektronów π, odpowiadających za sprzęŝanie pierścieni aromatycznych. Coraz szersze są badania nad wykorzystaniem ftalocyjaniny i teksapiryny. W teksapirynie występują trzy pierścienie pirolowe, natomiast pierścienie pirolowe we ftalocyjaninie są połączone mostkami azotowymi Porfiryny Nazwa porfiryn pochodzi z greki: πoρϕνρoσ, co oznacza szkarłatne, purpurowe. Charakteryzują się unikatowymi właściwościami optycznymi są silnie 25

26 zabarwione absorbują promieniowanie EM z zakresu widzialnego. Są waŝnym elementem organizmów Ŝywych [1,3,19]. Rys Trójwymiarowy schemat porfiryny. Cząsteczki porfiryn są płaskie, a ich budowa opiera się na pierścieniach atomowych zawierających cztery atomu azotu (N). Porfiryny są makrocyklicznymi związkami, które zawierają jedynie wiązanie o hybrydyzacji sp 2. Mogą tworzyć kompleksy z jonami metali, umiejscowionymi w środku struktury cząsteczki. Jony metali przejmują od atomów azotu pirolu pary elektronów [3,19]. W organizmie pirol powstaje z dwóch cząsteczek kwasu δ-aminolewulinowego (patrz. rozdz ). Rys Porfiryna: (od lewej) uproszczony wzór Fishera, asymetryczny typ III oraz struktura chemiczna pirolu elementarnej części związków z grupy porfirynoidów [19]. Wszystkie porfiryny zbudowane są z układu zwanego porfiną, która nie występuje w przyrodzie w stanie wolnym, z róŝnymi podstawnikami bocznymi. Wszystkie istotne w biologii porfiryny mają asymetrycznie rozmieszczone podstawniki boczne typu III. Takie porfiryny nazywa się protoporfirynami IX [19] Porfiryny występujące w przyrodzie Porfiryny występują w organizmach Ŝywych, moŝna je równieŝ otrzymywać sztucznie. Porfiryny mają zdolność do kompleksowego wiązania metali, co warunkuje ich charakterystyczne właściwości [1]. Znalazło to odniesienie w nazewnictwie i z tego 26

27 powodu mówi się o nich jako metaloporfirynach [20]. Do najpopularniejszych substancji wykazujących szkieletową budowę porfiryn moŝna zaliczyć witaminę B 12, chlorofil, urynoporfiryny, koproporfiryny i hem [3,19]. Rys Wzory strukturalne: uroporfiryny III, koproporfiryny III oraz hemu (protoprfiryny III) [wg. 3]. Przyłączenie Ŝelaza lub magnezu warunkuje przekształcenie porfiryny odpowiednio do hemu lub chloryny do chlorofilu [19]. Bakteriochlorofil posiada w swej strukturze posiada równieŝ magnez. W cząsteczce witaminy B 12 występuje jon kobaltu [1,20]. Chlorofil, który występuje we wszystkich roślinach zielonych zawiera w swej strukturze jon magnezu. Jego obecność pozwala na absorpcję promieniowania elektromagnetycznego z zakresu widzialnego a za razem reakcję fotosyntezy. Pochłonięcie fotonów jest ściśle powiązane z obecnością w podwójnych wiązaniach elektronów π [3]. Obecny rozwój technologiczny pozwala równieŝ na sztuczne otrzymywanie tych związków Porfiryny otrzymywane syntetycznie Porfiryny moŝna równieŝ syntetyzować w laboratoriach, uzyskując ich coraz to lepsze właściwości optymalne do PDT i PDD. Substancje takie najczęściej nie występują naturalnie w przyrodzie. Obecnie otrzymuje się wiele ich odmian opierając się na pochodnych najprostszych porfiryn [3]. W zaleŝności od rodzaju syntezy podstawniki boczne mogą być jednakowe lub róŝne. Podstawowy szkielet porfiryn syntetyzuje się w kilku etapach w reakcjach pomiędzy aldehydami, pirolami lub analogicznymi prekursorami w środowisku kwasowym i pod wpływem procesów oksydacji. Pierwszą zsyntetyzowaną porfiryną 27

28 była tetrafenyloporfiryna (TPP). Otrzymał ją w 1936 roku przez Rothmund. Od tamtego czasu otrzymuje się coraz to nowsze i o lepsze substancje fotoczułe. HpD Praktycznie wszystkie fotouczulacze stosowane do tej pory bazują na budowie porfiryn, chlorin, bakteriochloryn i ftalocyjanin. Pierwszym klinicznie zastosowanym fotouczulaczem w terapii fotodynamicznej była pochodna hematoporfiryny (HpD) opisana przez zespół Lipson a w 1961 roku. WciąŜ stosuje się rozpuszczaną w wodzie pochodną hematoporfiryny (HpD). Jej oczyszczona forma została skomercjalizowana i sprzedawana jest pod nazwą Photofrin II [3]. Badania nad właściwościami HpD określiły cechy, które idealny fotouczulacz powinien spełniać. Udowodniono, Ŝe większa masa odpowiada za lepszą lokalizację w komórkach nowotworowych, ale jednocześnie wiąŝe się to ze spadkiem wydajności kwantowej tlenu singletowego [8,21]. Photofrin II Photofrin II fotouczulacz wytwarzany przez firmę QLT jako pierwszy [9,8] uzyskał atest FDA i jest szeroko stosowany na świecie w terapii jak i diagnostyce fotodynamicznej na świecie. Photofrin II jest pochodną HpD Skutecznie stosuje się go przy wielu typach nowotworów, jednakŝe nie przy wszystkich z takim samym efektem. Charakteryzuje się długofalowym pasmem absorpcji przy czerwonym świetle o długości fali λ max ~ 630 nm. Stosowane promieniowanie w tym obszarze pozwala na fotouczulenie do głębokości ok. 5 mm. Ogranicza to zastosowanie tylko do leczenia nowotworów osadzonych blisko powierzchni. Liczne badania przeprowadzane na tym związku wykazały, Ŝe nie wywołuje on zmian mutagennych i nie jest toksyczny. MoŜna go stosować wielokrotnie, gdyŝ nie ulega odporności wielolekowej. Optymalne warunki do leczenia następują po 48 godzinach wtedy następuje największa kumulacja w nowotworze. Photofrin II pozostaje w skórze pacjenta przez 4 do 8 tygodni, co powoduje jego nadwraŝliwość na światło w tym okresie [4,17,22]. 28

29 Rys Wzór strukturalny Photofrin II [wg. 8] Kwas aminolewulinowy 5-ALA Kwas aminolewulinowy (oznaczany jako ALA, lub 5-ALA) ma szczególne znaczenie w syntezie porfiryn. Jego właściwości do endogennej syntezy protoporfiryny wykorzystano na początku lat 90-tych [23]. Jest prekursorem w powstawaniu hemu występującego u wszystkich ssaków. Podanie kwasu delta aminolewulinowego prowadzi do selektywnej akumulacji protoporfiryny IX (Pp IX). Jest ona równieŝ niezbędna w procesie powstawania hemu. Schemat przedstawiono na rys Kwas ALA powoduje nadmierne powstawanie Pp IX. Fakt ten jest wykorzystywany w diagnostyce i terapii fotodynamicznej. Właściwości fotouczulające ALA wykorzystywane są równieŝ w walce z chwastami i owadami. Zasada działania we wszystkich tych przykładach jest analogiczna powstające porfiryny są czułe na światło. Naświetlanie odpowiednim światłem, dopasowanym do pasm absorpcji, pozwala na detekcję (przy uŝyciu niebieskiego światła) lub niszczenie obszarów o zwiększonym stęŝeniu Pp IX (czerwony obszar widma) (rys.3.7.) [21,24,25]. Rys Schemat przedstawiający proces powstawania hemu. Po lewej widoczna jest cząsteczka ALA. Podanie kwasu aminolewulinowego powoduje akumulacje Pp IX, co prowadzi do nadwraŝliwości na światło [wg. 25]. 29

30 Komórki nowotworowe zachowują się nieco odmiennie aniŝeli zdrowe. Charakteryzują się inną aktywności enzymów związanych z syntezą Pp IX i hemu. W komórkach nowotworowych obniŝona jest aktywność ferrochelatazy. Związane jest to z większą kumulacją ALA i powstawaniem większej ilości Pp IX [25]. Zastosowanie ALA w onkologii jest dość duŝe poświadcza to fakt, iŝ dostępny jest gotowy lek oparty na tym kwasie Levulan [26]. Jest to naturalnie występujący kwas w organizmie, przez co nie powoduje dodatkowych szkód. Diagnostyka fotodynamiczna, która jest stosowana z wykorzystaniem ALA jest powszechna w neurochirurgii czy urologii. Chirurgiczne usuwanie obszarów przy białym świetle często prowadzi do usunięcia jedynie wyraźnie widocznego ogniska nowotworu, gdzie występują miejsca martwicze. Zastosowanie światła niebieskiego pozwala na uwidocznienie obszarów, gdzie pozornie nie występuje nowotwór. Usunięcie takich miejsc pozwala na zatrzymanie rozwoju nowotworu i pozwala na uniknięcie nawrotów choroby. Kwas aminolewulinowy idealnie nadaje się do takich celów, aczkolwiek charakteryzuje się szybkim wybielaniem fluorescencji [25,26]. Ten niepoŝądany efekt moŝna zniwelować poprzez stosowanie zamiennie światła niebieskiego (oznaczenie zmian) oraz światła białego pozbawionego niebieskiej części widma (usunięcie zmian). Wybielanie fluorescencji i jej wpływ na fototerapię jednakŝe nie jest w pełni zrozumiany [26]. Przydatne okazuje się równieŝ filtrowanie obserwowanej fluorescencji. Wycina się obszar światła, którym wzbudzana jest protoporfiryna IX a obserwuje się jedynie obszar świecący w innych długościach fali [25]. Zastosowanie fotouczulacza pozwala na obserwacje jam ciała, w których występują problemy z diagnozowaniem nowotworów. Fototerapia z wykorzystaniem ALA znajduje zastosowanie w walce z nowotworami płuc, mózgu, Ŝołądka i pęcherza moczowego [23] Pasma absorpcyjne porfiryn Porfiryny, chloryny oraz bakteriochloryny mają odpowiednio 22, 20 i 18 elektronów π, odpowiadających za sprzęŝanie pierścieni aromatycznych. ZłoŜony układ wiązań sprzęŝonych powoduje, Ŝe związki te dobrze absorbują światło z zakresu widzialnego. 30

31 Związki z grupy porfirynoidów cechują się dwoma silnymi pasmami absorpcji: o pasmem Soreta o pasmem Q Pasmo Soreta Wszystkie związki z grupy porfiryn, niezaleŝnie od posiadanych podstawników bocznych wykazują silną absorpcję w obszarze ~ nm, zwanym pasmem Soreta [20,25]. Obszar ten jest uŝywany jedynie dla celów diagnostycznych (PDD), co wynika z charakteru tego światła. Promieniowanie o długości fali λ ~ 400 nm bardzo słabo penetruje tkanki. Czasami zakres UV-Vis stosuje się do leczenia płaskich zmian w śluzówce. Rys Schemat przedstawiający widmo absorpcyjne Protoporfiryny IX [wg. 25]. Większość roztworów porfiryn i ich pochodnych po naświetleniu światłem nadfioletowym wykazują fluorescencje, o zwiększonej względem oświetlanej długości fali (przesunięcie Stokesa). Wyświecają w czerwonym obszarze światła widzialnego. Silna fluorescencja pojawia się nawet w przypadku śladowych ilości tych cząsteczek. Zjawisko to wykorzystuje się np. w wykrywaniu porfirii obserwuje się świecenie uroporfiryn i koproporfiryn metabolitantów pośrednich syntezy hemu [3,9,19,20,25] Pasmo Q W terapii fotodynamicznej wykorzystuje się obszar wykazujący głębsze wnikanie w tkanki. Jest to obszar λ nm, zwany pasmem Q. Pasma 31

32 absorpcyjne barwników stosowanych w PDT rozszczepione są na 3 4 składowe, słabiej absorbujące niŝ pasmo Soreta. Najsilniejsze pasmo absorpcji dla porfiryn przypada na λ ~ 630 nm, chloryn λ ~ 650 nm a bakteriochloryny λ ~ 710 nm. Pochodne porfiryny znajdują zastosowanie w PDT, gdyŝ cechują się maksimum absorpcji w obszarze światła o barwie czerwonej, są cząsteczkami występującymi w przyrodzie. Niektóre są produkowane w organizmie człowieka. Wszystkie są małotoksyczne dla ludzi. Posiadają duŝą wydajność kwantową produkcji tlenu singletowego (Q ) [3,9,19-21,25] Cechy fotouczulaczy Wczesne badania nad HpD doprowadziły do ogólnych wniosków dotyczących właściwości fotouczulaczy i wytycznych, do których naleŝy się stosować podczas ich produkcji. Obecnie znanych i stosowanych jest wiele substancji fotouczulających. Zanim zostaną dopuszczone do uŝytku, muszą spełniać warunki, które są sprawdzane w testach klinicznych: o selektywność kumulacji w tkankach chorych o aktywność od 70 do 150 godzin po podaniu pacjentowi o stosunkowo szybka usuwalność z organizmu (po ok. 150 godzinach) o absorpcja w obszarze widma EM dobrze penetrującym tkanki (kilka kilkanaście mm), a jednocześnie nienakładającym się na pasma absorpcji naturalnie występujących w organizmie barwników czułych na światło (tj. hemoglobina, melanina czy nawet woda) o duŝa wydajność kwantowa produkcji tlenu singletowego głównego czynnika cytotoksycznego o brak toksyczności dla organizmu pacjenta Spełnienie wszystkich powyŝszych warunków jest niezwykle trudne. Związane jest to z róŝną budową patologicznych tkanek i róŝnym ich oddziaływaniu z cząstkami fotosensybilizatora. Najczęściej prowadzone badania, związane z fotouczulaczami, wykonuje się przy uŝyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Analizuje się jednoskładnikowe, 32

33 luminescencyjne fotouczulacze. Okazuje się, Ŝe cząsteczki fotouczulacza są przyłączane do jąder komórkowych, mitochondriów, lizosomów oraz membran plazmatycznych w komórkach nowotworowych, co daje moŝliwości stosowania w onkologii [3,4,7-9,10,21] Zastosowanie Wykazano, Ŝe terapia fotodynamiczna niszczy komórki rakowe, co wynika z selektywnej kumulacji stosowanego fotouczulacza. Podczas takiej terapii powstają równieŝ liczne skrzepy w naczyniach krwionośnych, co powoduje odcięcie dopływu tlenu i substancji odŝywczych do komórek nowotworowych [9]. Zastosowanie światłowodów i przyrządów endoskopowych pozwala na rozszerzenie PDT i PDD do badania i leczenia jam ciała. Obecnie występują coraz bardziej wyspecjalizowane i specjalnie przystosowane do tych celów sondy medyczne. Pozwalają na wykorzystanie fotosensybilizatorów przykładowo w: urologii, proktologii, czy teŝ otolaryngologii [27]. Tab. 1. Najczęściej stosowane fotouczulacze oraz zastosowanie (n= nowotwór) [5,8]. Egzogenne Prekursory fotouczulacze Fotouczulacz Główny składnik Zastosowanie o n. płuc Photofrin HpD o n. pęcherza o n. przełyku Visudyne BPDMA o zmiany naczyniowe Foscan m-thpc o n. jamy ustnej Levulan 5-ALA o zmiany skórne o n. pęcherza Metvix m-ala o choroba Bowena Dawki W zaleŝności od obszarów leczonych i charakteru fotouczulacza wybiera się odpowiedni sposób podawania. Dostarcza się go w formie pastylek, maści czy 33

34 roztworów dostarczanych doŝylnie, czy śródtkankowo. NajwaŜniejsze w całym procesie jest dobranie stęŝenia barwnika oraz odczekania pewnej ilości czasu, aby nastąpiła jego selektywna kumulacja [8,9]. W zaleŝności od rodzaju fotouczulacza czas akumulacji w tkance wynosi od 30 min (BPD-MA) do 96 godzin (m-thpc) [4]. Przykładowo Photofrin II podaje się w dawce 2 mg/kg ciała pacjenta, podczas gdy inny barwnik (meta-tetrahydroksyfenylochloryna Foscan ) wymaga duŝo mniejszego stęŝenia (0,1mg/kg) by uzyskać identyczny efekt terapeutyczny. Jak juŝ wcześniej wspomniano, penetracja ciała wynika z podawanych energii (długości fali). Teksapiryna lutetu ( Lutex ) stosowana do leczenia czerniaków, wykazuje największa absorpcję na długości fali λ ~ 730 nm co pozwala na wnikanie głębiej w tkanki [28]. W leczeniu onkologicznym podawane są duŝe dawki, małe w stanach zapalnych. Skuteczność działania zaleŝy od wydajności kwantowej tlenu. Do niszczenia tkanek wykorzystuje się światło o mocy J/cm 2 przy mw/cm 2 i duŝym stęŝeniu fotouczulacza. Stany zapalne leczy się oświetlając 10 J/cm 2 przy 40 mw/cm 2 i małym stęŝeniu fotouczulacza. Kwas aminolewulinowy (ALA) podaje się zazwyczaj na dwa sposoby: 60mg/kg doustnie lub 30mg/kg doŝylnie. Od czasu podania fotosensybilizatora do momentu badania/leczenia zazwyczaj oczekuje się mniej niŝ 6 godzin. Leczenie glejaków przy podaniu tego fotouczulacza i częstego naświetlania pozwala na usunięcie zmian nowotworowych do 1,4 cm w głąb tkanki [23,25]. Rys Etapy terapii fotodynamicznej [5]. 34