AKTYWNOŚĆ DEHYDROGENAZY ALDEHYDOWEJ KLASY TRZECIEJ ALDH3A1 W STANIE FIZJOLOGICZNYM ORAZ NOWOTWORACH I TORBIELACH JAMY USTNEJ

Transkrypt

1 AKTYWNOŚĆ DEHYDROGENAZY ALDEHYDOWEJ KLASY TRZECIEJ ALDH3A1 W STANIE FIZJOLOGICZNYM ORAZ NOWOTWORACH I TORBIELACH JAMY USTNEJ Joanna Giebułtowicz Zakład Bioanalizy i Analizy Leków, Wydział Farmaceutyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny 1 WPROWADZENIE Aldehydy ze względu na swoją wysoką reaktywność są związkami potencjalnie szkodliwymi, a niektóre z nich mają udowodnioną cytotoksyczność, genotoksyczność, mutagenność lub kancerogenność. Występują one dosyć powszechnie w środowisku, najczęściej w niewielkich stężeniach. Stanowią dodatki smakowozapachowe, zanieczyszczenia bądź naturalne składniki żywności, a także powstają w procesach jej przetwarzania (np. aldehyd anyżowy, cytral, wanilina, nonanal, aldehyd cynamonowy, formaldehyd, aldehyd dimalonowy). Są także składnikami kosmetyków, środków myjących, leków, mebli, dywanów, tkanin, farb, spalin (np. formaldehyd, acetaldehyd) oraz emitowane są do środowiska przez przemysł, pożary lasów czy łąk [3]. Aldehydy powstają także w organizmie człowieka w wyniku przemian chemicznych endogennych i egzogennych prekursorów, np.: aminokwasów, węglowodanów, lipidów, amin (w tym biogennych), witamin [5]. Około 200 różnych aldehydów powstaje w procesie peroksydacji lipidów. Peroksydacja lipidów jest to proces prowadzący do powstania nadtlenków lipidów, które mogą ulegać redukcji do odpowiednich alkoholi przy udziale peroksydazy glutationowej. Zwiększona ilość wolnych rodników lub zmniejszona aktywność peroksydazy glutationowej powoduje uwalnianie z błony komórkowej różnych związków m.in. aldehydu dimalonowego i 4-hydroksy-2-nonenalu. Te metastabilne aldehydy oddziałują z białkami, DNA i fosfolipidami, wykazując działanie cytotoksyczne i kancerogenne. Najważniejszymi enzymami metabolizującymi te związki są S-transferaza glutationowa i dehydrogenaza aldehydowa [1, 4, 6]. ALDH3A1 (Aldehyde dehydrogenase, dimeric NADP-preferring; ALDHIII; aldehyde dehydrogenase 3; aldehyde dehydrogenase family 3 member A1, EC ) wraz z ALDH3A2, ALDH3B1 i ALDH3B2 należy do klasy trzeciej dehydrogenaz aldehydowych. Jest to homodimeryczne białko o masie podjednostki około 50 kda. Konstytutywną ekspresję ALDH3A1 opisano w rogówce, przełyku, żołądku, płucach i śliniankach. Enzym ten występuje zwykle w cytozolu komórki, choć wykryto go także w jądrze komórkowym [2, 6-8]. ALDH3A1 jest jedynym izoenzymem dehydrogenazy aldehydowej wykrytym w ślinie i wykazuje specyficzność substratową względem aldehydów aromatycznych i średniołańcuchowych alifatycznych. Enzym ten ze względu na swoje właściwości katalityczne może pełnić pewną rolę w bezpieczeństwie żywienia, neutralizowaniu skutków peroksydacji lipidów oraz prewencji chemicznej kancerogenezy. 2 CEL PRACY Pierwszym celem pracy był pomiar aktywności ALDH3A1 w ślinie osób zdrowych w celu opisania: 1) wpływu różnych czynników środowiskowych na aktywność enzymu; 2) związku pomiędzy aktywnością ALDH3A1 a aktywnością/stężeniem najważniejszych antyoksydantów w ślinie. 19

2 Drugim celem pracy było porównanie aktywności ślinowej ALDH w grupie osób zdrowych i pacjentów z patologiami jamy ustnej, takimi jak: rak płaskonabłonkowy, nowotwory łagodne, torbiel zębopochodna. Wynik porównania miał odpowiedzieć na pytanie: czy badane stany patologiczne jamy ustnej wpływają na aktywność ALDH w ślinie oraz czy aktywność ALDH może wpływać na ryzyko wystąpienia raka jamy ustnej. 3 MATERIAŁY I METODY 3.1 Metody analizy statystycznej Porównanie dwóch zmiennych w grupach niepowiązanych wykonywano testem t-studenta, jeżeli nie było postaw do odrzucenia hipotezy o normalności i jednorodności wariancji obu rozkładów. Jeżeli nie odrzucono hipotezy o normalności, a odrzucono hipotezę o jednorodności wariancji, używano testu Cochrana-Coxa. W przypadku braku normalności rozkładu stosowano test Manna-Whitneya. Jeżeli analizowane zmienne były nominalne, stosowano test Chi 2 (χ 2 ). Porównanie zmiennych w przypadku więcej niż dwóch grup niepowiązanych wykonywano metodą analizy wariancji ANOVA, jeżeli nie było podstaw do odrzucenia hipotezy o normalności i jednorodności wariancji rozkładów. W przeciwnym razie stosowano test Kruskala- Wallisa. W przypadku analizy zmiennych nominalnych stosowano test Chi 2. Hipotezę o normalności i jednorodności wariancji rozkładów testowano odpowiednio z użyciem testu Shapiro-Wilka i testu Levene a. Poziom istotności we wszystkich testach przyjęto 0,05. Krytyczny poziom istotności (p) podawano z dokładnością do pięciu cyfr po przecinku. Jeżeli jego wartość była mniejsza niż 0,00001, pisano p<0, Wartość p-value zwykle podawano dla hipotezy obustronnej. Jeżeli podawano ją dla hipotezy jednostronnej po wartość p-value umieszczano odpowiednią adnotację. W celu oceny powiązania pomiędzy zmiennymi stosowano rangowy test korelacji Spearmana (wraz z wizualną oceną rozrzutu zmiennych rangowanych), analizę regresji wielorakiej lub analizę kanoniczną (dla zmiennych wielowymiarowych). W celu oceny wpływu różnych czynników na zmienne nominalne stosowano także analizę korespondencji oraz dyskryminacji. Analizy te w powiązaniu z analizą skupień stosowano też do określania czynników mogących mieć wpływ na wartość dwuwymiarowej zmiennej losowej. Krzywą ROC stosowano do oceny przydatności diagnostycznej proponowanego klasyfikatora. Jako estymatory wartości oczekiwanej w statystyce opisowej podawano średnią arytmetyczną lub medianę, która jest lepszym estymatorem wartości oczekiwanej w przypadku znacznych odchyleń od rozkładu normalnego. Jako miarę zmienności stosowano odchylenie standardowe (SD) (na wykresach błąd standardowy) oraz rozstęp kwartylowy (IQR). Miary zmienności często podawano w nawiasach za wartościami oczekiwanymi. Użycie każdej statystyki poprzedzono sprawdzeniem założeń. Analizy przeprowadzano z użyciem pakietu STATISTICA. 3.2 Metody pomiaru aktywności enzymów Całkowitą aktywność dehydrogenazy aldehydowej (aktywność w środowisku DTT) oraz procent inaktywacji enzymu wyznaczano metodą fluorymetryczną z użyciem aldehydu 6-metoksynaftaleno-2-karboksylowego jako substratu. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) wyznaczano przy użyciu zmodyfikowanej metody spektrofotometrycznej Beauchamp, a aktywność peroksydazy ślinowej (SPO) oznaczano zmodyfikowaną metodą fluorymetryczną zaproponowaną przez Proctor [3]. Stężenie kwasu moczowego (UA) oznaczano z użyciem komercyjnego zestawu firmy Human, Uric Acid liquicolor Plus. 3.3 Materiały Materiał do charakterystyki aktywności ALDH3A1 u osób zdrowych stanowiła ślina mieszana 118 osób. Dodatkowo od osób tych zbierano dane obejmujące: wiek, płeć, zażywane leki, choroby metaboliczne i inne, liczba wypijanych filiżanek kawy, jednostek alkoholu i liczba wypalonych papierosów w tygodniu poprzedzającym badanie. Analizując wpływ leków hipotensyjnych, nieopioidowych leków przeciwbólowych i leków hormonalnych (hormony płciowe) na aktywność ALDH w ślinie, grupy kontrolne 20 Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska 2012

3 konstruowano tak, aby składały się z osób nieprzyjmujących żadnych leków. Grupy te ponadto były zbliżone wiekowo oraz pod względem statusu palenia, picia alkoholu i kawy do grupy badanej. W celu zbadania związku pomiędzy aktywnością ALDH3A1 a aktywnością/stężeniem najważniejszych antyoksydantów w ślinie użyto materiału pobranego od 30 ochotników. W celu opisania aktywności ALDH3A1 w grupie pacjentów z nowotworami i torbielami jamy ustnej zbadano ślinę 173 osób w tym: 59 osób z rakami płaskonabłonkowymi jamy ustnej, 74 osób z torbielami zębopochodnymi, 11 osób z zębopochodnym guzem keratocystycznym, 23 osoby z innymi nowotworami łagodnymi jamy ustnej (szkliwiaki, zębiaki, guzy z komórek ziarnistych, nadziąślaki, śluzaki zębopochodne). Ślinę pobierano dwukrotnie: przed zabiegiem i 3-8 dni po zabiegu, w zależności od szybkości gojenia się ran pooperacyjnych. Grupę kontrolną stanowiło 116 osób zdrowych (kontrola aktywności ALDH3A1 przed zabiegiem) oraz 36 osób ze złamaniami w obrębie jamy ustnej i 27 osób z wadami gnatycznymi, wymagających zabiegu w obrębie jamy ustnej (kontrola aktywności ALDH3A1 po zabiegu). 4 WYNIKI CZĘŚĆ I: BADANIE AKTYWNOŚCI ALDH3A1 W ŚLINIE OSÓB ZDROWYCH 4.1 Wyodrębnianie czynników mających potencjalny wpływ na aktywność ALDH3A1 Metody eksploracyjnej analizy danych wydają się być bardzo przydatne, szczególnie w badaniach biologicznych, gdzie spotykamy się z dużą zmiennością międzyosobniczą i dużą liczbą czynników na nią wpływających. Metody te pozwalają między innymi opisać strukturę próby badanej i jej podgrup, wykryć czynniki, które wpływają na zmienność analizowanych danych w próbie oraz wskazać kierunek dalszych badań. Charakterystyka aktywności ALDH3A1 w ślinie pozwoliła wyodrębnić z badanej próby podgrupy różniące się profilem całkowitej aktywności [U/g] i inaktywacji [%] ALDH. Umożliwiła także wyodrębnienie czynników, które mogą wpływać na to zróżnicowanie. Osoby wchodzące w skład badanej próby grupowano pod względem aktywności ALDH3A1 (aktywność całkowita [U/g], inaktywacja [%]), wykorzystując metodę Warda. Wyniki przedstawiono na rys. 1. Odległość wiąz Odległ. euklidesowa C_104 C_108 C_68 C_112 C_90 C_113 C_57 C_31 C_33 C_91 C_111 C_29 C_109 C_106 C_53 C_92 C_74 C_94 C_44 C_95 C_107 C_63 C_38 C_25 C_102 C_24 C_56 C_30 C_21 C_15 C_72 C_64 C_85 C_5 C_110 C_70 C_103 C_47 C_101 C_79 C_45 C_61 C_42 C_84 C_37 C_77 C_32 C_89 C_93 C_88 C_66 C_41 C_13 C_69 C_76 C_117 C_59 C_52 C_27 C_116 C_20 C_87 C_80 C_39 C_9 C_75 C_118 C_43 C_36 C_105 C_26 C_28 C_99 C_23 C_60 C_10 C_73 C_8 C_51 C_48 C_50 C_119 C_7 C_86 C_65 C_115 C_49 C_17 C_14 C_96 C_83 C_58 C_3 C_78 C_97 C_82 C_71 C_40 C_2 C_81 C_67 C_35 C_62 C_34 C_19 C_16 C_55 C_6 C_11 C_22 Rys. 1. Dendrogram dla aktywności ALDH3A1 (całkowita aktywność [U/g] i inaktywacja [%]) w próbie badanej. W toku analizy z badanej grupy wyodrębniono cztery podgrupy: G_1 (n=34), G_2 (n=21), G_3 (n=43), G_4 (n=20). Standaryzowane aktywności w poszczególnych podgrupach przedstawiono na rys Skupienie standaryzowana aktywność całkowita ALDH3A1 [U/g] standaryzowana inaktywacja ALDH3A1 [%] Rys. 2. Średnie i błędy standardowe standaryzowanych aktywności całkowitych ALDH3A1 [U/g] i inaktywacji [%] w czterech skupieniach, powstałych metodą k-średnich. Statystycznie istotna różnica pod względem liczby wypalanych papierosów była pomiędzy podgrupą G_3 a G_4 (p=0,0038). W podgrupie G_1 było największe średnie spożycie alkoholu, najmniejsze średnie spożycie kawy i największy procent osób biorących leki przeciwbólowe. W podgrupie G_3 najmniejszy był procentowy udział osób pijących alkohol, a największy pijących kawę i palących papierosy. Średnia liczba wypalonych papierosów była w tej podgrupie C_18 C_100 C_4 C_114 C_54 C_46 C_12 Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska

4 największa (p=0,02568 dla G_1; p=0,00762 dla G_2; p=0,00025 dla G_4). Najmniej papierosów w tygodniu poprzedzającym badanie wypaliły osoby z podgrupy G_4. W podgrupie tej był największy udział osób przyjmujących hormony płciowe. Zależność pomiędzy przynależnością do podgrup a paleniem papierosów, piciem alkoholu i kawy przedstawiono na rys. 3. Redukcja przestrzeni wielowymiarowej do trójwymiarowej pozwoliła na wyjaśnienie 56% całkowitej bezwładności. Zależność pomiędzy przynależnością do podgrup, a rodzajem zażywanych leków przedstawiono natomiast na rys. 4, który wyjaśnia 43% bezwładności. W ykre s 2W w s p ółrzęd n yc h ko lu m n ; w ym ia r 1 x 2 W ykre s 2W w s p ółrzęd n yc h ko lu m n ; w ym ia r 1 x 2 1,5 2,0 W ymiar 2; W. własna:,32576 (14,48% bezwładn. ) - a lkohol:nie p apieros y:n ie kawa:n ie kawa:d u żo p apieros y:d u żo a lkohol:dużo kawa:m a ł o a lkohol:m a ło p apieros y:m a ło W ymiar 2; W. własna: (16.42% bezwładn. ) 1,5 - le ki:i n ne le ki:h o rm o n a ln e le ki:h i pote n s yj ne le ki:b rak le ki:p rze c iw b ólowe - 1,5 2,0 W ym ia r 1 ; W. wła s n a :, (1 9,04% be zw ła d n. ) -2,0-2,5-2,0-1,5 2,0 W ym ia r 1 ; W. wła s n a : (1 8.69% be zw ła d n. ) W ykre s 2W w s p ółrzęd n yc h ko lu m n ; w ym ia r 1 x 3 W ykre s 2W w s p ółrzęd n yc h ko lu m n ; w ym ia r 2 x 3 1,5 W ymiar 3; W. własna:,27684 (12,30% bezwładn. ) - p apieros y:n ie a lkohol:nie kawa:n ie a lkohol:m a ło kawa:d u żo kawa:m a ł o p apieros y:d u żo a lkohol:dużo p apieros y:m a ło W ymiar 3; W. własna: (15.06% bezwładn. ) - -2,0 le ki:h o rm o n a ln e le ki:p rze c iw b ólowe le ki:b rak le ki:i n ne le ki:h i pote n s yjne - 1,5 2,0 W ym ia r 1 ; W. wła s n a :, (1 9,04% be zw ła d n. ) -2,5-2,0-1,5 2,0 W ym ia r 2 ; W. wła s n a : (1 6.42% be zw ła d n. ) W ykre s 2W w s p ółrzęd n yc h ko lu m n ; w ym ia r 2 x 3 W ykre s 2W w s p ółrzęd n yc h ko lu m n ; w ym ia r 1 x 3 1,5 W ymiar 3; W. własna:,27684 (12,30% bezwładn. ) - p apieros y:m a ło a lkohol:m a ło kawa:m a ł o kawa:n ie p apieros y:d u żo p apieros y:n ie a lkohol:nie a lkohol:dużo kawa:d u żo W ymiar 3; W. własna: (15.06% bezwładn. ) - -2,0 le ki:i n ne le ki:h o rm o n a ln e le ki:b rak le ki:p rze c iw b ólowe le ki:h i pote n s yj ne - 1,5 W ym ia r 2 ; W. wła s n a :, (1 4,48% be zw ła d n. ) -2,5-2,5-2,0-1,5 2,0 W ym ia r 1 ; W. wła s n a : (1 8.69% be zw ła d n. ) Rys. 3. Połączone wykresy dwuwymiarowe powstałe z rozbicia wykresu 3W współrzędnych kolumn (podgrupa (skupienie), status palenia papierosów, picia alkoholu i kawy) uzyskanego metodą analizy korespondencji. Zmienne określające jedną kategorię (np. alkohol) połączono linią tak, aby kody grupujące były uszeregowane (np. nie, mało, dużo). Wykres 4. Połączone wykresy dwuwymiarowe powstałe z rozbicia wykresu 3W współrzędnych kolumn (podgrupa (skupienie), przyjmowane leki) uzyskanego metodą analizy korespondencji. Analizując wzajemne położenie punktów na wykresie korespondencji, można m.in. zauważyć, że istnieje tendencja do współwystępowania kategorii: palący duże ilości papierosów i pod Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska 2012

5 grupa 3 (G_3) oraz kategorii: zażywający leki hormonalne i podgrupa 4 (G_4). Kategorie: niezażywający leków, zażywający leki przeciwbólowe wykazują natomiast tendencję do współwystępowania z kategorią: podgrupa 1 (G_1). Analizę dyskryminacyjną prowadzono metodą najlepszego podzbioru w powiązaniu z wielowymiarową statystyką lambda Wilksa (p=0,00025, λ=0,76). Tylko pierwsza funkcja dyskryminacyjna była statystycznie istotna (p=0,00098, λ=0,62). Na postać pierwszej funkcji najsilniej wpływała liczba wypalonych papierosów (-0,79), zażywanie leków przeciwbólowych (-0,87), leków hipotensyjnych (-0,99) oraz współzażywanie leków hormonalnych i hipotensyjnych (-0,64). Słabiej wpływał wiek (0,32), ilość wypitej kawy (0,17) oraz współzażywanie leków regulujących czynność tarczycy i leków hormonalnych (-0,25). Poprawna klasyfikacja do podgrupy G_1 wynosiła 52%, a do G_2, G_3 i G_4 odpowiednio 47, 43 i 77%. Średnie zmiennych kanonicznych wynosiły odpowiednio: -0,39, -0,16, -0,91 i 0,64 dla skupień 1, 2, 3 i Wpływ wybranych czynników na aktywność ALDH3A Wiek Analiza statystyczna wykazała umiarkowaną, istotną statystycznie ujemną korelację pomiędzy wiekiem a całkowitą aktywnością ALDH3A1 w ślinie (r s =-0,19, p=0,04121). Eliminacja z analizy osób pijących alkohol i palących papierosy spowodowała zwiększenie siły i istotności korelacji pomiędzy analizowanymi zmiennymi (N=34; r s =-0,43, p=0,01352). Nie stwierdzono istotnych statystycznie korelacji pomiędzy wiekiem a procentem inaktywacji ALDH3A1 (p=0,17009, NS) w grupie badanej Palenie papierosów W analizowanej grupie wykazano istnienie dodatniej korelacji pomiędzy deklarowaną liczbą wypalonych papierosów w tygodniu poprzedzającym badanie śliny a całkowitą aktywnością ALDH3A1 (r s =0,30, p=0,00110). Nie zaobserwowano korelacji pomiędzy liczbą wypalonych papierosów a procentem inaktywacji ALDH3A1 w ślinie (p=0,21233, NS) Spożywanie alkoholu Analiza korelacji Spearmana wskazała, że w badanej grupie istnieje dodatnia korelacja pomiędzy spożyciem alkoholu w tygodniu poprzedzającym badanie a całkowitą aktywnością ALDH3A1 w ślinie (r s =0,27, p=0,00398) Picie kawy W badanej próbie nie zaobserwowano statystycznie istotnych korelacji pomiędzy ilością wypitej kawy w tygodniu poprzedzającym badanie a całkowitą aktywnością lub procentem inaktywacji ALDH3A1 w ślinie. Eliminacja z analizy osób palących papierosy i pijących alkohol spowodowała pojawienie się silnie dodatniej korelacji pomiędzy spożyciem kawy i procentem inaktywacji ALDH3A1 (N= 34, r s =0,58, p=0,00029). W szerszej grupie zawierającej także osoby pijące umiarkowane ilości alkoholu (mniej niż 40 g alkoholu w ostatnim tygodniu) i osoby palące mniej niż 1 paczkę papierosów w tygodniu (N=48) korelacja pomiędzy ilością wypitej kawy, a procentem inaktywacji ALDH3A1 w ślinie była słabsza (r s =0,40, p=0,00055). Dołączenie do grupy osób, które w tygodniu przed badaniem wypiły do 400g alkoholu spowodowało jeszcze większe osłabienie korelacji (N=99, r s =0,21, p=0,03128). W celu porównania wpływu poszczególnych czynników środowiskowych na aktywność ALDH w ślinie obliczano współczynniki korelacji cząstkowej Spearmana (tabela 1). Współczynnik ten jest miarą zależności między jedną ze zmiennych a pozostałymi traktowanymi z osobna (przy wyeliminowaniu wpływu wszystkich pozostałych zmiennych objaśniających). Tabela 1. Współczynniki korelacji cząstkowych Spearmana (r s ) dla wybranych czynników środowiskowych. *oznaczono wyniki statystycznie istotne. Czynnik Całkowita środowiskowy akywność [U/g] Inaktywacja [%] Papierosy 0,25(p=0,00813)* -0,16 (p=,09718) Alkohol 0,21(p=0,02683)* -0,03 (p=0,73148) Kawa -0,04(p=0,68627) 0,19(p=0,04311)* W celu opisania ilościowego wpływu zmiennych niezależnych na zmienną objaśnianą przeprowadzono także krokową regresję wieloraką. Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska

6 W związku z tym, że w analizie regresji wielorakiej otrzymano bardzo niskie współczynniki determinacji liniowej (około 20%) oraz duże błędy standardowe estymacji, otrzymane równania nie mogą być używane w celu predykcji. Porównywane mogą być natomiast standaryzowane współczynniki regresji cząstkowej (BETA), które można interpretować w podobny sposób jak współczynniki korelacji cząstkowej. Na aktywność całkowitą największy wpływ miał wiek (BETA=-0,26(0,09), p=0,00498), liczba wypalonych papierosów (BETA=0,25(0,09), p=0,00521) oraz ilość wypitego alkoholu (BETA =0,19(0,09), p=0,04165) w tygodniu poprzedzającym pobranie śliny. Na procent inaktywacji natomiast najsilniej wpływał status palenia papierosów (BETA=-0,26(0,10), p=0,00834), picia kawy (BETA=0,22(0,10), p=0,02261) i wiek (BETA=0,19(0,09), p=0,04285). Na rys. 5 i 6 przedstawiono zależności pomiędzy całkowitą aktywnością ALDH w ślinie i zmiennymi niezależnymi, które okazały się statystycznie istotne w krokowej regresji wielorakiej: wiekiem, liczbą wypalonych papierosów i wypitego alkoholu w tygodniu poprzedzającym badanie. W celu zbadania zakresu i kierunku zależności pomiędzy grupami zmiennych (aktywność całkowita, procent inaktywacji oraz liczba wypalonych papierosów, ilość wypitego alkoholu, ilość wypitej kawy, wiek) posłużono się analizą kanoniczną. Tylko pierwsza zmienna kanoniczna okazała się statystycznie istotna (p=0,00021). Wyniki analizy kanonicznej przedstawiono w tabeli 2, a wykres rozrzutu dla pierwszej korelacji kanonicznej na rys. 7. Rys. 5. Zależność całkowitej aktywności ALDH3A1 w ślinie od wieku i ilości wypitego alkoholu w tygodniu poprzedzającym badanie. Tabela 2. Wyniki analizy kanonicznej. Zmienne jednego zbioru Zmienne kanoniczne U1 U2 Wiek -0,65-0,51 Ilość wypitego alkoholu [jednostki/tydz] 0,36-0,34 Ilość wypitej kawy [jednostki/tydz] -0,02-0,63 Liczba wypalonych papierosów [paczki/tydz] 0,58-0,11 Korelacje kanoniczne 0,48 0,20 (p=0,00021) (p=0,25159) Redundancja całkowita 8,20% Redundancje drugiego zbioru Zmienne drugiego zbioru Procent inaktywacji ALDH3A1 Całkowita aktywność ALDH3A1 6,9% 1,3% Zmienne kanoniczne V 1 V 2-0,11-1,02 0,97-0,32 Rys. 6. Zależność całkowitej aktywności ALDH3A1 w ślinie od ilości wypitego alkoholu i liczby wypalonych papierosów w tygodniu poprzedzającym badanie. Wartość redundancji całkowitej jest mała, co sugeruje, że należałoby w modelu uwzględnić dodatkowe zmienne. Analiza wykazała, że badane czynniki silniej niż na inaktywację wpływają na aktywność całkowitą enzymu. Najwyraźniej zaznaczał się wpływ wieku i palenia. Na procent inaktywacji najsilniej wpływała ilość wypitej kawy w tygodniu poprzedzającym badanie Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska 2012

7 V U 1 Rys. 7. Wykres rozrzutu pierwszej korelacji kanonicznej. SPO, SOD i stężenie UA) posłużono się analizą kanoniczną. Tylko pierwsza zmienna kanoniczna okazała się statystycznie istotna (p=0,00112). Wyniki analizy kanonicznej przedstawiono w tabeli 3, a wykres rozrzutu dla pierwszej korelacji kanonicznej na rys. 8. Analiza wykazała, że aktywność/stężenie antyoksydantów w ślinie wywiera silniejszy wpływ na aktywność całkowitą ALDH niż procent inaktywacji enzymu. Aktywnosć całkowita ALDH najsilniej zależała od aktywności SOD Wpływ zażywania leków Przeprowadzone analizy wykazały, że całkowita aktywność ALDH3A1 w ślinie osób leczonych na nadciśnienie tętnicze (n=14) była wyższa niż w grupie osób zdrowych (n=12) (p=0,01616). Średnia aktywność wynosiła odpowiednio 4,5(5,0) U/g vs 1,3(1,4) U/g. Procent inaktywacji enzymu był natomiast niższy w grupie leczonych na nadciśnienie tętnicze (p=0,06981) i wynosił 55(53)% vs 79 (25)%. Całkowita aktywność ALDH3A1 w ślinie była niższa u kobiet przyjmujących hormonalne środki antykoncepcyjne (n=14) niż w grupie kontrolnej (n=36; p=0,03547) i wynosiła odpowiednio 1,7(1,3) U/g vs 2,7(3,9) U/g. Procent inaktywacji był natomiast niższy w grupie kontrolnej (p=0,04213) i wynosił 67(44)% vs 78(14)%. W grupie osób przyjmujących nieopioidowe leki przeciwbólowe (n=21) całkowita aktywność ALDH3A1 była wyższa niż w grupie kontrolnej (n=61; p=0,00125) i wynosiła 4,7(3,5) U/g vs 2,2(3,6) U/g. Nie wykazano natomiast statystycznie istotnych różnic procentu inaktywacji między tymi grupami (p=0,28735) Wpływ antyoksydantów w ślinie Aktywność całkowita ALDH3A1 [U/g] korelowała ze stężeniem kwasu moczowego [mmol/g] (r s =0,27, p=0,04327) oraz aktywnością dyzmutazy ponadtlenkowej (r s =0,57, p=0,00001) w ślinie. Korelacja z dyzmutazą była silniejsza w grupie osób niepalących (r s =0,74, p<0,00001). Procent inaktywacji enzymu skorelowany był natomiast z aktywnością peroksydazy ślinowej (r s =-0,28, p=0,03171). W celu zbadania zakresu i kierunku zależności pomiędzy grupami zmiennych (aktywność całkowita, procent inaktywacji oraz aktywność Tabela 3. Wyniki analizy kanonicznej. Zmienne jednego zbioru Zmienne kanoniczne U1 U2 SPO aktywność [U/g] -0,15 0,95 UA stężenie [mmol/g] -0,09-0,31 SOD stężenie [U/mg] -0,95-0,16 Korelacje kanoniczne 0,64 0,31 (p=0,00112) (p=0,16671) Redundancja całkowita 19% Redundancje drugiego zbioru 15,1% 3,9% Zmienne drugiego zbioru Zmienne kanoniczne V 1 V 2 Procent inaktywacji ALDH3A1-0,38-0,94 Całkowita aktywność ALDH3A1-0,99 0,21 P ra wy 0, , , , , , , L e wy Rys. 8. Wykres rozrzutu pierwszej korelacji kanonicznej. CZĘŚĆ II: BADANIE AKTYWNOŚCI ALDH3A1 W ŚLINIE OSÓB Z PATOLOGIAMI JAMY USTNEJ 4.3 Porównanie aktywności ALDH w ślinie osób zdrowych i osób z patologiami jamy ustnej Aktywność całkowita ALDH3A1 [U/g] wyższa niż w grupie kontrolnej była u pacjentów z rozpoznaniem: torbiel zębopochodna (p=0,00789), keratocysta (p=0,04832), a niższa u pacjentów Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska

8 z rakiem płaskonabłonkowym jamy ustnej (p=0,00019). Procent inaktywacji enzymu w porównaniu do grupy kontrolnej był wyższy u pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym (p=0,0263), a niższy u pacjentów z torbielą zębopochodną (p=0,00099). Analizując całkowite aktywności ALDH3A1 w ślinie po zabiegu stwierdzono, że aktywność u pacjentów z rakami płaskonabłonkowymi nadal była niższa niż w grupie osób zdrowych (p<0,00001), w grupie osób z torbielami, zębopochodnym guzem keratocystycznym i nowotworami łagodnymi natomiast nie różniła się ona istotnie w porównaniu do kontroli. 4.4 Aktywność ALDH w ślinie pacjentów z rakiem jamy ustnej versus inne patologie Aktywność ALDH3A1 [U/g] u pacjentów z rakami płaskonabłonkowymi jamy ustnej była niższa niż u pacjentów z zębopochodnym guzem keratocystycznym (p=0,00697), torbielą zębopochodną (p<0,00001), nowotworami łagodnymi (p=0,03343). Procent inaktywacji natomiast różnił się istotnie tylko w porównaniu z pacjentami z torbielą zębopochodną (p=0,01040). Celem pierwszej analizy było m.in. wskazanie predyktorów pozwalających odróżnić grupę osób z rakiem i innymi guzami jamy ustnej (nowotwory, torbiele). Analiza dyskryminacyjna pozwoliła poprawnie sklasyfikować 92% przypadków do grupy z rakiem jamy ustnej i 89% przypadków do grupy z innymi guzami jamy ustnej. Wartość statystyki Lambda Wilksa wynosiła 0,327. Test χ 2 wykazał statystyczną istotność pierwszego pierwiastka kanonicznego (p<0,00001). Metoda analizy krokowej wprowadziła do modelu trzy zmienne niezależne. Ich średnie w grupie pacjentów z rakami i innymi guzami przedstawiono w tabeli 4. Tabela 4. Średnie predykatorów w klasie guz i rak jamy ustnej. Predyktor RAK GUZ Wiek [lata] Stężenie neutrofili [G/l] 8,6 3,6 Całkowita aktywność ALDH3A1 [U/g] 0,9 4,3 gdzie: w wiek, n stężenie neutrofili, A aktywność całkowita ALDH3A1. Średnia zmiennej D dla pacjentów z rozpoznaniem rak wynosiła 1,68, a inne guzy wynosiła -1,15. Na postać funkcji dyskryminacyjnej najmocniej wpływał wiek (-0,80), następnie aktywność całkowita ALDH3A1 [U/g] (0,53) i stężenie neutrofili we krwi (-0,51). Klasyfikację niezdiagnozowanych przypadków do grupy (rak, inny guz) umożliwia funkcja klasyfikacyjna, której współczynniki przedstawiono w tabeli 5. Analizowany przypadek klasyfikowany jest do tej grupy, dla której wartość funkcji klasyfikacyjnej jest największa. Tabela 5. Współczynniki funkcji klasyfikacyjnej. Predyktor RAK GUZ Wiek [lata] 0,37 0,19 Stężenie neutrofili [g/l] 0,85 0,40 Całkowita aktywność ALDH3A1 [U/g] -0,16 0,21 Stała -15,53-5,34 Celem drugiej analizy było określenie przydatności aktywności ALDH3A1 w ślinie jako samodzielnego wskaźnika diagnostycznego umożliwiającego przyporządkowanie osoby badanej do dwóch klas: 1) chory na raka jamy ustnej; 2) chory z inną patologią jamy ustnej lub zdrowy. Wartość AUC dla badanego modelu wynosiła 0,823 (SE=0,036). Optymalnym punktem odcięcia wybrano aktywność 0,708 U/g. Punkt ten cechował się czułością 0,57 i specyficznością 0,90. Analiza wykazała, że całkowita aktywność ALDH3A1 może być predyktorem raka jamy ustnej, jednak wnioskowanie na podstawie tylko tego wskaźnika jest niepolecane ze względu na niską czułość testu. Należy zatem: 1) poszukać większej liczby predyktorów (np. zastosować te, które wyodrębniono w toku analizy dyskryminacji: wiek, stężenie neutrofili) w celu stworzenia dokładniejszych reguł decyzyjnych; 2) przeprowadzić analizy na większej grupie badanej w celu potwierdzenia zaobserwowanych zależności. Postać funkcji dyskryminacyjnej wyglądała następująco: D = 0,06 w + 0,16 n 0,13 A 3, Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska 2012

9 Czulosc 1,0 0,8 0, ,4 0,2 0,0 Wykres ROC 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1-Specyficznosc Rys. 9. Krzywa ROC opisująca przydatność całkowitej aktywności ślinowej ALDH jako predyktora raka jamy ustnej. 5 PODSUMOWANIE UZYSKANYCH WYNIKÓW 1 Aktywność ślinowej ALDH zależy od wieku, statusu palenia papierosów, picia alkoholu i kawy oraz zażywanych leków. 2 Większą inaktywację ALDH3A1 w ślinie opisano u osób pijących kawę. 3 Procent inaktywacji ALDH3A1 korelował z aktywnością najważniejszego enzymu antyoksydacyjnego w ślinie SPO [U/g]. Wskazuje to, że zależy on w dużej mierze od stężenia antyoksydantów w ślinie, a w mniejszym stopniu od czynników zewnętrznych. Palenie papierosów przykładowo obniżało inaktywację ALDH3A1 prawdopodobnie na skutek indukcji enzymów antyoksydacyjnych i stężenia UA w ślinie. 4 Wzmożoną całkowitą aktywność ślinowej ALDH zaobserwowano u osób palących papierosy, pijących alkohol, przyjmujących leki przeciwbólowe oraz u chorych z leczonym nadciśnieniem. Wyższą aktywność enzymu zaobserwowano także w grupie osób z torbielą zębopochodną i zębopochodnym guzem keratocystycznym. Wycięcie zmiany powodowało spadek aktywności enzymu w ślinie. Wynik ten sugeruje pewną rolę ALDH3A1 w ochronie organizmu przed skutkami stresu oksydacyjnego. 5 Korelacje całkowitej aktywności ALDH3A1 z aktywnością/steżeniem antyoksydantów w ślinie wskazują na rolę enzymu w procesie ochrony organizmu przed skutkami stresu oksydacyjnego. 6 Wraz z wiekiem malała aktywność całkowita ALDH3A1 w ślinie. Obniżała się zatem także ochrona jamy ustnej przed aldehydami różnego pochodzenia. 7 Spadek aktywności całkowitej ALDH3A1, a zatem obniżoną ochronę jamy ustnej przed aldehydami opisano także u kobiet przyjmujących hormonalne leki antykoncepcyjne. 8 Pacjenci z rakiem płaskonabłonkowym jamy ustnej charakteryzowali się niższą aktywnością ALDH3A1 w ślinie. Niska aktywność ślinowej ALDH może być czynnikiem rozwoju raka, szczególnie u osób starszych gdy aktywność enzymu jest już obniżona, a także u osób palących papierosy, pijących alkohol lub źle odżywiających się. 6 NAJWAŻNIEJSZE WNIOSKI Jak wynika ze specyficzności substratowej ALDH3A1, enzym ten chroni organizm przed skutkami stresu oksydacyjnego, m.in. neutralizując wysoce reaktywny 4-HNE. Dlatego w czasie stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego indukowana jest ekspresja tego enzymu. Niska aktywność ALDH3A1 w ślinie może być czynnikiem zwiększonego ryzyka rozwoju raka jamy ustnej. BIBLIOGRAFIA 1) Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology and Medicine. 11, 1, ) Estey T., Piatigorsky J., Lassen N., Vasiliou V ALDH3A1: a corneal crystallin with diverse functions. Experimental Eye Research. 84, 1, ) Feron V.J., Til H.P., de Vrijer F., Woutersen R.A., Cassee F.R., van Bladeren P.J Aldehydes: occurrence, carcinogenic potential, mechanism of action and risk assessment. Mutation Research/Genetic Toxicology. 259, 3 4, ) Lassen N., Bateman J.B., Estey T., Kuszak J.R., Nees D.W., Piatigorsky J., Duester G., Day B.J., Huang J., Hines L.M., Vasiliou V Multiple and Additive Functions of ALDH3A1 and ALDH1A1. Journal of Biological Chemistry. 282, 35, Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska

10 5) O Brien P.J., Siraki A.G., Shangari N Aldehyde sources, metabolism, molecular toxicity mechanisms, and possible effects on human health. Crit Rev Toxicol. 35, 7, 63. 6) Pappa A., Estey T., Manzer R., Brown D., Vasiliou V Human aldehyde dehydrogenase 3A1 (ALDH3A1): biochemical characterization and immunohistochemical localization in the cornea. Biochemical Journal. 376, 3, ) Pappa A., Brown D., Koutalos Y., DeGregori J., White C., V. V Human aldehyde dehydrogenase 3A1 inhibits proliferation and promotes survival of human corneal epithelial cells. J Biol Chem 280, 8. 8) Stagos D., Chen Y., Cantore M., Jester J.V., Vasiliou V Corneal aldehyde dehydrogenases: Multiple functions and novel nuclear localization. Brain Research Bulletin. 81, 2 3, Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska 2012