Nowe Trendy w Naukach Przyrodniczych Embriogeneza somatyczna in vitro. Dariusz Kulus

Transkrypt

1

2 6. Embriogeneza somatyczna in vitro Dariusz Kulus 6.1. Embriogeneza u roślin naczyniowych Embriogeneza odgrywa kluczową rolę w ontogenezie roślin. W trakcie jej trwania z pojedynczej komórki zygoty w wyniku kolejnych podziałów tworzy się kulisty prazarodek, a z niego dojrzały zarodek, który następnie akumuluje substancje zapasowe, niezbędne w czasie desykacji, kiełkowania oraz wczesnego rozwoju siewki [Park, Harada 2008]. W trakcie ewolucji wiele roślin rozwinęło różne mechanizmy aseksualnej embriogenezy (bez zapłodnienia i fuzji gamet), które stanowią zabezpieczenie przed warunkami (zarówno środowiskowymi jak i genetycznymi) niesprzyjającymi zapłodnieniu [Von Arnold 2008]. Pochodzenie takich aseksualnych zarodków jest bardzo zróżnicowane. Mogą powstać np. w wyniku apomiksji (procesie, w którym uruchomienie programu embriogenezy następuje przedwcześnie, co prowadzi do rozwoju diploidalnego zarodka z niezapłodnionej komórki jajowej, z pominięciem procesu mejozy) lub diploidalnej komórki ośrodka [Grabowska i in. 2001]. Istnieje również możliwość otrzymania androgenicznych zarodków z mikrospor i ziaren pyłku [Maraschin i in cyt. za Quiroz-Figueroa 2006]. Tworzenie się zarodków niezygotycznych nie jest zjawiskiem rzadkim i występuje o wielu gatunków roślin [Sankara-Rao 1996]. W warunkach naturalnych niezygotyczne (somatyczne) zarodki rozwijają się z zalążków (np. rodzaj Paeonia L., Ranunculus L.) lub rzadziej z liści (Asplenium L., Kalanchoe Adans.) [Von Arnold 2008]. Mogą rozwinąć się z nich zdrowe, kompletne rośliny z w pełni wykształconym jednym lub dwoma liścieniami (odpowiednio dla roślin jedno- lub dwuliściennych), epikotylem i korzonkiem zarodkowym [Bach 2004]. W kulturach roślin nagonasiennych, formują się zarodki o liczbie liścieni charakterystycznej dla gatunku [Zoglauer i in. 2003] Embriogeneza somatyczna Embriogeneza somatyczna polega na regeneracji zarodków z komórek somatycznych i jest formą rozmnażania wegetatywnego [Lema-Rumińska, Kulus 2012]. Występowanie tego procesu w przyrodzie zostało po raz pierwszy opisane przez Starsburgera w 1978 roku jako embriogeneza przybyszowa [Kępczyński, Kępczyńska 2001]. W ciągu ostatnich 40 lat zjawisko to opisano u wielu gatunków [Von Arnold 2008]. W trakcie embriogenezy somatycznej dochodzi do odróżnicowania komórek lub tkanek mitotycznie nieaktywnych do stanu merystematycznego [Lynch 1999]. Wymienione przemiany wymagają jednak istotnej transpozycji programu rozwojowego komórek w celu nabycia kompetencji oraz potencjału embriogenicznego (w trakcie rozwoju rośliny, geny związane z embriogenezą są nieaktywne w niezygotycznych komórkach [Rose i in. 2010]). W roślinie rozwijającej się in vivo, najczęściej tylko zygota jest kompetentna do tego, żeby w wyniku podziałów utworzyć zarodek. W warunkach kultur in vitro potencjał ten wyzwalany jest w pozostałych komórkach. Wiadomo jednak, że występują różnice w kompetencji do embriogenezy zygoty i komórek somatycznych oraz mikrospor [Grabowska i in. 2001] Drogi rozwoju zarodków somatycznych Somatyczne zarodki mogą powstawać pośrednio przez kalus (np. Eupchorbia pulcherrima Willd. Ex Klotzsch [Jasrai i in. 2003]) lub bezpośrednio z tkanek eksplantatu (np. Phalaenopsis Blume [Kuo i in. 2005]), którego wybór zależy od dostępności oraz 45

3 celu doświadczenia i jest ściśle skorelowany z wydajnością mikrorozmnażania [Rubluo 1997]. Ponieważ w określonych warunkach każda żywa komórka może stać się embriogeniczną [Bach 2004] eksplantatami mogą być fragmenty płatków kwiatów, blaszki liściowej, ogonka liściowego, szypułki kwiatowej, osi kwiatostanowej i korzeni, a także liścienie i inne fragmenty siewek, np. hipokotylu [Jerzy, Krzymińska 2005]. Pośrednia embriogeneza somatyczna W embriogenezie pośredniej najpierw z eksplantatu rozwijają się zaindukowane embriogennie zdeterminowane komórki (IDECs). Komórki te nie były embriogenie i potencjału tego nabrały w trakcie prowadzenia kultury. Podczas fazy indukcji ulegają one wielokrotnym podziałom i w konsekwencji powstaje kalus [Kępczyński, Kępczyńska 2001]. Wykazano, że auksyna 2,4-D (kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy) stymuluje podziały kambium oraz epidermy i subepidermy. W wyniku podziałów komórkowych tkanki twórczej, powstaje nieembriogeniczny kalus. Natomiast embriogeniczny, tworzy się w konsekwencji podziałów epidermy i subepidermy. Na ogół można go łatwo rozpoznać na podstawie struktury i barwy. Typ embriogeniczny zbudowany jest ze zwartych tzw. proembriogenicznych mas komórek (PEMs) [Von Arnold 2008]. W zależności od ich morfologii i stopnia rozwoju wyróżnia się wśród nich trzy stadia: PEM I, PEM II i PEM III [Latkowska 2002]. W odpowiednich warunkach zarodki mogą różnicować się z PEM III na powierzchni lub w kulturze zawiesinowej otrzymanej z tego właśnie kalusa [Slater i in. 2008]. Wiadomo, że rośliny przejawiające naturalną poliembrionię, częściej tworzą embriogeniczny kalus [Rubluo 1997]. Bezpośrednia embriogeneza somatyczna W trakcie embriogenezy bezpośredniej zarodki tworzą się z proembriogenicznie zdeterminowanych komórek (PEDCs) [Kępczyński, Kępczyńska 2001]. Pomimo, że somatyczne zarodki tworzą się na drodze bezpośredniej rzadko, to jednak istnieją tkanki, z których regenerują one częściej niż formy pośrednie. Są to na ogół tkanki młode lub związane z generatywnym rozmnażaniem np. zarodki, siewki, ośrodek zalążka, szyjka słupka lub ziarna pyłku [Slater i in. 2008]. Istnieje specjalny podtyp bezpośredniej embriogenezy somatycznej zwany wtórną embriogenezą. Ma ona miejsce wówczas, gdy z powstałego zarodka somatycznego nie rozwija się roślina, lecz kolejne (drugo- i trzeciorzędowe) zarodki. Regenerują one bezpośrednio z epidermy (lub komórek subepidermalnych) liścieni lub hypokotyli [Von Arnold 2008]. Wtórne zarodki mają szczególne znaczenie w przypadku roślin cechujących się długim cyklem rozwojowym i niską wydajnością embriogenezy somatycznej [Li i in. 2002]. To, którą ścieżką potoczy się embriogeneza zależy zarówno od czynników genetycznych, jak również epigenetycznych [Lynch 1999]. Sugeruje się, że w przypadku embriogenezy bezpośredniej wystarczy zapewnić kulturze jedynie odpowiednie warunki, aby aktywować potencjał embriogenny (komórki kompetentne są już obecne). W przypadku embriogenezy pośredniej konieczne są poważniejsze zmiany w ich programie genetycznym. Komórki muszą nabyć kompetencji do embriogenezy najczęściej przez odróżnicowanie tkanek eksplantatu i wytworzenie kalusa [Williams, Maheswaran 1986 cyt. za Quiroz-Figueroa, 2006]. Dodatkową zaletą embriogenezy bezpośredniej jest mniejsze ryzyko wystąpienia zmienności somaklonalnej, zwłaszcza jeśli zarodki tworzą się z pojedynczej komórki [Karp 1988 cyt. za Fras i in. 2008]. Spowodowane jest to faktem, że tworzą się one wówczas szybciej [Gatica i in. 2008]. 46

4 6.4. Przebieg embriogenezy somatycznej in vitro W zależności od sposobu regeneracji zarodków, stosuje się różnorodne pożywki oraz wyróżnia różną liczbę faz ich otrzymywania. We wszystkich przypadkach najważniejszy jest pierwszy etap, czyli indukcja embriogenezy [Kępczyński, Kępczyńska 2001]. Inicjacja embriogenezy somatycznej Zarodki somatyczne otrzymuje się na ogół dwufazowo. W pierwszym etapie, zwanym też inicjalnym (lub fazą determinacji), wykorzystuje się duże stężenie auksyn (na ogół 2,4-D), często również cytokinin. Odróżnicowane tkanki nabierają kompetencji do embriogenezy [Kępczyńska 2006]. Mogą wówczas powstać dwa rodzaje komórek: duże, silnie zwakuolizowane nieembriogeniczne oraz małe embriogenne, o gęstej cytoplazmie, dużym centralnie położonym jądrze, małych wakuolach (o bardziej zasadowym ph), licznych mitochondriach i diktiosomach [Halperin, Jenkins 1967 cyt. za Quiroz-Figueroa 2006], a także dużych ilościach skrobi zmagazynowanych w amyloplastach. Charakterystyczną cechą związaną z indukowaniem procesu somatycznej embriogenezy jest izolowanie się komórek grubą ścianą, otaczanie warstwą kalozy lub kutykuli, zanik połączeń plazmodesmowych oraz intensywne podziały [Fiuk, Rybczyński 2006]. Dojrzewanie zarodków somatycznych W drugiej fazie (różnicowania) następuje ujawnienie embriogenicznej kompetencji. Embriogeniczne struktury powstałe z eksplantatu inicjalnego zaczynają proliferować, dając początek liniom komórkowym, z których regenerują zarodki [Latkowska 2002]. Odbywa się to na pożywce pozbawionej auksyn lub zawierających bardzo niewielką ich ilość (za to często wzbogaconej odpowiednimi cytokininami i aminokwasami), w sposób analogiczny do embriogenezy zygotycznej. Egzogenne auksyny są niezbędne tylko do inicjacji, zazwyczaj działają jednak jak inhibitory na powstałe w pierwszym etapie embriogeniczne komórki [Sankara-Rao 1996]. Spowodowane jest to tym, że komórki te nie są w stanie metabolizować ich w takim samym stopniu jak ich naturalne analogii. Spadek zawartości auksyn w pożywce pod koniec pasażu umożliwia różnicowanie się z PEM III zarodków somatycznych. Drugi etap można podzielić na dwie podfazy: prematurację (podziały zostają zahamowane, następuje formowanie zarodków i ich wczesny rozwój) oraz właściwe dojrzewanie, w czasie którego dochodzi do morfologicznych i biochemicznych przemian: gromadzenia substancji zapasowych oraz nabywania tolerancji na desykację [Von Arnold 2008]. Dojrzewanie może zachodzić w ciemności lub na świetle. Często wspomagane jest dodatkiem ABA i/lub obniżeniem potencjału osmotycznego pożywki, co jednocześnie ogranicza możliwość wystąpienia deformacji [Latkowska 2002]. Somatyczne zarodki mogą rozwijać się z pojedynczej komórki (np. Picea abies (L.) Karst. i P. glauca (Moench) Voss [Nagmani i in. 1987]) lub z niewielkiej ich grupy (np. u Agave victoriaereginae T. Moore [Martinez-Palacios i in. 2003]) (ryc. 1). 47

5 Ryc. 1. Schemat powstawania somatycznych zarodków [wg Williams, Maheswaran 1986 cyt. za Quiroz-Figueroa i in. 2006] Jeżeli zarodek tworzy się z pojedynczej komórki, to można zauważyć, że proliferuje ona w sposób skoordynowany, a on sam często połączony jest z tkanką macierzystą przez strukturę przypominającą wieszadełko. Natomiast zarodki o pochodzeniu wielokomórkowym, początkowo zauważalne są w postaci wypukłości. Ich podział jest nieskoordynowany i są bezpośrednio połączone u podstawy z tkanką macierzystą [Williams, Maheswaran 1986 cyt. za Quiroz-Figueroa i in. 2006]. Ponadto w sytuacji tej istnieje większe ryzyko wystąpienia zmienności somaklonalnej [Martinez- Palacios i in. 2003] Struktura zarodków somatycznych Wielokrotne podziały komórki prowadzą do otrzymania uorganizowanej struktury tzw. stadium globularnego. dalszy rozwój prowadzi do rozwoju stadium sercowatego, a następnie torpedy [Slater i in. 2008]. W stadium tym dostrzegalne są już zawiązki liścieni w okolicach merystemu apikalnego [Al-Ramamneh i in. 2006]. Zarodki somatyczne kształtem bardzo przypominają swoje zygotyczne analogi i przechodzą podobne fazy rozwojowe (ryc. 2). Różnią się jednak pochodzeniem, gdyż powstają bez fuzji gamet. Od pędów przybyszowych różnią się strukturą dwubiegunową i wyraźnie wyodrębnioną osią apikalno-bazalną [Jerzy, Krzymińska 2005]. Polaryzacja następuje dość wcześnie w trakcie rozwoju zarodka. Objawy dyferencjacji tkanek są widoczne już w stadium globularnym, a merystem apikalny pojawia się w stadium sercowatym [Slater i in. 2008]. Ciało zarodka budują trzy rodzaje tkanek: zewnętrzna protoderma, środkowa mezoderma oraz wewnętrzne prokambium [Park, Harada 2008]. Badania histologiczne dowiodły, że w przeciwieństwie do pędów przybyszowych nie ma połączeń waskularnych pomiędzy somatycznymi zarodkami, a eksplantatem [Fras i in. 2008]. 48

6 Ryc. 2. Stadia rozwojowe zarodka Brassica oleracea L. var gemmifera [wg Willmar, Hellendorn 1968 cyt. za Zenkteler 1984]: A kuliste; B wczesno sercowate; C sercowate; D późno sercowate; E wczesnej torpedy; F torpedy; G późnej torpedy; H laski; I dojrzałe I; K dojrzałe II 6.6. Genetyczna regulacja embriogenezy somatycznej Podczas embriogenezy somatycznej ekspresji ulega wiele genów (ryc. 3). Identyfikacja czynników genetycznych jest jednak trudna i trwa już blisko 30 lat [Gruszczyńska, Rakoczy-Trojanowska 2007]. Źródłem wielu informacji na temat mechanizmów regulujących rozwój zarodków oraz genów związanych z procesem embriogenezy są badania prowadzone na mutantach zarodkowych [Grabowska i in. 2001]. Na przestrzeni lat powstało kilka teorii na temat dziedziczenia tej cechy. Większość zakłada, że proces somatycznej embriogenezy jest kontrolowany przez niewielką liczbę genów i jest cechą dominującą. Najważniejszymi genami zaangażowanymi zarówno w somatyczną jak i zygotyczną embriogenezę są: SERK, LEC oraz BBM. Większość z nich koduje odpowiednie czynniki transkrypcyjne [Grabowska i in. 2001], [Gruszczyńska, Rakoczy-Trojanowska 2007]. Najlepiej scharakteryzowanym markerem molekularnym kompetencji komórek do przekształcenia się z PEMs w zarodki somatyczne jest produkt genu SERK (somatic embryogenesis receptor kinase). Białko SERK jest kinazą receptorową mogącą brać udział w przekazywaniu sygnałów i uruchamianiu całej kaskady procesów prowadzących do zapoczątkowania embriogenezy. Gen ten ulega ekspresji już w komórkach proembriogennych, natomiast brak go w liniach niezdolnych do embriogenezy. Ekspresja SERK zanika w stadium globularnym zarodka [Grabowska i in. 2001]. Do grupy genów LEC (leafy cotyledon) należą: LEC1, LEC2 i FUS3. Kodują one białka stanowiące grupę regulatorów zaangażowanych w prawidłowy rozwój zarodka zarówno podczas morfogenezy, jak i dojrzewania [Stone i in cyt. za Gruszczyńska, Rakoczy-Trojanowska 2007]. Mutacje tych genów powodują dużo słabsze zdolności 49

7 embriogeniczne w porównaniu z typem dzikim. Kluczowymi dla inicjalnej fazy embriogenezy są geny LEC1 oraz LEC2 [Grabowska i in. 2001]. LEC2 odpowiada za nabywanie kompetencji przez komórki somatyczne i przekształcanie ich w zarodki. Reguluje on proces biosyntezy auksyn oraz wpływa na ich aktywność. Możliwe, że wpływa również na wrażliwość eksplantatu na te regulatory. Gen ten odpowiada również za indukcję fazy dojrzewania zarodków [Stone i in. 2006]. Gen LEC1 ma działanie plejotropowe i wpływa na morfologię liścieni, rozwój wieszadełka i dojrzewanie zarodka. Jego nadekspresja u rzodkiewnika, powodowała rozwój zarodków somatycznych na liściach. Produkt genu LEC1 jest regulatorem transkrypcji i prawdopodobnie bierze udział w indukowaniu zarodkowego szlaku rozwojowego [Grabowska i in. 2001]. Do innych genów mających znaczenie w embriogenezie należą: cdc2aat odpowiadający za indukcję kompetencji do embriogenezy [Sugiyama 1999], AGL15 (agamous-like), PEI1, oraz NIR (ferrodoxin-nitrate reductase) [Gruszczyńska, Rakoczy-Trojanowska 2007]. Geny SERK, AGL15 i BBM najbardziej aktywne są na wczesnych etapach embriogenezy. Pozostałe transkrybowane są w późniejszych stadiach. Poznanie mechanizmów kontrolujących embriogenezę stworzy szansę sterowania tymi procesami w roślinnych kulturach in vitro [Gruszczyńska, Rakoczy-Trojanowska 2007] oraz pozwoli poprawić współczynnik regeneracji roślin na tej drodze. Ryc. 3. Kolejność genów ulegających ekspresji podczas rozwoju zarodka [wg Gruszczyńska, Rakoczy-Trojanowska Różnice między embriogenezą zygotyczną i somatyczną Pomimo znacznego podobieństwa, wielu autorów podkreśla różnice morfologiczne oraz histologiczne, pomiędzy zygotycznymi i somatycznymi zarodkami pojawiające się w 50

8 trakcie ich rozwoju. Kępczyńska [2006] oraz inni badacze dostrzegają następujące kontrasty: embriogeneza zygotyczna rozpoczyna się od podwójnego zapłodnienia, w trakcie którego jedna komórka plemnikowa łączy się z komórką jajową, a druga z wtórnym jądrem centralnym, dając początek zygocie i komórce macierzystej bielma [Park, Harada 2008]. Zarodki zygotyczne powstają w woreczku zalążkowym, somatyczne natomiast w warunkach in vitro bezpośrednio (lub pośrednio) z eksplantatu, w embriogenezie zygotycznej, pierwszy podział zygoty jest asymetryczny. W efekcie powstają dwie komórki: mniejsza apikalna i większa bazalna. W wyniku dalszych podziałów tej drugiej, w stadium wczesnoglobularnym rozwija się suspensor, który zanika w stadium torpedy lub pozostaje w stopniu szczątkowym [Rodkiewicz 1973]. Zarodki somatyczne na ogół go nie posiadają. Wieszadełko bierze udział w transporcie substancji pokarmowych oraz syntezie fitohormonów. W kulturach tkankowych, to pożywka dostarcza składników odżywczych i regulatorów wzrostu, stąd nie ma potrzeby rozwoju suspensora [Von Arnold 2008], globularne stadia zarodków somatycznych są większe niż zygotycznych, merystem wierzchołkowy pędu zarodków somatycznych jest słabiej rozwinięty. Stożek wzrostu korzenia natomiast, otoczony jest warstwą komórek które nie pojawiają się w zarodkach zygotycznych [Bandyopadhyay, Hamill 2000], zarodki zygotyczne i somatyczne wytwarzają różną liczbę liścieni. Ponadto liścienie tych drugich są mniejsze, w embriogenezie zygotycznej na ogół tworzy się tkanka odżywcza bielmo. W trakcie embriogenezy somatycznej nie dochodzi do jego rozwoju, zarodki somatyczne produkują takie same materiały zapasowe jak zygotyczne, ale w innym czasie, miejscu i ilościach. Przykładowo białka zapasowe zarodków zygotycznych wytwarzane są w stadium liścieniowym, a somatycznych w globularnym i sercowatym. Ponadto produkowane są w mniejszych ilościach i gromadzone w hipokotylu, a nie w liścieniach, zarodki zygotyczne otoczone są zawsze okrywą nasienną (tworzącą się z osłonek zalążka), natomiast w rozwoju zarodków somatycznych nigdy ona nie powstaje, stąd czasami nie ma stadium liścieniowego w postaci laski i odwróconej litery U. Zdarza się natomiast, że są one pokryte warstwą wosku [Bandyopadhyay, Hamill 2000], rozwój somatycznych zarodków jest wolniejszy, później rozwijają się tkanki przewodzące (dopiero w stadium późnosercowatym) [Fras i in. 2008], rozwój zygotycznego zarodka kończy się powolnym odwodnieniem, które powoduje stopniowe spowolnienie metabolizmu i wprowadzenie zarodka w stan spoczynku. Pomimo że wśród somatycznych zarodków do tego nie dochodzi, to jednak wydzielają one i akumulują kwas abscysynowy, a także syntetyzują białka z grupy LEA (late embryogenesis abundant), które w zarodkach zygotycznych odpowiedzialne są za nadawanie odporności na desykację [Sankara-Rao 1996] Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków Kiełkowanie suchych somatycznych zarodków różni się od kiełkowania nasion, ponieważ bardzo często wytwarzają one tylko korzeń, ale nie liście. Spowodowane jest to faktem, iż merystem wierzchołkowy pędu jest bardziej wrażliwy na stres desykacyjny niż merystem korzenia. Na tej podstawie kiełkowanie somatycznych zarodków określane jest jako zdalność do formowania korzenia zarodkowego, a konwersja jako równoczesny rozwój korzenia i pędu. Tylko te, które zakumulowały dostatecznie dużo materiałów zapasowych i nabrały tolerancji na desykację w końcowej fazie dojrzewania wytworzą 51

9 zdrowe rośliny [Von Arnold 2008]. Konwersja zarodków i restytucja roślin mogą zachodzić na pożywkach pozbawionych regulatorów wzrostu lub suplementowanych cytokininami. Otrzymane w ten sposób rośliny nazywane są siewkami somatycznymi. Zregenerowane siewki z rozwiniętymi liścieniami, epikotylami i korzeniami mogą być przeniesione do niesterylnych warunków. Początkowo umieszcza się je w szklarni, a po określonym czasie przesadza do gruntu [Latkowska 2002]. Literatura Al-Ramamneh E., Sriskandarajah S., Serek M Plant regeneration via somatic embryogenesis in Schlumbergera truncata. Plant Cell Tissue Organ Cult. 84: Bach A Rozmnażanie wegetatywne. W: Malepszy S. (red.), Biotechnologia roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: Bandyopadhyay S., Hamill J.D Ultrastructural studies of somatic embryos of Eucalyptus nitens and comparisons with zygotic embryos found in mature seeds. Ann. Bot. 86: Fiuk A., Rybczyński J.J Wykorzystanie metod współczesnej analizy materiału roślinnego w badaniach somatycznej embriogenezy Gentiana kurroo (Royle). Biotechnologia 4(75): Fras A., Smolen B., Maluszynska J Vascularyzation of zygotic and somatic embryos of Arabidopsis thaliana. Acta Biol. Crac. s. Botanica 50(2): Gatica A., Arrieta G., Espinoza A.M Direct somatic embryogenesis in Coffea Arabica L. cvs. Caturra and Catuai: effect of triacontanol, light condition, and medium consistency. Agron. Costarric. 32(1): Grabowska A., Filipecki M., Linkiewicz A Genetyczna regulacja embriogenezy u roślin. Postępy Biologii Komórki 28(4): Gruszczyńska A., Rakoczy-Trojanowska M Charakterystyka genów ulegających ekspresji podczas somatycznej embriogenezy u roślin. Biotechnologia 1(76): Jasrai T.Y., Thaker K.N., D Souza C.M In vitro propagation of Euphorbia pulcherrima Willd. through somatic embryogenesis. Plant Tissue Cult 13(1): Jerzy M., Krzymińska A Rozmnażanie wegetatywne roślin ozdobnych. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Poznań, pp. 5-7; Kępczyńska E Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro. Biotechnologia 4(75): Kępczyński J., Kępczyńska E Regulatory wzrostu w somatycznej embriogenezie Medicago sativa L. Biotechnologia 2(53): Kuo H., Chen J., Chang W Efficient plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants of Phalaenopsis Little Steve. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 41: Latkowska M. J Somatyczna embriogeneza roślin iglastych na przykładzie świerka pospolitego (Picea bies [L.] Karst.). Biotechnologia 4(59): Lema-Rumińska J. Kulus D Induction of somatic embryogenesis in Astrophytum asterias (Zucc.) Lem. in the aspect of light conditions and auxin 2,4-D concentrations. Acta Sci. Pol. Hort. Cult. 11(4): Li X., Krasnyanski S.F., Korban S.S Somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis, and shoot organogenesis in Rosa. J. Plant Physiol. 159: Lynch P.T Tissue culture techniques in in vitro plant conservation. W: Benson E.E. (red.), Plant conservation technology. Taylor and Francis, London, pp Martinez-Palacios A., Ortega-Larroccea M., Chavez V.M Somatic embryogenesis and organogenesis of Agave victoriae-reginae: considerations for its conservation. Plant Cell Tissue Organ Cult. 74:

10 Nagmani R., Becwar M.R., Wann S.R Single-cell origin and development of somatic embryos in Picea abies (L.) Karst. (Norway spruce) and P. glauca (Moench) Voss (white spruce). Plant Cell Rep. 6(2): Park S., Harada J Plant embryogenesis Arabidopsis embryogenesis. Methods Mol. Biol. 427: Quiroz-Figueroa R.F., Rojas-Herrera R., Galaz-Avalos R.M., Loyola-Vargas V.M Embryo production through somatic embryogenesis can be used to study cell differnatiation in plants. Plant Cell Tissue Organ Cult. 86: Rodkiewicz B Embriologia roślin kwiatowych. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: 285 pp. Rose R.J., Mantiri F.R., Kurdyukov S., Chen S-K., Wang X-D., Nolan K.E., Sheahan M.B Developmental biology of somatic embryogenesis. W: Pua E.C., Davey M.R. (red.),. Plant Developmental Biology Biotechnological Perspectives 2. Springer, Berlin Heidelberg: Rubluo A Micropropagation of Mammillaria species (Cactaceae). Biotech. Agric. For. 40: Sankara-Rao K Embryogenesis in flowering plants: recent approaches and prospects. Recent Dev. Plant Embryogenesis 21: Slater A., Scott N., Fowler M Plant Biotechnology the genetic manipulation of plants. Oxford University Press, Oxford: Stone S.L., Braybrook S.A., Paula S.L., Kwong L.W., Meuser J., Pelletier J., Tzung- Fu H., Fischer R.L., Goldberg R.B., Harada J Arabidopsis LEAFY COTYLEDON2 induces maturation traits and auxin activity: implications for somatic embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 105(8): Sugiyama M Organogenesis in vitro. Curr. Opin. Plant Biol. 2: Von Arnold S Somatic embryogenesis. W: George E.F., Hall M.A., De Klerk G.J. (red.), Plant propagation by tissue culture 3rd Edition. Springer, Dordrecht: Zenkteker M Metoda hodowli in vitro w embriologii doświadczalnej. W: Zenkteler M. (red.), Hodowla i tkanek roślinnych. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: Zoglauer K., Behrendt U., Rahmat A., Ross H., Taryono X Somatic embryogenesis - the gate to biotechnology in conifers. W: Laimer M., Rucker W. (red.), Plant tissue culture. Springer-Verlag, Wien: Nazwa instytucji: Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich w Bydgoszczy, Wydział Rolnictwa i Biotechnologii, Katedra Roślin Ozdobnych i Warzywnych Pracownia Biotechnologii Opiekun naukowy: Prof. dr hab. inż. Małgorzata Zalewska Adres do korespondencji: Wydział Rolnictwa i Biotechnologii UTP w Bydgoszczy, Katedra Roślin Ozdobnych i Warzywnych Pracownia Biotechnologii, ul. Bernardyńska 6, Bydgoszcz, dkulus@gmail.com 53