BIOLOGIA KOMÓRKI. Mechanizmy ruchów komórkowych wpływ anestetyków na komórki.

Transkrypt

1 BIOLOGIA KOMÓRKI Mechanizmy ruchów komórkowych wpływ anestetyków na komórki.

2 Wstęp 1. Migracja komórek Aktywna migracja komórek jest procesem mającym fundamentalne znaczenie dla całego świata Ŝywego. Począwszy od organizmów jednokomórkowych, dla których aktywny ruch jest niezbędny do zdobycia pokarmu, aŝ do tak skomplikowanych procesów, jak: rozwój embrionalny organizmów wielokomórkowych, gojenie ren i regeneracja tkanek, reakcje układu odpornościowego czy tworzenie przerzutów przez komórki nowotworowe. Warunkiem niezbędnym dla aktywnej migracji komórek jest adhezja komórki do podłoŝa po którym się porusza. Ruch komórki moŝemy podzielić na 3 główne etapy: - polaryzacja ciała komórki - tworzenie wypustek w krawędzi wiodącej komórki - retrakcja tyłu komórki połączona ze skurczem ciała komórki KaŜdy z etapów ruchu jest ściśle regulowany poprzez gradientowe rozmieszczenie cząsteczek sygnałowych i białek regulujących poszczególne procesy wewnątrz komórki. Do białek regulujących zmiany cytoszkieletu aktynowego w ruchu komórek zalicza się głównie małe białka G z rodziny Rho: białka Rac1 i Cdc42 zlokalizowane są w krawędzi wiodącej i odpowiadają za tworzenie wypustek komórkowych (Rac1 lamellipodia, Cdc42 filopodia), a białko RhoA zlokalizowane jest w tyle komórki, gdzie aktywuje skurcz ciała komórki. W przypadku komórek zwierzęcych wyróŝnia się kilka typów ruchu, jakim poruszają się komórki: - ruch ameboidalny - komórki charakteryzują się duŝą plastycznością kształtu, wytwarzaniem pęcherzykowatych wypustek, wysoką prędkością ruchu, nie tworzą silnych połączeń adhezyjnych z podłoŝem, np. leukocyty, ameby - ruch mezenchymalny - komórki o silnie wydłuŝonym kształcie, z charakterystycznym lamellipodium w krawędzi wiodącej, z widocznymi włóknami napręŝeniowymi i kontaktami zogniskowanymi, wolniejszy, komórki wykazują zdolność do wytwarzania proteinaz i trawienia białek macierzy zewnątrzkomórkowej, np. fibroblasty - tzw. gliding motion komórki z widocznym duŝym lamellipodium, poruszają się bardzo płynnie co uniemoŝliwia wyróŝnienie poszczególnych faz ruchu, np. keratynocyty - ruch kolektywny jest to migracja grup komórek z zachowaniem charakterystyki ruchu mezenchymalnego, komórki z krawędzi wiodącej na etapie skurczu ciała komórki ciągną za sobą resztę komórek np. wiele komórek nowotworowych. Ze względu na istotne znaczenie procesu migracji komórek jest on przedmiotem wielu badań w pracowniach na całym świecie i opracowane zostało wiele technik umoŝliwiających jego analizę. Początkowo, ze względu na łatwą obserwację, szybkość ruchu, wielkość i temperaturę Ŝycia organizmem modelowym do badania ruchów były organizmy jednokomórkowe, takie jak Ameba proteus czy Dictyostelium discoideum. Wraz z rozwojem techniki pojawiła się jednak moŝliwość badania ruchu ssaczych komórek tkankowych, w tym ludzkich. Metody badań ruchu komórek moŝemy podzielić na pośrednie, w których obserwowany jest punkt początkowy i końcowy eksperymentu, oraz bezpośrednie, w których ruch komórek obserwowany jest przez cały okres trwania doświadczenia. Do metod pośrednich zaliczamy m.in. zmodyfikowane komory Boydena, reakcję zarastania rany monolayeru, do bezpośrednich natomiast poklatkową rejestrację ruchu komórek. Przykładowy układ do rejestracji poklatkowej ruchu komórek powinien składać się z: - mikroskopu odwróconego z optyką kontrastu fazowego 2

3 - kamery CCD - modułu do rejestracji w trybie time-lapse - stolika (lub komory) podgrzewanej do 37 st. C 2. Anestetyki Anestetyki są to leki wywołujące stan anestezji. Są one powszechnie uŝywane do wywołania narkozy (ogólnie działające środki znieczulające) lub do miejscowego znieczulenia (anestetyki lokalne). Pod względem budowy najczęściej stosowane anestetyki lokalne są aminoestrami: pochodnymi kwasu benzoesowego (kokaina), kwasu p-aminobenzoesowego (prokaina, tetrakaina) lub amidoamidami (lidokaina, bupiwakaina). Wszystkie te związki charakteryzują się obecnością ugrupowania lipofilnego (pierścień aromatyczny) połączonego wiązaniem estrowym lub amidowym z łańcuchem węglowym oraz obecnością grupy hydrofilowej (trzeciorzędowa grupa aminowa). Do związków o działaniu znieczulającym zaliczamy równieŝ wodę destylowaną, roztwory sacharozy, chlorków potasu i magnezu, etanol, benzen, eter, benzamid i wiele innych. Mimo trwających od lat intensywnych badań działania anestetyków na komórki oraz powszechnego ich stosowania w medycynie, molekularny mechanizm ich działania nie jest w pełni poznany. Najczęściej działanie anestetyków wiązane jest z ich wpływem na błonę komórkową. Mogą one oddziaływać bezpośrednio na dwuwarstwę lipidową, zmieniając jej płynność lub przepuszczalność dla wody, jak i zmieniać transport jonów w poprzek błony poprzez kanały jonowe. Według najpowszechniej przyjmowanej teorii, działanie znieczulające anestetyków związane jest z hamowaniem napływu jonów sodu do cytoplazmy poprzez zaleŝne od potencjału kanały sodowe w błonach komórek nerwowych. Przyłączenie anestetyku zachodzi w obrębie poru kanału i powoduje zmiany konformacyjne białka utrudniające przechodzenie jonów. W ostatnich latach przybywa wiele dowodów na poparcie tezy, Ŝe działanie anestetyków nie ogranicza się jedynie do blokowania zaleŝnych od potencjału kanałów sodowych. Wykazano m.in. hamowanie przez te leki napływu do wnętrza neuronów jonów wapnia poprzez zaleŝne od potencjału kanały wapniowe. Działanie anestetyku nie ogranicza się do błony komórkowej. Obejmuje takŝe inne organelle komórkowe. Związki te zmieniają stęŝenie wewnątrzkomórkowe jonów wapnia, które są wtórnym przekaźnikiem sygnału w komórce. StęŜenie jonów wapnia zaleŝne jest nie tylko od aktywności kanałów wapniowych w błonie komórkowej, ale głównie od uwalniania tych jonów z wnętrza cystern siateczki śródplazmatycznej. W błonach tej siateczki znajdują się dwa typy kanałów jonowych. Jeden z nich określany jest typem receptora IP 3 (inozytolo-(1,4,5)- trifosforanu), drugi typ kanału to kanał rianodinowy (aktywowany przez wapń). Aktywność kanału rianodinowego jest stymulowana między innymi przez kofeinę, a hamowana przez prokainę i inne środki miejscowo znieczulające. Wywołane działaniem anestetyków zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia mogą więc wpływać na aktywność wielu zaleŝnych od wapnia ścieŝek sygnałowych, co moŝe prowadzić do zaburzenia wielu procesów komórkowych, jak np. skurcz komórek mięśniowych i niemięśniowych, regulacja wydzielania komórkowego i inne. Wiele prac wskazuje, Ŝe pod wpływem anestetyku zaburzeniu ulegają procesy, których przebieg uzaleŝniony jest od organizacji cytoszkieletu. Do procesów takich naleŝą wzrost aksonów komórek nerwowych i transport w aksonach, przepływ cytoplazmy, ruch komórek, procesy endocytozy. 3

4 PoniewaŜ działanie anestetyków nie ogranicza się do komórek nerwowych i mięśniowych, ich stosowanie moŝe prowadzić do występowania wielu działań niepoŝądanych. Przedmiotem zainteresowania jest ich wpływ na fibroblasty, komórki epitelialne, komórki układu immunologicznego, gdyŝ stosowanie tych środków mogłoby zakłócać proces gojenia się ran i upośledzać zdolności obronne organizmu. Wykonanie ćwiczenia Wpływ etanolu na ruchliwość ameb 1. Przygotować do pracy mikroskop kontrastowo-fazowy (obiektyw 20x PhA, okulary 10x SK). ZałoŜyć do mikroskopu zielony filtr. 2. Przygotować 4 komory, pamiętając o dokładnym umyciu i odtłuszczeniu szkiełek, gdyŝ warunkuje to przyczepienie się ameb do szkła: 3. Umieścić na szkiełku 3 ameby, po czym nałoŝyć szkiełko nakrywkowe. Poczekać około 3 minut, aŝ ameby przyczepią się do szkła i przybiorą typowy, spolaryzowany kształt i zaczną się poruszać. Opisać kształt, wygląd powierzchni i rozkład ziarnistości oraz hialoplazmy. Ocenić przeciętną prędkość poruszania się ameby. 4. Obserwując amebę w mikroskopie bardzo delikatnie, uwaŝając by strumień cieczy nie oderwał ameby od podłoŝa, wprowadzić do komory 2% roztwór etanolu w roztworze Chalkley`a. Pipetką umieszczać kroplę roztworu z jednej strony i odciągać bibułą z drugiej strony komory. Zanotować kolejne zmiany w wyglądzie i ruchu ameby i czas jaki upłynął od chwili dodania alkoholu (kształt, wygląd powierzchni, rozkład ziarnistości i hialoplazmy oraz sposób poruszania się). Obserwacje prowadzić około 10 minut. 5. W komorze z punktu 4 umieścić 0.5 mm roztwór Ca 2+ (r-r Chalkley`a z Ca 2+ ). Zaobserwować ustępowanie zmian wywołanych etanolem. 6. W nowej komorze umieścić ameby jak w punkcie W komorze z punktu 6 umieścić 5% etanol w r-rze Chalkley`a. Prowadzić obserwacje w taki sam sposób jak poprzednio. 8. Przygotować nową komorę i zbadać wpływ 2% roztworu etanolu z jonami Ca Podobnie jak w punkcie 8 postąpić z 5% roztworem etanolu z jonami Ca 2+. 4

5 Zakres materiału, który naleŝy przygotować do ćwiczeń: Referat: 1) Aktywność ruchowa komórek niemięśniowych. 2) Cytoszkielet aktynowy i mikrotubularny- rola w migracji komórek; rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu i migracji 3) Udział jonów wapnia w migracji komórek 4) Mechanizm działania anestetyków Strategie kuchu komórek w układach trójwymiarowych. 5