Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Transkrypt

1 Klichowska-Palonka M. i inni: Wykorzystanie badania śliny w diagnostyce endokrynlogicznej Vol. 8/2009 Nr 1(26) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Wykorzystanie badania śliny w diagnostyce endokrynologicznej The Use of Saliva Analysis in Endocrinological Diagnostics 1 Małgorzata Klichowska-Palonka, 2 Elżbieta Pac-Kożuchowska 1 Katedra i Zakład Stomatologii Zachowawczej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 Klinika Pediatrii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie Adres do korespondencji: Małgorzata Klichowska-Palonka, Katedra i Zakład Stomatologii Zachowawczej, ul. Karmelicka 7, Lublin, tel Słowa kluczowe: ślina, hormony Key words: saliva, hormones STRESZCZENIE/ABSTRACT W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się możliwościom wykorzystania śliny w diagnostyce laboratoryjnej. Szczególnie ważne jest wykorzystania śliny w diagnostyce i monitorowaniu stanu zdrowia u osób często oznaczających stężenia hormonów we krwi. Oznaczanie hormonów w ślinie umożliwia szybkie oraz nieinwazyjne określanie ich poziomu w organizmie. Praca stanowi przegląd piśmiennictwa w zakresie wykorzystania śliny jako dobrego materiału do oznaczania stężenia hormonów. Endokrynol. Ped. 8/2009;2(27): In recent years increasingly more attention has been devoted to the possibilities of saliva analysis in laboratory diagnostics. The use of saliva for diagnostic tests and monitoring of the health status of patients who frequently measure the concentration of hormones in the blood is especially important. Salivary hormone measurements enable quick and non-invasive determination of their level in the body. The article presents literature review concerning the use of saliva as a good diagnostic material for the measurement of hormone levels. Pediatr. Endocrinol. 8/2009;2(27): Wstęp Stężenia hormonów produkowanych w organizmie podlegają dużej zmienności w cyklu dobowym, zmieniają się pod wpływem różnych czynników, np. stresu czy wysiłku fizycznego. W prawidłowej ocenie czynności gruczołów dokrewnych największą wartość mają testy czynnościowe rytmiczności wydzielania, a to wymaga wielokrotnego pobierania próbek krwi. Ponieważ częste pobieranie krwi do badań nie jest zabiegiem obojętnym dla pacjentów, poszukiwane są alternatywne możliwości. Od wielu lat trwają badania dotyczące wykorzystania śliny do badań laboratoryjno-diagnostycznych. Materiał ten umożliwia wielokrotne, nieinwazyjne, a przede wszystkim bezstresowe pobieranie prób, co ma szczególne znaczenie w badaniach czynności układu endokrynnego 61

2 Praca przeglądowa Endokrynol. Ped., 8/2009;2(27):61-66 [1]. Ślina jest jedną z biologicznych wydzielin wytwarzanych regularnie, zawiera liczne substancje, podobnie jak inne płyny ustrojowe np. krew i mocz. Wydaje się więc, że jej praktyczne wykorzystanie jest wciąż niedoceniane [2]. Praca ta ma na celu przedstawienie potencjalnych możliwości wykorzystania śliny jako materiału przydatnego w diagnostyce i stanowiącego alternatywę dla powszechnie wykorzystywanych próbek krwi. Opisane zostaną również mechanizmy przedostania się do śliny hormonów i możliwości ich wykorzystania na podstawie najnowszych doniesień naukowych. Większość hormonów przedostaje się z osocza krwi na drodze dyfuzji biernej zachodzącej w komórkach gruczołowych, tylko małe polarne cząsteczki przedostają się do śliny drogą ultrafiltracji. Produkcja śliny, transport hormonów drogi przedostawania się do śliny różnych substancji: 1. Wydzielina gruczołów ślinowych gruczoły ślinowe dostarczają główne składniki śliny, takie jak woda, białka, enzymy i immunoglobuliny IgA. 2. Ultrafiltracja przedostawanie się małych cząsteczek pochodzących z surowicy, jak katecholaminy czy estry sterydowe. Cząsteczki transportowane w ten sposób występują w ślinie w bardzo niewielkich stężeniach od 1/300 do nawet 1/3000 w stosunku do surowicy krwi. 3. Dyfuzja bierna drogą tą przedostają się do śliny cząsteczki rozpuszczalne w tłuszczach z płynu międzykomórkowego, takie jak wolne hormony sterydowe, których stężenia w stosunku do surowicy są od 10 do 100 razy mniejsze. Można tu jednak mówić o zachowywaniu stałego stężenia w ślinie w stosunku do surowicy krwi z uwagi na szybki transfer. Oznaczanie ich w ślinie jest reprezentatywne w stosunku do stężeń w surowicy. 4. Wysięk do jamy ustnej odbywa się poprzez kieszonki dziąsłowe i bezpośrednio przez błonę śluzową. Drogą tą dostają się do jamy ustnej z surowicy krwi takie cząsteczki, jak albuminy i wydzielanie to wzrasta w przypadku istnienia stanów zapalnych dziąseł, otarć błony śluzowej wywołanych szczotkowaniem lub jedzeniem lub uszkodzeń błony śluzowej z krwawieniem [2]. Pobierania śliny do oznaczania hormonów Ślina jest wytwarzana przez trzy pary gruczołów ślinowych: ślinianki przyuszne, podżuchwowe i podjęzykowe oraz przez liczne małe gruczoły policzkowe wyścielające jamę ustną. Do oznaczania poziomu hormonów zbierana jest ślina mieszana, którą można przechowywać w temperaturze 4 C lub zamrażać bez zmian stężenia hormonów [3]. Najprostsza metoda pobrania śliny polega na zbieraniu śliny do probówki w ciągu 10 min. Następnie ślinę odwirowujemy, oddzielając w ten sposób białka o wysokiej masie cząsteczkowej. Innym sposobem jest wykorzystanie systemu Salivette, polegające na umieszczeniu pod językiem lub żuciu przez sek. jałowego tamponu. Nasączony śliną tampon umieszcza się w odpowiedniej probówce i odwirowuje bezpośrednio po wyjęciu z jamy ustnej, otrzymując 0,4 1,1 ml nasączu do badań. Do zbierania śliny można również użyć sączka papierowego, który zatrzymuje około 0,1 ml śliny. Badania Gröschl i wsp. wykazały brak wpływu zawartych w ślinie substancji, takich jak jedzenie czy środki do higieny jamy ustnej, na wyniki oznaczania hormonów (kortyzolu, progesteronu oraz metabolitu 17-OH-progesteronu) [4]. Tak więc próbki śliny mogą być zbierane samodzielnie przez chorych i przechowywane w domu lub wysyłane pocztą bezpośrednio do laboratorium. Stanowi to znaczne udogodnienie w prowadzeniu badań, szczególnie wymagających częstych analiz, czyniąc w takich przypadkach badania śliny metodą z wyboru [5]. Hormony steroidowe Hormony steroidowe najczęściej oznaczane są we krwi zarówno w surowicy, jak i w osoczu, można je również oznaczać w moczu, tkance tłuszczowej, kulturach tkankowych, płynie owodniowym lub ślinie. Badania nad obecnością hormonów sterydowych w ślinie i ich praktycznym wykorzystaniem prowadzone są od wielu lat. Przeprowadzono wiele badań porównawczych wskazujących na istnienie istotnych korelacji pomiędzy stężeniami hormonów sterydowych we krwi i w ślinie [3, 6 9]. W badaniach w zakresie metodyki i interpretacji oznaczeń hormonów sterydowych w ślinie stwierdzono, że ilości hormonów sterydowych w ślinie odpowiadają stężeniom ich wolnej frakcji w surowicy krwi, nawet wtedy, gdy stężenie hormonów 62

3 Klichowska-Palonka M. i inni: Wykorzystanie badania śliny w diagnostyce endokrynlogicznej we krwi szybko się zmienia. Najczęściej stosowanymi metodami do oznaczania stężenia steroidów w ślinie są metody enzymatyczne EIA z przeciwciałami zwierzęcymi i metody radioimmunologiczne RIA z użyciem przeciwciał znakowanych radioaktywnie. W praktyce klinicznej często wykorzystywane są również metody separacyjne, takie jak chromatografia gazowa i cieczowa [10]. Kortyzol Oznaczanie kortyzolu w ślinie pozwala uniknąć błędów spowodowanych stresem podczas pobierania krwi do badań. Umożliwia również wykonanie pomiarów kilka razy dziennie, co jest szczególnie użyteczne przy analizowaniu zaburzeń kinetyki wydzielania kortyzolu i nie można tego wykonać przez pojedyncze jego oznaczenia we krwi obwodowej. Stwierdzono, że stężenia kortyzolu w ślinie są niezależne od szybkości wydzielania śliny, gdyż dyfuzja tego hormonu zachodzi bardzo szybko. Stężenie kortyzolu w ślinie wykazuje cykliczność wydzielania i wzrasta 0,5 godz. po obudzeniu. Średnie stężenie kortyzolu w ślinie rano po wstaniu wynosi 15 nmol l -1, a przed snem 3 nmol l -1 [2]. Dzięki zastosowaniu śliny jako materiału do badań możliwe było określenie dziennego profilu uwalniania tego hormonu [11 13]. Określenie stężeń kortyzolu w ślinie może być wykorzystane do stwierdzenia choroby Cushinga lub Addisona oraz do monitorowania hormonalnej odpowiedzi organizmu na ćwiczenia fizyczne i na wzmożony stres. Metoda ta może być bardzo pomocna w diagnostyce i leczeniu pacjentów z zaburzeniami psychicznymi [14]. Vinning i wsp. w swoich badaniach stwierdzili, że badanie kortyzolu w ślinie lepiej określa funkcje kory nadnerczy niż badanie kortyzolu w surowicy krwi i może znaleźć zastosowanie w badaniach czynności osi przysadkowo-nadnerczowej z zastosowaniem supresji deksametazonem czy stymulacji przez ACTH [9, 15]. Badanie poziomu kortyzolu w ślinie może być także wykorzystane do określania funkcji kory nadnerczy u osób z astmą oskrzelową [16]. Na podstawie licznych doniesień naukowych można stwierdzić, że badanie kortyzolu może być wykonane w ślinie zamiast w surowicy krwi przy oszczędzaniu pacjentowi stresującego i trudniejszego pobrania krwi do analizy. Stężenie aldosteronu we krwi istotnie koreluje ze stężeniami aldosteronu w ślinie, zatem wzrost ilości tego hormonu obserwowany jest tak samo w ślinie, jak i we krwi w pierwotnym aldosteronizmie w zespole Conna [5, 17]. Oznaczanie poziomów hormonów w ślinie może być przydatne w monitorowaniu stanu zdrowia chorych na depresję, chorobę Alzheimera czy dystrofię mięśni [18 20]. Hill i wsp. zajmowali się oznaczaniem we krwi i ślinie stężenia dehydroepiandrosteronu DHEA oraz jego metabolitu 7α-OH-DHEA, potwierdzając wysoką korelację ich stężeń w obu płynach ustrojowych [21]. Elzing i wsp. wykazali zmiany stężenia kortyzolu w ślinie pod wpływem stresujących wspomnień i przeżyć przebytych w przeszłości. Wykazali oni wzrost wydzielania kortyzolu nawet o 122% w porównaniu z grupą kontrolną [22]. Testosteron Przykładem przydatności śliny w badaniach endokrynologicznych było oznaczanie testosteronu w stanach hiper- i hypoandrogennych. Ilości testosteronu w ślinie to około 1,5% do 7,5% wolnej frakcji testosteronu w osoczu, czyli u dorosłego mężczyzny średni poziom testosteronu w ślinie wynosi 260 pmol l -1. Zastosowanie śliny do oznaczeń testosteronu umożliwiło ustalenie zakresów normy wydzielania tego hormonu w różnych grupach wieku u chłopców w okresie pokwitania [1]. W pracy Kusiak i wsp. porównywano stężenia testosteronu i kortyzolu w osoczu i ślinie zdrowych dziewcząt i chłopców w wieku lat. Stężenie testosteronu i kortyzolu w surowicy i ślinie oznaczano metodą radioimmunologiczną. Stwierdzono, że oznaczanie testosteronu i kortyzolu w ślinie jest metodą o dobrej powtarzalności i dokładności. Porównanie poziomu badanych hormonów w osoczu i ślinie wykazało wysoką korelację dla testosteronu (r = 0,76, p < 0,001) i kortyzolu (r = 0,72, p < 0,001). Wyniki niniejszej pracy potwierdzają możliwość wykorzystania w badaniach laboratoryjnych śliny zamiast surowicy krwi do pomiaru stężenia testosteronu i kortyzolu [23]. Estrogeny, progesteron Laine i wsp. na podstawie stężeń progesteronu i jego metabolitów w ślinie badali zmiany stężenia tego hormonu podczas przechowywania próbek poddanych wstępnej inkubacji, a następnie zamrożonych. Stwierdzono, że ślina posiada nieznaczne właściwości metaboliczne, mogące wpływać na zawartość hormonów, a szybkość reakcji rozkładu zależy od ilości komórek zawartych w próbce [24]. 63

4 Praca przeglądowa Endokrynol. Ped., 8/2009;2(27):61-66 Tabela I. Porównanie stężeń wybranych hormonów w ślinie i we krwi na podstawie piśmiennictwa Hormon Ślina mieszana Surowica krwi Kortyzol szczyt działania Kortyzol 8 godzin po szczycie 13,8 48,9 nmol/l 1,4 8,6 nmol/l nmol/l nmol/l Aldosteron u kobiet pmol/l pmol/l Estradiol szczyt działania 9 29 pmol/l pmol/l Estriol 40 tydzień ciąży 4,5 9,8 mmol/l mmol/l Progesteron faza lutealna Progesteron faza owulacyjna Testosteron u mężczyzn Testosteron u kobiet przed menopauzą Żeńskie hormony płciowe badane w ślinie umożliwiają śledzenie zmian cyklu menstruacyjnego w przypadkach nieprawidłowej owulacji w niepłodności. W licznych badaniach klinicznych potwierdzono występowanie istotnych zależności pomiędzy stężeniem wolnej frakcji estriolu (E 3 ) a zagrożeniem życia płodu i przedwczesnym porodem nawet kilka tygodni wcześniej. Stwierdzono również, że stężenie hormonów sterydowych w ślinie jest niezależne od szybkości jej wydzielania i bardzo dobrze odzwierciedla stężenie ich wolnej frakcji we krwi [25]. Oznaczanie estriolu (E 3 ) w ślinie jest przydatne w monitorowaniu czynności jednostki płodowo-łożyskowej. Wykazano wysoką korelację pomiędzy stężeniami E 3 w ślinie i osoczu w przebiegu ciąży, uznając pomiar E 3 w ślinie metodą z wyboru dla celów monitorowania dobrostanu płodu i zapobiegania przedwczesnemu porodowi [26 29]. Synteza, katabolizm oraz wchłanianie estradiolu, głównego estrogenu, są regulowane w sposób skomplikowany. Dlatego też wzrasta zapotrzebowanie na ciągłe monitorowanie stężenia tego hormonu w organizmie. Tadeusiak i wsp. badali możliwość zastąpienia surowicy śliną jako materiałem podstawowym do oznaczania estradiolu, porównując jego stężenie w tych dwóch płynach ustrojowych. W tym celu oznaczano estradiol metodą immunoenzymatyczną (MEIA) we krwi i w ślinie pobranej metodą absorpcyjną trzema różnymi zestawami Salivette u 25 pacjentek (ciężarnych i w połogu). Stwierdzono wysoką korelację między stężeniami estradiolu w ślinie i w surowicy, najwyższą w przypadku zastosowania poliestru jako materiału absorpcyjnego [30]. W tabeli I. zestawiono porównanie stężeń wybranych hormonów w ślinie i we krwi [31] pmol/l <160 pmol/l pmol/l pmol/l pmol/l pmol/l Hormony niesterydowe Marchetti i wsp. stwierdzili przydatność oznaczeń insuliny w ślinie do celów klinicznych z uwagi na wysoką korelację tego hormonu w stosunku do surowicy krwi [32]. Katecholaminy dyfundują do śliny z osocza i z gruczołowych zakończeń nerwów współczulnych. Są obecne w ślinie w ilości pg/ml, ale ich stężenia w ślinie i we krwi słabo korelują ze sobą. Poziom noradrenaliny w ślinie znacząco wzrasta w sytuacji stresowej. Obecne są czynnik wzrostu IGF-I i IGF-II [33]. Tak więc, podobnie jak immunoglobuliny, oznaczanie tych czynników w ślinie wymaga wykonania dalszych szczegółowych badań. W ostatnio publikowanych pracach duże nadzieje na znalezienie nowych biomarkerów dla chorób wiąże się z badaniami białek śliny. Podjęto badania mające na celu stworzenie katalogu ślinowych białek z podziałem na białka śliny mieszanej i białka dużych gruczołów ślinowych. Obecnie zidentyfikowano już 3020 białek osocza i 1939 ślinowych białek, które są kombinacją unikalnych sekwencji peptydów wyizolowanych z całkowitej i przewodowej śliny. Z tej liczby zidentyfikowanych białek 597 ślinowych białek można stwierdzić w osoczu [34]. Kontynuowanie tych badań w przyszłości ma przynieść możliwość odnalezienia biologicznych markerów umożliwiających diagnostykę wielu chorób. Podsumowanie pmol/l pmol/l Ślina może stanowić alternatywę dla badania stężeń wielu hormonów, których oznaczenia są rutynowo wykonywane we krwi. Ślina jest szcze- 64

5 Klichowska-Palonka M. i inni: Wykorzystanie badania śliny w diagnostyce endokrynlogicznej gólnie przydatna do oznaczania hormonów sterydowych. Istnieje wiele powodów, dla których wykorzystanie śliny do badań laboratoryjnych jest korzystne, a więc: Łatwość pobierania materiału do analizy i możliwość wielokrotnego pobierania go np. w ciągu dnia, Brak stresu przed pobraniem materiału, Możliwość analizy takich parametrów, które mogą ulec zmianie w wyniku stresu, Mniejsze koszty badania, Próbki śliny do badań mogą być przechowywane przez tydzień w temperaturze 4, a w temperaturze otoczenia nawet do 24 godzin, podczas gdy surowica musi być natychmiast zamrożona. Na podstawie przeglądu dostępnego piśmiennictwa w zakresie wykorzystania śliny jako dobrego materiału do oznaczania stężenia hormonów można wnioskować o wykorzystanie tej metody w diagnostyce endokrynologicznej u dzieci. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Marek B., Kos-Kudła B., Bunter B.: Ślina użyteczny materiał diagnostyczny w praktyce pediatrycznej? Ped. Pol., 1992:1-2, [2] Lac G.: Saliva assays In clinical and research biology. Pathol. Biol., 2001:49, [3] Lac G., Lac N., Robert A.: Steroid assays in saliva: a method to detect plasmatic contaminations. Arch. Int. Physiol. Bioch. Biophys., 1993:101, [4] Gröschl M., Wagner R., Rauh M., Dörr H.G.: Stability of salivary steroids: the influences of storage food and dental care. Steroids., 2001:66, [5] Kaufman E., Lamster I.B.: The diagnostic applications of saliva a review. Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 2002:13, 2, [6] Luisi M., Franchi F.: Salivary steroid measurement. An alternative approach to plasma assays in assessing endocrine function. Front Oral Physiol., 1984:5, [7] Obimski Z., Stupnicki R.: Radioimmunoassay of cortisol in saliva. Endocrinol. Polska, 1991:42, 3, [8] Luisi M., Franchi F.: Salivary steroid measurement. An alternative approach to plasma assays in assessing endocrine function. Front Oral Physiol., 1984:5, [9] Cetinkaya S., Ozon A., Yordam N.: Diagnostic value of salivary cortisol in children with abnormal adrenal cortex functions. Horm. Res., 2007:67, 6, [10] Dziurkowska E., Zarzycki P.K.: Rola oznaczania hormonów steroidowych w ślinie w nowoczesnej diagnostyce medycznej. Bromat. Chem. Toksykol. XL, 2007:4, [11] Hucklebridge F., Clow A., Evans P.: The relationship between salivary secretory immunoglobulin A and cortisol: neuroendocrine response to awakening and diurnal cycle. Int. J. Psychophysiol., 1998:31, [12] Jacobs N., Nicolson N.A., Derom C., Delespaul P., van Os J., Myin-Gemeys I.: Electronic monitoring of salivary cortisol sampling compliance in daily life. Life Sci., 2005:76, [13] Hucklebridge F., Hussain T., Evans P., Clow A.: The diurnal patterns of the adrenal steroids cortisol and dehydroepiandrosterone (DHEA) in relation to awakening. Psychoneuroendocrinology, 2005:30, [14] Jezova D., Hlavacova N.: Endocrine factors in stress and psychiatric disorders: focus on anxiety and salivary steroides. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2008:1148, [15] Vining R.F., Mc Ginley R.A., Maksvytis J.J., Ho K.Y.: Salivary cortisol: a better measure of adrenal cortical function than serum cortisol. Ann. Clin. Bioch., 1983:20, [16] Kos-Kudła B., Pluskiewicz W., Marek B., Ostrowska Z., Buntner B.: Use of salivary cortisol levels during the synacthem test in patients with bronchial asthma. Med. Sci. Monitor, 1999:5, 2, [17] Hubl W., Taubert H., Freymann E., Hofmann F., Meissner D., Garten C.D.: A simple solid phase enzyme immunoassay for aldosterone in plasma and saliva. Exp. Clin. Endocrinol., 1983:82, [18] Michael A., Jenaway A., Paykel E.S., Herbetr J.: Altered salivary dehydroepiandrosterone levels in major depression in adults. Biol. Psychiatry, 2000:48, [19] Johansson A., Andrew R., Forsberg H., Cederquist K., Walker B.R., Olsson T.: Glucocorticoid metabolism and adrenocortical reactivity to ACTH in Myotonic Dystrophy. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001:86, [20] Young A.H., Gallagher P., Porter R.J.: Elevation of the cortisol-dehydroepiandrosterone ratio in drug-free depressed patients. Am. J. Psychiatry, 2002:159, [21] Hill M., Lapcik O., Havlikowa H., Morfin R., Hampl R.: 7-Hydroxydehydroepiandrosterone epimers in human serum and saliva comparison of gas chromatography-mass spectrometry and radioimmunoassay. J. Chromatogr. A., 2001:935, [22] Elzinga B.M., Schmahl C.G., Vermetten E., van Dyck R., Bremner J.D.: Higher cortisol levels following exposure to traumatic reminders in abuse-related PTSD. Neuropsychopharmacology, 2003:28, [23] Kusiak E., Drużyńska J., Wójcikowski C.: Ślina jako materiał diagnostyczny do oznaczeń testosteronu i kortyzolu. Diagn. Lab., 1997: 33, 4,

6 Praca przeglądowa Endokrynol. Ped., 8/2009;2(27):61-66 [24] Laine M.A., Ojanotko A.O.: Progesterone metabolism in human saliva in vitro. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999:70, [25] Goffinet F., Maillard F., Fulla Y., Cabrol D.: Biochemical markers (without markers of infection) of the risk of preterm delivery. Implications for clinical practice. Eu. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 2001:94, [26] Voss Fred H.: Saliva as a fluid for measurement of estriol levels. Am. J. Obstet. Gynecol., 1999:180, [27] Tadeusiak W., Dębski R., Bobilewicz D.: Oznaczanie wolnego estriolu w ślinie nowe możliwości w praktyce położniczej. Diagn. Lab., 2004:40, [28] Hayashi R.H., Mozurkewich E.L.: How to diagnose preterm labor: a clinical dilemma. Clin. Obstet. Gynecol., 2000:43, [29] Chez R.A.: Zapobieganie przedwczesnemu porodowi: wprowadzenie do praktyki klinicznej trzech nowych metod diagnostycznych. Medycyna po Dyplomie, 2000, [30] Tadeusiak W., Dynowski K.: Przydatność oznaczania estradiolu w ślinie w monitorowaniu stanu hormonalnego. Pol. Merkuriusz Lek., 2004:17, 99, [31] Saliva Diagnostics. [32] Marchetti P., Grossi C., Giannarelli R., Masoni A., Cristofani R., Giannecchini M.: Salivary immunoreactive insulin: a new entry in clinical chemistry? Clin. Chem., 1988:34, [33] Costigan D.C., Guyda H.J., Posner B.I.: Free insulin-like growth factor I (IGF-I) and IGF-II in human saliva. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1988:66, [34] Weihong Yan et al.: Systematic comparison of human saliva and plasma proteomes. Proteomics Clin. Appl., 2009:3,