Analiza i rozpoznawanie promotorów minimalnych

Transkrypt

1 Kompozycja i konserwacja motywów dla pojedyńczych i alternatywnych miejsc startu transkrypcji w genomach Drosophilia MIMUW 28 października 2010

2 Referowana praca Wstęp Pojęcia Motywy Motif composition, conservation and condition-specificity of single and alternative transcription start sites in the Drosophila genome Elizabeth A Rach, Hsiang-Yu Yuan, William H Majoros, Pavel Tomancak and Uwe Ohler Genome Biology 2009, 10:R73

3 Definicje Wstęp Pojęcia Motywy Transkrypcja - proces w którym enzym polimeraza dokonuje przepisywania fragmentu DNA na pre-mrna dojrzałe mrna - mrna z usuniętymi intronami(niekodujacymi fragmentami) oraz posiadajace 5 czapeczkę, zabezpieczajac a przed degradacja. TSS (Transcription Start Site) - miejsce w sekwencji DNA od którego zaczyna się transkrypcja.

4 Definicje Wstęp Pojęcia Motywy Promotor - odcinek DNA, położony zazwyczaj powyżej sekwencji kodujacej genu, który zawiera sekwencje rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne, które wiaż ac się z DNA umożliwiaja zwiazanie się polimerazy RNA z nicia DNA i rozpoczęcie transkrypcji. Można wyróżnić promotor minimalny, promotor bliższy oraz promotor dalszy. Promotor rdzeniowy, Promotor minimalny (core promoter) - fragment sekwencji DNA znajdujacy się najbliżej TSS (zwykle do ± 100bp)

5 Transkrypcja Wstęp Pojęcia Motywy ucbzwdr/teaching/b250-99/enhancers.htm

6 Dojrzałe mrna Wstęp Pojęcia Motywy

7 Definicje Wstęp Pojęcia Motywy biblioteka cdna - kombinacja sklonowanych fragmentów cdna (komplementarnego DNA) wstawionych np. do plazmidów, które razem tworza transkryptom badanego organizmu. cdna jest produkowane z mrna macierzystego organizmu i z tego powodu zawiera jedynie geny podlegajace ekspresji EST (Expressed Sequence Tag) - krótka sekwencja transkrybowanego fragmentu cdna. Może być używana do identyfikacji transkryptu genu

8 Definicje Wstęp Pojęcia Motywy CAGE (Cap Analysis Gene Expression) - technika używana do znajdowania końca 5 populacji mrna. Małe fragmenty (zwykle bp długości ) z poczatku mrnas (5 końca dla transkryptów 5 ) sa wyciagane, i przypisywane na DNA, wzmacniane przy pomocy PCR i sekwencjonowane.

9 Definicje Wstęp Pojęcia Motywy Motyw - pewien charakterystyczny wzorzec który może być częścia składowa rdzenia promotora, w ogólności może pojawiać się w innych obszarach (np motywy cis-regulatorowe). Najbardziej znane motywy: TATA (TATA box) - rozpoznawany przez TBP (TATA-box binding protein) będacy składnikiem TFIID Inr (Initiator) - otaczajacy miejsce inicjacji transkrypcji, rozpoznawany przez TAF wchodzace w skład TFIID DPE (Downstream Promoter Element) - rozpoznawana przez TAF MTE (Motif Ten Element)

10 Position-specific scoring matrix Wstęp Pojęcia Motywy A C G T

11 Przykładowe motywy Wstęp Pojęcia Motywy Motyw PSSM(graficznie) Konsensus DRE TATA INR DPE WATCGATW STATAWAAR TCAGTYKNNNTYNR CRWMGCGWKCGGTTS

12 Hierarchiczne klastrowanie EST Entropia Hierarchiczne klastrowanie EST, 1)-3)

13 Hierarchiczne klastrowanie EST Entropia Hierarchiczne klastrowanie EST, 4)-6)

14 Entropia Hierarchiczne klastrowanie EST Entropia Entropia dla rozkładu dyskretnego S o prawdopodobieństwach p i wynosi: H(S) = p i log 2 p i (1) i Dla każdego (pod)klastra tss możemy policzyć Q i,tss dla rozkładu S tss z prawdopodobieństwami P(i tss), gdzie i to pewien warunek: Q i,tss = H(S tss ) log 2 P(i tss) (2)

15 Źródła EST Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków W celu odnalezienia TSS użyto EST dostępnych jako adnotacje w Berkeley Drosophilia Genome Collection w wersji EST zostały podzielone na grupy ze względu na czas i miejsce ekspresji zarodkowe (embryo) larwalne/poczwarkowe (larva/pupa) głowa (head) zalażnia(ovary) jadra(testes) Schneider cells mbn2 hemocytic cells ciałko tłuszczowe (fat body) inne(diverse) dorosły osobnik = głowa, zalażnia, jadra, mbn2, ciałko tłuszczowe

16 Źródła EST Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków

17 EST -> TSS Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Zastosowano wstępne filtowanie, usuwanie tagów które: nie pokrywaja żadnej przerwy intronowej (usuwanie niedojrzałych EST) były dłuższe niż 1500bp i posiadajacych przerwy intronowe długości > 100bp (usuwanie tagów błędnie zmapowanych na genom ) miały wiele miejsc uliniowień (aby mieć precyzyjne lokacje) na najbardziej 5 miejscu były odległe o 2bp od pewnego eksonu lub transpozonu z adnotacji BDGC 4.3 Zastosowano hierarchiczne klastrowanie na przefiltrowanych transkryptach

18 TSS Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Zidentyfikowano TSS dla genów. Podzielenie promotorów otaczajacych TSS na Peaked - dla genów z jednym TSS (69%) Broad - dla genów z wieloma alternatywnymi TSS (31%) Minimalny dystans między alternatywnymi TSS: 20bp Maksymalna ilość alternatywnych TSS: 7 dla genów Rtnl1 quick-to-court, CycG TSS zostały porównane z istniejacymi adnotacjami z EPD (Eukariotic Promoter Database) i FlyBase. Porównanie z każda z baz wykazało ich niekompletność.

19 TSS a dane z EPD i FlyBase (tramtrack) Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków

20 Użyte motywy Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Do wyszukiwania motywów został użyty PATSER na fragmencie promotora [-60,40] wzgledem TSS na nici + Użyto 8 motywów: TATA, INR, DPE, MTE, Ohler1, DRE, Ohler 6, Ohler 7

21 Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Występowanie motywów dla różnych typów promotorów

22 Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Występowanie grup motywów dla różnych typów promotorów

23 Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Konserwacja motywów dla różnych genomów

24 TSS i skojarzenia Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków TSS ze specyficznymi skojarzeniami - 0 Q i,tss < 1 TSS ze wspieranymi skojarzeniam - 1 Q i,tss < 10 TSS z mieszanymi skojarzeniami - 10 Q i,tss 35% (1 997) TSS ze specyficznymi skojarzeniami 29% (1 612) TSS ze wspieranymi skojarzeniam 14% TSS z dwoma wspieranymi skojarzeniami 22%(1 275) TSS z mieszanymi skojarzeniami

25 TSS ze specyficznymi skojarzeniami Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków

26 Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Wykorzystanie motywów dla dla różnych etapów rozwoju

27 Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Wykorzystanie grup motywów dla różnych etapów rozwoju

28 Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Wykorzystanie TSS podczas rozwoju zarodkowego

29 Rozpoznawanie alternatywnych TSS Występowanie i konserwacja motywów promotorowych Wykorzystanie promotorów w zależności od warunków Wykorzystanie TSS podczas rozwoju zarodkowego

30 Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Klasyfikacja na podstawie motywów Skoro obserwujemy różne użycie motywów w różnych rodzajach genów, może istnieje zestaw motywów, które pozwolilyby przewidzieć dla każdego promotora, w jaki sposób bedzie on używany?

31 Ogólny problem klasyfikacji Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Mamy zbiór obiektów U oraz skończony zbiór atrybutów A = {a 1,a 2,...,a r },a j : U V aj V aj = R - atrybut numeryczny V aj = {c j 1,...,cj m j } - atrybut symboliczny Ponadto istnieje atrybut decyzyjny dec : U D,D = {d 1,d 2,...,d k } Szczególnym przypadkiem jest D = 2 (klasyfikacja binarna) Możemy więc o każdym obiekcie o U myśleć jako o krotce (wierszu tabeli obiektów z U) (a 1 (o),a 2 (o),...,a r (o),dec(o)) (3)

32 Przykładowe dane Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia

33 Ogólny problem klasyfikacji Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Weźmy skończony pozbiór V U. Chcemy na podstawie atrybutów warunkowych dla zbioru V wyznaczyć klasyfikator, tj funkcję h : U D taka że: h(o) = dec(o) dla każdego o V (4) Ponadto chcemy, żeby równość (4) zachodziła dla jak największej ilości o U\V V nazywane jest zbiorem treningowym Pewne W U\V nazywane jest zbiorem testowym

34 Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Miary jakości dla klasyfikacji binarnej Predykcja Dane Prawda Fałsz Prawda TP FP Fałsz FN TN

35 Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Miary jakości dla klasyfikacji binarnej Czułość (True Positive Rate) TPR = TP TP + FN (5) Swoistość (True Negative Rate) TNR = TN FP + TN (6)

36 Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Miary jakości dla klasyfikacji binarnej Dokładność (ACCuracy) TN + TP ACC = TP + FN + FP + TN (7) Matthews Correlation Coefficient MCC = TN TP FP FN (TP + FP)(TP + FN)(TN + FP)(TN + FN) (8)

37 klasyfikacji Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Drzewa decyzyjne Lasy losowe (Random forests) - metoda ensemble, wykorzystujaca zbiory drzew decyzyjnych. Zbiory przybliżone (Rough sets) - generowanie zbioru reguł Sieci Bayesowskie (Bayesian networks) - wyznaczanie zależności między atrybutami Maszyny wektorów podpierajacych (Support vector machines) Sieci neuronowe (Neural networks)

38 Użyteczne narzędzia Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia k-fold cross validation - podział danych na k rozłacznych podzbiorów, k 1 podzbiorów - zbiór treningowy pozostały zbiór - zbiór testowy Bootstrapping - losowanie ze zwracaniem z istniejacego zbioru danych. Uzyskujemy w ten sposób zbiór treningowy, zbiór testowy to pozostałe obiekty.

39 Użyteczne narzędzia Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Boosting - konstrukcja silnego klasyfikatora binarnego z wykorzystaniem słabych klasyfikatorów binarnych h t : U { 1,1} (odpowiednie dobieranie współczynników α t 0): h(o) = sgn( α t h t (o)) (9) t Konkretne algorytmy: ADABoost LPBoost

40 Drzewa decyzyjne Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia S v Gain(S,a) = H(S) v V a S H(S v) (10)

41 Lasy losowe Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia 1 Wybierz t - liczbę drzew 2 Wybierz m << A gdzie A to zbiór atrybutów 3 Zbuduj t drzew, dla każdego drzewa: 1 wygeneruj próbę bootstrap wykonujac V losowań ze zwracaniem z V (zbioru treningowego) 2 przy tworzeniu każdego wierzchołka drzewa weź m atrybutów wylosowanych z A i znajdź najlepsze cięcie. 4 Klasyfikuj poprzez przeprowadzenie głosowania wśród wszystkich drzew. em jest głos większości.

42 Ukryte Modele Markowa Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Dany zbiór stanów S i prawdopodobieństw przejść między nimi jako macierz stochastyczna M = (p i,j ) i,j S p i,j = 1 i S (11) j S oraz prawdopodobieństwa e i (x) wyemitowania symbolu x Σ w stanie i S e i (x) = 1 i S (12) x Σ Znamy ciag symboli które zostały wyemitowane, ale nie wiemy w jaki sposób zmieniały się stany (sa one niejako ukryte) Algorytm Viterbiego - wyznaczanie najbardziej prawdopodobnego ciagu stanów który wyemitował sekwencje Algorytm Bauma-Welcha - wyznaczanie paramterów p i,j i e i (x).

43 Ukryte Modele Markowa Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia

44 McPromoter Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia generegulation/mcpromoter/ Praca: Ohler U, Liao GC, Niemann H, Rubin GM Computational analysis of core promoters in the Drosophila genome. Genome Biol 2002, 3:RESEARCH0087 ogólniony ukryty model Markowa Zbiór TSS (do trenowania/testów) wyodrębniono przy pomocy klastrowania EST Dla regionu Adh: dla progu 0.98 uzyskano TPR=19.5% TNR=69.2% dla progu 0.8 uzyskano TPR=65.2% TNR=29.3%

45 NNPP Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Praca: Reese MG Application of a time-delay neural network to the annotation of the Drosophila melanogaster genome. Comput Chem 2001, 26: sieć neuronowa z opóźnionym wejściem

46 Zarys Pracy Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Stworzenie zestawów danych Ustalenie atrybutów warunkowych Wyznaczenie wartości atrybutów warunkowych Implementacja metod klasyfikacji i/lub użycie gotowych narzędzi W przypadku dużej ilości atrybutów warunkowych, wyznaczenie które sa tak naprawde istotne Porównanie wydajności klasyfikatorów

47 Stworzenie zestawów danych Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Dla roznych eksperymentalnych zbiorow danych generujemy zestawy znanych promotorow wraz z atrybutami decyzyjnymi insitu.fruitfly.org genow opisanych wg ekspresji zarodkowej (np. maternal vs. zygotic) dane o aktywności promotorów (modencode.org, odczyty H3K4me3) - dokładna aktywność promotorów w czasie Dla kazdego promotora, wyciagamy sekwencje z genomu (-n,+k nukleotydow)

48 Ustalenie atrybutów warunkowych Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Zliczamy wystapienia: motywów promotorowych motywów czynników transkrypcyjnych z bazy JASPAR (jaspar.genereg.net) motywów nadreprezentowanych w sekwencjach promotorowych nowych przy pomocy narzedzi typu MEME lub weeder. Liczymy dla każdej pozycji, dla każdego badanego motywu hit (PSSM) Liczymy dla każdej pozycji, dla każdego badanego motywu czy jest wystapienie (konsensus) Znajdujemy pozycje pierwszego wystapienia dla każdego motywu Robimy wszystko tak samo z pewnymi podsłowami tak jak robiliśmy z motywami

49 Klasyfikacja Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Przetestowanie znanych metod klasyfikacji dla różnych zadań: odróżnianie promotorow od nie-promotorow odróżnianie promotorow genow zarodkowych/macierzystych (in-situ) odróżnianie promotorow aktywnych/nieaktywnych w zarodkach (modencode) Jako pierwsza zostanie użyta metoda lasów losowych, w drugiej kolejności sieci Bayesowskie

50 Wstęp do klasyfikacji Inne podejścia Co jest do zrobienia Wyznaczenie istotnych atrybutów warunkowych Las losowy -> szukanie dobrych drzew Sieć Bayesowska -> zmienne (wierzchołki) które maja duży wpływ na ostateczny wynik Reguły -> redukty