ĆWICZENIE Nr 2 OBSERWACJE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM WYBRANYCH KOMÓREK, ORGANELLI KOMÓRKOWYCH ORAZ ZJAWISKA PLAZMOLIZY I DEPLAZMOLIZY

Transkrypt

1 ĆWICZEIE r 2 OBSERWACJE W MIKROSKOPIE ŚWIETLYM WYBRAYCH KOMÓREK, ORGAELLI KOMÓRKOWYCH ORAZ ZJAWISKA PLAZMOLIZY I DEPLAZMOLIZY Wynalezienie w XVII wieku mikroskopu świetlnego umożliwiło obserwację tkanek i komórek, zarówno zwierzęcych jak i roślinnych. Dzięki niemu można zauważyć, że tkanka jest podzielona na tysiące komórek, których przeciętna średnica wynosi 5-20 µm. Znacznie trudniej ujrzeć wewnętrzną strukturę komórki, nie tylko, dlatego, że jej części są bardzo małe, ale też dlatego, że są one w większości przeźroczyste i z zasady bezbarwne. Obserwację struktur komórkowych umożliwiają techniki barwienia, dzięki którym różnym składnikom komórki nadaje się odmienne kolory. Do barwników struktur komórkowych wykorzystywanych w biologii komórki należą: błękit metylenowy, eozyna, Sudan III, zieleń Janusowa, czy też hemotaksylina. I. BARWIEIE KOMÓREK EPIDERMY CEBULI (ŁAC. ALLIUM CEPA) ZA PO- MOCĄ BŁĘKITU METYLEOWEGO Do barwienia komórek często stosuje się barwniki zasadowe wykorzystując ich powinowactwo do składników komórek, które posiadają odczyn kwaśny. Przykładem jest błękit metylenowy - kationowy barwnik, którego dodatnio naładowane jony łączą się z ujemnie naładowanymi strukturami komórek, nadając im niebieski kolor. Reakcji barwnej z błękitem metylenowym ulegają struktury wykazujące odczyn kwaśny, w tym chromatyna jądrowa (obecność DA) czy rejony cytoplazmy bogate w rybosomy (obecność RA), Tkanka epidermalna (spotykana z reguły w postaci pojedynczej warstwy komórek), okrywa łodygę, liście i korzenie. Właściwe komórki epidermalne są żywe, mało wyspecjalizowane i ściśle przylegają do siebie tworząc zwarty układ pozbawiony przestworów komórkowych. Komórki te posiadają grubą pierwotną ścianę komórkową i są silnie zwakuolizowane. Tkanka epidermalna pochodząca z dorosłych łusek cebuli (Ryc. 1) jest niezwykle korzystnym materiałem do badań mikroskopowych i może być pobrana bez poważniejszego uszkodzenia komórek żywych łuski cebuli. Ryc. 1. Preparat ze skórki wewnętrznej cebuli wybarwiony błękitem metylenowym ( 1

2 WYKOAIE: 1. Pokroić cebulę skalpelem na ćwiartki. Wyjąć z jednej ćwiartki łuskę i naciąć żyletką jej powierzchnię (od wklęsłej strony łuski) formując kwadraty o boku około 3mm. 2. a dwóch szkiełkach podstawowych umieścić po kropli wody destylowanej. Za pomocą pęsety zdjąć dwa uformowane kwadraty skórki i ostrożnie przenieść na szkiełka podstawowe. 3. Jeden preparat przykryć szkiełkiem nakrywkowym obserwować wakuole, jądro i jąderko. 4. Do drugiego preparatu dodać kroplę 0.2% roztworu błękitu metylenowego. 5. Poczekać, aż materiał dokładnie wyschnie na powietrzu. 6. Ponownie zalać szkiełko barwnikiem i barwić przez 3 min. 7. Spłukać szkiełko używając wody destylowanej, osuszyć bibułą i nałożyć szkiełko nakrywkowe. 8. Obserwować uzyskany preparat pod mikroskopem z obiektywem immersyjnym pod dużym powiększeniem (100x). 9. Wykonać rysunki wraz z opisem widocznych struktur komórkowych. II. BARWIEIE MITOCHODRIUM ZA POMOCĄ ZIELEI JAUSA Mitochondria to organelle obecne zasadniczo we wszystkich komórkach eukariotycznych (wyjątek stanowią niektóre ameby patogenne oraz erytrocyty). Poza ich dominującą funkcją wytwarzania dwóch form energii: protonowej siły motorycznej oraz ATP, pełnią wiele innych funkcji metabolicznych. Po zastosowaniu specjalnych barwień (np. hematoksyliną żelazistą lub przyżyciowo zielenią Janusową ryc. 2) mitochondria można dostrzec pod mikroskopem optycznym w postaci cytoplazmatycznych ziarenek lub niteczek o średnicy 0.5 µm i długości 2-5 µm. Mitochondria w wyniku barwienia uzyskują kolor niebieski - barwna reakcja wywołana jest obecnością w mitochondriach oksydazy cytochromowej, która utrzymuje barwnik w obrębie mitochondrium w postaci utlenionej (barwnej), podczas gdy w cytoplazmie zieleń Janusowa zostaje zredukowana do formy bezbarwnej. Reakcja barwna jest więc zależna od tlenu, mitochondria zostają odbarwione w momencie, gdy zostanie usunięty ze środowiska tlen. Ryc. 2. Struktura chemiczna barwnika zieleń Janusa. WYKOAIE: 1. Przygotować niewielki fragment wewnętrznej skórki łuski cebuli patrz ćw. I. 2. a czyste szkiełko podstawowe nanieść dwie krople 0.1% roztworu zieleni Janusowej. 3. Umieścić w roztworze przygotowany fragment skórki cebuli. 4. Barwić około 0.5 godziny, przewietrzając roztwór kilka razy za pomocą pipety. 5. anieść na preparat świeżą kroplę 0.1% roztworu zieleni Janusowej i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. 6. atychmiast oglądać preparat przy powiększeniu 40x zabarwienie mitochondriów znika po krótkim czasie. 7. Wykonać rysunki wraz z opisem widocznych struktur komórkowych. 2

3 III. BARWIEIE KOMÓREK TŁUSZCZOWYCH ZA POMOCĄ SUDA III Sudan III (Ryc. 3) jest nierozpuszczalnym w wodzie, ale rozpuszczalnym w tłuszczach, diazowym barwnikiem o kolorze czerwonym, wykazującym duże powinowactwo do lipidów. Dlatego też jest wykorzystywany do ich wykrywania. HO Ryc. 3. Struktura chemiczna barwnika Sudan III. Komórki tłuszczowe (Ryc. 4) są odpowiedzialne za wytwarzanie i magazynowanie tłuszczu. W tych komórkach, zwanych adipocytami jądro i cytoplazma są spłaszczone, a większą część komórki zajmuje kropla tłuszczu. Ryc. 4. Adipocyty (komórki tłuszczowe) wybarwione Sudanem III ( WYKOAIE: 1. Za pomocą skalpela lub żyletki przygotować cienkie skrawki nasion z dyni. 2. a czyste szkiełko podstawowe ze skrawkami dyni nanieść przygotowany roztwór Sudanu III. 3. Barwione skrawki dyni ogrzewać lekko nad palnikiem przez około 3 minuty. 4. Przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem krople tłuszczu. 5. Wykonać rysunki wraz z opisem widocznych struktur komórkowych. IV. OBSERWACJA IEBARWIOYCH PREPARATÓW KOMÓREK MIĘKISZO- WYCH KOMÓRKI MIĘKISZOWE Komórki miękiszowe parenchymatyczne (Ryc. 5) występują we wszystkich rodzajach tkanek roślinnych. Są to komórki żywe, które otacza cienka pierwotna ściana komórkowa. Do funkcji komórek parenchymatycznych należą: a. dostarczanie nowych komórek niezbędnych do wzrostu rośliny (komórki merystemów wierzchołkowych i bocznych) oraz w procesach regeneracji, b. synteza substancji pokarmowych i ich magazynowanie (komórki mezofilu), c. stanowią główny składnik większości owoców i warzyw (komórki miękiszu spichrzowego). 3

4 PLASTYDY Plastydy są organellami występującymi u wszystkich żyjących komórek roślinnych. Plastydy zawierają własny DA i są oddzielone od cytoplazmy podwójną błoną komórkową. Wszystkie plastydy rozwijają się z proplastydów, które są relatywnie małymi organellami obecnymi w niedojrzałych komórkach merystematycznych. Proplastydy rozwijają się zgodnie z wymaganiami każdej różnicującej się komórki, co jest w większej mierze determinowane przez DA jądrowe. Rodzaje plastydów: etioplasty, leukoplasty, chloroplasty oraz chromoplasty. Ryc. 5. Komórki parenchymatyczne (Alberts B Molecular Biology of the Cell). a. CHLOROPLASTY Chloroplasty to organelle, występujące tylko w komórkach roślinnych (Ryc. 6). Zawierają barwnik chlorofil, umożliwia przeprowadzanie fotosyntezy. azwa chloroplast pochodzi od greckiego słowa chloros zielony oraz plast kształt, forma. Ryc. 6. Tkanki owocu wiśni: zielonego zawierającego chloroplasty (po lewej) oraz dojrzałego zawierającego chromoplasty (po prawej). (Clayton M.W. Composite of the tissue of ripe and green Jerusalem cherry fruit showing chloroplasts and chromoplasts). WYKOAIE: 1. Przygotować skrawek z przekroju poprzecznego liścia aloesu. 2. a szkiełku podstawowym umieścić kroplę wody destylowanej. Przygotowany preparat liścia aloesu umieścić w kropli wody. 3. Przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem jako tzw. preparat bezpośredni (powiększenie 40x oraz 100x). 4. Obserwować typowe komórki miękiszowe oraz znajdujące się w nich chloroplasty. 5. Wykonać rysunki wraz z opisem widocznych struktur komórkowych. 4

5 b. CHROMOPLASTY Chromoplasty są plastydami odpowiedzialnymi za syntezę i magazynowanie barwników karotenoidowych. adają barwę kwiatom, owocom i niekiedy korzeniom (np. marchwi), ale nie biorą udziału w fotosyntezie. WYKOAIE: 1. a dwa szkiełka podstawowe nanieść po kropli wody destylowanej. 2. Za pomocą skalpela zeskrobać cienkie skrawki z korzenia marchwi, przenieść je do kropli wody na jedno z przygotowanych szkiełek podstawowych. 3. Wykonać rozmaz z komórek miękiszowych pomidora na drugim z przygotowanych szkiełek podstawowych. 4. Przykryć preparaty szkiełkami nakrywkowymi. 5. Obserwować chromoplasty pod mikroskopem przy powiększeniu 40x. 6. Wykonać rysunki wraz z opisem widocznych struktur komórkowych. V. OBSERWACJA ZJAWISKA PLAZMOLIZY I DEPLAZMOLIZY Plazmoliza to zjawisko polegające na kurczeniu się protoplastu i jego odstawaniu od ścian komórkowych, wskutek umieszczenia komórki w roztworze hipertonicznym. Cytoplazma w kilku miejscach odrywa się dużymi fałdami od ściany komórkowej, zmniejsza się powierzchnia i objętość wakuoli, cytoplazma gęstnieje, nie widać jądra komórkowego, cytoplazma pozostaje połączona ze ścianą tylko za pomocą cienkich nici plazmatycznych. Ciśnienie osmotyczne (potencjał osmotyczny) różnica ciśnień wywieranych na półprzepuszczalną membranę/błonę przez dwie ciecze, które ta membrana rozdziela. Przyczyną pojawienia się ciśnienia osmotycznego jest różnica stężeń związków chemicznych lub jonów w roztworach po obu stronach membrany i dążenie układu do ich wyrównania. Roztwory izotoniczne roztwory o jednakowym potencjale osmotycznym. Roztwór hipertoniczny roztwór mający wyższy potencjał osmotyczny. Roztwór hipotoniczny roztwór mający niższy potencjał osmotyczny. Wyróżniamy 4 rodzaje plazmolizy: kątowa początkowe stadium plazmolizy; protoplast odstaje od ściany komórkowej jedynie w narożach komórki. wklęsła skurczony protoplast ma wyraźne wklęśnięcia. wypukła (graniczna) skurczony protoplast odstaje od ściany komórkowej w postaci uwypuklonej. Deplazmoliza proces odwrotny do plazmolizy, polegający na pobieraniu wody przez komórkę zanurzoną w roztworze hipotonicznym lub izotonicznym. Dochodzi do stopniowego rozkurczania się protoplastu i jego powrotu do normalnych kształtów. Deplazmoliza zachodzi tylko, jeżeli nie zostało uszkodzone są białka protoplastu. 5

6 WYKOAIE: a. Przygotowanie preparatu z cebuli do plazmolizy: 1. Odciąć cienką warstwę komórek skórki cebuli. 2. Umieścić skrawek w 10% roztworze acl na szkiełku podstawowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. 3. Obserwować kolejne stadia plazmolizy przy powiększeniu 40x. 4. Wykonać rysunki wraz z opisem widocznych rodzajów plazmolizy. b. Przygotowanie preparatu do deplazmolizy: 1. Ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe z preparatu poddanego plazmolizie. 2. Umieścić preparat na nowym szkiełku podstawowym w roztworze hipotonicznym lub izotonicznym. 3. Obserwować zjawisko deplazmolizy, powrotu cytoplazmy do normalnych kształtów. przy powiększeniu 40x. 4. Wykonać rysunki wraz z opisem widocznych struktur komórkowych. ODCZYIKI: - 10% acl, - barwniki: błękit metylenowy (0.2% roztwór wodny), Sudan III, zieleń Janusa B (0.1% roztwór wodny), - olejek immersyjny, - etanol, - liść aloesu, nasiona dyni, marchew, cebula, pomidor. LITERATURA: Alberts B Podstawy biologii komórki. Kawiak J., Mirecka J., Olszewska M., Warchoła J Podstawy cytofizjologii. Kurczyńska E.U., Borkowska-Wykręt D Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej. 6