płodności. W pokoleniu F2 mieszańca między linią CMS-19T (z cytoplazmą T. timopheevi) a linią Stan I obserwowano przewagę roślin całkowicie lub

Transkrypt

1 WYNIKI z realizacji zadania na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w 16 roku Genetyczne podłoże męskiej sterylności pszenżyta z różnymi cytoplazmami oraz możliwość wykorzystania badanych cytoplazm do tworzenia systemów CMS u pszenicy Temat badawczy 1 Wytworzenie populacji mapujących i mapowanie porównawcze genów kontrolujących męską płodność w różnych cytoplazmach sterylizujących pszenżyta. Cel zadania badawczego: Ocena fenotypowa męskiej płodności/sterylności w obrębie trzech mieszańców pszenżyta z cytoplamami T. timopheevi i CMS-Pampa, skonstruowanie dla jednej z nich mapy sprzężeń i określenie na niej przypuszczalnych rejonów zawierających geny kontrolujące przywracanie płodności u pszenżyta oraz wytworzenie populacji mapującej do planowanego mapowania porównawczego restorerów skutecznych w cytoplazmie Ae. sharonensis. cel zrealizowany Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Materiałem badawczym ocenianym fenotypowo w 16 roku były rośliny mieszańców F2 otrzymanych w wyniku zapylenia męskosterylnej linii L19 występującej w dwóch wersjach cytoplazmatycznych: z cytoplazmą T. timopheevi i cytoplazmą Pampa (z żyta uprawnego), pyłkiem trzech linii pszenżyta: Bolero 14/1, Stan I i Krakowiak. Ocena fenotypowa męskiej płodności została wykonana na około 9 osobnikach każdej kombinacji mieszańcowej. Badania prowadzono na polu stacji doświadczalnej ZUT w Szczecinie. Rośliny na polu były wysadzane ręcznie w szerokiej rozstawie x cm. Do oceny wykorzystano dwie metody: wzrokową ocena pylenia roślin przy użyciu -stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral (2) oraz ocenę zawiązywania ziaren w kłosach pod izolatorami. Na początku strzelania w źdźbło pobrano i zamrożono w -7 stopniach C fragmenty liści z roślin badanych mieszańców w celu późniejszej izolacji DNA i wykonania analiz genetycznych. Spośród ocenionych trzech kombinacji krzyżowania (z których każda występowała w dwóch wersjach cytoplazmatycznych) do analiz DNA wybrano jedną. Podstawą wyboru były m.in. zgodne wyniki obu metod oceny fenotypowej. Po wyizolowaniu DNA osobniki wybranej populacji mapującej poddane zostały analizom DArTseq - wysoko-przepustowej techniki genotypowania oferowanej przez firmę Diversity Arrays Technology Pty. Technologia ta generuje dwie kategorie markerów molekularnych: Silico-DArT (markery dominujące) oraz SNP (markery kodominujące pozwalające na identyfikację heterozygot w populacjach mapujących). Konstruowanie grup sprzężeń wykonywano przy użyciu programu JoinMap 3. wykorzystującego algorytm Regression Mapping (RM). Grupowanie wykonywano w oparciu o funkcję LOD przy wartości krytycznej, a dystanse na mapach określano w centymorganach (cm) przy zastosowaniu funkcji Kosambi. Dodatkowo ocenie fentypowej pod kątem męskiej płodności poddano około linii bliskoizogenicznych w stosunku do męskosterylnej linii CMS-Salvo /1 oraz cztery mieszańce F2 między czterema męskosterylnymi liniami pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi (CMS-T), Ae. Sharonensis (CMS-A), Ae. Ventricosa (CMS-V) i CMS-Pampa (CMS-P) zapylonych wspólnym restorerem DAD182/. Wyniki tej wstępnej oceny przeprowadzono na około osobnikach w celu określenia przydatności w/w mieszańców do mapowania genów restorerowych działających w różnych cytoplazmach sterylizujących pszenżyta (pozytywny wynik oceny skutkował decyzją o założenia w dwóch miejscowościach doświadczenia polowego z populacjami mapującymi przeznaczonymi do mapowania porównawczego). Wyniki (opisać) Wszystkie trzy kombinacje mieszańców międzyliniowych występujące w dwóch wersjach cytoplazmatycznych (z cytoplazmą T. timopheevi i CMS-Pampa), które oceniano w warunkach polowych charakteryzowały się obecnością roślin o zróżnicowanym poziomie męskiej 1

2 płodności. W pokoleniu F2 mieszańca między linią CMS-19T (z cytoplazmą T. timopheevi) a linią Stan I obserwowano przewagę roślin całkowicie lub prawie całkowicie męskopłodnych (rys.1). Analogiczne genotypy w cytoplazmie Pampa dzieliły się w miarę równomiernie pomiędzy kategorie form męskosterylnych i męskopłodnych.. 2

3 CMS-19T x Stan I CMS-19P x Stan I Rys.1 Rozkład fenotypowy męskiej płodności (wg -stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral 2) w populacjach mapujących mieszańców F2 otrzymanych po skrzyżowaniu męskosterylnych wersji linii CMS-19 z linią Stan I 3

4 CMS-19T x Krakowiak CMS-19P x Krakowiak Rys.2 Rozkład fenotypowy męskiej płodności (wg -stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral 2) w populacjach mapujących mieszańców F2 otrzymanych po skrzyżowaniu męskosterylnych wersji linii CMS-19 z linią Krakowiak 4

5 CMS-19T x Bolero CMS-19P x Bolero Rys.3 Rozkład fenotypowy męskiej płodności (wg -stopniowej skali bonitacyjnej opracowanej przez Góral 2) w populacjach mapujących mieszańców F2 otrzymanych po skrzyżowaniu męskosterylnych wersji linii CMS-19 z linią Bolero 14/1

6 Linia Krakowiak w sposób bardzo skuteczny przywracała płodność w mieszańcach z cytoplazmą T. timopheevi, ale przy obecności cytoplazmy Pampa okazała się być mało efektywnym restorerem (rys.2). Linia Bolero 14/1 w sposób porównywalny przywracała męską płodność w obu badanych cytoplazmach (rys.3). Jednocześnie u mieszańców z udziałem tej linii ojcowskiej rozkłady fenotypowe w pokoleniu F2 były najbardziej zbliżone do rozkładu normalnego. Taki rozkład jest metodycznie pożądany przy próbach zastosowania metody mapowania w przedziałach (ang. Interval Mapping IM) do lokalizowania genów odpowiedzialnych za dziedziczenie cech o złożonym podłożu genetycznym. Wyniki oceny wzrokowej były u mieszańców między CMS-19 a linią Bolero 14/1 wysoce istotnie skorelowane (wartości wsp. korelacji powyżej,7) z rezultatami oceny zawiązywania ziaren pod izolatorami (tab.1). Ta kombinacja krzyżowania została wybrana do analiz przy użyciu technologii DArTseq. Genotypowaniem objęto po 9 roślin mieszańca między linią CMS-19 a Bolero z cytoplazmą T. timopheevi i Pampa (łącznie 18 genotypów) oraz linie rodzicielskie. Tabela 1 Współczynniki korelacji pomiędzy wynikami oceny męskiej płodności opartymi o obserwacje wzrokowe pylenia i zawiązywanie ziaren pod izolatorami. Mieszaniec F2 Wsp. korelacji CMS-19T x Stan I,633 CMS-19P x Stan I,887 CMS-19T x Krakowiak,92 CMS-19P x Krakowiak,861 CMS-19T x Bolero,739 CMS-19P x Bolero,783 Do tworzenia grup sprzężeń w obrębie mieszańca [CMS-19T x Bolero]F2 użyto kodominujących markerów SNP, których w wyniku analizy techniką DArTseq otrzymano łącznie 967. Spośród nich do mapowania wybrano 2148 markerów, które różnicowały linie rodzicielskie CMS-19T i Bolero 14/1. W wyniku grupowania przy poziomie LOD= powstało 12 większych grup sprzężeń liczących co najmniej markerów oraz kilkadziesiąt drobnych grup liczących przeważnie po kilka-kilkanaście markerów. Większe grupy stanowiące znaczące fragmenty chromosomów pszenżyta wykorzystano do analizy Regression Mapping w celu skonstruowania map genetycznych. Finalnie w obrębie utworzonych map znalazło się łącznie 1269 markerów (tab.2). Największą liczbę markerów zawierały grupy sprzężeń 1, 3 i 4 (każda około 18 markerów), ale największą długość miała mapa grupy sprzężeń (prawie 1cM) licząca zaledwie 67 markerów i charakteryzująca się w związku z tym stosunkowo małą gęstością (rys.4) Tabela 2 Charakterystyka grup sprzężeń utworzonych w obrębie populacji mapującej [CMS-19T x Bolero]F2 Grupa sprzężeń Liczba markerów Długość mapy (cm) Przypuszczalny fragment chromosomu Brak danych B (6BL) B R Brak danych A Brak danych R (RL) R (7RL) B R (2RS) Brak danych Ogółem

7 _6:T>C _16:C>T 43784_19:T>C 43437_7:G>A _8:C>T 43747_6:T>C 3676_3:A>G 4737_38:A>G 83861_31:C>G _21:C>G _3:G>C _6:G>A 83811_3:T>C _23:T>C 43614_12:G>A 43798_34:T>C _14:A>T 1896_11:A>T 49793_6:G>C 2463_37:A>G 2146_17:G>A 2222_14:A>T _18:G>T 83793_2:A>G 37_2:A>G 48234_16:A>C 4848_9:A>G _8:A>G _31:A>C 1963_23:G>A _6:T>C 34127_34:C>T 16342_13:A>G _11:T>G _9:A>C 17241_:A>G 34814_8:A>G 36111_:T>C 36743_8:A>G 242_9:C>G 34484_12:C>G _19:G>A 3473_33:C>G 4638_22:C>T 99836_8:T>A 34391_19:T>C _11:G>A _24:G>T 34296_:A>G 3414_1:C>T 427_13:C>G 3474_29:C>T _:A>G _22:C>G 194_18:C>T _7:G>T 4786_11:G>C _4:A>G _4:G>A _16:G>C _18:T>A 46613_:G>T _8:G>C 83934_8:A>G 42781_36:C>A _19:A>C 42613_:A>G 34342_:A>G _:T>A _:A>G 3426_62:A>G 11726_24:A>C 43482_13:G>A 43443_23:G>A 427_11:G>A _31:C>A 36_6:G>C _:G>C _29:T>C _:G>C _27:C>A _7:A>G _2:A>G 36177_34:G>T 83873_12:T>C 1198_3:A>C 36174_:C>T _11:A>G _43:C>T 36933_26:T>C 4663_33:G>A _:A>G 47372_8:G>C _6:C>T 3443_62:A>C _13:T>C 873_38:A>G _9:C>G 191_13:C>G 36214_6:C>T 47_38:A>G 4324_13:A>G _22:A>G _31:T>C 87_8:T>G _23:C>G _32:G>A _6:T>A _22:C>G 34692_19:C>G _:G>A 99834_8:C>T 3444_49:T>A 18966_19:T>C 23227_:C>A _2:G>C 3473_41:C>T 48_32:G>C 3486_3:G>A 34182_2:C>G 36196_:C>G 34686_12:C>A 34233_:C>A _19:A>G _33:C>G _:A>G _7:A>G _4:C>G _14:A>T _38:A>G 34127_1:G>C _:C>G _38:T>C _:C>T _39:G>A 42121_6:C>G _13:C>T 8489_28:T>A 44931_:A>G _19:G>C _8:A>G _16:G>T 819_11:A>G 42181_34:A>G 83798_12:T>C 446_6:G>C 3673_41:T>C _37:T>G _44:T>C 426_6:C>T 43476_23:G>A 81118_9:T>C 19168_:C>T 36233_33:A>G 3473_49:A>C _17:A>G _2:T>C 41278_29:A>G _2:A>G _9:C>A 3474_29:A>G _:G>A 34697_4:C>A 8317_16:T>A 34697_17:T>G 3424_2:A>G _18:T>A 34788_26:C>G 42187_32:T>C 3474_14:A>G _19:A>G 2448_11:G>C 48_22:A>G 83717_17:C>T 43843_14:T>A 36644_:T>C 3478_42:C>A _4:T>C _3:A>C 1191_8:T>C _28:C>G 34713_24:A>G 3616_43:T>A 349_6:T>G _21:T>C 34769_3:A>G 34619_44:T>C _:T>C 11913_7:T>G _8:A>C 4343_27:C>T _36:C>T 36446_2:G>A _19:T>C 482_47:C>T _19:C>G 81246_:G>A _:A>C _:T>C 34831_11:G>A _:C>T 19333_6:A>G 4384_:C>A 34723_18:A>G _11:A>G _39:G>A 3639_22:T>C _18:C>A 348_2:A>G 4769_:C>T 44839_:A>G 42134_18:G>C 43667_16:T>C _16:T>C 42112_19:C>T 83827_8:C>T _27:C>G 34744_19:C>T _:A>G _44:A>G 421_42:T>C 34689_31:C>A _8:C>G 46831_44:T>C _12:A>G _37:C>T _23:G>T 34768_19:A>C 8473_:G>C 8396_17:C>G _6:T>C 8993_7:T>G 43476_3:A>G _13:G>C _:A>G _17:G>C _22:G>C _37:A>G 42933_27:A>G 34134_28:A>C _2:C>T _13:C>A 42779_18:A>C 4239_17:A>G 2394_12:A>G 81293_16:C>G _11:G>A 3487_31:C>G _7:G>A _11:T>C 4316_21:G>C 1472_:C>T 8197_16:G>A _:C>G _14:G>C 489_:G>C 48448_22:G>C _9:T>G _12:C>T 42212_26:T>G _4:C>T _:G>A _37:G>A _13:T>C _16:A>T 81279_22:A>G 461_:G>A 833_:A>C 49476_46:T>C _7:T>C _21:A>C _39:T>C 43698_:C>T _8:A>T 476_:T>A _:A>C _7:C>A 83837_22:C>T _47:G>A _34:A>G _11:C>G _2:C>A _12:T>G 43699_6:T>A 43432_31:G>A _8:C>G 46613_31:G>T _8:A>G 4936_23:T>C _17:T>C 3466_8:T>C 3464_2:C>G _44:A>T 364_3:A>G _39:C>G _27:T>C 8348_7:G>C _12:C>T 3626_28:G>T 42121_23:A>G _:T>C 43632_49:C>G 81262_12:C>T 36396_:A>G 42971_29:T>C 3682_8:A>G 26_18:T>C _:C>G _:C>T 19787_27:G>A 34133_2:T>C _23:T>A _14:G>C _39:G>A 4624_:C>T _14:A>G _26:T>C 4223_41:A>T _6:A>G _34:C>T 34718_6:A>G 426_44:T>C 3436_:A>G 44834_3:C>T _24:C>G _17:A>T 4367_18:G>T 3682_8:T>C _64:G>A _9:G>T _38:T>C 43729_26:T>C _13:A>G _23:C>T _18:G>A 83274_9:T>C _26:A>T 436_6:A>G _:T>C _17:G>A 36748_29:C>G _18:C>G 81293_23:T>C _7:T>C _17:C>T _14:A>C _9:T>C 36261_27:T>C _16:T>A 34797_39:T>A 43922_8:G>C 36448_7:C>G _31:A>C 81167_8:A>G _7:C>T 99813_23:A>G 83312_8:C>A 83896_19:T>C _26:C>G _27:A>G _2:C>T 34881_17:A>T 43479_9:A>T _8:C>G _18:C>T 34_66:A>G _26:T>G 81293_22:T>C 421_38:T>C 83617_14:T>G 2_6:A>G _37:C>G _28:G>C 34861_17:A>G _16:T>C 4637_24:T>C _21:G>A _38:G>C _:T>G _18:C>G 43319_12:C>T 4471_11:T>G _62:G>A 36924_:T>A _33:T>G 42614_26:A>G 234_38:T>C 3418_7:T>C 496_41:A>T 34369_17:A>G _27:A>C _38:A>G _68:A>C 428_9:T>A _8:C>G 4268_24:A>T _21:A>G _:G>C _11:G>A 4176_:C>G _38:G>C _:T>C 34384_:C>A _3:G>T _31:A>G _34:C>T 369_:A>G _13:T>G _18:C>T 83797_22:A>G 43443_16:G>C _:T>C 44178_14:G>C 364_12:C>A 43486_:G>A 362_7:C>G 479_:C>T 99831_19:C>T 44831_4:G>A 837_21:A>G _17:C>A 362_:G>A 3611_64:A>C _14:T>A _:T>C _32:T>C _9:G>C 34991_37:A>T _6:T>C _:T>G 8114_9:A>T 1666_16:T>C 427_9:A>G 34669_13:G>C _9:T>C 43643_9:C>G _8:T>G _9:G>A 3443_12:T>G _3:G>C 817_24:T>A 8332_38:A>G _11:G>A _24:T>G 43897_:T>C _48:T>C 829_:G>T 4612_14:A>G _:C>G _24:A>G 837_8:G>A 42679_3:G>A 3467_4:T>G _6:G>A 342_4:C>G 34739_36:A>G _62:A>G 43879_8:A>C _23:G>A _29:A>T 43841_18:T>A 437_32:G>C _8:G>A 42797_18:T>G 3617_6:T>C _41:T>C 83498_7:G>C _6:T>C 34643_2:A>G _2:C>G 43468_34:T>G 47867_63:T>C _11:A>G 443_17:G>A 4272_:C>G 4668_12:A>T 81227_2:T>C _13:A>G 47334_:A>G 34773_38:C>T 34771_9:T>C _7:A>G 434_11:A>G _19:T>A _:G>T 36292_33:C>G 3426_37:A>G 34824_8:A>G 34386_7:T>C 36484_3:A>C 34737_46:A>G _27:A>G _38:G>C 484_:A>C _33:T>C _27:G>C _49:A>C _11:G>A _38:G>A _11:T>C 433_16:T>G 841_:T>C _19:A>G _23:G>A 348_8:G>A _17:G>A 3423_22:G>A 34497_32:G>C 3477_68:G>C _24:T>C 3674_:A>G 48738_6:A>G _26:A>G 489_37:C>A 13_11:A>C 34849_2:C>T 4968_4:T>C 342_27:G>A _12:T>C 437_9:T>A 42186_11:G>A 46226_43:A>G _:T>A 83741_8:G>A _19:G>C 3687_13:A>G 8268_:G>A 124_7:T>A 34771_3:C>T _13:T>C _28:A>T 3674_36:C>G 4868_43:G>A 4293_21:C>T 8474_18:A>G _9:G>C _32:G>C 42_7:C>G _11:G>C _6:C>A 36184_41:T>G 34628_:C>G 36166_9:G>A 42967_32:T>C 42918_34:T>C _3:A>G _32:T>G 42393_9:A>C _2:G>A _7:C>A _:C>T _8:G>C 21167_22:A>T _:A>G _29:A>G _24:A>T _7:T>C _:T>C 838_9:T>C 43_:C>G 83339_2:T>C 346_48:C>T _14:A>G 347_16:A>G _8:C>T 42137_31:A>T _3:G>C _32:G>T _:T>G 344_26:A>G 19_14:T>C _:T>C 3478_22:T>C _8:C>G _33:A>G 122_:G>A 34814_26:C>G 3486_18:A>G 16661_8:G>T 4362_8:A>G 34791_7:C>T 2334_9:T>C 347_4:T>C 36421_4:C>G _41:C>A 3617_7:C>T _24:C>A 36493_19:T>C _21:C>G _14:A>G 4919_:C>A _6:C>T 43438_13:T>C _47:G>T 34344_:G>A _37:C>A _7:C>G _8:C>G _32:T>G 4783_18:T>A 3681_16:C>A _18:A>G _41:T>A 4471_49:T>C _27:A>C 4333_64:A>G _8:G>C 34272_26:T>G 41_12:C>G _3:A>G _3:G>T 83767_32:A>C 83839_31:G>A 3627_13:G>C _18:T>G 46627_32:T>C _:C>T 43433_21:T>G 36338_6:T>A _14:G>A 3488_19:C>A _9:A>G _7:T>C 349_28:A>G 4473_7:T>G _:A>G 34822_13:G>A _:A>T 428_24:A>G _8:T>C _7:T>C 4492_31:G>A _14:G>A 16634_:A>G _3:A>G 3474_17:C>T _23:T>C 42184_28:C>G 22949_13:C>T 34172_3:C>T 34829_16:C>T _6:T>C 4414_:G>A 486_49:C>G _:C>G 83979_16:T>C _13:T>C 34669_29:T>C _8:G>C _:G>A 34698_13:G>A 3492_41:C>A 4_14:C>T 3477_23:G>A 43482_7:T>C _9:C>T 43649_:C>T 343_8:G>A 24774_6:A>G 3643_17:A>G 4288_31:T>C 43783_11:T>C _24:C>T 3636_39:G>A 49191_11:T>C _28:T>C _43:T>C _63:A>G 41326_44:A>C _29:A>G _27:A>T _16:G>C _37:T>C _19:T>C 43144_11:T>C _17:A>G _6:C>T 43937_9:T>C 443_8:A>G 4832_28:A>T _8:A>G _16:C>G 34338_29:T>C _13:A>G _26:G>A 81271_26:T>A 83896_16:C>A _3:A>T _13:T>C _16:T>A 42147_37:C>T _2:G>A _19:T>A _23:G>C 34762_38:C>A _27:A>C _38:T>C 83942_13:C>T _:T>C _:G>T _8:T>C 43699_8:A>G _41:A>C _13:C>G 3484_:G>C 4399_32:T>C 3463_3:T>C 347_36:T>C 47941_17:A>G _24:A>G 42222_14:T>C 43_24:G>C 34864_68:T>C _:C>G _36:C>T _8:C>T 43774_19:G>A _13:C>A 2241_18:G>A 83969_7:A>G _43:G>A _43:T>C 4777_16:A>G 3489_18:C>T _48:G>A _21:G>A _12:A>C _43:C>T 36126_1:C>T 4236_:C>T 44821_11:G>A 42681_43:C>A 49443_28:T>C _2:C>G _46:C>G _:C>G 489_23:C>T 461_14:C>A 34638_3:A>G _16:G>A 34496_4:C>T _34:A>G _8:C>T 34488_38:A>G 4996_26:C>A 46614_22:A>C 43939_:T>C 43462_17:C>T _:G>A _:G>T _2:C>T 8494_18:G>C _8:C>T 43741_34:C>G _:G>A _68:T>G _24:A>G _14:C>A 34848_4:T>C _8:T>C 81231_3:A>T _9:C>G 34288_3:T>C _13:G>A _24:A>G 3466_29:T>C _13:A>G 4372_13:C>T 341_19:T>A 36962_4:G>A 46_8:T>A _29:A>C 36241_14:G>A 13717_33:T>G 34189_46:G>A _1:C>G _29:A>G _29:A>T _6:C>T 2342_14:G>A 3497_61:G>A _4:C>T 2342_24:T>C _3:C>G 34619_18:A>G 34971_16:T>C 34711_42:G>C 83776_8:G>T _17:A>G _:C>T 49686_3:T>C 8178_:A>G _31:C>T _21:C>A 43329_13:T>C 3482_:T>C 34147_31:C>T 3446_31:T>G _16:G>C 43979_31:G>A 41444_4:G>C 47462_:A>G _:A>G _4:G>A _:T>C 34843_34:C>G 3439_18:A>G 3473_29:T>C 4448_26:G>C _16:G>T 36638_16:G>C _67:C>G 23814_14:G>A _:G>A 34826_:C>A _:A>G 36422_31:A>G _18:G>A 3417_:G>A _7:A>G _14:C>A 3496_:C>G 49398_16:C>G 34328_32:T>C _19:A>T 44479_28:A>G _11:G>T 3463_27:A>G 34688_:C>T _17:G>C 43424_7:C>T _7:A>G _31:A>G 348_42:C>T 3494_1:T>C 34671_21:G>A _:T>G _14:T>C 34797_28:G>C 34766_12:A>C _37:T>G 438_6:C>T 48446_14:C>T 364_:C>T 36_16:C>T 81184_6:A>G 4893_:T>A 3697_:A>G _24:G>A _11:A>G _7:C>G 34677_32:G>T 8112_28:G>A _32:A>G _29:T>C 83838_:C>T 4212_8:A>G 4394_44:C>A _9:G>A _:C>T _9:T>G _23:G>A _6:T>C _:G>C 34398_29:C>G 3692_7:T>G 34398_17:A>G 36947_:G>C _13:G>T 3681_2:G>T _49:G>A 3674_19:A>T _28:C>A _11:C>A 17_:T>A 4736_6:A>G 36_31:G>A 36783_2:C>T 36829_9:C>G _32:T>G 36961_3:A>G _7:T>A _2:A>T _32:A>C _11:T>C 36696_6:A>G 42189_22:G>A 81232_6:C>T 814_28:C>T 814_7:T>C _:C>T _27:T>G _14:A>G _29:C>G _:C>T _19:C>G _13:G>C 3422_17:T>C _7:G>A _37:C>G _8:C>G _11:G>T 36979_42:C>G _19:A>G 83341_3:T>C _4:G>C 8146_:T>A _8:G>C _6:T>C _3:G>A 43477_:A>G _23:A>C _17:T>G _16:G>C _26:A>T 36183_28:A>G _61:T>C 43436_28:A>G 1992_13:T>C 36641_19:G>A _16:G>A _:T>C _14:A>G _13:G>A _41:C>T _:T>A 4861_31:A>C _17:C>A _13:T>G 3686_49:A>T _27:A>C 42976_22:T>C 34748_47:C>G _24:G>C _22:A>C 42_2:G>A _28:A>C _:G>C 437_37:G>T _24:A>C _3:G>T _13:G>C _9:T>A 462_31:A>T _2:A>C _31:A>G _14:A>C _9:A>C 34634_14:T>G 34843_68:C>G _13:A>T 34817_66:T>G 4478_19:G>T 46962_22:T>C 44669_7:G>C 42132_27:C>G _17:C>G 34379_29:C>A 42728_33:T>C 46622_29:C>T 8364_13:G>C _23:T>A _6:T>C _12:G>A 4811_24:C>G _22:A>G 36274_17:A>G 34344_61:C>G _13:T>G 36348_12:G>C 3414_46:G>A 1911_9:G>C 34673_6:T>C 3464_49:A>C _19:A>G 4463_9:G>A _11:C>T 4727_26:A>C _38:C>T _:A>G _18:G>A 3477_31:C>T 43789_31:G>A _7:T>C 34236_:A>G _44:C>T _3:C>T _9:G>A 3418_66:G>C 4349_62:A>G _34:T>C _29:T>C 46129_6:A>G 42134_14:A>T _:A>G 8126_17:A>G _12:T>C _2:G>A _:C>A _2:G>A _19:C>T 14413_61:C>G 3469_2:C>T 43429_11:T>C _24:G>T _:T>A 3612_7:A>G 46784_11:T>C 4647_61:T>C _7:A>C _26:A>G _3:A>G 81144_44:A>G 839_7:C>G 24688_21:A>G _27:C>T _29:C>T _14:A>T 34_7:G>A 36138_13:C>A 44466_7:G>A 16917_11:T>C 2487_7:T>G 348_6:C>G 81227_4:C>G 22677_27:T>C 34428_16:G>A 8334_17:G>A 8431_:A>G 43438_:A>G _19:T>C 4832_19:T>C 8996_:A>C _7:C>G _23:T>C _7:T>C 3482_:A>G _4:G>C 36632_14:C>T 8363_23:A>T _31:A>C 47268_9:A>G _26:T>G 21132_14:C>T 2198_21:A>T 47326_16:C>T 3663_39:T>C _12:C>T _22:T>A 34237_13:C>T 43463_8:G>A _8:C>G _41:G>A _36:T>C _6:C>G _:G>C _17:C>G 42292_14:C>A 4726_2:C>G _8:C>G 222_6:T>A 41336_26:A>C _18:A>C _12:C>T _3:C>G 4347_3:A>G _12:T>C _7:G>C 34787_37:C>G 46_41:G>A 36198_8:G>A 36328_29:T>C _:C>G 43744_68:C>T 42146_:G>A 4347_27:A>G 4278_7:A>G 349_2:T>G 43814_14:C>T 34724_7:T>G _8:A>G 36439_3:A>G _29:T>C 41347_:T>C 3412_3:A>G 43471_7:A>C 3439_:A>C 34729_2:T>C 34921_6:A>C 4867_14:T>C 4444_9:C>T 8378_17:T>C 4219_9:A>T 34811_26:G>A 437_3:C>T 42679_32:T>C _9:A>G _14:A>C _37:C>T 34729_:G>A 349_47:A>G 36211_21:T>C 4389_46:A>G _:C>A 49_17:G>C 42122_32:G>A 22168_8:T>G 46239_7:T>C _9:A>G _17:T>C 4246_21:C>G 3697_44:C>T _:G>A 43489_28:A>G _6:A>G _18:G>A 43433_2:T>C _28:G>A _8:G>A 44967_18:A>G _17:G>C 4668_23:A>G 168_16:T>C 43422_24:A>G 3479_22:C>T 342_36:G>C _37:G>T _6:T>C 46833_:T>A 44886_2:C>G 42213_44:G>C 36938_16:G>A _37:A>G _8:C>T 34413_33:G>T 42171_23:C>T 862_14:G>C _12:A>C 34283_19:C>T _66:G>C 34297_7:G>A 3469_17:G>C 4446_27:A>C 8376_6:A>G 34187_9:G>A 3493_32:A>G 4347_7:T>C 34177_24:T>C 34713_7:A>G _24:T>C _61:C>T 43444_37:C>A _19:C>T _34:C>A _27:G>A 3486_7:T>C _12:T>A _13:T>C 341_36:C>G 4639_7:C>T _16:C>T _36:A>G 4238_18:A>G 34769_13:T>C 4862_2:T>A _9:C>G 47933_31:T>C 4_11:A>G 3489_14:T>C _21:T>C 43633_4:T>G _8:G>A 3489_21:T>C 49418_11:A>G _4:T>C _31:G>A 42929_14:A>G 89796_67:G>A 4837_6:A>T 48832_12:C>T 3637_:C>G 47143_63:T>C 34646_11:T>C 89921_39:A>C _13:T>C 8377_6:G>A _18:A>G _2:C>T 16838_3:C>A 43427_2:A>C 43474_49:T>C 3417_24:A>C _6:G>C 8143_19:T>C 34733_34:G>T 44422_17:G>A 24864_12:T>A 467_7:C>T 413_18:G>C _11:G>A 34826_:T>G 34668_44:A>C _9:C>A 83787_38:C>G 46734_36:G>A _24:A>C 42838_14:A>G _13:C>T _26:A>G 47744_:T>C _32:G>A 46494_41:C>T 4174_39:T>C 4698_6:A>G 833_17:C>G 436_1:T>C 4289_47:G>T _24:T>A 243_9:A>G 34274_3:G>A 243_7:C>G _31:G>A 3418_21:C>A 277_17:A>G _6:T>A 41618_6:C>G _38:T>C _:A>G 344_23:A>G 34826_3:T>C _:A>G _26:C>G 888_7:T>C 3481_:C>T 34361_36:A>G 81116_8:C>T 4243_6:C>G _39:T>C _19:A>G 34621_37:A>C 4783_:G>A 491_11:A>C 36361_4:A>G 36616_46:A>G _39:T>C 3461_16:G>A 3469_11:T>C 8117_:T>G 4342_22:C>G 34831_3:C>T 421_:T>A 34266_:C>A _9:C>A 34693_31:A>T 3432_63:T>C 3661_12:G>T _31:C>A 49639_37:A>G 36171_8:T>C _43:G>A _3:A>T 19249_19:G>T _31:C>T 49849_6:C>G _33:A>C _:A>G 34728_21:T>A 83147_39:G>C 3439_61:G>C LG1 LG2 LG3 LG4 LG LG6 LG7 LG8 LG9 LG LG11 LG12 Rys. 4. Mapa genetyczna dwunastu grup sprzężeń markerów SNP-DArTseq w populacji [CMS-19T x Bolero]F2 7

8 Pewne trudności napotkano przy identyfikowaniu lokalizacji chromosomowej otrzymanych grup sprzężeń. Poszukiwano polimorficznych markerów PCR oraz markerów DArTseq o znanej lokalizacji chromosomowej. Osiem z dwunastu grup sprzężeń przypisano do konkretnych chromosomów (ramion chromosomowych) pszenżyta (tab.2). Wśród zidentyfikowanych chromosomów jeden pochodził z genomu A (A), trzy z genomu B (1B, 6B, 7B) i cztery z genomu R (2R, R, 6R, 7R). Próbę określenia lokalizacji na utworzonych mapach sprzężeniowych genów odpowiedzialnych za przywracanie męskiej płodności zrealizowano przy zastosowaniu metody mapowania interwałowego. Tylko w przypadku dwóch grup sprzężeń 4 (chromosom 6R) i (chromosom dotąd niezidentyfikowany) krzywa LOD przekroczyła poziom istotności określony na LOD=2, (rys.). Zarówno przebieg krzywej, jak i wartości parametrów wykrytych QTLi wskazują na obecnośći genów o słabym efekcie fenotypowym. Dodatkowo wykonana analiza danych testem nieparametrycznym Kruskala-Wallsa wykazała statystycznie istotny związek z genami restorerowymi zaledwie 71 markerów SNP-DArTseq. Wśród nich 8 znajdowało się w obrębie wymienionych dwóch grup sprzężeń, a pozostałe 13 markerów nie były włączone do skonstruowanych map (znajdowały się wśród markerów tworzących wspomniane powyżej drobne grupy sprzężeń). Rys.. Przebieg krzywych LOD w obrębie grup sprzężeń 4 (chromosom 6R) i Spośród 967 makerów SNP otrzymanych w wyniku analiz DArTseq w populacji [CMS-19P x Bolero]F2, 1894 markery polimorficzne użyto do konstruowania map sprzężeń. Przy wartości krytycznej parametru LOD uzyskano 8 dużych grup sprzężeń zawierających co najmniej 4 markerów oraz kilkanaście drobnych grup liczących po kilka-kilkanaście loci. Dla ośmiu dużych grup sprzężeń skonstruowano mapy genetyczne (rys.6) o długościach od 31,9 do 94,2cM (tab.3). Łącznie w obrębie map sprzężeń znalazły się 764 markery SNP, a łączna długość utworzonej mapy to 48,4cM. 8

9 _:C>G 83934_6:C>A _16:G>T _23:T>C _14:G>C _8:A>G 8489_28:T>A _14:A>T _17:G>C _3:G>C 2222_14:A>T _6:G>A 3486_3:G>A 83811_3:T>C _31:A>C 3426_62:A>G 18966_19:T>C 23227_:C>A _12:C>G _7:A>G _29:T>C 3414_1:C>T 427_13:C>G 17241_:A>G 48234_16:A>C 99834_8:C>T 4786_11:G>C 34814_8:A>G 873_38:A>G _2:A>G _2:G>C 1963_23:G>A 4324_13:A>G 36111_:T>C _9:C>G _:A>G 47_38:A>G _32:G>A _38:T>C 3443_62:A>C 43482_13:G>A 194_18:C>T 42613_:A>G 3474_29:C>T _:G>A 34233_:C>A 4663_33:G>A _19:A>C 34296_:A>G _24:G>T 47372_8:G>C _22:C>G _:A>G _6:T>C 191_13:C>G _:G>C 83934_8:A>G _7:G>T 34692_19:C>G _:A>G 36177_34:G>T _:G>C _19:A>G 42781_36:C>A 34391_19:T>C _9:A>C 242_9:C>G _6:C>T 36_6:G>C 34342_:A>G _27:C>A 83873_12:T>C _11:A>G 11726_24:A>C 34484_12:C>G _13:T>C 46613_:G>T 36214_6:C>T _16:G>C 99836_8:T>A _:T>A 36174_:C>T _8:A>G _18:T>A 34182_2:C>G 43443_23:G>A 427_11:G>A _31:C>A _4:A>G _19:G>A 4638_22:C>T _7:A>G _22:A>G 16342_13:A>G _8:G>C _31:T>C 34686_12:C>A 83793_2:A>G _23:C>G 4848_9:A>G _22:C>G _:A>G 1198_3:A>C 87_8:T>G _11:G>A 3444_49:T>A _6:T>A 34127_34:C>T 3473_41:C>T 3473_33:C>G 34127_1:G>C 43614_12:G>A _13:C>T _:C>T 49793_6:G>C _:C>G _19:G>C _4:C>G _11:T>G 36196_:C>G 1896_11:A>T _14:A>T 819_11:A>G 44931_:A>G 81118_9:T>C 36233_33:A>G _18:G>T _33:C>G _37:T>G _44:T>C 426_6:C>T 3473_49:A>C 19168_:C>T 4737_38:A>G _17:A>G _:G>A 8317_16:T>A 3474_29:A>G 3424_2:A>G _27:C>G 42187_32:T>C 34697_17:T>G 3673_41:T>C _2:T>C 34788_26:C>G 34697_4:C>A 83717_17:C>T 446_6:G>C 83798_12:T>C _19:A>G 43476_23:G>A _8:C>T _21:C>G 3676_3:A>G 43747_6:T>C 2448_11:G>C 83861_31:C>G _6:C>T _19:T>C 22677_27:T>C 349_47:A>G _14:A>C 42679_32:T>C 36211_21:T>C 34729_:G>A 34921_6:A>C 43438_:A>G _36:T>C _37:C>T 36198_8:G>A _12:T>C _22:T>A 3412_3:A>G 3439_:A>C 4389_46:A>G _:G>C _18:A>C 42146_:G>A _29:T>C 4726_2:C>G 47326_16:C>T _23:T>C 34729_2:T>C 349_2:T>G 4219_9:A>T 43463_8:G>A _41:G>A 36439_3:A>G 4347_27:A>G 43471_7:A>C 47268_9:A>G 222_6:T>A _12:C>T 21132_14:C>T _7:G>C 4832_19:T>C 41336_26:A>C 36328_29:T>C _12:C>T _17:C>G 8363_23:A>T 34787_37:C>G _:C>G _3:C>G 4444_9:C>T _4:G>C 437_3:C>T 8334_17:G>A 8127_36:C>A 1669_18:T>C _31:A>C _7:T>C 34724_7:T>G _8:C>G _26:T>G 36632_14:C>T _6:C>G 34237_13:C>T 43744_68:C>T 41347_:T>C 4347_3:A>G 43814_14:C>T _9:A>G 8996_:A>C 4278_7:A>G 2198_21:A>T _8:C>G 3663_39:T>C 8378_17:T>C _7:C>G _8:A>G 3482_:A>G 42292_14:C>A 4867_14:T>C 34428_16:G>A 8431_:A>G _:C>A 34811_26:G>A 49_17:G>C 42122_32:G>A 22168_8:T>G 348_6:C>G 46239_7:T>C 48187_32:G>T _16:A>C _:C>T _3:C>A _3:A>T 2468_16:T>C 3466_33:C>T 43674_13:A>G _2:T>C 3412_22:A>G 4264_3:G>T 36744_4:G>A 4264_31:C>T _36:A>T 362_7:C>G _8:A>G 36924_:T>A 43486_:G>A 34133_2:T>C _34:C>T 428_9:T>A _:T>C _33:T>G 81262_12:C>T 19787_27:G>A _38:T>C _11:G>A _:C>T _62:G>A _2:C>T _38:A>G _26:T>C 234_38:T>C 36396_:A>G _27:T>C _8:C>G 83274_9:T>C _39:G>A 34384_:C>A 26_18:T>C 99813_23:A>G _7:T>C 421_38:T>C 43729_26:T>C _16:T>C 83896_19:T>C _23:T>A 4268_24:A>T 2_6:A>G _21:A>G _14:A>C 43319_12:C>T _6:A>G _9:T>C _14:A>G _18:C>T 3436_:A>G 34797_39:T>A _17:G>A _23:C>T _28:G>C _14:G>C _26:T>G _13:A>G 81293_23:T>C 83617_14:T>G 36261_27:T>C _68:A>C _37:C>G _26:C>G 34881_17:A>T _31:A>C _24:C>G 34_66:A>G 4367_18:G>T _16:T>A _26:A>T 43922_8:G>C _17:C>T _17:A>T _:C>G 81167_8:A>G 42614_26:A>G 42971_29:T>C _7:C>T 81293_22:T>C 496_41:A>T _38:G>C _:T>C _18:G>A 3418_7:T>C 83312_8:C>A 436_6:A>G _27:A>G 36448_7:C>G 43479_9:A>T 43632_49:C>G 4471_11:T>G 426_44:T>C 34369_17:A>G _18:C>G 44834_3:C>T 4223_41:A>T _18:C>G _:T>G 34861_17:A>G 4637_24:T>C 42121_23:A>G _64:G>A _38:G>C _9:G>T 3682_8:T>C 3682_8:A>G _27:A>C 8348_7:G>C _21:G>A _:T>C 4176_:C>G _8:C>G _18:C>T _3:G>T _:G>C _34:C>T _31:A>G 43443_16:G>C 44178_14:G>C 4624_:C>T 34726_6:T>C 83797_22:A>G 3626_28:G>T _13:T>G 369_:A>G 364_12:C>A 364_3:A>G _:T>C _12:C>T _44:A>T 3464_2:C>G _:G>C _19:C>T 43432_31:G>A 4936_23:T>C 423_:G>A _8:C>G _17:T>C 3466_8:T>C 46613_31:G>T 24864_12:T>A 42143_17:A>C _2:A>C _13:G>C _9:T>A _13:G>C 437_37:G>T _28:A>C _:G>C _24:A>C 1992_13:T>C 34748_47:C>G _24:G>C _27:A>C _13:T>G 3686_49:A>T 42976_22:T>C _17:C>A _13:G>A 36641_19:G>A 43436_28:A>G _22:A>C 17_:T>A _16:G>A _16:G>C _14:A>G _26:A>T 4861_31:A>C _6:T>C _3:G>A 36183_28:A>G _19:A>G _8:G>C 43477_:A>G _23:A>C _4:G>C 4384_8:C>G _11:G>T _8:C>G _:C>T _:C>T _2:C>T _14:T>C 421_14:A>G 3462_16:C>G _:T>C _13:G>C _32:T>G _22:C>T 43711_:C>T _:C>G 83939_38:A>T 34398_17:A>G 34398_29:C>G _:G>C _11:G>A _17:G>A _24:A>G 36947_:G>C _:G>A _32:A>C 41926_21:A>G _4:G>C 83838_:C>T 4212_8:A>G 3443_17:A>C 34766_12:A>C _:C>G 42292_:G>C _:T>G _46:T>C 36347_17:T>C _67:C>G 34971_16:T>C _4:C>T 4126_29:G>C 3446_31:T>G _:A>G 43979_31:G>A 41444_4:G>C 2342_14:G>A 2342_24:T>C 47462_:A>G 43424_7:C>T 36422_31:A>G 49686_3:T>C _4:G>A 3439_18:A>G 348_42:C>T 49398_16:C>G _11:G>T 36638_16:G>C 83776_8:G>T 34843_34:C>G _21:C>A 3463_27:A>G _18:G>A _:A>G 3494_1:T>C 34671_21:G>A 34328_32:T>C _:T>C 4448_26:G>C _7:A>G 3473_29:T>C 3496_:C>G 44479_28:A>G _:G>A 34826_:C>A 43329_13:T>C _14:C>A 34711_42:G>C _17:G>C 3697_3:C>T _16:G>T _31:A>G 8178_:A>G 34147_31:C>T _16:G>C _:C>T _19:A>T _17:A>G _29:A>G 34688_:C>T 3482_:T>C _7:A>G 36241_14:G>A _31:C>T 46_8:T>A 3497_61:G>A _29:A>C _:C>G 16319_:C>A 23814_14:G>A _29:A>T 34619_18:A>G _6:C>T _3:C>G 3487_6:C>T 233_18:G>T 83819_18:C>T _43:A>G _49:T>A 423_8:G>A _:T>G 8321_7:A>C _19:A>G 34177_28:T>C _17:C>T _68:A>G _41:C>T _39:A>G 4478_19:G>T 3486_3:C>A _7:A>G 83979_14:C>T 42973_46:A>G _24:A>G _46:C>G _23:T>A 44669_7:G>C 3464_49:A>C 81144_44:A>G 8364_13:G>C 42728_33:T>C 3414_46:G>A _38:C>T _13:T>G _:C>A 1911_9:G>C _24:G>T _29:T>C _26:A>G 3477_31:C>T 4647_61:T>C _9:G>A 34673_6:T>C 4349_62:A>G _6:T>C _3:C>T _2:G>A 14413_61:C>G 3418_66:G>C 43789_31:G>A _2:G>A 42134_14:A>T _34:T>C _11:C>T 3469_2:C>T 4727_26:A>C 46129_6:A>G _7:T>C 34236_:A>G 3612_7:A>G 8126_17:A>G _19:C>T _18:G>A _12:T>C _:A>G _44:C>T 4463_9:G>A 34379_29:C>A _:A>G _19:A>G _:T>A 36348_12:G>C 839_7:C>G _7:A>C 43429_11:T>C 46784_11:T>C 46962_22:T>C _22:A>G 46622_29:C>T _17:C>G 34344_61:C>G 24688_21:A>G 4811_24:C>G _3:A>G 42132_27:C>G _27:C>T _29:C>T 36274_17:A>G _14:A>T 448_:T>C _2:A>G 8396_17:C>G 8473_:G>C _6:T>C _:A>G _17:G>C _22:G>C _13:G>C _37:A>G 43476_3:A>G 42933_27:A>G _2:C>T 34134_28:A>C 81293_16:C>G 2394_12:A>G 42779_18:A>C _11:G>A _14:G>C _:C>G 3487_31:C>G 4316_21:G>C _7:G>A _11:T>C 1472_:C>T 8197_16:G>A 4239_17:A>G _13:C>A _12:C>T _9:T>G 42212_26:T>G 489_:G>C 48448_22:G>C _13:T>C _37:G>A _4:C>T 81279_22:A>G 43698_:C>T _7:T>C 83837_22:C>T _16:A>T _39:T>C _34:A>G 461_:G>A _21:A>C 476_:T>A _8:A>T 49476_46:T>C _:A>C 833_:A>C _47:G>A _7:C>A _11:C>G 34233_61:C>T 81216_11:C>T _12:T>C 34768_19:A>C _37:C>T _23:G>T _8:C>G _44:A>G 34689_31:C>A 83827_8:C>T 46831_44:T>C _:A>G _27:C>G 34831_11:G>A _:A>C 4384_:C>A _16:T>C 42112_19:C>T 34744_19:C>T 348_2:A>G 42134_18:G>C 43667_16:T>C 44839_:A>G 4769_:C>T 34723_18:A>G _39:G>A 3639_22:T>C _11:A>G _18:C>A 421_42:T>C _:C>T 19333_6:A>G _:T>C _19:C>G 4343_27:C>T 482_47:C>T 3616_43:T>A _19:T>C _36:C>T 349_6:T>G _8:A>C 36446_2:G>A 34619_44:T>C 11913_7:T>G _18:A>G 34769_3:A>G _:T>C _21:T>C 34713_24:A>G _28:C>G _3:A>C 1191_8:T>C 3697_44:C>T 44967_18:A>G 36938_16:G>A _6:A>G 43489_28:A>G _:G>A 4444_13:G>A 43433_2:T>C _8:G>A _28:G>A _18:G>A 42213_44:G>C 42234_4:C>A _12:A>C 3479_22:C>T 34662_:A>G 342_36:G>C 47612_:A>C _68:A>G _37:G>T _6:T>C 46833_:T>A 443_9:C>T _8:C>T 34413_33:G>T 34283_19:C>T 34297_7:G>A 4446_27:A>C _12:T>A _19:C>T 3486_7:T>C 83641_14:C>A 341_36:C>G _61:C>T _4:T>C _7:C>G 47143_63:T>C _18:A>G _6:G>C 16838_3:C>A 3417_24:A>C 43474_49:T>C 349_:C>A 4768_9:T>C 23_7:A>G 44831_4:G>A LG1 LG2 LG3 LG4 LG LG6 LG7 LG8 Rys. 6. Mapa genetyczna ośmiu grup sprzężeń markerów SNP-DArTseq w populacji [CMS- 19P x Bolero]F2 Tabela 3 Charakterystyka grup sprzężeń utworzonych w obrębie populacji mapującej [CMS-19P x Bolero]F2 Grupa sprzężeń Liczba markerów Długość mapy (cm) Przypuszczalny fragment chromosomu 1 7,3 R (1R) ,9 Brak danych ,7 6B ,2 6R 81,2 2R 6 2 6,7 R 7 2 4,4 7R (3B, B) , 7B (R) Ogółem ,4 Ocena fenotypowa liczących po około osobników populacji F2 pszenżyta z czterema źródłami CMS (CMS-V, CMS-A, CMS-T i CMS-P), w których uniwersalnym restorerem był ród DAD182/ ujawniła zróżnicowanie w obrębie każdego z badanych obiektów (rys.6-9). Ogólnie najmniej liczną kategorią fenotypową były rośliny z przywróconą w pełni płodnością (oceniane na w skali bonitacyjnej wg Góral 2). W mieszańcach z CMS-V i CMS-A nie było takich roślin w ogóle (rys. 6 i 7), przy obecności cytoplazm CMS-T i CMS-P (rys. 8 i 9) były to pojedyncze osobniki. W cytoplazmach CMS-V i CMS-T najliczniejszymi kategoriami fenotypowymi były formy całkowicie męskosterylne, podczas gdy w pozostałych dwóch cytoplazmach najczęściej pojawiały się osobniki częściowo płodne. 9

10 CMS-V Płodność (skala -stopniowa) Rys. 6. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-V CMS-A Płodność (skala -stopniowa) Rys. 7. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-A

11 CMS-T Płodność (skala -stopniowa) Rys. 8. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-T CMS-P Płodność (skala -stopniowa) Rys. 9. Wyniki oceny męskiej płodności u mieszańca F2 pszenżyta z cytoplazmą CMS-P Wyniki tej wstępnej oceny zmienności fenotypowej w obrębie mieszańców z czterema typami cytoplazmy pozwoliły na podjęcie decyzji o założeniu więszego doświadczenia polowego w dwóch lokalizacjach (Szczecin i Kraków), gdzie w kolejnym sezonie wegetacyjnym planowane jest zebranie danych fenotypowych niezbędnych do mapowania porównawczego genów restorerowych. 11

12 Dyskusja (opisać jak w publikacji) Wyniki oceny męskiej płodności roślin pochodzących z różnych mieszańców pszenżyta wskazują na dość złożony mechanizm dziedziczenia tej cechy. W populacjach F2 pojawiały się rozkłady o różnych kształtach od zbliżonych do normalnego po typowo bimodalne. Złożony charkater dziedziczenia przywracania płodności w systemach CMS pszenżyta był wcześniej opisywany (Góral i in. ). Niewiele wiadomo o lokalizacji genów odpowiadających za przywracanie płodności. Analizy cytogenetyczne wskazywały na obecność genów restorerowych na chromosomach 4R i 6R (Curtis i Lukaszewski 1993). Wyniki mapowania wykonanego na jednej populacji mapującej potwierdzały znaczenie chromosomu 6R z jednoczesnym wskazaniem, że na chromosomach 6A i 6b też są zlokalizowane geny przywracające płodność (Stojałowski i in 13). Uzyskane wyniki opisane powyżej stanowią kolejne potwierdzenie znaczenia chromosomu 6R, ale sugerują jednocześnie, że jest tu zlokalizowany tylko jeden z co najmniej kilku genów regulujących przywracanie męskiej płodności u pszenżyta. Dotychczas skonstruowano niewiele pełnych map genetycznych pszenżyta. Pierwsze mapy dla pojedynczych populacji mapujących, które zaczęły się pojawiać na początku obecnej dekady były przeważnie niekompletne (nie obejmowały wszystkich chromosomów w całości (Tyrka i in. 11; Stojałowski i in. 13). Jedynie w pracy Alheit i in. (11) opartej o markery DArT, w której mapa została utworzona w wyniku integracji danych z pięciu populacji mapujących, mapa pszenżyta jest kompletna. Niestety użyte w pracy markery DArT (markery otrzymywane techniką mikromacierzy) nie były analizowane w populacji [CMS-19T x Bolero]F2, gdyż użyto bardziej efektywnej techniki DArTseq (bazującej na nowych metodach sekwencjonowania NGS). Markery tego typu zostały ostatnio użyte do skonstruowania nowej mapy genetycznej pszenżyta (Tyrka i in. ), która okazała się bardzo pomocnym narzędziem przy identyfikowaniu lokalizacji chromosomowej utworzonych grup sprzężeń. Wnioski (opisać jak w publikacji) Przywracanie męskiej płodności u pszenżyta znajduje się pod kontrolą większej liczby genów o stosunkowo słabym działaniu. Tego rodzaju geny są trudne do zlokalizowania na mapach chromosomowych. Chromosom 6R u pszenżyta zawiera geny restorerowe, ale siła ich działania nie jest wystarczająca do pełnego przywracania męskiej płodności. Temat badawczy 2 Identyfikacja przydatnych dla hodowli markerów molekularnych wykazujących sprzężenie z genami kontrolującymi męską płodność u pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi, CMS-Pampa. Weryfikacja skuteczności tych markerów w obrębie różnych genetycznie mieszańców. Cel: Zaprojektowanie starterów PCR pozwalających na rozpoczęcie poszukiwań przydatnych w hodowli markerów wykazujących sprzężenie z głównymi genami kontrolującymi męską płodność u pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi i CMS-Pampa cel zrealizowany. Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Realizacja zadania jest oparta o dane otrzymane z genotypowania populacji mapującej wykonywanego w zadaniu 1. Na podstawie danych sekwencyjnych uzyskanych z analiz DArTseq (komercyjny wariant metody GBS) wykonanych przez firmę Diversity Arrays Technology Pty. oraz sekwencji dostępnych w bazach danych, które zlokalizowane są w obszarach zainteresowań zaprojektowano w 16 roku par starterów. Markery otrzymane metodą PCR z użyciem tych starterów oceniono pod kątem wykrywania polimorfizmu DNA pomiędzy formami rodzicielskimi populacji mapujących. Przed przygotowaniem reakcji PCR, uzyskane izolaty DNA rozcieńczano wodą MilliQ do uzyskania stężenia końcowego ng/μl. Mieszanina do reakcji PCR zawierała: - 12,3 µl H2O - 2, µl x bufor PCR [Fermantas] - 2, µl MgCl2 (2 mm) [Fermantas] -, µl dntp ( mm) [Fermantas] -, µl starter forvard ( μm) [Proligo] 12

13 -, µl starter reverse ( μm) [Proligo] -,2 µl polimeraza Taq (U/µl) [Fermantas] - 2, µl DNA Amplifikacje prowadzono w termocyklerze firmy Eppendorf, a profil temperaturowy reakcji przedstawiał się następująco: - początkowa denaturacja 94 C/3s - denaturacja 94 C/3s - przyłączenie starterów 4 C/1min 3x - amplifikacja DNA 72 C/2min - końcowa amplifikacja DNA 72 C/min - chłodzenie 4 C Sprawdzenie wydajności amplifikacji przeprowadzono na 2% żelach agarozowych zawierających bromek etydyny. Właściwą weryfikację długości amplifikowanych fragmentów (wykrywanie niewielkich różnic w wielkości amplikonów) przeprowadzono rozdzielając produkty PCR w % żelach polikryloamidowych w buforze 1xTBE przy natężeniu pola V/cm przez h. W celu wizualizacji produktów reakcji wykonano barwienie żelu (3 min) w roztworze bromku etydyny o stężeniu, μg/1 ml i podświetlanie światłem UV. Wyniki (opisać) Markery PCR otrzymywane w wyniku amplifikacji z użyciem starterów zaprojektowanych do sekwencji otrzymanych jako wynik analizy techniką DArTseq nie ujawniały polimorfizmu genetycznego w badanym materiale. Z uwagi na fakt, że fragmenty amplifikowanego DNA były bardzo krótkie nie było możliwości zaprojektowania innych wersji starterów lub wykorzystania enzymów restrykcyjnych, które mogłyby pomóc w uzyskaniu polimorficznych markerów. Wśród badanych markerów część została zaprojektowana w oparciu o znaną lokalizację genu restorerowego na chromosomie 6R. Sekwencje DNA żyta zdeponowane w bazach danych NCBI oraz GABI wybrano na podstawie ich lokalizacji i zaprojektowano dodatkową serię starterów. Niestety markery te również okazały się w większości monomorficzne lub startery nie inicjowały amplifikacji, albo też generowały produkty mało specyficzne. Dokładna analiza porównawcza wielkości amplikonów u form rodzicielskich CMS-19T, CMS-19P oraz Bolero (populacje użyte do konstruowania map sprzężeń w temacie badawczym 1) wykazała polimorfizm w przypadku 6 markerów: SWES 131, SWES, 13, SWES 188, SWES 4, SWES 9 i SWES 217 (tab.4). Spośród nich tylko dwa ostatnie ujawniały różnice pozwalające na zastosowanie ich do mapowania porównawczego dla obu badanych populacji mapujących (wykryte różnice dotyczyły linii ojcowskiej oraz obu wariantów linii matecznej). Niestety wykryte różnice w wielkości produktów są niewielkie (poniżej nukleotydów), w związku z czym wymagają wykonywania analiz w żelach poliaryloamidowych. 13

14 Tabela 4. Wyniki analiz PCR dla markerów Startery Oczekiwany produkt [pz] Obserwowany produkt [pz] CMS-19T Bolero CMS-19P SWES 1 (f/r) SWES 3 (f/r) SWES 12 (f/r) SWES 19 (f/r) SWES 48 (f/r) SWES 71 (f/r) SWES 131 (f/r) 29/28 282, , 249, 239 SWES 13 (f/r) SWES 149 (f/r) SWES 166 (f/r) SWES 18 (f/r) SWES 184 (f/r) SWES 188 (f/r) SWES 19 (f/r) SWES 4 (f/r) , 239, , SWES 7 (f/r) , , , 239 SWES 9 (f/r) SWES 217 (f/r) SWES 2 (f/r) SWES 21 (f/r) Dyskusja (opisać jak w publikacji) Pszenżyto należy do gatunków uprawnych, które mają zauważalne znaczenie w skali globalnej, a w gospodarce rolnej krajów Europy Środkowej należą do najważniejszych zbóż. Pomimo tego, wiedza na temat genetyki pszenżyta jest wciąż bardzo ograniczona. Pierwsze mapy genetyczne pszenżyta zaczęły powstawać dopiero w ostatnich latach (Tyrka i in. 11; ; Alheit i in. 11; Stojałowski i in. 13) i w wielu przypadkach nie obejmowały całego genomu. Jest to o tyle zaskakujące, że mapy genetyczne gatunków rodzicielskich pszenżyta: pszenicy i żyta znane są już od ponad lat. Można przypuszczać, że problem z analizami pszenżyta wynika z jednej strony z jego mniejszej stabilności cytogenetycznej, a z drugiej strony z ograniczonej zmienności genetycznej pszenżyto jest gatunkiem nowym i nie było dość czasu, aby naturalna zmienność wynikająca ze spontanicznych mutacji mogła się znacząco rozwinąć. Stąd też trzeba się liczyć z ograniczoną efektywnością prac badawczych zmierzających do otrzymania przydatnych w hodowli pszenżyta markerów DNA. W czasie przeprowadzonych badań uzyskano tylko dwa markery przydatne do mapowania porównawczego genów restorerowych. Oba markery wymagają wykonywania analiz w żelach poliaryloamidowych, co ze względu na pracochłonność ogranicza ich przydatność dla komercyjnej hodowli. Wnioski (opisać jak w publikacji) Bezpośrednie wykorzystanie sekwencji markerów DArTseq do projektowania markerów PCR nie przyniosło pozytywnych rezultatów nie uzyskano markerów polimorficznych. Wykorzystanie dostępnych baz danych o sekwencjach DNA roślin zbożowych pozwala na uzyskanie polimorficznych markerów PCR o potencjalnej przydatności w pracach hodowlanych, ale efektywność tego rodzaju działań nie jest wysoka. 14

15 Temat badawczy 3 Ocena różnic pomiędzy genomami mitochondrialnymi i próba identyfikacji czynników wywołujących męską sterylność u pszenżyta z różnymi cytoplazmami Cel: przygotowanie materiału biologicznego do oceny różnic pomiędzy genomami mitochondrialnymi pszenżyta z cytoplazmami T. timopheevi i CMS-Pampa cel zrealizowany. Materiały i metody (opisać jak w publikacji) Badania w 16 roku polegały na namnożeniu nasion męskosterylnych wersji linii CMS-Salvo /1 z cytoplazmą T. timopheevi oraz linii 19 z cytoplazmami T. timopheevi oraz CMS-Pampa, jak również ich męskopłodnych analogów. Z uzyskanych nasion wytworzono etiolowane kiełki zawierające różne cytoplazmy: normalną (partie kiełków oznaczone N13 i N), CMS- Timopheevi (T13 i T) oraz Pampa (P13 i P). Izolacja mitochondriów 1. Około g etiolowanch 1-tygodniowych kiełków homogenizowano blenderem kuchennym w 18 ml buforu homogenizacyjnego. 2. Homogenat przefiltrowywano przez pojedynczą warstwę tkaniny do kolby. Uzyskany filtrat przelewano do butelki wirowniczej o poj. 2 ml. Wypełnione butelki równoważono, a następnie wirowano przez minut przy 2 3 rcf (rotor Sorvall F16-2). 3. Nadsącz przelewano do nowych butelek wirowniczych o poj. 2 ml, które równoważono i wirowano przez minut przy 6 rcf (rotor Sorvall F16-2). 4. Uzyskany osad zawieszano w ml buforu do DNazy. Do zawiesiny dodawano µl 1 M MgCl2 oraz 94 µl r-ru DNazy [ mg DNazy I (Sigma DN2) + µl buforu do DNazy]. Całość inkubowano w 4 C przez 4 minut mieszając zawartość butelki co minut.. Po inkubacji do mieszaniny dodawano 4 ml buforu stopującego i wirowano przez minut przy 6 rcf (rotor Sorvall F16-2). 6. Nadsącz usuwano, natomiast osad zawieszano w 1 ml medium Y. Uzyskaną zawiesinę nakładano na skokowy gradient Percollu: 7. Gradienty wirowano przez minut przy 18 rcf (rotor Sigma H). 8. Po wirowaniu pipetą usuwano górne frakcje gradientu zanieczyszczone plastydami, a następnie pipetą ustawioną na µl odbierano około 6 µl frakcji mitochondriów do probówki o poj. 1, ml. Do odebranej zawiesiny mitochondriów dodawano 1 ml medium Y, całość mieszano przez kilkukrotne odwrócenie probówki i wirowano przez minut przy 18 rcf (rotor Sigma H). 9. Po usunięciu nadsączu osad mitochondriów zamrażano w ciekłym azocie, a następnie umieszczano w zamrażarce w -8 C. Wszystkie wirowania wykonywano w temp. 4 C. Poza wirowaniami i inkubacją z DNazą próby były przetrzymywane w lodzie. Posłużyła ona do wyizolowania i oczyszczenia DNA mitochondrialnego wg następującej metodyki: Izolacja mitochondrialnego DNA (mtdna) Izolację mtdna wykonano przy użyciu zestawu Qiagen Plant Mini Kit, w którym oryginalne kolumny adsorpcyjne zastąpiono kolumnami typu III firmy Dongsheng Biotech. 1. Zamrożone osady mitochondriów rozpuszczano w 4 µl buforu AP1, a następnie próby inkubowano w 6 C przez minut. Nie dodawano RNazy. 2. Do preparatów dodawano 13 µl buforu AP2, zawartość probówek mieszano na worteksie, a następnie próby inkubowano w lodzie przez minut. 3. Próby wirowano przez minut przy 18 rcf. 4. Nadsącz odbierano do nowych probówek o poj. 1, ml i ponownie wirowano przy takich samych parametrach (w odebranym nadsączu były widoczne zanieczyszczenia).

16 . Nadsącz odbierano do nowych probówek o poj. 1, ml i dodawano 1, objętości buforu AP3. Zawartość probówek mieszano przez pipetowanie, a następnie nakładano na kolumnę adsorpcyjną i wirowano przez 1 minutę przy 8 rcf. 6. Kolumny przepłukiwano dwukrotnie µl buforu AW, po każdym płukaniu wirując je przez 1 minutę przy 8 rcf, po czym kolumny suszono wirując je dodatkowo przy 18 rcf przez minut. 7. Elucję wykonywano dwukrotnie 4 µl buforu TE. Po nałożeniu buforu kolumny inkubowano przez minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez 1 minutę przy 8 rcf. 8. Probówki z roztworem mtdna umieszczano w zamrażarce w - C. Oczyszczanie mitochondrialnego DNA Oczyszczanie mtdna wykonywano przy wykorzystaniu roztworów sporządzonych we własnym zakresie na podstawie składu odpowiednich roztworów z zestawu Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System firmy Promega. Do oczyszczania wykorzystywano kolumny adsorpcyjne typu III firmy Dongsheng Biotech. Przed oczyszczaniem pulowano próby z I i II elucji danego preparatu DNA. 1. Do 7 µl spulowanych prób mtdna dodawano 7 µl RNazy A ( µg/ml, Sigma R487). Próby inkubowano przez 1 godzinę w 37 C. 2. Do preparatów dodawano Membrane Binding Solution (w stosunku 1 : 1 v/v) i całość dokładnie mieszano przez pipetowanie. Otrzymaną mieszaninę nakładano na złoże krzemionkowe kolumn i kolumny inkubowano przez 1 minutę w temp. pokojowej. 3. Kolumny wirowano przez 1 minutę przy 16 rcf. 4. Kolumny przenoszono do nowych probówek zbiorczych. Dodawano µl Membrane Wash Solution i wirowano przez 1 minutę przy 16 rcf.. Kolumny przenoszono do nowych probówek zbiorczych. Dodawano µl Membrane Wash Solution i wirowano przez minut przy 16 rcf. 6. Kolumny przenoszono do nowych probówek zbiorczych. Wieczka kolumn otwierano i wirowano dodatkowo przez 1 minutę przy 16 rcf. 7. Kolumny przenoszono do nowych probówek o poj. 1, ml. Dodawano 4 µl mm Tris ph 8,; inkubowano przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez 1 minutę przy 16 rcf (I elucja). 8. Kolumny przenoszono do nowych probówek o poj. 1, ml. Dodawano 3 µl mm Tris ph 8,; inkubowano przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez 1 minutę przy 16 rcf (II elucja). 9. Otrzymane preparaty mtdna umieszczano w zamrażarce w - C. Jakość wyizolowanych preparatów mtdna oceniano na podstawie ich rozdziału elektroforetycznego w 1% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny o stężeniu 1,33 µg/ml. Rozdział prowadzono w buforze TBE przy natężeniu pola 4 V/cm przez 1, godziny. Na żel nakładano 3 µl preparatu mtdna z dodatkiem 2 µl buforu obciążającego (6x Loading Dye, Fermentas) oraz 7 µl wody. Równolegle z preparatami mtdna na żel nakładano µl wzorca wielkości fragmentów DNA (1 kb ladder, Dongsheng Biotech) oraz zróżnicowane ilości DNA faga λ. Wyniki (opisać) Do izolacji mitochondrialnego DNA (mtdna) pszenżyta wykorzystano sześć partii kiełków: N13, P13, T13, N, P oraz T. W rezultacie przeprowadzonej izolacji mitochondriów oraz mitochondrialnego DNA uzyskano próby o stężeniach DNA rzędu kilku ng/µl (rys. 11). 16

17 Rys. 11. Obraz elektroforetyczny uzyskanych preparatów mtdna pszenżyta. Równolegle rozdzielano wzorzec wielkości fragmentów DNA (M) oraz zróżnicowane ilości ( 4 ng) DNA faga λ (Thermo Scientific SD11). W próbach tych odnotowano także obecność znacznych ilości rybosomalnego RNA. Z tego względu próby mtdna poddano obtrawianiu RNazą A i dodatkowej rundzie oczyszczania na kolumnach adsorpcyjnych. Inspekcja oczyszczonych prób mtdna (rys. 12) wykazała brak zanieczyszczeń rybosomalnym RNA. Efektem ubocznym wykonanego doczyszczania było jednak obniżenie ilości DNA w próbach w większości z nich jest ono mniejsze niż 1 ng/µl. Szczególnie niskie wartości koncentracji odnotowano dla próby N13 z I elucji (rys.12). Pozostałe pięć izolowanych obiektów też charakteryzowało się niskim stężeniem, ale uznano, że spełniają one kryteria niezbędne do wykorzystania ich do dlaszych badań na poziomie sekwencyjnym. Rys. 12. Obraz elektroforetyczny oczyszczonych (obtrawianie RNazą A i II runda oczyszczania na kolumnach adsorpcyjnych) preparatów mtdna pszenżyta. Równolegle rozdzielano wzorzec wielkości fragmentów DNA (M) oraz zróżnicowane ilości ( 4 ng) DNA faga λ. Dyskusja (opisać jak w publikacji) Izolacja DNA mitochondrialnego zbóż jest najefektywniejsza, gdy materiał biologiczny stanowią etiolowane -14 dniowe kiełki (Tudzynski i in. 1986). Zastosowana w aktualnym projekcie metoda izolacji dała bardzo dobre wyniki przy analizach cytoplazm żytnich i zaowocowała opracowaniem pierwszych markerów diagnostycznych dla rodzaju cytoplazmy hodowlanej u żyta (Stojałowski i in. 6). Pewnym zaskoczeniem były problemy z uzyskaniem preparatów mtdna pszenżyta o zadowalającej czystości. Dodatkowa runda oczyszczania spowodowała, że koncentracja DNA została znacząco obniżona w finalnych preparatach, ale dla obiektów pozostaje wciąż w granicach, które pozwalają na użycie otrzymanych ekstraktów do sekwencjonowań wysokoprzepustowych nowej generacji (NGS). Obecnie do uzyskania biblioteki DNA w systemie firmy Illumina (jeden z wariantów NGS) wystarcza nawet 1 ng DNA (informacja od Emily Kumimoto z Genome Center, University of California-Davis). Biorąc pod uwagę możliwość łączenia prób reprezentujących tą samą cytoplazmę, ilości mtdna jakie zostały zabezpieczone są rzędu kilkudziesięciu nanogramów. Wnioski (opisać jak w publikacji) Uzyskano i zabezpieczono prób mtdna reprezentujących trzy cytoplazmy pszenżyta (normalna, CMS-T i CMS-P) w celu wykonania analiz sekwencjonowania metodami nowej generacji (NGS) 17