Praca magisterska. Struktura chromatyny rejonu promotorowego genu CTA1 drożdży Saccharomyces cerevisiae. Takao Ishikawa. Uniwersytet Warszawski

Transkrypt

1 Praca magisterska Struktura chromatyny rejonu promotorowego genu CTA1 drożdży Saccharomyces cerevisiae Takao Ishikawa Uniwersytet Warszawski 2003

2 Struktura chromatyny rejonu promotorowego genu CTA1 drożdży Saccharomyces cerevisiae Takao Ishikawa Praca magisterska wykonana pod kierunkiem dr. hab. Jana Fronka Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii, Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski 2003

3 Serdecznie dziękuję dr. hab. Janowi Fronkowi za opiekę, życzliwość, cierpliwość i zawsze konstruktywne rady mgr Urszuli Bulkowskiej dr Joannie Trzcińskiej-Danielewicz za życzliwość i praktyczne rady Agacie Jacewicz za nieocenioną pomoc w pracy laboratoryjnej wszystkim pracownikom i studentom Zakładu Biologii Molekularnej za stworzenie wspaniałej atmosfery pracy

4 Spis treści 1. Streszczenie Wstęp Założenia i cel pracy Materiały i metody...14 Informacje ogólne...14 Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane do doświadczeń...14 Pojemność stosowanych kolb Erlenmeyera i objętość hodowli...15 Badanie aktywności promotora genu CTA1 za pomocą genu reporterowego...16 Konstrukcja genu reporterowego oraz wektory...16 Otrzymywanie DNA plazmidowego z bakterii...17 Transformacja S.cerevisiae i selekcja transformantów...18 Pożywki użyte do regulacji aktywności genu CTA Hodowla S.cerevisiae...19 Schemat doświadczenia...21 Sporządzenie ekstraktów...22 Oznaczenie poziomu aktywności promotora genu CTA Oznaczanie stężenia białka w otrzymanym ekstrakcie...23 Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy...24 Obliczanie aktywności właściwej β-galaktozydazy...25 Analiza statystyczna...26 Badanie struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA Pożywki użyte w części doświadczenia dotyczącej ustalania struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA Hodowla S.cerevisiae...28 Izolacja jąder komórkowych S.cerevisiae i trawienie chromatyny nukleazą z micrococcus i DNazą I...30 Usuwanie komponentów białkowych z preparatu chromatyny i uzyskanie oczyszczonego DNA...33 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym mająca na celu sprawdzenie jakości preparatu...34 Analiza produktów trawienia DNazy I i nukleazy z Micrococcus...35 Trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI...35

5 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym preparatów gotowych do przeniesienia na membranę...36 Przenoszenie DNA z żelu agarozowego na membranę...36 Znakowanie sondy do hybrydyzacji...37 Hybrydyzacja typu Southern...38 Autoradiografia Wyniki...40 Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji...40 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu...45 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w fazie stacjonarnej...46 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu...47 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w fazie stacjonarnej...48 Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA Ustalenie miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie kontrolnym (MHY501α)...53 Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie pip Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach adr1 i oaf1 w warunkach represji i derepresji genu CTA Próba porównania położenia miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach MHY501α, adr1, oaf1 i pip2 w warunkach derepresji genu CTA Analiza miejsc nadwrażliwych na DNazę I w szczepie kontrolnym (MHY501α) i szczepie oaf1 w warunkach indukcji genu CTA Dyskusja...63 Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji...63 Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA Podsumowanie Literatura...73

6 1. Streszczenie Gen CTA1 kodujący katalazę A występującą w peroksysomach drożdży Saccharomyces cerevisiae podlega trójpoziomowej regulacji ekspresji zależnej od dostępnego źródła węgla. Ważną rolę w regulacji genu CTA1, a także innych genów peroksysomalnych, odgrywają czynniki transkrypcyjne Oaf1p i Pip2p. Ich rola w indukcji genów peroksysomalnych nie została jednak jednoznacznie wyjaśniona. W derepresji, a prawdopodobnie także w indukcji genu CTA1 bierze również udział czynnik transkrypcyjny Adr1p, regulujący transkrypcję wielu genów podlegających, podobnie jak gen CTA1, represji glukozowej. Badano wpływ wymienionych czynników transkrypcyjnych na ekspresję genu CTA1 śledząc poziom indukcji genu CTA1 przy użyciu wprowadzonej do komórek S.cerevisiae konstrukcji będącej fuzją obszaru promotora genu CTA1 z genem reporterowym, a także analizując strukturę nukleosomową rejonu promotora badanego genu w warunkach represji, derepresji i indukcji. Przeprowadzone badania sugerują, iż istotną rolę w procesie indukcji genu CTA1 pełni czynnik transkrypcyjny Oaf1p, natomiast czynniki transkrypcyjne Pip2p i Adr1p wydają się nie pełnić istotnej roli w indukcji genu CTA1. Uzyskane wyniki wskazują na subtelną reorganizację struktury chromatyny zachodzącą podczas indukcji w rejonie promotora genu CTA1. Nie zaobserwowano natomiast istotnych zmian struktury chromatyny w procesie derepresji genu CTA1. Jak dotąd nie udało się jednoznacznie określić wpływu poszczególnych czynników transkrypcyjnych na strukturę chromatyny rejonu promotora badanego genu. 1

7 2. Wstęp W każdym organizmie żywym informacja genetyczna zawarta jest w kwasie deoksyrybonukleinowym (DNA). We wszystkich organizmach jest odpowiedzialna za rozmaite procesy życiowe, ponadto w organizmach wielokomórkowych odpowiada ona także za proces rozwojowy, prowadzący do ukształtowania dojrzałego organizmu z zygoty powstałej w wyniku zapłodnienia. Organizmy żyjące dzieli się na prokarionty i eukarionty. Jedną z najważniejszych cech różniących te dwie grupy jest rozmieszczenie DNA w komórce. U prokariontów DNA znajduje się w cytoplazmie, w przeciwieństwie do eukariontów, których materiał genetyczny znajduje się w jądrze komórkowym. Warto tutaj wspomnieć, że komórka eukariotyczna jest tworem wysoce uporządkowanym. Występuje w niej wiele wyspecjalizowanych struktur zbudowanych z błon lipidowych, których funkcje są ściśle zdefiniowane. Można do nich zaliczyć m.in. jądro komórkowe przechowujące materiał genetyczny, siateczkę śródplazmatyczną będącą m.in. miejscem syntezy białek, aparat Golgiego odpowiedzialny za transport i sekrecję odpowiednich białek i peroksysomy, w których przede wszystkim zachodzą procesy związane z detoksykacją komórki. Funkcje jądra komórkowego nie ograniczają się do fizycznej izolacji materiału genetycznego. Jest to miejsce, w którym przebiega transkrypcja oraz różne procesy prowadzące do powstania ostatecznej cząsteczki mrna transportowanej następnie do cytoplazmy, gdzie zachodzi translacja. Fakt, że istnieje bariera oddzielająca materiał genetyczny wprowadza dodatkowy etap umożliwiający regulację wyrażania informacji genetycznej. 2

8 DNA w jądrze komórki eukariotycznej występuje w skondensowanej formie związany z silnie konserwowanymi ewolucyjnie białkami histonowymi, tworząc chromatynę. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom, zbudowany z oktameru histonowego składającego się z histonów H2A, H2B, H3 i H4 oraz fragmentu DNA o długości 146pz [1, 2]. Taki kompleks DNA i białek histonowych kondensując dalej tworzy tzw. włókno 30nm będące kolejnym stopniem upakowania materiału genetycznego. Włókna 30nm uważa się za najczęściej występującą formę chromatyny w jądrze niedzielącej się komórki. Warto przy tym wspomnieć, że w procesie kondensowania chromatyny bierze udział również histon H1, który wiąże się z DNA łączącym poszczególne nukleosomy [3]. W dzielących się komórkach dalsza kondensacja chromatyny ostatecznie prowadzi do powstania chromosomów metafazowych będących najsilniej skondensowaną formą materiału genetycznego. Histony H2A, H2B, H3 i H4 wchodzące w skład rdzenia nukleosomu mają identyczny schemat budowy charakteryzujący się silnie zasadową częścią rdzeniową tych białek oraz ogonami nie przyjmującymi konkretnych struktur przestrzennych. Domena rdzeniowa histonów, ze względu na swoje właściwości fizyczne, bardzo efektywnie oddziałuje z DNA umożliwiając wspomnianą wcześniej jego kondensację [4]. Część ogonowa histonów ulega różnym modyfikacjom posttranslacyjnym: acetylacji [5], fosforylacji [6], metylacji [7] i ubikwitynylacji [8, 9]. Uważa się, że enzymy modyfikujące reszty aminokwasowe tego rejonu mają ułatwiony dostęp dzięki brakowi zwartych i zdefiniowanych struktur przestrzennych. Modyfikacje posttranslacyjne ogonów histonowych pełnią istotną rolę w regulacji stopnia kondensacji chromatyny. Acetylacja powoduje obniżenie ładunku pozytywnego histonów i osłabia oddziaływanie DNA z tymi białkami, a w konsekwencji powoduje 3

9 rozluźnienie struktury chromatyny [10]. Jednak modyfikacje te nie służą jedynie regulacji struktury chromatyny. Hipoteza kodu histonowego zakłada, że pewne kombinacje modyfikacji posttranslacyjnych mogą powodować selektywną indukcję lub represję niektórych obszarów genoforu [11]. Niewątpliwie formowanie chromatyny służy kondensacji DNA, ale jej funkcje, jak wcześniej wspomniano, nie ograniczają się jedynie do fizycznego zmniejszenia długości nici DNA. Dzięki badaniom prowadzonym w ciągu ostatnich kilkunastu lat okazało się, że chromatyna pełni także funkcje regulujące transkrypcję genów, ponadto bierze ona udział w wielu procesach komórkowych związanych z DNA, takich jak naprawa czy rekombinacja [12]. Często spotykany w ostatnich latach termin epigenetyka definiuje się jako dziedziczne zmiany ekspresji genów niezależne od sekwencji nukleotydowej DNA [13]. Mechanizmy epigenetycznej regulacji transkrypcji genów uważa się zatem za niezależne w sposób bezpośredni od sekwencji nukleotydowej DNA. Głównymi mechanizmami takiej regulacji transkrypcji genów jest metylacja DNA i posttranslacyjne modyfikacje ogonów histonów powodujące reorganizację struktury chromatyny [14]. Obszary DNA, które uległy metylacji są zwykle nieaktywne transkrypcyjnie [13], znajduje to potwierdzenie również w przypadku wyciszenia transkrypcji genów w jednej z kopii chromosomów X u samic ssaków [15]. Metylacja DNA i modyfikacje ogonów histonów są ze sobą powiązane w słabo jak dotąd poznany sposób. Istnieje jednak kilka przykładów wskazujących na związek tych zjawisk. Jednym z nich jest Neurospora crassa. W organizmie tym stwierdzono, iż do metylacji DNA konieczna jest metylacja określonych reszt aminokwasowych w obrębie ogonów histonowych [16]. Istnieje również głęboki związek między metylacją DNA i 4

10 deacetylacją histonów. Badania wykazały, że metylacja DNA jest znacznikiem rozpoznawanym przez deacetylazy histonów, które przeprowadzają deacetylację ogonów histonów znajdujących się w nukleosomach w danym rejonie [17]. Powoduje to kondensację DNA i ogólną represję transkrypcji genów. Natomiast regulacja transkrypcji genów w drodze reorganizacji struktury chromatyny opiera się, najogólniej rzecz biorąc, na przesuwaniu nukleosomów i modulowaniu dostępności określonych sekwencji promotorowych dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii transkrypcyjnej. W tym przypadku, podobnie jak w przypadku metylacji, stwierdzono głęboki związek z modyfikacjami posttranslacyjnymi ogonów histonowych. Okazało się bowiem, że rekrutacja kompleksów reorganizujących strukturę chromatyny, takich jak Swi/Snf, uzależniona jest od acetylacji ogonów histonowych przeprowadzonej przez acetylazy histonowe [18, 19]. Wszystkie przedstawione przykłady wskazują na to, że mechanizmy epigenetycznej regulacji transkrypcji genów mają silne powiązania. Znanych jest wiele genów, których aktywność transkrypcji regulowana jest przez zmianę rozmieszczenia nukleosomów w rejonie promotorowym. Pod tym względem dokładnie poznano m.in. geny z grupy GAL (białka umożliwiające wykorzystanie galaktozy) [20, 21] i PHO (fosfataza kwaśna oraz białka regulatorowe) [22], gen ADH2 (dehydrogenaza alkoholowa II) [23, 24, 25] i gen TOP1 (topoizomeraza I) [26]. Wszystkie te badania zostały przeprowadzone na drożdżach piekarniczych Saccharomyces cerevisiae. Jest to najprostszy dobrze poznany organizm eukariotyczny, a łatwość manipulacji genetycznych i znajomość pełnej sekwencji nukleotydowej jego genomu czyni go bardzo atrakcyjnym organizmem modelowym do różnych badań. Ponadto posiada on wiele wspólnych cech z wyższymi organizmami eukariotycznymi. Można wśród nich wymienić m.in. ogólne zasady organizacji 5

11 struktury chromatyny, modyfikacje posttranslacyjne histonów i obecność kompleksów zmieniających strukturę chromatyny w sposób zależny od ATP [27]. Warto jednak pamiętać o szczególnych cechach S.cerevisiae. Genom S.cerevisiae jest niezwykle mały i prawie w całości aktywny transkrypcyjnie, podczas gdy w genomach wyższych organizmów eukariotycznych jedynie niewielka jego część ulega transkrypcyji [28]. Niektóre obszary metabolizmu komórkowego również są nieco odmienne w S.cerevisiae. Przykładem tego może być β-oksydacja, która zachodzi wyłącznie w peroksysomach [29]. To organellum pełni więc istotną rolę w degradacji kwasów tłuszczowych w komórkach drożdżowych, a dzięki temu S.cerevisiae staje się atrakcyjnym organizmem do prowadzenia badań nad tymi procesami. Podobnie jak w przypadku genów z grupy GAL i genu ADH2, geny peroksysomalne są regulowane przez warunki środowiska zewnętrznego. Zarówno dla genów z grupy GAL i genu ADH2, jak i dla genów peroksysomalnch jest nim źródło węgla. Geny z grupy GAL ulegają transkrypcji, gdy w środowisku znajduje się galaktoza [20], natomiast gen ADH2 jest aktywowany przez etanol lub brak glukozy [23]. W obu przypadkach regulacja jest dwupoziomowa (represja i derepresja). Sytuacja staje się bardziej skomplikowana w przypadku genów peroksysomalnych [30]. Kiedy w środowisku jest dostatecznie wysokie stężenie glukozy, która jest dla S.cerevisiae najdogodniejszym źródłem węgla, geny peroksysomalne ulegają represji [31]. Wynika to z faktu, iż w warunkach optymalnych komórka nie przeprowadza biogenezy peroksysomów. Derepresja tych genów jest powodowana obecnością związków niefermentowalnych, takich jak etanol. W stanie derepresji geny te ulegają transkrypcji, ale na bardzo niskim poziomie. Dopiero w środowisku bogatym w kwasy tłuszczowe geny peroksysomalne ulegają pełnej indukcji [32]. Można zatem stwierdzić, że jest to 6

12 regulacja trójpoziomowa. Geny peroksysomalne można podzielić na dwie grupy: geny kodujące białka odpowiedzialne za proliferację peroksysomów i geny kodujące enzymy katalizujące reakcje chemiczne zachodzące w peroksysomach. W przypadku S.cerevisiae do pierwszej grupy zalicza się około 20 genów PEX [33]. Fakt, iż mutacje genów ortologicznych u człowieka powodują choroby genetyczne, takie jak syndrom Zellwegera [34], wyraźnie wskazuje na to, że są to geny kodujące białka odgrywające istotne role w podstawowym metabolizmie komórki. Do drugiej grupy zalicza się takie geny jak CTA1 (katalaza A) [35], POX1 (oksydaza acylocoa), ECI1 (izomeraza enoilocoa), FOX2 (kompleks β-oksydacji) i FOX3 (tiolaza 3-oksoacyloCoA) [36]. Obok enzymów degradujących kwasy tłuszczowe, w peroksysomach występują także enzymy przeprowadzające detoksykację komórki. Wśród nich szczególnie istotną rolę wydaje się pełnić katalaza A kodowana przez gen CTA1, która jest odpowiedzialna za utylizację cząsteczki H 2 O 2 powstającej m.in. w procesie rozkładu kwasów tłuszczowych w peroksysomach. Transkrypcja genu CTA1 jest regulowana nie tylko przez źródło węgla, ale także przez tlen oraz hem [37]. Zarówno hodowla S.cerevisiae w warunkach beztlenowych, jak i brak hemu powodują znaczne obniżenie poziomu mrna genu katalazy A. Podobny sposób regulacji dotyczy także innych genów, ale w przypadku genu CTA1 obecność hemu nie znosi zahamowania transkrypcji spowodowanego hodowlą w warunkach beztlenowych. Jest to cecha wyróżniająca gen CTA1 spośród innych genów regulowanych przez tlen i hem. Poziom ekspresji genu CTA1 nie zmienia się także pomimo zmiany poziomu Hap1p, czynnika transkrypcyjnego zależnego od hemu [38]. Jest to zaskakujące, ponieważ w rejonie promotorowym genu CTA1 7

13 stwierdzono obecność sekwencji wykazującej duży stopień podobieństwa do sekwencji wiążącej Hap1p i można było się spodziewać wpływu tego białka na poziom ekspresji genu CTA1 [35]. Wydaje się więc prawdopodobne, że istnieje niepoznany jeszcze mechanizm regulujący transkrypcję genu CTA1 przy udziale tlenu i hemu. Jak wcześniej wspomniano, regulacja transkrypcji genu CTA1 zależna od dostępnego źródła węgla jest trójpoziomowa, a jej mechanizm jest dużo lepiej poznany w porównaniu z mechanizmem regulacji przy udziale tlenu i hemu. Zidentyfikowane zostały sekwencje nukleotydowe w rejonie promotora genu CTA1, z którymi wiążą się odpowiednie białka regulujące transkrypcję tego genu, m.in. Oaf1p, Pip2p i Adr1p. Funkcje niektórych z tych białek nie zostały jednak jednoznacznie określone. Fragment sekwencji promotora genu CTA1 Konsensus Sekwencja nukelotydowa ORE CGGCTTTAACAAATATAAACTCCG CGGNNNTNA(N )CCG Tab. 2-1 Porównanie sekwencji ORE występującej w rejonie od -209 do -185 promotora genu CTA1 z konsensusem tej sekwencji. Zaadaptowano z [39]. Charakterystyczną sekwencją nukleotydową występującą w rejonie promotorów genów regulowanych przez kwasy tłuszczowe jest ORE (oleate response element) [39]. Sekwencja ta odpowiedzialna jest za wiązanie białek aktywujących transkrypcję wielu genów peroksysomalych, w tym także genu CTA1. W przypadku tego genu, sekwencja ORE występuje w rejonie od -209 do -185 (numerem 1 oznaczono początek sekwencji nukleotydowej kodującej Cta1p) [35]. Tuż obok znajduje się inna istotna sekwencja nukleotydowa biorąca udział w regulacji transkrypcji genu CTA1. Jest to sekwencja UAS1 (upstream activating sequence type 1) 8

14 występująca w rejonie od -184 do -156 [40]. Jest ona miejscem wiązania białka odpowiedzialnego za derepresję genu CTA1 [32]. Stosunkowo dobrze poznana została rola czynników transkrypcyjnych Oaf1p, Pip2p i Adr1p w regulacji transkrypcji genu CTA1. Pip2p zostało opisane również jako Oaf2p [41]. Porównanie Oaf1p i Pip2p wykazało około 40% homologię sekwencji aminokwasowych, szczególnie wysoką w części N-końcowej tych białek, gdzie znajdują się motywy palców cynkowych (Zn 2 Cys 6 ) odpowiedzialne za wiązanie tych białek z sekwencją ORE [42, 43, 44]. Białka te wydają się wiązać z sekwencją ORE jako heterodimer Oaf1p-Pip2p [43, 45, 46], jednak istnieją badania sugerujące możliwość wiązania się homodimeru (Oaf1p) 2 z sekwencją ORE przy braku Pip2p [39, 45]. Niedobór Pip2p może być spowodowany różnicą w ekspresji genów kodujących te białka. W przeciwieństwie do genu OAF1 wyrażanego konstytutywnie, transkrypcja genu PIP2 jest aktywowana przez kwasy tłuszczowe, a w rejonie promotorowym genu PIP2 występuje sekwencja ORE [45]. Niektóre prace sugerują jednak konieczność występowania heterodimeru Oaf1p-Pip2p do indukcji genu CTA1 [43, 45, 46], tak więc mechanizm aktywacji transkrypcji tego genu wymaga dalszych badań. Adr1p jest czynnikiem transkrypcyjnym aktywującym transkrypcję genów związanych z wykorzystywaniem niefermentowalnych źródeł węgla, takich jak etanol, glicerol czy kwasy tłuszczowe, kiedy stężenie glukozy w pożywce jest zbyt niskie [31]. Pod jego kontrolą jest wiele genów kodujących enzymy związane z metabolizmem niefermentowalnych źródeł węgla, w tym gen CTA1 [41]. Adr1p wiąże się z sekwencją UAS1 występującą w rejonie od -184 do -156 genu CTA1 i pełni istotną rolę w derepresji tego genu [32]. Niektóre prace sugerują także udział tego białka w indukcji genu CTA1 [32, 47]. Istnieje jednak praca, która stwierdza brak oddziaływania między 9

15 Adr1p i sekwencją ORE [32]. Wydają się więc niezbędne dalsze badania mające na celu wyjaśnienie mechanizmu ewentualnej indukcji genu CTA1 przez Adr1p. ORE UAS1 CTA Indukcja? Derepresja Oaf1p Pip2p Adr1p lub Oaf1p Oaf1p Ryc. 2-1 Schemat rejonu promotora genu CTA1. Zaznaczono istotne sekwencje nukleotydowe biorące udział w regulacji tego genu oraz oddziałujące z nimi białka. Regulacja genów związanych z wykorzystaniem niefermentowalnych źródeł węgla może również być kontrolowana na wyższym poziomie. W procesie tym biorą udział takie białka jak Snf1p i Glc7p [47, 48]. Snf1p jest kinazą białkową działającą wydajnie w warunkach niskiego stężenia glukozy w komórce. Aktywna forma Snf1p fosforyluje wcześniej wspomniany czynnik transkrypcyjny Adr1p i umożliwia jego działanie jako aktywatora transkrypcji genów związanych z wykorzystywaniem niefermentowalnych źródeł węgla. Glc7p zaś jest fosfatazą białkową aktywną w warunkach wysokiego stężenia glukozy w komórce i działając na Adr1p uniemożliwia W ostatnim czasie stwierdzono, że ekspresja genu PIP2 jest zależna od Adr1p [66]. W sugerowanej przez niektórych autorów indukcji genu CTA1 przez Adr1p może więc pośredniczyć gen PIP2. Nie poznano jednak ewentualnego mechanizmu indukcji genu CTA1 przez Adr1p. 10

16 jego działanie jako czynnika transkrypcyjnego [48]. Można stwierdzić, że Adr1p pełni rolę swoistego przełącznika odpowiednich genów, w tym genu CTA1, włączającego lub wyłączającego transkrypcję w zależności od stężenia glukozy w środowisku zewnętrznym. Istnieje inny, równie ważny mechanizm regulacji transkrypcji genów, który najprawdopodobniej jest zaangażowany także w regulację transkrypcji genu CTA1. Jest nim reorganizacja struktury chromatyny. Czasowe wyłączenie syntezy histonu H4 w specjalnie skonstruowanym szczepie S.cerevisiae spowodowało aktywację transkrypcji ok. 15% genów zawartych w genomie [49]. Jako przyczynę tego zjawiska podano niemożność formowania poprawnej struktury chromatyny spowodowaną brakiem histonu H4, a w konsekwencji ogólne rozluźnienie chromatyny. W ten sposób białka inicjujące transkrypcję genów uzyskują łatwiejszy dostęp do istotnych w tym procesie sekwencji nukleotydowych. Wśród genów, w których nastąpiła aktywacja transkrypcji znajduje się również gen CTA1. Może to świadczyć o tym, że istnieje związek struktury chromatyny i regulacji transkrypcji genu CTA1. Jednak rozluźnienie struktury chromatyny może powodować również zmiany poziomu ekspresji innych genów, których produkty wpływają na transkrypcję genu CTA1, tak więc może to być jedynie efekt pośredni. Dzięki stosunkowo dobrze poznanym wpływom czynników transkrypcyjnych oraz prawdopodobnemu udziałowi struktury chromatyny w regulacji ekspresji genu CTA1, gen ten wydaje się atrakcyjnym modelem do badań nad wpływem struktury chromatyny na ekspresję genów. Pełne poznanie mechanizmów regulacji transkrypcji genów w komórkach S.cerevisiae powinno ułatwić także zrozumienie podobnych procesów w innych organizmach. Dzięki temu możliwe będzie dokładne poznanie 11

17 mechanizmów rozwoju organizmu, przyczyn wielu chorób, metod ich leczenia i innych zagadnień związanych z wyrażaniem informacji genetycznej. 12

18 3. Założenia i cel pracy Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 regulowana jest w zależności od dostępnego źródła węgla. Mechanizm ten został dość dobrze poznany, jednak rola niektórych czynników transkrypcyjnych biorących udział w regulacji transkrypcji genu CTA1 nie została jednoznacznie wyjaśniona. Nie została także poznana kinetyka indukcji genu CTA1. Prawdopodobna natomiast jest regulacja aktywności transkrypcji genu CTA1 przez reorganizację struktury chromatyny. Jednak do tej pory nie zostały przeprowadzone badania mające na celu stwierdzenie udziału tego mechanizmu w regulacji transkrypcji genu CTA1. Celem tej pracy było: Ustalenie wpływu nieobecności czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p na regulację aktywności transkrypcyjnej genu CTA1. Zbadanie kinetyki indukcji genu CTA1. Wykazanie udziału reorganizacji struktury chromatyny w regulacji aktywności transkrypcyjnej genu CTA1 oraz wpływu czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p na reorganizację struktury chromatyny. 13

19 4. Materiały i metody Informacje ogólne POCh i Merck. Jeżeli nie zaznaczono inaczej, stosowano odczynniki cz.d.a. z firm: Sigma, Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane do doświadczeń Symbol szczepu Symbol usuniętej ORF Nazwa usuniętego genu Genotyp MHY501α MATα; his3-200; leu2-3; 112 ura3-52 trp1-1 BY4742 MATα; his3 1; leu2 0; lys2 0; ura3 0 Y10355 oaf1 YAL051w OAF1 BY4739; MATα; leu2 0; lys2 0; ura3 0; YAL051w::kanMX4 Y11660 pip2 YOR363c PIP2 BY4742; MATα; his3 1; leu2 0; lys2 0; ura3 0; YOR363c::kanMX4 Y13575 adr1 YDR216w ADR1 BY4742; MATα; his3 1; leu2 0; lys2 0; ura3 0; YDR216w::kanMX4 Wszystkie wyżej wymienione szczepy pochodzą z EUROSCARF (European Saccharomyces cerevisiae archive for functional analysis) z wyjątkiem szczepu MHY501α, który został opisany w [50]. 14

20 Pojemność stosowanych kolb Erlenmeyera i objętość hodowli Pojemność kolby 100ml 250ml 2000ml Objętość hodowli 25ml 50ml lub 75ml 500ml 15

21 Badanie aktywności promotora genu CTA1 za pomocą genu reporterowego Badanie aktywności promotora genu CTA1 prowadzono przy użyciu wprowadzonej do komórek S.cervisiae konstrukcji będącej fuzją natywnego obszaru promotora genu CTA1 z genem kodującym β-galaktozydazę. Po sporządzeniu ekstraktu z odpowiednich hodowli S.cerevisiae oznaczano zawartość białka oraz aktywność β-galaktozydazy niżej opisanymi metodami. Obliczona w sposób niżej opisany aktywność właściwa β-galaktozydazy jest pośrednią miarą aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1. Konstrukcja genu reporterowego oraz wektory Doświadczenie prowadzono przy użyciu genu reporterowego będącego fuzją obszaru promotorowego genu CTA1 z S.cerevisiae (sekwencja nukleotydowa od -819 do +3, numerem 1 oznaczono początek sekwencji nukleotydowej kodującej Cta1p) i sekwencji genu lacz z Escherichia coli kodującej β-galaktozydazę. Ten gen fuzyjny został wprowadzony na wektor episomalny i integracyjny. Wektor episomalny, pochodna plazmidu YEp357 [51], niesie ori 2µ i dzięki temu występuje w komórce w wielu kopiach. Wektor integracyjny zaś występuje w komórce w jednej kopii i jest pochodną plazmidu YIp357, który integruje z genomem w locus URA3 [51]. Oba plazmidy niosą marker uracylowy przydatny w selekcji transformantów drożdżowych, ponadto oba plazmidy są bifunkcyjne, funkcjonują zarówno w komórkach S.cerevisiae 16

22 jak i E.coli. Plazmidy te zostały zaprojektowane, wykonane i udostępnione przez dr. M. Skonecznego z Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Plazmid episomalny i integracyjny nazwano odpowiednio p149 i p150. Otrzymywanie DNA plazmidowego z bakterii Plazmidy udostępnione przez dr. M. Skonecznego znajdowały się w komórkach E.coli XL-1 Blue MRF ( (mcra)183 (mcrcb-hsdsmr-mrr)173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac [F proab laci q Z M15 Tn10 (Tet r )]). Plazmidowy DNA został wyizolowany metodą lizy alkalicznej [52]. Dodatkowo do buforu, w którym zawieszano bakterie, dodano RNazęA (Sigma) do końcowego stężenia 0,5mg/ml. W celu identyfikacji otrzymanych plazmidów część wyizolowanego preparatu poddano trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI/BamHI i ApaI/BamHI (Fermentas), a następnie przeprowadzono elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym. Uzyskano fragmenty DNA zgodne z oczekiwanymi na podstawie map restrykcyjnych tych plazmidów (elektroforetogramów nie przedstawiono). Plazmid integracyjny został poddany trawieniu endonukleazą restrykcyjną ApaI (Fermentas), której jedyne miejsce rozpoznawane znajduje się w obrębie genu URA3. W ten sposób plazmid integracyjny został przygotowany do transformacji i integracji z genomem S.cerevisiae w locus genu URA3. 17

23 Transformacja S.cerevisiae i selekcja transformantów W celu wprowadzenia plazmidów p149 i p150 do wszystkich wyżej wymienionych szczepów S.cerevisiae, zastosowano metodę wysokowydajnej transformacji drożdży [53]. S.cerevisiae szczepiono na pożywkę YPD2% (1% ekstrakt drożdżowy, 1% pepton, 2% glukoza) i inkubowano w 30 0 C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc. Po sprawdzeniu gęstości hodowli (liczenie komórek w komorze Bürkera), przeszczepiano odpowiednią objętość hodowli w ten sposób, aby w nowej pożywce YPD2% (obj. 50ml) gęstość hodowli wynosiła komórek/ml. Prowadzono hodowlę w 30 0 C z wytrząsaniem (250obr./min.) do momentu uzyskania gęstości hodowli komórek/ml. Hodowlę wirowano następnie przy 3000g przez 5min., płukano wodą i zawieszano w 1,0ml 100mM octanu litu. Po wirowaniu w mikrowirówce i usunięciu supernatantu zawieszano osad komórek w 100mM octanu litu tak, aby objętość końcowa wynosiła 500µl. Do 50µl w ten sposób przygotowanych komórek S.cerevisiae dodawano 350µl buforu do transformacji (240µl PEG 3350 (50% w/v), 36µl 1M octanu litu, 15µl ssdna (10mg/ml), 59µl wody) oraz ok. 1µg DNA plazmidowego. Po dokładnym wymieszaniu mieszaninę inkubowano w 30 0 C przez 30min., a następnie poddawano szokowi cieplnemu w 42 0 C przez 30min. Poprzez wirowanie w mikrowirówce usuwano bufor do transformacji, a osad komórek zawieszano w 300µl wody. Całość zawiesiny komórek wysiewano na szalkę z pożywką ω 0 2% (0,67% YNB (zestaw soli mineralnych i witamin, ang. Yeast Nitrogen Base without Aminoacids, Difco), 2% glukoza) zawierającą odpowiednie uzupełnienia aminokwasów (10-50µg/ml), ale bez uracylu, ponieważ selekcja transformantów opierała się na zniesieniu wymagania uracylu do wzrostu. 18

24 Pożywki użyte do regulacji aktywności genu CTA1 Represja Derepresja Indukcja ω 0 10% ω 0 EtOH ω 0 Kw.Ol. 0,67% YNB 10% glukoza 0,67% YNB 0,5% glukoza 2% etanol 0,67% YNB 0,5% kwas olejowy Hodowla S.cerevisiae Dzień 1 Odpowiedni szczep drożdży S.cerevisiae szczepiono na pożywkę ω 0 2% (obj. 50ml) i hodowano w 30 0 C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc do osiągnięcia wartości OD 600 =2,5-3,0 (fazy stacjonarnej). Dzień 2 Z hodowli założonej w dniu poprzednim szczepiono do pożywek ω 0 10% (obj. 50ml) i ω 0 EtOH (dwie hodowle o obj. 75ml), odpowiednio po µl i 1,0-6,0ml hodowli. Zaszczepione pożywki umieszczano w takich samych warunkach. Hodowle prowadzono przez noc. Dzień 3 Hodowle z poprzedniego dnia prowadzono do momentu osiągnięcia wartości OD 600 =1,5 (logarytmiczna faza wzrostu) i OD 600 =2,5 (faza stacjonarna). Po osiągnięciu planowanych wartości OD 600, z hodowli prowadzonych w pożywce ω 0 10% sporządzano 19

25 ekstrakt (w sposób niżej opisany), natomiast dwie identyczne hodowle prowadzone w pożywce ω 0 EtOH o objętości 75ml w pożywce mieszano ze sobą uzyskując w ten sposób 150ml hodowli. Po rozdzieleniu hodowli na 6 porcji po 25ml, poddawano je wirowaniu (5000g, 2min.), następnie po usunięciu pożywki w sterylnych warunkach przenoszono komórki do pożywki ω 0 Kw.Ol w porcjach po 25ml. Z jednej z sześciu tak przeszczepionych hodowli sporządzano ekstrakt natychmiast po przeszczepieniu, a pozostałe pięć hodowli umieszczano w 30 0 C i prowadzono hodowlę z wytrząsaniem (250obr./min.) przez 3, 6, 9, 12 i 24 godziny. Po hodowli prowadzonej przez określony czas sporządzano ekstrakt. Hodowle mające na celu indukcję genu CTA1 przeszczepiano po osiągnięciu planowanej wartości OD 600 w pożywce ω 0 EtOH, ponieważ komórki S.cerevisiae nie dzielą się w pożywce ω 0 Kw.Ol. Opisana procedura oraz schemat hodowli S.cerevisiae (Ryc. 4-1) dotyczą pełnego doświadczenia mającego na celu zbadanie zarówno procesu indukcji, jak i procesu derepresji genu CTA1. W dalszej części pracy zostaną jednak przedstawione wyłącznie wyniki dotyczące procesu indukcji badanego genu. 20

26 ω 0 2% 50ml ω 0 Kw.Ol. 6 x 25ml Zaraz po przeszczep. ekstrakt ω 0 EtOH 2 x 75ml do OD 600 =1,5 Ekstrakt po hodowli przez 3, 6, 9,12 i 24h ω 0 10% 50ml do OD 600 =1,5 ω 0 EtOH 2 x 75ml do fazy stac. ω 0 10% 50ml do fazy stacjonarnej ω 0 Kw.Ol. 6 x 25ml Zaraz po przeszczep. ekstrakt Ekstrakt po hodowli przez 3, 6, 9,12 i 24h Ekstrakt Ekstrakt Ryc. 4-1 Schemat hodowli S.cerevisiae prowadzonych w celu sporządzania ekstraktów drożdżowych, w których następnie oznaczano aktywność promotora genu CTA1 mierząc aktywność β-galaktozydazy. Linią przerywaną zaznaczono część doświadczenia, której wyniki zostaną przedstawione w dalszej części pracy. 21

27 Sporządzenie ekstraktów Hodowlę poddawano wirowaniu przy 5000g przez 2min., w 4 0 C. Osad komórek uzyskany w wyniku wirowania zawieszano w 25ml sterylnej wody w celu usunięcia resztek pożywki. Komórki następnie poddawano wirowaniu jak wcześniej, a uzyskany osad komórek zawieszano w 400µl (dla hodowli o obj. 25ml) lub 800µl (dla hodowli o obj. 50ml) 50mM buforu potasowo-fosforanowego (50mM KPi ph7,0). Do zawiesiny dodawano równą objętość szklanych kulek ( 0,45-0,50mm), a następnie zamrażano w C. Na tym etapie przechowywano uzyskane komórki od kilku dni do miesiąca. Po rozmrożeniu w temperaturze pokojowej komórki rozbijano przez sześciominutowe wytrząsanie na mikrowstrząsarce typu vortex w temperaturze 4 0 C. W celu usunięcia nierozbitych komórek i reszt ścian komórkowych, uzyskany homogenat poddawano wirowaniu przy 10000g przez 5min. w 4 0 C. Otrzymaną w supernatancie frakcję cytoplazmatyczną wykorzystywano bezpośrednio do oznaczeń stężenia białka oraz aktywności β-galaktozydazy. Stosowane podczas sporządzania ekstraktów szklane kulki płukano przed użyciem w stężonym kwasie solnym. Po ok. 4 godzinach przemywano wodą doprowadzając do ph7, a następnie suszono przez 3 godziny w C. 22

28 Oznaczenie poziomu aktywności promotora genu CTA1 A. Oznaczanie stężenia białka w otrzymanym ekstrakcie Oznaczanie przeprowadzano metodą Bradford [54], zgodnie z niniejszym schematem. Do oznaczeń używano odczynnika Bradford z firmy Sigma. Próba kontrolna Próba oznaczana 1ml H 2 O 990µl H 2 O + 10µl ekstraktu rozcieńczonego 2x lub 5x w 50mM KPi 1ml odczynnika Bradford 1ml odczynnika Bradford Po dodaniu odczynnika Bradford próby pozostawiano na 10min., a następnie oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali 595nm. Rozcieńczenia ekstraktu dobierano tak, aby odczyt spektrofotometryczny mieścił się w przedziale 0,2-0,7. Każdy ekstrakt oznaczano w dwóch powtórzeniach, a stężenie białka w ekstrakcie obliczano na podstawie uśrednionych wartości z dwóch pomiarów. Podstawę obliczeń stężenia białka stanowiła krzywa wzorcowa wykonana przy użyciu roztworu albuminy o stężeniu 1mg/ml. Roztwór ten rozcieńczano wodą tak, aby uzyskać stężenia albuminy 1,67µg/ml, 3,33µg/ml, 5,0µg/ml, 10µg/ml, 15µg/ml i 20µg/ml. Wszystkie wymienione roztwory albuminy oznaczano w dwóch powtórzeniach i odczyty uśredniano, podobnie jak w przypadku oznaczenia stężenia białka w próbach. Dla każdej nowej butelki odczynnika Bradford sporządzano nową krzywą wzorcową. 23

29 B. Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy prowadzono wg [55] przy użyciu o-nitrofenylogalaktopiranozydu (ONPG). Związek ten rozkładany jest przez β-galaktozydazę na galaktozę i barwny o-nitrofenol. Do 800µl buforu Z (60mM NaH 2 PO 4, 40mM Na 2 HPO 4, 10mM KCl, 1mM MgSO 4, ph7,0) dodawano 50µl ekstraktu odpowiednio rozcieńczonego w 50mM KPi. W próbie kontrolnej zamiast ekstraktu dodawano 50mM KPi. Przygotowaną próbkę inkubowano w 30 0 C przez 5min. Następnie dodawano 160µl 0,4% ONPG (substrat do reakcji, rozpuszczony w 50mM Tris-HCl, ph8) i inkubowano w takich samych warunkach, mierząc czas inkubacji, do uzyskania widocznego gołym okiem jasno żółtego zabarwienia. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 400µl 1M węglanu sodu i umieszczano w lodzie. Oznaczanie zawartości o-nitrofenolu prowadzono spektrofotometrycznie przy długości fali 420nm. Oznaczenie aktywności β-galaktozydazy dla każdego ekstraktu prowadzono w dwóch powtórzeniach. Następnie wyniki pomiaru spektrofotometrycznego uśredniano w celu prowadzenia dalszych obliczeń. Czas trwania reakcji wahał się od 3 do 46min., natomiast rozcieńczenia ekstraktów od 1 do 500 razy. Różnice zarówno w czasie reakcji, jak i w rozcieńczeniu ekstraktu wynikają z poziomu aktywności β-galaktozydazy w poszczególnych ekstraktach. Reakcja ta jest liniowa w czasie i w stosunku do rozcieńczeń ekstraktu [56]. 24

30 C. Obliczanie aktywności właściwej β-galaktozydazy Aktywność właściwą β-galaktozydazy obliczano stosując następujący wzór matematyczny: A u x = ε l p v t gdzie: x aktywność właściwa β-galaktozydazy [µmol mg -1 min -1 ] A u wartość absorbancji przy długości fali 420nm całkowita objętość, w której prowadzono reakcję. W stosowanym układzie doświadczalnym wartość ta wynosiła 1,41 [ml] ε współczynnik absorbancji o-nitrofenolu przy długości fali 420nm. Wartość współczynnika wynosi 0,0045 [µm -1 cm -1 ] l p v t grubość kuwety. W doświadczeniu używano kuwet o grubości 1 [cm] stężenie białka w ekstrakcie [mg/ml] objętość nierozcieńczonego ekstraktu dodana do reakcji [ml] czas trwania reakcji [min.] 25

31 Na podstawie otrzymanych wyników dla każdego szczepu, w logarytmicznej fazie wzrostu oraz w fazie stacjonarnej, obliczano względny poziom indukcji promotora genu CTA1, wyrażany następującym wzorem: Akt. Akt. Kw.Ol. xh EtOH (Kw.Ol.0h) gdzie: Akt. Kw.Ol. xh aktywność β-galaktozydazy po x godzinach hodowli w warunkach indukcji (gdzie x = 3, 6, 9, 12 lub 24 godziny) Akt. EtOH (Kw.Ol. 0h) aktywność β-galaktozydazy w warunkach derepresji (wartości uzyskane dla ekstraktów sporządzanych z komórek tuż po ich przeniesieniu do pożywki ω 0 Kw.Ol.) D. Analiza statystyczna W celu sprawdzenia istotności statystycznej różnic poziomu indukcji genu CTA1 między szczepem kontrolnym i szczepami badanymi przeprowadzono test sprawdzający równość wariancji oraz dwustronny test t Studenta różnic między średnimi przy różnych wariancjach. W obu testach za próg istotności statystycznej przyjęto wartość p=0,

32 Badanie struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1 Przy badaniu struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1 stosowano metodę pośredniego znakowania końców [57, 58, 59]. Wyizolowane jądra komórkowe poddawano trawieniu nukleazą z Micrococcus i DNazą I o różnych stężeniach. Po zakończeniu reakcji odbiałczano DNA i przecinano wyczerpująco odpowiednio dobraną endonukleazą restrykcyjną. Wybrano endonukleazę restrykcyjną, która nie ma miejsca cięcia w obszarze, którego strukturę chromatyny analizowano, ale tnącą DNA w pobliżu tego obszaru. W przypadku genu CTA1 dogodną endonukleazą restrykcyjną jest MboI, która ma miejsce cięcia zarówno po stronie 5', jak i 3' obszaru promotorowego CTA1. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym DNA poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym, przenosi na filtr i po denaturacji hybrydyzuje z krótką, wyznakowaną radioaktywnie sondą o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji zlokalizowanej blisko miejsca działania użytej endonukleazy restrykcyjnej. Z sondą hybrydyzują odcinki DNA o różnej długości, jednak jeden ich koniec jest zawsze ten sam, powstały w wyniku trawienia endonukleazy restrykcyjnej. Natomiast drugi koniec powstaje w wyniku trawienia nukleazą z Micrococcus lub DNazą I. Miejscem działania nukleazy z Micrococcus jest DNA znajdujący się między nukleosomami, nie chroniony przez oktamery histonowe. Zatem długości hybrydyzujących odcinków określają odległość miejsc wrażliwych na użytą nukleazę od miejsca cięcia MboI, a co za tym idzie, rozmieszczenie nukleosomów w badanym rejonie chromatyny. W przypadku działania DNazą I można zidentyfikować tzw. miejsca nadwrażliwe. Są one jednak często w innym miejscu niż miejsca wrażliwe na nukleazę z Micrococcus. Substratem dla DNazy I są miejsca na nici DNA o zmienionej strukturze przestrzennej. DNaza I 27

33 atakuje miejsca te nawet wtedy, gdy znajdują się one na nukleosomach. Interesujący jest również fakt, iż miejsca te są charakterystyczne dla obszarów promotorowych i często odpowiadają miejscom wiązania czynników transkrypcyjnych [60, 61]. Pożywki użyte w części doświadczenia dotyczącej ustalania struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1 Hodowlę mającą na celu odświeżenie i namnożenie komórek S.cerevisiae prowadzono w pożywce pełnej YPD2%, następnie hodowle przeszczepiano na pożywki zapewniające regulację aktywności promotora genu CTA1. Represja Derepresja Indukcja YPD10% YPDE YPO 1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 10% glukoza 1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 0,5% glukoza 2% etanol 1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 0,5% kwas olejowy Hodowla S.cerevisiae Dzień 1 Odpowiedni szczep drożdży S.cerevisiae szczepiono na pożywkę YPD2% (obj. 25ml) i hodowano w 30 0 C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc do osiągnięcia wartości OD 600 =9,0-10,0 (fazy stacjonarnej). 28

34 Dzień 2 Niewielką objętość hodowli (300µl-900µl) założonej poprzedniego dnia szczepiono do trzech kolb z pożywką YPD10% (represja) i sześciu kolb z pożywką YPDE (derepresja i indukcja) o objętości 500ml. Pożywki te uzupełniano streptomycyną i ampicyliną (odpowiednio 40µg/ml i 30µg/ml). Zaszczepione pożywki umieszczano w takich samych warunkach i prowadzono hodowle przez noc. Dzień 3 Hodowlę z poprzedniego dnia prowadzono do momentu osiągnięcia OD 600 =2,5 (logarytmiczna faza wzrostu). Po osiągnięciu planowanej wartości OD 600 hodowle z trzech kolb z jednakową pożywką łączono, a następnie prowadzono izolację jąder komórkowych (represja i derepresja) lub przenoszono do pożywki YPO (indukcja). W tym przypadku poddawano hodowlę wirowaniu przy 3000g przez 5min. w temperaturze pokojowej. Następnie osad komórek przenoszono sterylnie do trzech kolb z pożywką YPO (obj. 500ml). Hodowlę prowadzono w 30 0 C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc. Dzień 4 (dotyczy tylko hodowli prowadzonej w warunkach indukcji genu CTA1) komórkowych. Po trwającej 24 godziny hodowli w pożywce YPO rozpoczynano izolację jąder Hodowlę mającą na celu indukcję genu CTA1 przeszczepiano po osiągnięciu planowanej wartości OD 600 w pożywce YPDE, ponieważ komórki S.cerevisiae nie dzielą się w pożywce YPO. 29

35 Wartości OD 600 wskazujące na osiągnięcie przez hodowlę odpowiedniej fazy wzrostu różnią się w zależności od stosowanej pożywki. Przy hodowli prowadzonej w pożywce minimalnej ω 0 (stosowana w części dotyczącej oznaczenia aktywności właściwej β-galaktozydazy) wartość OD 600 =2,5 odpowiada najczęściej fazie stacjonarnej, w pożywce pełnej YPD wartość ta jednak odpowiada logarytmicznej fazie wzrostu. Izolacja jąder komórkowych S.cerevisiae i trawienie chromatyny nukleazą z Micrococcus i DNazą I Izolację jąder przeprowadzano metodą wirowania w gradiencie gęstości fikolu lizatu sferoplastów otrzymanych w wyniku traktowania komórek drożdży zymoliazą [22]. Hodowlę o odpowiedniej wartości OD 600 poddawano wirowaniu przy 3000g przez 5min. w temperaturze pokojowej. Osad komórek zawieszano w równej objętości wody * i wirowano w takich samych warunkach. Następnie osad zawieszano w 60ml roztworu 1 * (20mM EDTA ph7,4, 0,7M β-merkaptoetanol) i umieszczano w 30 0 C. Po inkubacji trwającej 30min. wirowano zawiesinę komórek przy 3000g przez 5min. w temperaturze pokojowej. Po zawieszeniu osadu komórek w 50ml 1M sorbitolu *, wirowano jak wcześniej. Uzyskany osad komórek zawieszano w 20ml roztworu 2 * (1M sorbitol, 5mM β-merkaptoetanol) i przenoszono do kolbki o pojemności 100ml, którą umieszczano w * Symbolem tym oznaczono roztwory, do których dodawano glukozę do stężenia 5% (w/v) w przypadku otrzymywania jąder komórkowych z hodowli prowadzonych w pożywce YPD10%. Dodatek ten służył utrzymaniu stanu represji glukozowej. 30

36 inkubatorze z wytrząsaniem (30 0 C, 200obr./min.). Następnie dodawano 10-20mg zymoliazy 100T z Arthrobacter luteus (Seikagaku) zawieszonej w 1ml 50mM KPi ph7,5 i prowadzono inkubację przez ok. 35min. Stopień strawienia ściany komórkowej S.cerevisiae oceniano na podstawie obserwacji w mikroskopie świetlnym wykorzystując właściwości sferoplastów (komórek pozbawionych ściany komórkowej), które rozpadają się w wodzie na skutek ciśnienia osmotycznego. Po pobraniu niewielkiej objętości z zawiesiny komórek umieszczano ją w wodzie oraz 1M sorbitolu i porównywano obraz obu zawiesin. Po stwierdzeniu braku sferoplastów w wodzie przystępowano do dalszego etapu procedury. W zależności od stopnia strawienia ściany komórkowej, czas trawienia zymoliazą 100T przedłużano do półtorej godziny prowadząc obserwację mikroskopową co 15min. Procedurę otrzymania jąder komórkowych z S.cerevisiae po uzyskaniu sferoplastów prowadzono w 4 0 C. Sferoplasty wirowano przy 3600g przez 10min., uzyskany osad zawieszano w 15ml 1M sorbitolu *. Zawiesinę poddawano wirowaniu w takich samych warunkach, uzyskując osad sferoplastów gotowych do lizy. Sferoplasty zawieszano w 100ml roztworu do lizy * (18% ficoll 400 (Pharmacia Fine Chemicals), 20mM KPi ph6,8, 0,25mM EGTA, 0,25mM EDTA, 1mM MgCl 2, 1mM PMSF) i homogenizowano ręcznie w lodzie przy pomocy homogenizatora typu Pottera-Elvehjema. Homogenat poddawano wirowaniu przy 2500g przez 5min., następnie supernatant przenoszono do nowych probówek i wirowano przy 30000g przez 25min (15749obr./min. w wirówce Beckman J-30I Avanti z rotorem JA30.50Ti). Połowę uzyskanego w ten sposób osadu jąder S. cerevisiae zawieszano w 15ml buforu do DNazyI * (15mM Tris ph7,4, 75mM NaCl, 3mM MgCl 2, 0,05mM CaCl 2, 1mM β-merkaptoetanol), a drugą połowę w 15ml buforu do nuklezay z Micrococcus * (15mM 31

37 Tris ph8,0, 50mM NaCl, 1,4mM CaCl 2, 0,2mM EGTA, 0,2mM EDTA, 5mM β-merkaptoetanol). Zawiesinę jąder wirowano przy 2500g przez 5min. Osad jąder zawieszano ponownie w 15ml odpowiedniego buforu i wirowano w takich samych warunkach. Uzyskany w ten sposób osad jąder zawieszano w 2ml odpowiedniego buforu. Następnie w celu ustalenia zawartości DNA w otrzymanych preparatach wprowadzano po 5µl zawiesiny jąder do 2ml roztworu do pomiaru stężenia DNA (1% SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, ph7,5). Zawartość DNA w preparatach ustalano spektrofotometrycznie przy długości fali 260nm. W przypadku uzyskania odczytów większych niż A 260 =240 dla nierozcieńczonych preparatów (A 260 =0,6 dla preparatu 400 razy rozcieńczonego przy pomiarze) rozcieńczano je odpowiednim buforem do wartości A 260 =240, natomiast przy odczytach większych niż A 260 =24 dla nierozcieńczonych preparatów (A 260 =0,06 dla preparatu 400 razy rozcieńczonego przy pomiarze) rozcieńczano je odpowiednim buforem do wartości A 260 =24 (procedura ustalona empirycznie przez dr Joannę Trzcińską-Danielewicz). Rozcieńczone preparaty dzielono na 6 porcji i poddawano trawieniu DNazą I (Calbiochem, stężenie końcowe 0,01-2,0U/ml z roztworu 2,2U/µl w wodzie) i nukleazą z Micrococcus (Sigma, stężenie końcowe 0, ,43U/ml z roztworu 0,2U/µl w 50mM Tris-HCl ph8,0, 0,05mM CaCl 2, 20% glicerol) w 37 0 C przez 20min. Reakcję zatrzymywano przez dodanie buforu STOP 5x (12,5mM Tris ph7,5, 0,375M NaCl, 37,5mM EDTA, 0,75% SDS) do końcowego stężenia 1x. Do preparatów dodawano proteinazę K (Sigma) do stężenia końcowego 5,0-10µg/ml i inkubowano przez noc w 37 0 C. 32

38 W stosowanej metodzie bardzo trudno było przewidzieć zawartość DNA w uzyskanym preparacie na podstawie pomiarów wartości A 260 oraz wynikających z nich obliczeń, ponieważ zaobserwowano brak zależności liniowej między wartością A 260 a zawartością DNA w preparacie. Na podstawie licznych doświadczeń stwierdzono, że przyjęty sposób postępowania zapewnia poprawną ocenę zawartości DNA w preparacie i dlatego stosowano go w celu uzyskania odpowiedniego stężenia DNA. Ponadto dzielono preparaty na 6 porcji, które następnie poddawano działaniu DNazy I lub nukleazy z Micrococcus o różnym stężeniu. Umożliwiało to późniejszy wybór preparatów o odpowiednim stopniu strawienia, które poddawano dalszej analizie. Usuwanie komponentów białkowych z preparatu chromatyny i uzyskanie oczyszczonego DNA Do preparatów po trawieniu proteinazą K dodawano równą objętości fenolu nasyconego 1M Tris-HCl ph8,0. Po energicznym wstrząsaniu wirowano w mikrowirówce w temperaturze pokojowej. Zbierano fazę wodną do nowej probówki. Czynność powtarzano dwukrotnie. Następnie dodawano równą objętości chloroformu i wstrząsano energicznie. Preparat poddawano wirowaniu w mikrowirówce w temperaturze pokojowej, a do zebranej fazy wodnej dodawano RNazę A do końcowego stężenia µg/ml i inkubowano w 37 0 C przez 2 godziny. Po inkubacji przeprowadzano ekstrakcję DNA dwukrotnie fenolem i chloroformem, w taki sam sposób jak opisano wcześniej. Po ekstrakcji chloroformem dodawano równą objętość izopropanolu i wytrącano DNA w C w ciągu 30min. Preparat wirowano przy 33

39 14500obr./min. w 4 0 C w celu uzyskania osadu wytrąconego DNA. Osad płukano w 200µl 70% etanolu. Po wirowaniu i usunięciu 70% etanolu, osad DNA osuszano przez 15min. DNA rozpuszczano w 100µl wody. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym mająca na celu sprawdzenie jakości preparatu Przygotowywano żel agarozowy o stężeniu 2% w buforze TAE (40mM Tris-octan, 1mM EDTA, ph7,2). Elektroforezie poddawano 5µl każdego preparatu DNA wraz z barwnikiem OrangeG. Elektroforezę w żelu agarozowym o długości 10cm prowadzono przy napięciu 80V przez ok. półtorej godziny do momentu dotarcia barwnika naniesionego wraz z preparatem do końca żelu. Następnie żel przenoszono do roztworu bromku etydyny (0,5µg/ml) na 15min. w celu zabarwienia DNA, który obserwowano na transiluminatorze UV. Fotografię żelu agarozowego wykonywano aparatem fotograficznym Polaroid DS34 z filmem Studio B/W o czułości ISO3000 tej samej firmy (czas ekspozycji 1s, wartość przesłony 4,5). Na podstawie elektroforetogramu wybierano preparaty do dalszej analizy. Odrzucano zarówno preparaty o zbyt niskim, jak i zbyt wysokim stopniu strawienia. 34

40 Analiza produktów trawienia DNazy I i nukleazy z Micrococcus DNaza I MNaza Numer ścieżki Stężenie enzymu Nazwa enzymu elektroforetogramu w próbce (U/ml) 1 0, ,05 3 0,1 DNaza I 4 0,2 5 0,4 6 0,8 7 0, ,001 Nukleaza z 9 0,003 Micrococcus 10 (MNaza) 0, , ,081 Ryc. 4-2 Elektroforetogram preparatu DNA uzyskanego ze szczepu pip2 hodowanego w pożywce YPDE, następnie poddanego trawieniu DNazą I i MNazą o różnych stężeniach. Do dalszej analizy wybrano preparaty ze ścieżek 3, 4 i 5 (po trawieniu DNazą I) oraz 8, 9 i 10 (po trawieniu MNazą). Elektroforezie poddawano 1/20 obj. każdej próbki. Trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI Całość wybranego preparatu poddawano trawieniu endonukleazą restrykcyjną MboI (Fermentas) w 37 0 C przez noc. Dodawano 4µl endonukleazy restrykcyjnej MboI (10U/µl) w celu przeprowadzenia wyczerpującego trawienia. Reakcję zatrzymywano, zgodnie z zaleceniami producenta, przez umieszczenie preparatu w 65 0 C na 20min. Następnie wytrącano DNA 96% etanolem w C w ciągu 30min. W celu uzyskania osadu DNA, preparat poddawano wirowaniu przy 14500obr./min. w 4 0 C. Osad płukano 35