MIKROFILTRACJA ZAGĘSZCZANIE BIAŁEK SERWATKOWYCH

Transkrypt

1 Wrocław, MIKROFILTRACJA ZAGĘSZCZANIE BIAŁEK SERWATKOWYCH 1. OPIS PROCESU Procesy membrany stosowane szeroko w przemyśle mleczarskim są często alternatywą dla jednostkowych procesów klasycznej inżynierii i technologii chemicznej. W przemyśle mleczarskim stosowane są wszystkie rodzaje membranowych procesów ciśnieniowych, od mikrofiltracji po nanofiltrację, sporadycznie stosowane są membrany z zakresu odwróconej osmozy. Membrany mikrofiltracyjne posiadają największe rozmiary porów spośród wszystkich rodzajów membran. Wspomniane rozmiary są większe niż w przypadku membran ultrafiltracyjnych, mniejsze natomiast niż średnice porów występujących w klasycznej filtracji. Wynoszą one od 0.1 do 10[µm]. Stosowane ciśnienie transmembranowe powinno zawierać się w zakresie od 0.1 do 2.0[bar]. Membrany mikrofiltracyjne są narażone na najintensywniejsze osadzanie się białka na membranie a tym samym na największy spadek strumienia permeatu oraz wzrost ciśnienia w trakcie procesu, ponieważ pory membran tego typu są największych rozmiarów. W przypadku mikrofiltracji produktów przemysłu mleczarskiego stosuje się głównie membrany ceramiczne, z racji możliwości ich wielokrotnego użycia, sterylizacji oraz łatwości mycia. Wykazano również, że polimerowe membrany mikrofiltracyjne nie są dobrym rozwiązaniem w przypadku separacji produktów mlecznych, z racji większej podatności materiału na adsorpcję białka a także mniejszą stabilność termiczną oraz chemiczną samej membrany. Stwierdzono również, że membrany polimerowe posiadają większą rozbieżność wielkości porów membrany. Jak pokazują badania, wszystkie z białek mleka (w tym serwatkowe) silnie agregują oraz adsorbują się na powierzchni membrany, jednak udowodniono, że β laktoglobulina powoduje najsilniejsze blokowanie membrany. Dzieje się tak najprawdopodobniej z racji

2 występowania w tym białku bardzo aktywnego wolnego wiązania sulfhydrylowego, które powoduje powstawanie dimerów a nawet oktamerów tego białka i jako duża cząstka blokuje pory. Dodatkowym negatywnym zjawiskiem zachodzącym przy powierzchni membran jest polaryzacja stężeniowa. Wynika ona z faktu kumulowania się składników separowanego roztworu wzdłuż membrany, co powoduje powstawanie wstecznego ciśnienia osmotycznego i tym samym zmniejszenie efektywnego ciśnienia transmembranowego oraz zwiększanie oporu. Wszystkie opisane zjawiska powodują, że na membranie powstaje dodatkowa warstwa, która staje się efektywną warstwą separacyjną nie jest nią sama membrana. Istotnym parametrem zapobiegającym osadzaniu się białek na membranie jest dobranie odpowiednio wysokiego strumienia retentatu podczas separacji, który może wynosić nawet 7 [m s -1 ]. Ponadto niekorzystne efekty membranowe można zredukować stosując niższe wartości ciśnienia transmembranowego. W trakcie separacji zauważalny jest spadek wartości ciśnienia wzdłuż membrany (Rys. 1). Istnieje wiele rozwiązań by zmniejszyć ten spadek ciśnienia wzdłuż membrany, polegających głównie na recyrkulacji permeatu.

3 Rys. 1. Profil ciśnienia występujący podczas separacji mikrofiltracyjnej Dodatkowo niekorzystne efekty membranowe można zredukować stosując back flushing lub back piulsing. Niemniej podczas separacji ultrafiltracyjnej i mikrofiltracyjnej wyróżnić można wyraźnie trzy etapy spadku strumienia permeatu (Rys. 1.), będącego skutkiem dwóch zjawisk: polaryzacji stężeniowej wzdłuż membrany oraz zatykania porów membrany. Rys. 1. Spadek strumienia permeatu, w separacji mikro- i ultrafiltracyjnej. I wstępny, szybki spadek, II długoterminowy, wolny spadek, III quasi statyczny, ustalony strumień permeatu Membrany zablokowane w trakcie procesu, poddaje się po jego zakończeniu oczyszczeniu. Woda do płukania i sporządzania roztworów myjących membrany nie może zawierać żadnych składników koloidowych ani mikroorganizmów, które mogłyby powodować zatykanie porów membrany czy ponowne zabrudzenie mytych instalacji. Z tego powodu woda do czyszczenia instalacji powinna być nie tylko destylowana, ale również mikrofiltrowana przy pomocy filtru o średnicy porów ok. 0.2 [µm]. Procedura mycia membran zależy głównie od materiału z jakiego sporządzona została membrana. W przypadku membran ceramicznych polega ona głównie na przemiennym myciu podgrzanymi środkami o odczynie zasadowym np. NaOH, obojętnym (woda) i kwasowym np. H 3 PO 4. Wykazano jednak, że stosowanie kwasu nie wpływa znacząco na odblokowanie porów i odmycie placka filtracyjnego (dzieje się to głównie w przypadku czyszczenia środkami zasadowymi) a nawet może powodować pogorszenie stanu membrany w porównaniu do mycia samymi alkaliami. Natomiast stosowanie podchlorynu sodu (NaClO) poza aspektami

4 dezynfekującymi powoduje najczęściej całkowite odmycie membrany oraz powrót do strumienia wyjściowego. Obecność wolnego chloru powoduje utlenianie organicznych związków osadzających się na membranie, do takich jak, aldehydy, ketony czy kwasy karboksylowe, które wykazują wyższą hydrofilowość, a więc niższe powinowactwo dla materiału membrany ceramicznej. Membrany polimerowe myte są zazwyczaj gotowymi i przeznaczonymi do tego celu środkami chemicznymi np. P3 Ultrasil 11 (Henkel Ecolab), które są drogie i powodują jedynie regenerację membrany powrót do wyjściowego strumienia permeatu a nie dezynfekcję membrany. Membrany polimerowe mogą być również czyszczone przy pomocy ultradźwięków, NaOH oraz alkoholu, np. etylowego. Główne zastosowania mikrofiltracji w przemyśle mleczarskim to: Sterylizacja mleka i produktów mlecznych Produkty mleczne są bardzo wrażliwe termicznie i niemożliwa jest klasyczna sterylizacja z wykorzystaniem wysokiej temperatury. Ekspozycja mleka na wysoką temperaturę (bez utraty jego cennych właściwości) może mieć miejsce jedynie na kilka sekund. Dodatkowo wysoka temperatura nie zabija wszystkich mikroorganizmów (ang. thermoduric bacteria bakterie, który są odporne na pasteryzację). Powoduje to zmniejszenie okresu trwałości mleka podczas składowania. W celu pozbycia się mikroorganizmów stosuje się membrany mikrofiltracyjne, przez które transport składników mleka zachodzi swobodnie, bakterie natomiast pozostają w strefie retentatu. Separowanie miceli kazeinowych Poprzez mikrofiltrację odtłuszczonego mleka, połączoną z diafiltracją, otrzymuje się stężony roztwór miceli kazeinowych. Technika separacji miceli kazeinowych opiera się głownie na mikrofiltracji w użyciem membrany o średnicy porów 0.1 do 0.2 [µm]. Uzyskuje się klarowny permeat składem przypominający serwatkę i zatężony roztwór miceli kazeinowych o wysokiej jakości. Odtłuszczanie mleka i serwatki Istnieje wiele doniesień literaturowych na temat odłuszczania mleka i serwatki przy pomocy membran. Zoptymalizowana metoda odłuszczania serwatki polega na:

5 a) Koncentracji przy pomocy membrany ultrafiltracyjnej i zmniejszenie objętości do 25% początkowej, w temperaturze 50 [ C], b) Usunięcia mikroorganizmów przy pomocy membrany mikrofiltracyjnej o średnicy porów 0.8 [µm], c) Podniesienia temperatury do 55 [ C] i ph do wartości 7.5, d) Separacji kompleksów fosfolipidowych wapnia przy pomocy membrany o średnicy porów 0.1 [µm]. W efekcie uzyskuje się zupełnie klarowną i całkowicie pozbawioną tłuszczu serwatkę. 2. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest opracowanie i monitoring procesu separacji (koncentarcji) białek zawartych w serwatce przy pomocy mikrofiltracyjnej techniki membranowej. Uwaga! Ćwiczeniem wykonywanym przez drugą grupę jest Perwaporacja. W czasie tego właśnie ćwiczenia należy wylać żele elektroforetyczne (SDS-PAGE), by na ćwiczeniu z Odwróconej osmozy wykonać elektroforezę w celu analizy jakościowej separacji, a więc sprawozdanie z tego ćwiczenia należy oddać po tym właśnie ćwiczeniu (po ok.3 tygodniach). Wykonanie elektroforezy (znanej Państwu z zajęć prowadzonych w Zakładzie Biochemii PWr) : 1) Wylanie żelu: Roztwory do wylania żelu: Żel dolny Żel górny MIX: Akrylamid/Bis-akrylamid (1:37.5) ml Bufor dolny ml Bufor górny ml H2O ml % SDS μl Temed μl % APS μl 60 20

6 Żele po związaniu należy owinąć w papierowe, mokre ręczniki a następnie folię i schować do lodówki. 3. APARATURA I PRZEBIEG PROCESU Aparatura przygotowana jest do procesu rozdzielania mieszaniny białek serwatkowych. Przed przystąpieniem do eksperymentu separacji białek serwatkowych należy zbiornik zasilający uzupełnić wodą i zmierzyć strumień permeatu (na wodzie). Separacja białek serwatkowych Roztwór serwatki o objętości 2 L wlewamy do zbiornika zasilającego (stężenie zostanie podane przez prowadzącego). Po włączeniu pompy łopatkowej (wirowej), co jest równoznaczne z rozpoczęciem prowadzenia procesu, uruchamiamy stoper. W trakcie procesu mierzymy strumień permeatu (co 20 min), stężenie laktozy oraz białek serwatkowych w permeacie i retentacie, odczytujemy temperaturę i strumień retentatu oraz ciśnienie transmembranowe.

7 Układ dodatkowo wyposażony jest w funkcję back pulsing u, co zmniejsza niekorzystny efekt fouling u, który automatycznie włącza się po uruchomieniu instalacji. Oznaczanie stężenia białka odbywa się na podstawie analizy Lowry ego wg krzywej standardowej (wykonanej na podstawie komercyjnego koncentratu białkowego firmy Olimp ): C B (g L -1 ) = A 750nm. Natomiast stężenia laktozy na podstawie analizy DNS wg krzywej standardowej C L (g L -1 ) = A 550nm. Metoda Lowry ego: 1. Do 0,5 ml próbki r-ru białka dodajemy 0,5 ml odczynnika Lowry ego czekamy 20 min 2. Do pkt.1 dodajemy 0,25 ml odczynnika Foilin a czekamy 30 min 3. Pamiętamy o wykonaniu kontroli na wodzie. Metoda DNS: 1. Do 0,5 ml próbki r-ru laktozy dodajemy 1,5 ml odczynnika DNS inkubujemy przez 5 min w 100 C 2. Po 5 min chłodzimy próbkę i czekamy kolejne 25 min przed pomiarem (po 30 min) dodajemy 8 ml wody 3. Pamiętamy o wykonaniu kontroli na wodzie. Po zakończeniu procesu instalację należy usunąć pozostałości serwatki ze zbiornika zasilającego. Następnie do zbiornika wlać 5% NaClO i myć przez 0,5h, a następnie (po ponownym usunięciu reszty podchlorynu) przez 0,5h wodą, do momentu uzyskania wyjściowego natężenia przepływu permeatu. Uzyskany permeat zamrażamy posłuży nam do przeprowadzenia odwróconej osmozy!!! Wykonujemy również posiew na płytce z wylanym podłożem agarowym w celu sprawdzenia czystości mikrobiologicznej permeatu. Pobieramy i zamrażamy próbki (nadawy, permeatu oraz retentatu) do wykonania elektroforezy!!! 4. OBLICZENIA W ramach sprawozdania należy : Przedstawić zależność stężenia białek i laktozy w permeacie i retentacie od czasu; Policzyć współczynniki retencji dla białka i laktozy;

8 Przedstawić ewentualną zmienność parametrów procesowych (temperatura, ciśnienie, strumień permeatu oraz retentatu) w czasie; Zbilansować układ; Policzyć strumień permeatu i przedstawić jego zależność od czasu. Opracowała: Dr inż. Magdalena Lech