Załącznik nr 2 AUTOREFERAT Dr Grażyna Mosieniak

Transkrypt

1 Załącznik nr 2 AUTOREFERAT Dr Grażyna Mosieniak Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im M.Nenckiego Warszawa,

2 1. Imię i Nazwisko Dr Grażyna Mosieniak Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Ul. Pasteura 3, Warszawa Tel: Fax: g.mosieniak@nencki.gov.pl 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe / artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej stopień doktora nauk biologicznych, specjalność biologia molekularna, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie. Promotor - Prof. dr hab. Bożena Kamińska-Kaczmarek Praca doktorska Molekularny mechanizm cytotoksycznego działania leku immunosupresyjnego cyklosporyny A na komórki glejaka C6 in vitro. Praca uzyskała wyróżnienie Rady Naukowej Instytutu Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie tytuł magistra biologii, specjalność genetyka, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Ogrodniczy, Zakład Genetyki i Hodowli Roślin Ogrodniczych. Promotor Prof. dr hab. Stefan Malepszy 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych / artystycznych. Od specjalista, Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Zakład Biochemii, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie; adiunkt, Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Zakład Biochemii, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie; adiunkt, Pracownia Regulacji Transkrypcji, Zakład Biochemii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie; staż podoktorski, Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej Zakład Biologii Molekularnej, kierownik Prof. Maciej Żylicz, Warszawa ( ); asystent, Pracownia Regulacji Transkrypcji, Zakład Biochemii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie; asystent, Pracownia Procesów Biosyntetycznych, Zakład Biochemii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie. 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): 4.1. Spis publikacji wchodzących w skład osiągnięcia 2

3 Tytuł osiągniecia Rola starzenia oraz autofagii i apoptozy w odpowiedzi komórki nowotworowej na związki o działaniu cytostatycznym. Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego: Prace oryginalne: 1. Mosieniak G. #, Sliwinska M.A., Przybylska D., Grabowska W., Sunderland P., Bielak-Zmijewska A., Sikora E. (2016), Curcumin-treated cancer cells show mitotic disturbances leading to growth arrest and induction of senescence phenotype. Int J Biochem Cell Biol., 74:33-43; IF ,046 ; IF 5-letni 4,371; punkty MNiSW 35, liczba cytowań 0 2. Mosieniak G.*, Sliwinska M.A.*, Alster O., Strzeszewska A., Sunderland P., Piechota M.,Was H., Sikora E. (2015) Polyploidy Formation in Doxorubicin-Treated Cancer Cells Can Favor Escape from Senescence. Neoplasia, 17(12):882-93; IF ,252 ; IF 5-letni 4,921; punkty MNiSW 35, liczba cytowań 0 3. Mosieniak G. #, Adamowicz M., Alster O., Jaskowiak H., Szczepankiewicz A.A., Wilczynski G.M., Ciechomska I.A., Sikora E. (2012) Curcumin induces permanent growth arrest of human colon cancer cells: link between senescence and autophagy. Mech Ageing Dev.,133(6): IF ,264 ; IF 5-letni 3,397; punkty MNiSW 30, liczba cytowań Sliwinska M.A., Mosieniak G., Wolanin K., Babik A., Piwocka K., Magalska A., Szczepanowska J., Fronk J., Sikora E. (2009) Induction of senescence with doxorubicin leads to increased genomic instability of HCT116 cells. Mech Ageing Dev., 130(1-2):24-32 IF ,179 ; IF 5-letni 3,397; punkty MNiSW 30, liczba cytowań Mosieniak G. #, Sliwinska M., Piwocka K., Sikora E.(2006) Curcumin abolishes apoptosis resistance of calcitriol-differentiated HL-60 cells. FEBS Lett., 580(19): ; IF ,372 ; IF 5-letni 3,372; punkty MNiSW 30, liczba cytowań 16 Prace przeglądowe: 6. Mosieniak G., Sikora E. (2010) Polyploidy: the link between senescence and cancer. Curr Pharm Des.;16(6):734-40; IF ,474 ; IF 5-letni 3,504; punkty MNiSW 35, liczba cytowań Mosieniak G. #, Strzeszewska A. (2014) Rola starzenie komórkowego w kancerogenezie i terapii przeciwnotworowej. [The role of cellular senescence in carcinogenesis and antitumor therapy]. Postepy Biochem.;60(2): IF ; IF 5-letni -; punkty MNiSW 5, liczba cytowań 0 # - autor korespodujący; *- równorzędni autorzy Opis indywidualnego wkładu habilitanta w powstanie każdej z wieloautorskich publikacji znajduje się w Załączniku 4 (Wykaz opublikowanych prac naukowych). Oświadczenia wszystkich współautorów określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie poszczególnych prac znajdują się w Załączniku 5. 3

4 4.2. Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania 1) Rola starzenia oraz autofagii i apoptozy w odpowiedzi komórki nowotworowej na związki o działaniu cytostatycznym. Wprowadzenie Opracowanie skutecznych terapii przeciwnowotworowych od lat jest jednym z największych wyzwań, z jakimi mierzy się medycyna. Poznawanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw komórkowej odpowiedzi na chemio- i radioterapię jest niezbędne do osiągnięcia tego celu. Z jednej strony daje ono szansę na opracowanie nowych, ukierunkowanych na eliminację konkretnych komórek nowotworowych strategii terapeutycznych, z drugiej umożliwia określenie procesów zachodzących w komórce, które czynią ją oporną na stosowane leki. Nasza wiedza dotycząca zmian zachodzących zarówno w samej komórce, jak i w otaczającym ją środowisku, które sprzyjają progresji nowotworu, wciąż jest wzbogacana i aktualizowana (Hanahan i Winberg 2011). Pozwala to na wytyczanie nowych kierunków badawczych. Terapie przeciwnowotworowe tradycyjnie opierają się na takich strategiach, które z założenia są wysoce cytotoksyczne i mają prowadzić do eliminacji komórki nowotworowej. Jednym z procesów indukowanym w komórkach nowotworowych w wyniku takiej terapii jest apoptoza. Choć w założeniu koncepcja ta jest jak najbardziej słuszna, wymaga jednak stosowania wysokich dawek chemioterapeutyków, które aby być skuteczne w takim stopniu jak się oczekuje, działają toksycznie na komórki prawidłowe, powodując silne skutki uboczne. Ponadto szereg nowotworów w trakcie onkogenezy lub w wyniku stosowanej terapii uruchamia mechanizmy pozwalające na unikanie apoptozy, co w efekcie ogranicza możliwość ich eliminacji. Alternatywnym podejściem jest stosowanie niższych dawek leków, które mają wpływ cytostatyczny na komórki nowotworowe i przyczyniają się do ograniczenia wzrostu guza. Wstępne badania kliniczne prowadzone z udziałem pacjentów z rakiem nerki, jajnika lub prostaty, u których wykorzystano terapie o efekcie cytostatycznym, przyniosły obiecujące rezultaty (Desai i wsp. 2006, Martin i Schilder 2006, Winquist i wsp. 2006). Jednym z procesów, który może być indukowany w wyniku terapii jest starzenie komórkowe, które w literaturze anglojęzycznej określa się mianem therapy induced senescence (TIS). Starzenie komórkowe wiąże się z nieodwracalną utratą potencjału replikacyjnego, przy czym komórka pozostaje żywa i aktywna metabolicznie. Wykazano, że starzenie komórek nowotworowych może warunkować pozytywny efekt terapii, szczególnie w nowotworach opornych na indukcję apoptozy (Schmitt C i wsp. 2002). Pomimo licznych przykładów świadczących o tym, że starzenie indukowane w trakcie terapii sprzyja walce z nowotworem, istnieją mocne przesłanki świadczące o tym, że stare komórki nowotworowe mogą podjąć na nowo proliferację, przyczyniając się do wznowy nowotworu. Poznanie molekularnych determinantów warunkujących stabilność i nieodwracalność utraty potencjału replikacyjnego przez stare komórki nowotworowe pozostaje aktualnie jednym z istotnych wyzwań biologii nowotworów. 1) w tej części zaznaczono: pogrubieniem - prace wchodzące w skład osiągnięcia, kursywą prace, których jestem współautorką i wchodzą w skład dorobku. 4

5 Odpowiedź komórek nowotworowych na stres, także ten związany z terapią, nie ogranicza się jedynie do apoptozy lub starzenia. Alternatywnie lub równolegle komórki mogą ulegać autofagii. Jest to proces kataboliczny, który służy degradowaniu z udziałem lizosomów uszkodzonych organelli komórkowych lub białek (Glick i wsp. 2010). W każdej komórce nie poddanej stresowi autofagia jest aktywna i zabezpiecza przed niekorzystnymi skutkami nagromadzania się uszkodzonych cząsteczek. Zapewnia to jej prawidłowe funkcjonowanie. Pod wpływem działania niekorzystnych czynników takich, jak na przykład związki przeciwnowotworowe, intensywność procesów związanych z degradacją na drodze autofagi uszkodzonych struktur komórkowych wzrasta. W efekcie autofagia może umożliwić przeżycie lub doprowadzić do śmierci komórki, gdy jej poziom jest zbyt wysoki. Od niedawna wiadomo, że autofagia jest procesem, który promuje starzenie komórkowe. Zatem, biorąc pod uwagę wpływ autofagii na komórki nowotworowe, wyróżniono autofagię cytoprotekcyjną, cytotoksyczną lub cytostatyczną (Gewritz, 2013). Celem podjętych przez mnie badań było poznanie molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za indukcję procesu starzenia komórek nowotworowych (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015; Mosieniak i wsp., 2016). Szczególną uwagę poświęciłam określeniu roli niestabilności genetycznej (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009, Mosieniak i Sikora 2010, Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015) oraz autofagii (Mosieniak i wsp. 2012), jako procesów determinujących losy starzejących się komórek. Mając na uwadze fakt, że starzenie jest jednym z elementów odpowiedzi komórkowej na terapie, poznanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw tego procesu może mieć istotne znaczenie w opracowywaniu efektywniejszych strategii przeciwnowotworowych. W ostatnich latach coraz częściej podejmowane są badania mające na celu selektywne usuwanie komórek nowotworowych, których proliferacja została zahamowana w wyniku zastosowanej terapii. Dotyczy to zarówno komórek ulegających starzeniu jak i tych, które podlegają różnicowaniu pod wpływem związków o charakterze przeciwnowotworowym. Komórki te cechują się często opornością na apoptozę. Dlatego też celem moich badań było określenie przydatności kurkuminy (związku pochodzenia naturalnego) do przełamania oporności na apoptozę zróżnicowanych komórek białaczkowych (Mosieniak i wsp. 2006). Starzenie komórkowe w terapii przeciwnowotworowej Proces starzenia komórkowego został po raz pierwszy zaobserwowany i opisany w trakcie prowadzenia hodowli komórek pierwotnych fibroblastów (Hayflick 1965). Wiąże się on z nieodwracalną utratą potencjału replikacyjnego. Przyczyną takiej zmiany jest skracanie występujących na końcach chromosomów telomerów następujące w każdej rundzie replikacji DNA. Skrócone telomery, których natywna struktura pętli ulega nieodwracalnemu zniszczeniu, są rozpoznawane przez komórkę jako miejsce pęknięcia dwuniciowego DNA. W efekcie dochodzi do indukcji sygnału wewnątrzkomórkowego, który prowadzi do trwałego zatrzymania komórek w cyklu (d Adda di Fagagna i wsp. 2003, Takai i wsp. 2003, Herbig i wsp. 2004). Starzenie zależne od skracania telomerów określa się starzeniem replikacyjnym. Oprócz niego wyróżnia się starzenie przyspieszone indukowane stresem, które zachodzi pod wpływem różnych czynników egzogennych lub endogennych. Prowadzą one do powstawania podwójnych pęknięć nici DNA. Takie nienaprawione uszkodzenia, podobnie jak skrócone telomery, indukują w komórce ścieżki przesyłania sygnału prowadzące do zatrzymania proliferacji starzenia. Szczególnym przykładem starzenia wywoływanego stresem jest starzenie indukowane onkogenami. W pionierskiej pracy Manuela Serrano i wsp. (1997) wykazano, że nadekspresja onkogenu Ras w fibroblastach prowadzi do starzenia. Był to pierwszy tak bezpośredni dowód świadczący o tym, że starzenie jest naturalną 5

6 barierą, która chroni organizm przed rozwojem nowotworu. Prowadzone od lat 90-tych badania przyniosły liczne dowody, że ten sam mechanizm, który opisał Serrano w oparciu o doświadczenia prowadzone in vitro zachodzi również w organizmie. Wykazano obecność komórek starych w łagodnych zmianach prenowowtowrowych, np. znamionach skórnych powstających w wyniku ekspresji onkogenu BRAF w melanocytach (Michaloglou i wsp. 2005). Podobnie w nowotworach na wczesnych etapach kancerogenezy w gruczolakach powstających pod wpływem onkogenu Kras G12V, stwierdzono liczne komórki, które uległy starzeniu (Collado i wsp. 2005). Lista onkogenów i genów supresorów nowotworu, które w wyniku mutacji prowadzą do indukcji starzenia towarzyszącego powstawaniu zmian prenowotworowych jest znacznie dłuższa (Mosieniak, Starzeszewska 2014). Jednakże, za każdym razem przejście od zmiany łagodnej do bardziej zaawansowanej skutkuje zmniejszeniem liczby starych komórek w tkance nowotworowej. Świadczy to o tym, że progresja nowotworu wiąże się z przełamaniem bariery przeciwnowotworowej jakią jest starzenie komórkowe. Dzieje się tak w wyniku pojawiania się kolejnych mutacji w genach kodujących białka uczestniczących w indukcji starzenia komórkowego. W starzenie zaangażowane są dwie podstawowe ścieżki przesyłania sygnału, w których krytyczną rolę odgrywają supresory nowotworów. Jest to ścieżka zależna od uszkodzeń DNA i prowadząca do aktywacji p53 oraz szlak sygnałowy, w którym uczestniczy p16 INK4A oraz Rb (Campisi i d'adda di Fagagna 2013). W większości nowotworów ludzkich i mysich wykazano występowanie mutacji w genach kodujących białka należące do jednego z tych dwóch, bądź obu wyżej wymienionych szlaków przesyłania sygnału. Fakt ten stanowi dodatkowe potwierdzenie obowiązującej tezy, że starzenie komórkowe przeciwdziała progresji nowotworu. W świetle przedstawionej powyżej wiedzy dużym zaskoczeniem były wyniki badań opublikowane w fundamentalnej pracy zespołu Igora Ronison a (Chang i wsp. 1999) dowodzącej, że komórki nowotworowe ulegają starzeniu pod wpływem m.in. chemioterapeutyków. Stare komórki nowotworowe identyfikowane są w oparciu o te same znaczniki ulegające starzeniu komórki prawidłowe. Należą do niech podwyższona aktywność enzymu lizosomalnego β-galaktozydazy (ang. Senescence associated-β-galactosidase, SA-β-Gal), zatrzymanie proliferacji związane z gromadzeniem się komórek w fazie G1 i G2 cyklu komórkowego, znaczne zwiększenie rozmiarów komórki oraz jej rozpłaszczenie, obecność nienaprawionych pęknięć dwuniciowego DNA i utrzymująca się aktywacja szlaku przesyłania sygnału od uszkodzeń DNA, sekrecja cytokin prozapalnych (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009, Mosieniak i wsp. 2012, Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015, Mosieniak i wsp., 2016). Starzenie komórkowe można wywołać nawet w komórkach nowotworowych pozbawionych białka p53 i/lub p16 INK4A, czego dowiedliśmy w doświadczeniach prowadzonych na komórkach raka okrężnicy HCT116 poddanych działaniu związku uszkadzającego DNA doksorubicyny lub naturalnego polifenolu kurkuminy (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009, Mosieniak i wsp. 2012). Podobne wyniki uzyskano na innych liniach komórkowych lini kostniakomięsaka Saos-2 czy też liniach SW-480 i U481 z mutacją w genie p53 oraz liniach HeLa i Hep-2, w których aktywność p53 była blokowana białkiem wirusowym E6 (Chang i wsp. 1999). Pomimo ewidentnych różnic pomiędzy komórkami prawidłowymi a nowotworowymi proces starzenia indukowanego stresem w obydwu typach komórek przebiega analogicznie, co może sugerować, że prowadzi do tego samego finału, jakim jest trwałe zahamowanie proliferacji. Postuluje się zatem, że starzenie komórkowe może prowadzić do zahamowania wzrostu guza, przyczyniając się do osiągnięcia pozytywnych rezultatów terapii. Doświadczenia przeprowadzone na myszach transgenicznych, w których dochodzi do rozwoju chłoniaka, pozwoliły na bezpośrednie potwierdzenie tej tezy. W wyniku zastosowania chemioterapii dochodziło do indukcji starzenia komórek nowotworowych wpływając na znaczące wydłużenie życia 6

7 badanych zwierząt (Schmitt i wsp. 2002). Wyniki analizy tkanek nowotworowych pobranych od pacjentów poddanych chemioterapii, w której zidentyfikowano stare komórki nowotworowe (Roberson i wsp. 2005), pozwalają przypuszczać, że również u ludzi starzenie komórkowe warunkuje skuteczność chemio- i radioterapii. Rola starzenia w terapii przeciwnowotworowej nie jest jednak jednoznaczna. Komórki stare mogą wpływać na otaczające mikrośrodowisko poprzez zwiększone wydzielanie m.in. cytokin prozapalnych, czynników wzrostu, metaloproteinaz itp. Tworzą one razem tzw. fenotyp sekrecyjny komórki starej (ang. Senescence associated secretory phenotype, SASP). Badania nad elementami SASP pozwoliły na zidentyfikowanie kilkuset różnych białek, które odgrywają rolą w takich procesach, jak stan zapalny, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej, angiogeneza, stymulacja proliferacji czy modulowanie odpowiedzi komórek układu odpornościowego (Rodier i Campisi, 2011). Doświadczenia prowadzone na starych fibroblastach dowiodły, że stymulują one proliferację komórek unieśmiertelnionych oraz nowotworowych, przyczyniając się do zwiększania rozmiarów guza (Krtolica i wsp. 2001). Z drugiej strony pewne elementy SASP wzmacniają proces starzenia a mogą wręcz przyczyniać się do jego indukcji w komórkach proliferujących. Ponadto niektóre z wydzielanych przez stare komórki białek działają jak chemokiny przyczyniając się do mobilizacji komórek układu odpornościowego bezpośrednio w obrębie tkanki nowotworowej. W efekcie dochodzi do eliminacji komórek nowotworowych i zmniejszenia guza (Xue i wsp. 2007). Skład sekretomu komórek ulegających starzeniu może zależeć od typu komórki, jak również od rodzaju czynnika indukującego proces starzenia. Podobnie jego wpływ może być zróżnicowany w zależności od kontekstu komórkowotkankowego. Wiedza pozwalająca precyzyjniej określić rolę SASP w starzeniu indukowanym w trakcie terapii przeciwnowotworowej wciąż jest przedmiotem badań. Pomimo istniejących wątpliwości, o których pisałam, trwają badania mające na celu opracowanie strategii terapeutycznych, które prowadziłby do indukcji procesu starzenia w komórkach nowotworowych. Opierając się na wiedzy dotyczącej molekularnych mechanizmów leżących u podstaw tego procesu podejmowane są próby wykorzystania określonych związków chemicznych, np. inhibitorów kinaz zależnych od cyklin, które prowadzą do starzenia komórek nowotworowych o zdefiniowanym tle genetycznym (Mosieniak i Strzeszewska 2014). Dlatego też szczególnie istotne staje się uzyskanie odpowiedzi na pytanie, czy starzenie komórek nowotworowych jest nieodwracalne. Jest ono równoznaczne z pytaniem, czy stara komórka nowotworowa jest komórką bezpieczną dla organizmu. Wraz z rozwojem badań nad starzeniem komórek nowotworowych coraz częściej pojawiały się doniesienia sugerujące, że proces ten jest odwracalny. Molekularny mechanizm umożliwiający wyjście ze stanu starzenia i wznowienie proliferacji nie jest do końca poznany. Istnieje kilka ścieżek przesyłania sygnału, które powiązano z odzyskiwaniem przez stare komórki potencjału proliferacyjnego. Podjęte przeze mnie badania skoncentrowały się nad określeniem roli poliploidyzacji w tym procesie. Wcześniej opublikowane prace pokazywały, że starzeniu komórek nowotworowych może towarzyszyć zwiększenie ploidii (Mosieniak i Sikora, 2010), jednakże mechanizm prowadzący do obserwowanej niestabilności genomowej, jak również jej konsekwencje, nie były badane. 7

8 Poliploidyzacja komórek ulegających starzeniu jako proces umożliwiający wznowienie podziałów komórek nowotworowych Poliploidyzacja komórek nowotworowych opisywana jest często jako skutek terapii przeciwnowotworowej po zastosowaniu zarówno związków uszkadzających DNA, jak i tych zaburzających punkt kontroli mitozy i/lub formowanie mikrotubul (Chang i wsp. 1999). Niejednokrotnie obecność komórek poliploidalnych korelowano z pozytywnym efektem zastosowanych związków przeciwnowotworowych, głównie dlatego iż uznawano komórkę poliploidalną za niezdolną do podziałów lub podatną na apoptozę. Z drugiej strony zwielokrotnienie w jednej komórce genomu, a co za tym idzie wszystkich organelli komórkowych, może zwiększyć oporność komórki na efekty cytotoksycznego działania związku przeciwnowotworowego (Mosieniak i Sikora, 2010). W takim wypadku poliploidyzację można traktować jako mechanizm adaptacji komórki nowotworowej do warunków stresowych. Pionierskie prace grupy Jekateriny Erenpreisy dowiodły po raz pierwszy, że komórki poliploidalne mogą podlegać rzadkim, nieprawidłowym podziałom, w efekcie których powstają komórki potomne o zestawie chromosomów zbliżonym do diploidalnego, zdolne do proliferacji (Illidge i wsp. 2000, Erenpreisa i wsp. 2000). Komórki te w wyniku ekspansji klonalnej mogą być odpowiedzialne za wznowę nowotworu po okresowym zahamowaniu jego wzrostu pod wpływem terapii. W ślad za tymi pracami opublikowane zostały następne, opisujące podobne zjawisko w różnych typach nowotworów (Prieur-Carrillo 2003, Stewenius 2005, Ianzini i wsp. 2009). Podział redukcyjny komórki poliploidalnej na komórki potomne może następować na drodze różnych procesów. Wykazano na przykład, że w komórkach poliploidalnych dochodzi do re-aktywacji genów kodujących białka, biorących udział w mejozie, sugerując, że podobny proces prowadzi do depoliploidyzacji komórki nowotworowej (Kalejs i wsp. 2006, Erenpreisa i wsp. 2009, Ianzini i wsp. 2009, Vitale i wsp. 2010). Ramarajan dowodzi z kolei, że komórki potomne mogą powstawać w wyniku pączkowania jądra komórki poliploidalnej, po którym następuje seria cytokinez. Ten nowy typ podziału komórkowego został przez autorów nazwany neozą (Sundaram i wsp. 2004). Fakt, że komórka poliploidalna może dać początek komórkom aneuplidalnym sprawia, że obecnie coraz częściej postrzega się komórki poliploidalne jako niepożądany efekt terapii przeciwnowotworowej (Coward i Harding 2014). W ramach prowadzonych przez nas badań wykazaliśmy, że komórki raka okrężnicy HCT 116 poddane działaniu niskich, niepowodujących śmierci stężeń doksorubicyny, ulegają poliploidyzacji i starzeniu (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009). Wiadomo, że zwiększenie ploidii komórek może być wynikiem fuzji komórek lub przejścia pojedynczej komórki przez tzw. endocykl, w którym po fazie syntezy DNA nie następuje rozdział materiału genetycznego do dwóch komórek potomnych. Komórki wchodzące w endocykl mogą ulegać endomitozie lub endoreduplikacji. W pierwszym przypadku zwiększenie ploidii jest związane z rozpoczęciem mitozy, która może być zakończona na różnych jej etapach, zawsze jednak jest to etap poprzedzający cytokinezę. Endoreduplikacja wiąże się ze zwielokrotnianiem genomu w wyniku następujących po sobie faz syntezy DNA (S) przedzielonych fazami G (Mosieniak i Sikora 2010). Wykazaliśmy, że większość komórek nowotworowych indukowanych do starzenia poliploidyzuje na drodze endoreduplikacji. Procesowi temu towarzyszyło zwielokrotnienie liczby centrosomów, które nie ulegały przesunięciu do przeciwległych biegunów jądra komórkowego, co jest konieczne do utworzenia bipolarnego wrzeciona podziałowego. Ponadto obserwowaliśmy utrzymujący się podwyższony poziom cykliny B1 w cytoplazmie. Cyklina B1 jest niezbędna do aktywacji kinazy cdk1, która działając w kompleksie z cykliną B1 ulega translokacji do jądra, co warunkuje wejście komórek w mitozę. Wykazaliśmy, że jądra poliploidalne komórek 8

9 nowotworowych charakteryzują się zaburzeniami w strukturze otoczki jądrowej, która tworzy tzw. pęcherzyki perinuklearne. Wewnątrz tych pęcherzyków gromadzą się białka np. p53, p21, Aurora B, których podwyższony poziom występuje również na terenie jądra komórki poliploidalnej (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015). Funkcjonalne znaczenie zmian zaobserwowanych w strukturze jądra nie jest jednoznaczne i pozostaje przedmiotem dalszych badań. Komórki nowotworowe ulegające poliploidyzacji i starzeniu charakteryzowały się również zaburzeniem morfologii jądra mikronukleacją, w efekcie której w jednej komórce identyfikowaliśmy wiele fragmentów poliploidalnego jądra o różnych rozmiarach (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009, Mosieniak, Sliwinska i wsp.2015). Istotną obserwacją poczynioną przez nas w trakcie badań nad starzeniem komórek nowotworowych było wykazanie, że stare, poliploidalne komórki nowotworowe pozostają w cyklu komórkowym, o czym świadczył wysoki poziom białka Ki-67 (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015). Do tej pory panowało przekonanie, że starzenie komórkowe jest jednoznaczne z utratą ekspresji Ki-67, co świadczyło jednocześnie o nieodwracalnej utracie potencjału proliferacyjnego komórek starych (Lowless i wsp. 2010, Kulliman i wsp. 2010). Ekspresja Ki-67 w komórkach starych może być więc znacznikiem tych komórek, które potencjalnie mogą przejść przez kolejne fazy cyklu i ulec podziałowi redukcyjnemu dającemu początek komórkom zdolnym do proliferacji. Już na początku naszych badań postawiliśmy hipotezę, że nieprawidłowy cykl komórkowy, któremu podlegają komórki poliploidalne indukowane do starzenia mogą prowadzić do odzyskiwanie aktywności podziałowej komórek nowotworowych, które w ten sposób przełamują barierę jaką jest starzenie. Zgodnie z tym przypuszczeniem wykazaliśmy, że niektóre komórki poliploidalne ulegające starzeniu wchodzą w nieprawidłową mitozę. Charakteryzowały ją wielopolarne wrzeciona i obecność opóźnionych chromosomów (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009). W efekcie po okresie intensywnej poliploidyzacji komórek indukowanych do starzenia obserwowaliśmy ich stopniową depoliploidyzację (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009, Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015), której towarzyszył wzrost liczby komórek pozbawionych markerów starzenia, zdolnych do proliferacji i tworzenia kolonii. Co szczególnie istotne, komórki które odzyskały potencjał proliferacyjny, charakteryzowały się zmienioną liczbą chromosomów w porównaniu do komórek, które były indukowane do starzenia (Sliwinska, Mosieniak i wsp. 2009). Zgodnie ze sformułowaną przed przeszło 100 laty i potwierdzoną przez szereg badań wiele lat później teorią Boveri ego, indukcja aneuploidii jest czynnikiem promującym rozwój nowotworu. Postulujemy zatem, że starzenie komórek nowotworowych indukowanych w trakcie terapii, któremu towarzyszy poliploidyzacja, niesie ryzyko wystąpienia wznowy nowotworu Opublikowane przez nas wyniki stanowiły pierwszy dowód świadczący o tym, że poliploidyzacja towarzysząca starzeniu komórkowemu indukowanemu chemioterapeutykami może prowadzić do zwiększenia niestabilności chromosomalnej komórek nowotworowych. Równolegle z opublikowaniem naszych wyników pojawiło się doniesienie, w którym autorzy badali wpływ cisplatyny na nowotwór prostaty w mysim modelu ksenograftów (Puig i wsp. 2008). Uzyskane przez nich wyniki były zbieżne z naszymi, dowodząc, że proces poliploidyzacji/depoliploidyzacji towarzyszący starzeniu zachodzi in vivo. Poszukując potencjalnych mechanizmów warunkujących podziały komórek poliploidalnych analizowaliśmy poziom reaktywnych form tlenu (RFT). Udział RFT w starzeniu komórkowym jest niekwestionowany i powszechnie rozpoznawany (Lu i Finkel 2008). Uważa się, że zwiększona produkcja RFT i powstające w wyniku ich działania uszkodzenia w makrocząsteczkach budujących 9

10 różne przedziały komórkowe są przyczyną starzenia komórkowego. Ponadto wykazano, że RFT odpowiedzialne są również za wsteczne przesyłanie sygnału niezbędne do podtrzymania fenotypu starzenia (Pasoss i wsp. 2010). Z drugiej strony RFT są coraz częściej rozpoznawane jako cząsteczki sygnałowe, które regulują szereg istotnych dla funkcjonowania komórki procesów takich, jak proliferacja, różnicowanie, migracja itp. (Ray i wsp. 2012). Zwiększona produkcja RFT jest też korelowana z transformacją nowotworową, jak również z progresją nowotworu (Sabharwal i Schumacker, 2014). Wykazaliśmy, że w komórkach raka okrężnicy HCT116 ulęgających poliploidyzacji i starzeniu dochodzi do znaczącego wzrostu masy mitochondriów oraz spadku potencjału na błonie mitochondrialnej. Zmianom tym towarzyszyła zwiększona produkcja reaktywnych form tlenu (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015). W celu wykazania roli, jaką pełnią reaktywne formy tlenu w starzeniu i poliploidyzacji zastosowaliśmy antyoksydant Trolox. Hodowla komórek w obecności antyoksydanta w istotnym stopniu obniżyła poziom RFT. Spowodowało to przejściowe obniżenie odsetka komórek poliploidalnych oraz nie wpłynęło na starzenie komórkowe. Co istotne wykazaliśmy, że obniżenie poziomu RFT komórek indukowanych do starzenia znacząco zmniejszyło liczbę komórek zdolnych do proliferacji, które pojawiają się gdy, indukcji starzenia towarzyszy poliploidyzacja (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015). Uzyskane wyniki podważają powszechnie obowiązujący, choć ostatnio coraz częściej kwestionowany paradygmat (Blogosklonny 2008, Ristow i Schmeisser 2011), mówiący o tym, że stres oksydacyjny jest kluczowym czynnikiem promującym starzenie komórkowe. Wyniki naszych badań wskazują, że podwyższony poziom RFT w poliploidalnej, ulegającej starzeniu komórce nowotworowej może być przyczyną wznowienia jej aktywności podziałowej. Starzenie komórek nowotworowych nie jest jednak bezwarunkowo związane z indukcją poliploidyzacji. Wykazaliśmy, że w analogicznych warunkach eksperymentalnych prowadzących do starzenia, komórki nowotworu piersi linii MCF 7 nie poliploidyzują (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015, Mosieniak i wsp. 2016). Co istotne, komórki te nie wznawiały proliferacji, co potwierdziliśmy badając ich klonogenność (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015). Był to kolejny dowód świadczący o tym, że to komórki poliploidalne ulegające starzeniu stanowią źródło komórek, które odzyskują potencjał proliferacyjny. W celu poznania molekularnego mechanizmu leżącego u podstaw poliploidyzacji prowadzącej do uniknięcia starzenia analizowaliśmy poziom dwóch kinaz serynowo-treoninowych mtor i Pim-1. Kinaza mtor należy do rodziny kinaz PI3KK. mtor uczestniczy w regulacji biosyntezy białek i wzrostu komórki, metabolizmu mitochondriów oraz autofagii. Udział tej kinazy w indukcji procesu starzenia potwierdzono eksperymentalnie dowodząc, że zahamowanie aktywności kinazy mtor może osłabić starzenie i zwiększyć potencjał proliferacyjny komórek (Xu i wsp. 2014). Niedawno opublikowana praca dowiodła również, że zahamowanie aktywności kinazy mtor jednocześnie obniżało poziom starzenia i poliploidii w komórkach nowotworowych (Sharma i wsp. 2014). Z kolei kinaza Pim-1 jest onkogenem, którego wysoki poziom występuje m.in. w nowotworach prostaty. Dowiedziono, że nadekspresja Pim-1 w unieśmiertelnionych komórkach nabłonkowych prostaty oraz piersi prowadzi do ich poliploidyzacji, koreluje ze zwiększoną niestabilnością chromosomalną oraz promuje powstawanie nowotowrów (Roh i wsp. 2008). Ponadto wzrost poziomu Pim-1 towarzyszy starzeniu replikacyjnemu i indukowanemu onkogenem fibroblastów (Jin i wsp. 2014). Korzystając z opracowanych przez nas modeli starzenia komórek nowotworowych raka okrężnicy (linia HCT116) oraz raka piersi (MCF7) indukowanego doksorubicyną wykazaliśmy, że wzrost aktywności mtor koreluje z poliploidyzacją komórek indukowanych do starzenia. Z kolei wysoki poziom Pim-1 10

11 stwierdziliśmy tylko w komórkach HCT116, a więc tych, które były podatne na indukcję poliploidyzacji towarzyszącej starzeniu (Mosieniak, Sliwinska i wsp. 2015). Uzyskane wyniki pozwalają przypuszczać, że zarówno kinaza mtor, jak i Pim-1 mogą być zaangażowane w regulację procesu ploiploidyzacji/depoliploidyzacji komórek nowotworowych indukowanych do starzenia. Określenie ich roli wymaga dalszych badań. Rola autofagii w starzeniu indukowanym w odpowiedzi na kurkuminę Odpowiedź komórek nowotworowych na chemio- i radioterapię wiąże się aktywacją wielu ścieżek sygnałowych, które mogą prowadzić do indukcji takich procesów, jak apoptoza, starzenie lub autofagia. Konsekwencją tych procesów może być eliminacja komórki nowotworowej lub jej przeżycie. Zatem efekt zastosowanej terapii jest wypadkową tych procesów i zależności, jakie pomiędzy nimi występują. Zarówno apoptoza, starzenie, jak i autofagia mogą przyczyniać się do ograniczenia wzrostu nowotworu, jednak tylko apoptoza prowadzi do nieodwracalnej eliminacji komórek nowotworowych. Niestety, w trakcie onkogenezy lub w wyniku stosowanej terapii komórki nowotworowe bardzo często nabywają oporność na apoptozę. W takim przypadku starzenie komórkowe i autofagia są procesami, które decydują o losach komórek nowotworowych. Autofagia jest procesem, który początkowo był opisywany jako programowana śmierć komórkowa typy II o porównywalnym znaczeniu co apoptoza (programowana śmierć komórkowa typy I) (Lockshin i Zakeri 2004). Aktualnie uważa się, że autofagia pełni w komórce poddanej stresowi przede wszystkim funkcje ochronne, umożliwiając usunięcie uszkodzonych makrocząsteczek. Badania na poziomie molekularnym wykazały, że istnieje szereg białek, które są zaangażowane w regulację zarówno apoptozy, jak i autofagi. W ten sposób dowiedziono, że obydwa te procesy są funkcjonalnie powiązane. Wykazano też, że zahamowanie autofagii może prowadzić do indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych poddanych działaniu chemioterapeutyku (Giansanti i wsp. 2011). Autofagia jest również powiązana ze starzeniem komórkowym, choć charakter tej zależności jest zdecydowanie mniej poznany niż to ma miejsce w przypadku apoptozy. Początkowo zaobserwowano obecność markerów autofagii w komórkach ulegających starzeniu replikacyjnemu (Gerland i wsp 2011). Dowiedziono również, że stare keartynocyty umierają na drodze autofagii (Gosselin i wsp. 2009, Deruy i wsp. 2010). Autofagia umożliwiała również przeżycie i w konsekwencji starzenie komórek śródbłonka poddanych stresowi (Patschan i wsp. 2008). Wszystkie powyższe prace były prowadzone na komórkach prawidłowych. Zależność pomiędzy autofagią i starzeniem w komórkach nowotworowych nie była wówczas badana. Podjęłam zatem prace mające na celu analizę związku pomiędzy apoptozą, autofagią i starzeniem zachodzącymi w komórkach nowotworowych poddanych stresowi. W badaniach wykorzystałam związek pochodzenia naturalnego kurkuminę. Kurkumina to polifenol o dobrze udokumentowanym działaniu przeciwnowotworowym i przeciwzapalnym (Gupta i wsp. 2013, Sikora i wsp. 2010). Jest związkiem o szerokim spektrum działania mającym bardzo wiele różnych celów w komórce. Dzięki swojej wybitnie niskiej toksyczności i dużej skuteczności w badaniach in vitro i in vivo, została ona włączona do badań klinicznych z obiecującymi rezultatami, głównie jako związek wspomagający klasyczne chemioterapeutyki. Jej wpływ na komórki nowotworowe oraz prawidłowe był przedmiotem licznych badań, prowadzonych od lat w zespole Prof. Ewy Sikory, w które byłam również zaangażowana 11

12 (Korwek i wsp. 2013, Wolanin i wsp. 2010, Wolanin i wsp. 2006, Sikora i wsp. 2006, Bielak-Mijewska i wsp. 2003, Piwocka i wsp. 2002). W podjętych przez nas badaniach wykazaliśmy, że kurkumina w zależności od stężania prowadzi do zahamowania proliferacji związanej z zatrzymaniem komórek raka okrężnicy HCT116, w fazie G1 i G2/M lub ich śmierci. Podobny efekt obserwowaliśmy w przypadku komórek posiadających funkcjonalne białko p53 (HCT116 p53+/+), jak i tych pozbawionych p53 (HCT116 p53-/-). Po raz pierwszy wykazaliśmy też, że okresowe (24-godzinne) traktowanie komórek nowotworowych kurkuminą podaną w stężeniu cytostatycznym prowadzi do wyraźnego zahamowania proliferacji komórek w ciągu kilku dni od usunięcia kurkuminy z pożywki. Obserwowanemu zahamowaniu proliferacji towarzyszyła indukcja starzenia (Mosieniak i wsp. 2012). W komórkach ulegających starzeniu pod wpływem kurkuminy dochodziło do aktywacji ścieżki p53/p21, która jest jedną z dwóch powiązanych z indukcją starzenia. Co istotne, komórki pozbawione białka p53 również ulegały starzeniu, a podniesiony poziom p21 świadczył o aktywacji szlaku przesyłania sygnału niezależnego od p53 i prowadzącego do indukcji ekspresji tego inhibitora cyklu komórkowego. Kurkumina prowadziła również do starzenia komórek raka piersi (MCF 7) oraz kostniakomięsaka (U2OS) dowodząc, że jej wpływ na komórki nowotworowe może mieć charakter uniwersalny (Mosieniak i wsp. 2012). Odpowiedź komórek raka okrężnicy na działanie cytostatycznych dawek badanego związku nie była jednorodna. W krótkim czasie po zabraniu kurkuminy obserwowaliśmy niski poziom apoptozy o przejściowym charakterze oraz indukcję autofagii. Co istotne, markery autofagii wykrywaliśmy w czasie poprzedzającym starzenie, ale również wtedy, gdy komórki nowotworowe miały już w pełni wyrażony fenotyp starzenia. Badanie immunocytochemiczne lokalizacji białka LC3 zaangażowanego w proces tworzenia autofagosomów oraz analiza z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej pozwoliła na identyfikację w komórkach ulegających starzeniu tzw. autofagosomów i autofagolizosomów charakterystycznych pęcherzyków powstających w trakcie autofagii. Co więcej, wzrost masy lizosomów, organelli uczestniczących w degradacji materiału komórkowego w trakcie autofagii, był skorelowany ze starzeniem komórek pod wpływem kurkuminy. Zgodnie z przedstawionymi wcześniej informacjami autofagia jest procesem powiązanym zarówno z apoptozą, jak i starzeniem, jednak charakter tych zależności pomiędzy tymi trzema procesami w komórkach nowotworowych poddanych stresowi nie był wcześniej badany. Stosując specyficzne sirna skierowane przeciwko białku ATG5 uczestniczącemu już we wczesnych etapach autofagii, hamowaliśmy ten proces w komórkach raka okrężnicy, a następnie poddawaliśmy je działaniu kurkuminy. Wykazaliśmy, że osłabienie autofagii nie wpłynęło na zwiększoną śmiertelność komórek, a jedynie osłabiło fenotyp starzenia i zwiększyło liczbę komórek zdolnych do proliferacji (Mosieniak i wsp. 2012). Uzyskane wyniki były pierwszymi, które pokazały, że hamowanie autofagii w komórkach nowotworowych poddanych działaniu związku o charakterze przeciwnowotworowym może prowadzić do osłabienia starzenia komórkowego i sprzyjać odzyskiwaniu potencjału proliferacyjnego. Wydaje się zatem uzasadnione stwierdzenie, że hamowanie procesu autofagii towarzyszącej starzeniu może osłabiać efekt terapeutyczny stosowanych związków. Opisana przez nas relacja zachodząca pomiędzy autofagią i starzeniem jest więc znacząco różna od tej zachodzącej pomiędzy autofagią i apoptozą, w której autofagia przeciwdziałała śmierci komórki, pełniąc funkcję cytoprotekcyjną niekorzystną z punktu widzenia terapeutycznego. Podobną jak zaobserwowana przez nas współzależność pomiędzy autofagią i starzeniem, opisał po raz pierwszy Young i wsp. (2009). Dowiedli oni, że w fibroblastach podlegających starzeniu 12

13 indukowanemu onkogenami autofagia bierze udział w przebudowie metabolizmu komórki, warunkując fenotyp sekrecyjny komórki starej. Podobnie jak w naszych badaniach, jej zahamowanie prowadziło do osłabienia procesu starzenia, ale nie eliminowało go całkowicie. Relacja pomiędzy starzeniem i autofagią nie jest jednoznaczna i uniwersalna. Część badań opublikowanych po ukazaniu się naszej pracy potwierdziło zaprezentowane przez nas wyniki (Goethe i wsp. 2012, Knizhnik i wsp. 2013). Niektóre zaś dowiodły, że autofagia jest procesem przeciwstawnym do starzenia, a zatem jej hamowanie promuje starzenie (Wang 2012, Drullion i wsp. 2012). Autofagia może również umożliwiać starzenie poprzez działanie antagonistyczne do apoptozy. W takim wypadku hamowanie autofagi prowadzi do nasilonej śmierci komórek i obniżenia liczby komórek starych (Huang i wsp. 2014, Filippi-Chiela i wsp. 2015). Współzależność, jaka występuje pomiędzy apoptozą, autofagią i starzeniem, może przybierać bardzo różne formy i być związana zarówno z typem komórek, jak i rodzajem stresu, któremu są poddawane, czasem działania stresu oraz jego intensywności. Bez wątpienia poznanie tych zależności oraz świadome ich modulowanie może przyczynić się do zwiększenia efektywności terapii. Zaburzenia mitozy jako przyczyna starzenia komórek indukowanego kurkuminą Kontynuując badania związane z indukcją starzenia komórek nowotworowych przez kurkuminę szukałam odpowiedzi na pytanie o mechanizm działania tego związku. Powszechnie uważa się, że główną przyczyną starzenia komórek prawidłowych oraz nowotworowych są uszkodzenia DNA, przede wszystkim te prowadzące do pęknięcia obydwu nici (ang. double strand DNA damage, DSB). Co więcej, uszkodzenia te nie są naprawiane w komórce ulegającej starzeniu, dzięki czemu na różnych jego etapach identyfikuje się na terenie jądra komórkowego skupiska białek związanych z rozpoznaniem i naprawą tych uszkodzeń (Rodier i Campisi 2011). Nienaprawianym uszkodzeniom DNA w komórkach ulegających starzeniu towarzyszy trwała aktywacja szlaku przesyłania sygnału od uszkodzeń DDR (ang. DNA damage response). W trakcie prowadzonych przez nas badań wykazaliśmy, że w komórkach indukowanych do starzenia kurkuminą dochodzi do wzrostu poziomu białka p53 i regulowanego przez niego inhibitora cyklu komórkowego p21, będących elementami szlaku DDR (Mosieniak i wsp. 2012). Ponadto stwierdziliśmy znaczący wzrost liczby skupisk ufosforylowanej formy histonu H2AX (ƳH2AX), będącego markerem miejsc pęknięcia podwójnej nici DNA w komórkach poddanych działaniu kurkuminy. Natomiast detekcja białka 53BP1, uczestniczącego w komórkowym mechanizmie rozpoznania i naprawy miejsc uszkodzenia DNA, potwierdziła, że ścieżka DDR pozostaje aktywna nawet w komórkach, które po okresowym działaniu kurkuminy są hodowane w pożywce pozbawionej tego związku (Mosieniak i wsp. 2016). Dowiedliśmy również, że aktywacja ścieżki DDR była konieczna do indukcji starzenia pod wpływem kurkuminy, gdyż zastosowanie inhibitora, w znaczący sposób obniżało odsetek komórek starych (Mosieniak i wsp. 2016). Nasze wątpliwości budził mechanizm indukcji uszkodzeń DNA przez kurkuminę. Część opublikowanych prac dowodzi, iż kurkumina może przyczyniać się do uszkodzeń DNA na przykład poprzez indukcję reaktywnych form tlenu (Scott i Loo 2004; Jianget i wsp. 2010) lub hamując aktywność topoizomerazy, enzymu zaangażowanego w rozplatanie DNA w trakcie replikacji lub transkrypcji (Martín-Cordero i wsp. 2003, López-Lázaro i wsp. 2007, Ketron i wsp.2013). Nasze własne badania, w których używaliśmy cytotoksycznych stężeń kurkuminy, dowiodły z kolei, że kurkumina nie prowadzi bezpośrednio do indukcji uszkodzeń DNA, zarówno w komórkach prawidłowych, jaki i nowotworowych (Korwek i wsp. 2013, Mosieniak i wsp. 2006). Obserwacja komórek linii HCT116 oraz MCF7 poddanych działaniu kurkuminy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem techniki time-lapse pozwoliła na stwierdzenie, że kurkumina prowadzi do długotrwałego zatrzymania komórek w mitozie (Mosieniak i wsp. 2016). W efekcie część z nich 13

14 umierała, zaś większość podlegała podziałowi na dwie komórki potomne lub przedwcześnie wychodziła z mitozy (tzw. ang. mitotic slippage) prowadząc do powstania komórki poliploidalnej. W trakcie przedłużonej mitozy komórki nabywały uszkodzeń DNA. Mechanizmy komórkowe prowadzące do tego zjawiska zostały niedawno opisane i wiążą się z częściową aktywacją apoptozy (Orth i wsp. 2012) lub z zaburzeniami struktury telomerów zależnymi od białka TRF2 (Hayashi i wsp. 2012). Przyczyną obserwowanych nieprawidłowości w podziale komórki było wadliwe formowanie wrzeciona podziałowego. Stosując barwienia immunocytochemiczne α-tubuliny wykazaliśmy w zdecydowanej większości komórek poddanych działaniu kurkuminy występowanie wrzecion monopolarnych, wielobiegunowych lub dwubiegunowych o wyraźnej asymetrii (Mosieniak i wsp.2016). Zaburzenia mitozy powodowane przez kurkuminę były opisywane przez nas we wcześniejszych pracach. Wykazaliśmy wówczas, że ich przyczyną może być nieprawidłowe funkcjonowanie kompleksu CPC (ang. chromosomal passanger complex), odpowiedzialnego za segregację chromosomów i cytokinezę (Magalska i wsp. 2006; Wolanin i wsp. 2006) lub hamowanie aktywności kinazy CDK1, która reguluje wejście komórek w mitozę (Bielak-Żmijewska i wsp. 2010). Podobny efekt działania kurkuminy był wiązany również z jej wpływem na Aurorę A, kinazę zaagażowaną w regulację segregacji chromosomów (Liu i wsp. 2011) oraz bezpośrednio na tubulinę, tworzącą wrzeciono podziałowe (Banerjee i wsp. 2010). Wszystkie wymienione powyżej prace korelowały zaburzenia mitozy indukowane przez kurkuminą ze śmiercią komórkową związaną z tzw. katastrofą mitotyczną. Nasza praca dowiodła po raz pierwszy, że zaburzenia mitozy nie kończą się śmiercią komórki lecz prowadzą do wydłużenia czasu podziału. Skutkuje to nabywaniem uszkodzeń DNA, które obecne są również w komórkach, które zakończyły mitozę i weszły w kolejną fazę cyklu. W konsekwencji utrzymujących się w komórkach uszkodzeń DNA i długotrwałej aktywacji szlaku DDR komórki poddane okresowemu działaniu kurkuminy ulegają starzeniu. Zadałam sobie również pytanie, na ile działanie kurkuminy jest specyficzne dla komórek nowotworowych i w jakim stopniu kurkumina poddana w tym samym schemacie wpływa na komórki prawidłowe. Wykazaliśmy, że kurkumina wywiera podobny efekt na proliferujące komórki mięśni gładkich aorty oraz fibroblasty, a więc prowadzi do gromadzenia się komórek w mitozie oraz ich starzenia (Mosieniak i wsp. 2016). Biorąc pod uwagę fakt, że w przeciwieństwie do komórek nowotworowych, większość komórek prawidłowych występujących w tkankach pozostaje w stanie spoczynku, badaliśmy wpływ kurkuminy na fibroblasty będące w fazie G0. Następnie fibroblasty były przesiewane i hodowane w warunkach promujących ich proliferację. Wykazaliśmy, że okresowe podanie kurkuminy spoczynkowym fibroblastom nie wpływa na ich późniejsze podziały oraz nie prowadzi do indukcji starzenia (Mosieniak i wsp. 2016). Na tej podstawie dowiedliśmy, że kurkumina, pomimo braku komórkowo-specyficznego działania, może wywierać korzystny z punktu widzenia terapeutycznego efekt na komórki nowotworowe, pozostając bezpieczna dla komórek prawidłowych. Kurkumina jako związek o przełamujący oporności na indukcję śmierci komórek nieproliferujących Jak wspominałam, starzenie komórkowe jest procesem, który zabezpiecza komórkę z uszkodzonym DNA przed wejściem na ścieżkę transformacji nowotworowej. Innym procesem komórkowym mającym podobny skutek jest różnicowanie. Dowiedziono, że hamowanie procesu różnicowania promuje nieograniczoną proliferację komórek charakterystyczną dla nowotworu. Klasycznym tego przykładem są ostre białaczki promielocytarne (APL), których powstanie wiąże się z zahamowaniem różnicowania komórek progenitorowych. Uważa się, że jest to wynikiem hamowania ekspresji genów 14

15 regulowanych przez kwas retinowy, uczestniczących w dojrzewaniu komórek linii mieloidalnej. Przyczyną obserwowanej represji genów zaangażowanych w różnicowanie są różnego typu translokacje w obrębie genu kodującego receptor kwasu retionowego α (RXRα) pełniącego funkcję czynnika transkrpcyjnego (Melnick i Licht 1999). Stąd też indukcja różnicowania komórek nowotworowych szybko stała się celem opracowywania nowych strategii terapeutycznych o niskiej toksyczności i wyższej specyficzności (Leszczynska 2001). Co ciekawe, istnieje szereg analogii pomiędzy różnicowaniem i starzeniem, a procesy te mogą być ze sobą powiązane. Wykazano na przykład, że indukcji starzenia może towarzyszyć ekspresja pewnych markerów różnicowania jak to miejsce w przypadku keratynocytów podlegających starzeniu pod wpływem onkogenu Ras (Lin i Lowe 2001). Dowiedziono również, że stosując te same związki można wywołać zarówno starzenie komórkowe, jak i różnicowanie, czego przykładem jest kwas retinowy powodujący różnicowanie białaczek (Melnick i Licht 1999) oraz starzenie komórek raka piersi (Chen i wsp. 2006). Warto zauważyć, że komórki zróżnicowane i stare mają szereg cech wspólnych. Podstawową jest bez wątpienia trwałe zahamowanie proliferacji. Wiąże się to często z aktywacją tych samych ścieżek przesyłania sygnału, prowadzących do wzrostu ekspresji inhibitorów cyklu komórkowego i spadku białek uczestniczących w regulacji proliferacji (Ferbeyre 2002). Ponadto wykazano, że zarówno komórki zróżnicowane (Ketley et al. 2000, Opolski et al. 2000, Wu et al. 1998, Wang i Studzinski 1997), jak i stare (Yosef i wsp. 2016, Sanders i wsp. 2013, Saski i wsp.2001, Wang i wsp. 1995) mają podwyższoną oporność na apoptozę. Zarówno różnicowanie, jak i starzenie komórek nowotworowych są procesami, które naśladują te zachodzące w komórkach prawidłowych w odpowiedzi na zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowe sygnały. Zgodnie z przedstawionymi przez mnie wcześniej wynikami istnieje w pełni uzasadnione przypuszczenie, że komórki nowotworowe ulegające starzeniu lub różnicowaniu mogą wymknąć się temu procesowi i wznowić proliferację. Zatem dążenie do eliminacji starzejących się lub różnicujących w wyniku zastosowanej terapii komórek nowotworowych jest w pełni uzasadnione. Poszukuje się więc związków mogących przełamać oporność na apoptozę tych komórek, umożliwiając ich usuniecie. Podjęłam zatem badania mające na celu sprawdzenie, czy kurkumina może okazać się użyteczna w przełamywaniu oporności na apoptozę nieproliferujacych komórek nowotworowych. Prace prowadzone wcześniej w zespole Prof. Ewy Sikory dowiodły, że kurkumina jest w stanie wywoływać apoptozę komórek nowotworowych opornych na cytotoksyczne działanie różnych związków stosowanych w terapiach (Wolanin i wsp. 2006, Magalska i wsp. 2006, Bielak-Mijewska i wsp. 2004, Piwocka i wsp. 2002). W badaniach wykorzystaliśmy dobrze opisany model różnicowania komórek białaczki HL-60 pod wpływem kalcitriolu - pochodnej witaminy D3 (1,25 dihydroksywitamin D3). W wyniku hodowli komórek linii HL-60 w obecności kacitriolu uzyskiwaliśmy populację komórek o wysokiej ekspresji markerów powierzchniowych charakterystycznych dla monocytów. Różnicowaniu komórek towarzyszyło ich zatrzymanie w fazie G1/G0 cyklu komórkowego (Mosieniak i wsp. 2006). Wykazaliśmy, że komórki zróżnicowane charakteryzowały się wysoką, w porównaniu do komórek niezróżnicowanych (proliferujących), opornością na cytotoksyczne działanie etopozydu chemioterapeutyku powodującego pęknięcia podwójnej nici DNA. W przeciwieństwie do etopozydu efekt działania kurkuminy na komórki zróżnicowane i niezróżnicowane w szerokim zakresie stężeń był zbliżony i prowadził do stopniowej utraty żywotności. Pod wpływem kurkuminy niezróżnicowane i zróżnicowane komórki HL-60 ulegały apoptozie. Dochodziło do aktywacji ścieżki zależnej od 15