Substancje pochodzenia naturalnego były stosowane w medycynie i ziołolecznictwie

Transkrypt

1 Związki pochodzenia naturalnego modulujące starzenie i śmierć komórek STRESZCZENIE Substancje pochodzenia naturalnego od setek lat były stosowane w medycynie i ziołolecznictwie. Od dawna wiadomo o ich działaniu przeciwbakteryjnym, przeciwgrzybiczym, przeciwnowotworowym, aktywności wspomagającej gojenie się ran czy wzmacniającej odporność. W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie nimi jako źródłem związków naturalnych, które mogą modulować starzenie komórkowe. Szczególne zainteresowanie budzą takie z nich, które mogą wpływać na indukcję starzenia komórek nowotworowych, opóźnienie starzenia komórek prawidłowych lub odwrócenie zmian związanych ze starzeniem komórek starych, czyli działające odmładzająco. Jak wykazano, niektóre związki naturalne mogą jednocześnie promować starzenie komórek nowotworowych oraz zapobiegać mu w komórkach prawidłowych, stąd ich duży potencjał w terapii chorób wieku podeszłego. Związki te działają m.in. poprzez regulację szlaków sygnałowych biorących udział w procesie starzenia, jak ścieżki zależne od poziomu składników odżywczych i stanu energetycznego (ang. nutrient and energy sensing pathways). Ponadto mogą one wpływać na hamowanie bądź indukcję takich procesów jak synteza reaktywnych form tlenu, wydzielanie cytokin, skracanie telomerów czy zmiany epigenetyczne DNA. Często substancje pochodzenia naturalnego działają plejotropowo, czyli mogą wpływać na starzenie komórek w różny sposób np. poprzez bezpośrednią neutralizację wolnych rodników i regulacje innych ścieżek sygnałowych. Ponadto, substancje pochodzenia naturalnego, często używane od lat np. jako przyprawy przeważnie nie wykazują skutków ubocznych. Dlatego ich zastosowanie jako suplementów diety bądź w terapii nawet przez dłuższy czas wydaje się stosunkowo bezpieczne. WPROWADZENIE Substancje pochodzenia naturalnego były stosowane w medycynie i ziołolecznictwie od setek lat. We współczesnej medycynie, opartej głównie na związkach syntetyzowanych chemicznie, wyszły z użycia lub zostały zapomniane. W ostatnich czasach substancje pochodzenia naturalnego wzbudzają zainteresowanie jako źródło związków biologicznie czynnych. Od wieków znane były ze swych właściwości np. antybakteryjnych, przeciwzapalnych czy przeciwnowotworowych. Dziś, kiedy ich działanie w wielu przypadkach poparte jest badaniami naukowymi, budzą na nowo zainteresowanie. Należą do nich liczne roślinne polifenole, np. resweratrol i kurkumina, różne alkaloidy lub hormony, np. melatonina. W ostatnich dziesięcioleciach znacznie wydłuża się średnia długość życia i systematycznie wrasta liczba osób w podeszłym wieku. Żyjemy dłużej, ale też chorujemy przewlekle, co powoduje, że leczenie jest coraz droższe. Chociaż nie można wyeliminować starzenia, jego opóźnienie oraz spowolnienie pojawiania się i rozwoju chorób związanych z wiekiem ma nie tylko na celu poprawę jakości życia, ale ma także istotny wymiar ekonomiczny. Dlatego też wzrasta liczba badań dotyczących samego procesu starzenia, jak i możliwości jego regulacji. Wiele badań wskazuje na to, że restrykcja kaloryczna może wpływać korzystnie na wydłużenie życia zwierząt. Jednak nie ma dostatecznych dowodów na to, że podobnie może ona działać na człowieka. Ponadto, ograniczenia diety są niekomfortowe dla ludzi. Dlatego rośnie zainteresowanie substancjami pochodzenia naturalnego, które mogą modulować proces starzenia naśladując zmiany, jakie obserwuje się przy stosowaniu restrykcji kalorycznej. Szereg związków naturalnych reguluje aktywność szlaków sygnałowych zależnych od dostępu substancji odżywczych (ang. nutrient sygnaling pathways), czy stanu energetycznego. Magdalena Dudkowska 1,* Karolina Kucharewicz 2 1 Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, Warszawa 2 Kolegium Międzywydziałowych Indywidualnych Studiów Matematyczno-Przyrodniczych, (MISMaP), Uniwersytet Warszawski, Warszawa * Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, Warszawa; tel. (22) , m.dudkowska@nencki.gov.pl Artykuł otrzymano 25 marca 2014 r. Artykuł zaakceptowano 14 kwietnia 2014 r. Słowa kluczowe: związki naturalne, restrykcja kaloryczna, starzenie komórkowe, śmierć komórkowa, długowieczność, odmładzanie Wykaz skrótów: DNMT (ang. DNA methyltransferases) metylotransferaza DNA; GH (ang. growth hormone) hormon wzrostu; HAT (ang. histone acetyltransferases) acetylotransferaza histonów; HDAC (ang. histone deacetylase) deacetylaza histonowa; htert (ang. human telomerase reverse transcriptase) katalityczna podjednostka telomerazy; IGF-1 (ang. insulinlike growth factor 1) insulinopodobny czynnik wzrostu 1; mtor (ang. mammalian target of rapamycin) kinaza białkowa mtor; RFT reaktywne formy tlenu; SASP (ang. senescence-associated secretory phenotype) fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem; SIRT1 NAD + -zależna deacetylaza Opublikowano dotąd wyniki wielu badań wskazujące na wpływ substancji pochodzenia naturalnego zarówno na przyspieszenie, jak i opóźnienie starzenia komórkowego oraz na długość życia zwierząt modelowych tj. Cenorhabditis elegans, muszki owocowej, myszy, a także ludzi [1]. Coraz więcej wiemy na temat mechanizmów działania związków pochodzenia naturalnego. Możliwość wywołania starzenia komórek nowotworowych, a więc w ten sposób zatrzymania ich proliferacji, ma szczególne znaczenie zwłaszcza w walce z nowotwora- Postępy Biochemii 60 (2)

2 mi opornymi na indukcję apoptozy. Istotny jest także fakt, że starzenie komórek nowotworowych można wywołać związkami stosowanymi dotąd w chemioterapii, jednak stosując niższe ich dawki, co zmniejsza efekty uboczne na komórki prawidłowe. Starzenie jest więc alternatywną drogą walki z nowotworami i stanowi ostatnio przedmiot intensywnych badań. Tak więc, regulacja procesu starzenia może mieć różne cele. Z jednej strony przeciwdziałanie starzeniu poprzez spowolnienie starzenia komórek prawidłowych, selektywną eliminację komórek starych czy działanie w kierunku ich odmłodzenia, z drugiej zaś indukcję starzenia jako formę walki z nowotworami. Wydaje się, że związki pochodzenia naturalnego mogą okazać się przydatne w realizacji powyższych celów (Ryc. 1). RESTRYKCJA KALORYCZNA Jak wykazano restrykcja kaloryczna, rozumiana jako obniżenie wartości kalorycznej pożywienia przy jednoczesnym zapewnieniu wszystkich niezbędnych składników do prawidłowego wzrostu i rozwoju organizmu, może wydłużać życie. Badania takie przeprowadzono na C. elegans, muszce owocowej, gryzoniach czy małpach [2,3]. Restrykcja taka nie może być zbyt duża, gdyż prowadzi wówczas do wielu zmian patologicznych i zwiększonej śmiertelności. Chociaż restrykcja o 30% wydłużała rezusom życie, trudno przypuszczać czy równie skuteczna byłaby dla ludzi. Wątpliwe jest także, aby ludzie dobrowolnie chcieli poddać się podobnym ograniczeniom. Ciągle niewiele wiemy o wpływie restrykcji kalorycznej na życie ludzi. Ponadto badania wskazują, że nie tylko sama restrykcja, ale i skład pożywienia może wpływać zarówno na długość, jak i jakość życia. Willcox i wsp. [4] w 2006 roku przedstawili wyniki badań dotyczące wpływu restrykcji kalorycznej na zdrowie i długość życia Japończyków z Okinawy. Zawartość kaloryczna pożywienia mieszkańców tej wyspy, znajdującej się pod okupacją amerykańską od drugiej wojny światowej aż do 1972 r., była niższa o około 11% niż innych Japończyków. Składała się ona głównie z produktów pochodzenia roślinnego, a była uboga w mięso i ryby. Wykazano, że średnia długość życia zarówno kobiet i mężczyzn z Okinawy jest wyższa niż innych Japończyków. Również liczba stulatków stąd pochodzących jest proporcjonalnie 4 5-krotnie wyższa niż spośród mieszkańców innych krajów rozwiniętych. Zauważono ponadto, że Japończycy ci nie tylko żyją dłużej, ale też później i rzadziej pojawiają się u nich choroby związane z wiekiem, takie jak nowotwory czy choroby serca. Jest to niewątpliwie skutek nie tylko restrykcji kalorycznej, ale i sposobu żywienia. Jak wykazano bowiem, rodzaj diety wpływa na zdrowie i długość życia np. dieta bogata w warzywa i owoce zmniejsza prawdopodobieństwo zachorowania na nowotwory trzustki [5]. Jednak zależność między restrykcją kaloryczną, dietą bogatszą w składniki pochodzenia roślinnego a wydłużaniem życia nie jest tak prosta. Ssaki naczelne, nawet blisko spokrewnione z człowiekiem, nie żyją od nas dłużej, a przecież ich dieta składa się głównie z owoców i warzyw (choć również w przypadku małp restrykcja kaloryczna prowadziła do wydłużenia ich życia) [6,7]. Zhao i wsp. [8] zbadali czy u ludzi doszło np. do mutacji genetycznych naśladujących zmiany obserwowane w przypadku stosowania restrykcji kalorycznej. Tłumaczyłoby to fakt, że żyjemy dłużej niż inne naczelne oraz, że ograniczona dieta nie będzie miała Rycina 1. Działanie związków naturalnych na komórki prawidłowe, stare i nowotworowe. Związki naturalne działają poprzez: A) opóźnianie starzenia komórek prawidłowych, B) działanie odmładzające na komórki stare, C) hamowanie transformacji nowotworowej komórek, które uległy uszkodzeniom DNA, D) indukcję starzenia komórek nowotworowych

3 takich pozytywnych efektów jak u innych zwierząt. Jednak wyniki badań dowiodły, że tak nie jest. Transkryptom (wzór ekspresji genów) u człowieka podobny jest do innych naczelnych i przypomina raczej taki jaki mają myszy karmione ad libitum, niż poddane restrykcji kalorycznej. Można więc oczekiwać, że ograniczenia takie u ludzi mogą mieć pozytywny efekt na długość życia. Shanley i Kirkwood zauważyli jednak, że na długowieczność wpływ ma nie tylko dieta, ale i środowisko. Małe ssaki inaczej reagują na ograniczenie pożywienia niż większe, dlatego wyników uzyskanych w doświadczeniach przeprowadzonych na gryzoniach nie powinno się przekładać bezpośrednio na ludzi [9,10]. Badania dotyczące ludzi przemawiają za tym, że restrykcja kaloryczna połączona ze zmianą diety wpływa korzystnie nie tyle na wydłużenie życia, ale na jego jakość, czyli zdrowie i opóźnienie wystąpienia chorób związanych z wiekiem [2,11,12]. Mimo płynących z tego korzyści trudno sobie wyobrazić, żeby przy tak łatwym dostępie do pożywienia w krajach rozwiniętych ludzie bez oporów poddaliby się ograniczeniom diety. Dlatego istotne wydają się poszukiwania substancji, które mogłyby wywoływać zmiany naśladujące te, które pojawiają się przy stosowaniu restrykcji kalorycznej. W ten sposób nie ograniczając spożycia, a stosując przy tym odpowiednie suplementy, moglibyśmy wpływać korzystnie na nasze zdrowie, a jednocześnie opóźniać starzenie. SZLAK ZALEŻNY OD HORMONU WZROSTU I IGF-1 Poziom dostępności składników odżywczych i stan energetyczny odbierany jest przez komórki za pośrednictwem specyficznych sensorów. Należą do nich szlaki sygnałowe biorące udział w odpowiedzi na bodziec jakim jest pożywienie (ang. nutrient sensing pathways). Jednym z nich jest szlak: hormon wzrostu/insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (GH/IGF-1, ang. growth hormone/insulinlike growth factor 1). IGF-1 produkowany jest w odpowiedzi na wzrost poziomu GH przez wiele komórek, zwłaszcza przez hepatocyty. Zarówno IGF-1 jak i insulina aktywują ten sam szlak sygnałowy, który m.in. prowadzi poprzez kinazę AKT do regulacji aktywności białek z rodziny FOXO oraz wpływa na tworzenie się kompleksów mtor (ang. mammalian target of rapamycin) [13], (Ryc. 2). Białka FOXO są czynnikami transkrypcyjnymi regulującymi ekspresję genów kodujących białka związane z hamowaniem cyklu komórkowego, opornością na stres czy apoptozą. Natomiast kinaza mtor, w zależności od kompleksu białek z nią związanych, może wpływać np. na metabolizm lipidów, translację, wzrost, czy autofagię, o czym będzie mowa dalej. Szlak zależny od IGF-1 odgrywa istotną rolę w procesie starzenia. Jak zauważono poziom IGF-1 spada z wiekiem. Sugeruje to, że jego wzrost mógłby działać korzystnie, czyli przeciwstarzeniowo. Istotnie w niektórych przypadkach Rycina 2. Schemat działania związków naturalnych na szlaki sygnałowe regulowane przez restrykcję kaloryczną. Związki naturalne przeciwdziałają syntezie cytokin prozapalnych przez działanie na czynnik transkrypcyjny NF-kB (melatonina, kurkumina), prowadzą do wzrostu poziomu autofagii poprzez hamowanie aktywności kinazy mtor (rapamycyna, kurkumina, kwercetyna, resweratrol), a także wpływają na zmiany syntezy i aktywność wielu białek tj. czynników transkrypcyjnych (FOXO, p53) poprzez aktywację NAD + -zależnej deacetylazy SIRT1 (monakolina, resweratrol). CR receptor dla cytokin; GH hormon wzrostu; IGFR receptor dla insulinopodobnego czynnika wzrostu; IR receptor dla insuliny; mtorc1 kompleks 1 mtor Postępy Biochemii 60 (2)

4 tak jest. Wiadomo, że niedowidzenie jest jedną ze zmian patologicznych charakterystycznych dla wieku podeszłego i dotyczy to nie tylko ludzi, ale i zwierząt. Zauważono, że podawanie IGF-1 dorosłym szczurom z wywołanym niedowidzeniem poprawiało plastyczność ich kory wzrokowej co stwierdzono m.in. na podstawie badania jej potencjałów [14]. Mogłoby się więc wydawać, że wzrost poziomu IGF-1 np. indukowany GH powinien przeciwdziałać starzeniu, ale paradoksalnie to właśnie obniżanie poziomu hormonu wzrostu sprzyja długowieczności. Myszy z niedoborem hormonu wzrostu żyją dłużej. Zaobserwowano u nich większą oporność na stres i wzrost syntezy enzymów antyoksydacyjnych [15]. Całkowite zahamowanie szlaku zależnego od IGF-1 okazało się letalne, podczas gdy obniżenie jego aktywności powoduje wydłużenie życia myszy. Zahamowanie szlaku zależnego od IGF- 1 poprzez mutację p110α podjednostki kinazy PI3K, prowadzącą do częściowej inaktywacji tej kinazy, przeciwdziała pojawiającym się z wiekiem zmianom u samców myszy, takim jak zmniejszona wrażliwość na insulinę czy nagromadzanie tłuszczu. Częściowe zahamowanie aktywności PI3K miałoby w tym wypadku prowadzić do wydłużenia życia myszy [16]. Wysoki poziom hormonu wzrostu, jak i IGF-1 jest potrzebny w czasie rozwoju, dopiero z wiekiem się obniża. Jego spadek zaobserwowano zarówno w prawidłowym jak i przyspieszonym starzeniu u myszy. U diabetyków z niedoborem receptora hormonu wzrostu, podobnie jak u osób z mutacją genu IGF-1 powodującą jego niedobór, nie zaobserwowano przypadków nowotworów. Jednak długość życia osób bez IGF-1 była o ponad połowę krótsza niż osób zdrowych, które tej mutacji nie miały. Zatem krótsza długość życia mogła być przyczyną braku u nich nowotworów [17]. Wśród stuletnich Żydów aszkenazyjskich zaobserwowano występowanie mutacji genu receptora IGF-1 prowadzącej do osłabienia jego aktywności [18]. Wydaje się, że osłabienie działania IGF-1 może sprzyjać długowieczności podczas gdy brak IGF-1 raczej nie. Na aktywność szlaku GH/IGF-1 wpływają nie tylko różnego rodzaju mutacje, ale również szereg substancji pochodzenia naturalnego np. polifenole roślinne. Zaobserwowano, że resweratrol, polifenol pochodzenia roślinnego występujący w ciemnych winogronach, owocach morwy czy czarnej porzeczki, może obniżać poziom IGF-1 u myszy w średnim wieku będących na wysokokalorycznej diecie. Wydłużał im życie w stosunku do myszy kontrolnych, przywracał wrażliwość na insulinę, prowadził do wzrostu aktywności kinazy aktywowanej AMP (AMPK, ang. 5 AMP-activated protein kinase) i poprawy funkcjonowania mitochondriów. Jednak takich zmian nie obserwowano u myszy karmionych standardowo [19]. Podobny efekt, czyli wydłużający życie, wykazały polifenole z rooibosa (Aspalathus linearis) o właściwościach antyoksydacyjnych, których głównymi składnikami są dihydrochalkon i aspalatyna. Aspalatyna zwiększała oporność na stres Caenorhabditis elegans, regulując prawdopodobnie szlak IGF-1/Daf-16 (Daf-16 to występujący u nicieni ortolog FOXO), co prowadziło do wydłużenia ich życia [20]. Natomiast szczury, którym podano do hipokampa kwas kainowy, powodujący drgawki podobne do napadów epilepsji, zachowywały lepsze zdolności poznawcze, o ile przez 8 tygodni przed podaniem kainianu były karmione dietą zawierającą 2% polifenoli z czarnych jagód. Stwierdzono u tych zwierząt spadek poziomu cytokin prozapalnych takich jak IL-1β, TNF-α, któremu towarzyszy obniżenie aktywności NFκB i wzrost poziomu IGF-1 [21]. Wyniki te wskazują na to, że polifenole z czarnych jagód mogą mieć znaczenie w spowalnianiu rozwoju chorób neurodegeneracyjnych, a więc tych, których ryzyko występowania wzrasta z wiekiem. Kolejna grupa polifenoli, tym razem z czarnej herbaty, działała hamująco na szlak IGF-1/FOXO prowadząc do wzrostu aktywności FOXO1a, co obserwowano w komórkach linii 293 i komórkach nowotworu wątroby linii HL1c. Towarzyszył temu spadek w nich ekspresji genu kodującego PEPCK (ang. phosphoenolpyruvate carboxykinase), białko biorące udział w regulacji glukoneogenezy w wątrobie. Autorzy sugerują, że polifenole z herbaty mogą mieć znaczenie w przeciwdziałaniu chorobom pojawiającym się z wiekiem, a szczególnie cukrzycy typu II [22]. Wpływ na rozwój cukrzycy typu II ma też stan zapalny i stres oksydacyjny, których pojawieniu się sprzyja otyłość. Melatonina, ssaczy hormon o właściwościach antyoksydacyjnych, podawana otyłym szczurom z cukrzycą, prowadziła do zmniejszenia poziomu cytokin prozapalnych (IL-6 i TNF-α oraz łagodziła stres oksydacyjny, a co za tym idzie przeciwdziałała rozwojowi choroby [23]. Trudno jest te wyniki przekładać na ludzi, gdyż szczury w przeciwieństwie do ludzi prowadzą nocny tryb życia, więc muszą mieć różną od ludzi regulację poziomu melatoniny. Jednak zarówno badania wskazujące na związek pomiędzy polimorfizmem MTNRIB, genu kodującego receptor melatoniny MT2 a cukrzycą typu II oraz na stwierdzony niższy poziom melatoniny u cukrzyków sugerują, że i u ludzi może ona przeciwdziałać rozwojowi tej choroby [24]. Powyższe przykłady wskazują na to, że substancje pochodzenia naturalnego mogą modulować szlak sygnałowy zależny od IGF-1, co może mieć znaczenie w opóźnieniu pojawienia się chorób związanych z wiekiem, jak też łagodzeniu ich objawów. SZLAK ZALEŻNY OD mtor PROWADZĄCY DO AUTOFAGII Kinazę mtor (ang. mammalian target of rapamycin) można zaliczyć do czujników dostępności składników odżywczych, gdyż jest sensorem wysokiego stężenia aminokwasów. mtor bierze udział w wielu procesach fizjologicznych takich jak wzrost, autofagia czy starzenie komórkowe (Ryc. 2 i 3). Wzrost jej aktywności, przy jednoczesnym zahamowaniu cyklu komórkowego, prowadzi do starzenia, podczas gdy jej spadek wiązany jest z aktywacją procesu autofagii [13,25]. Autofagię pierwotnie opisano jako odpowiedź komórki na głodzenie. Obecnie wiadomo, że jest ona aktywowana w odpowiedzi na różnego rodzaju stres. Aktywność kinazy mtor rośnie z wiekiem, a wzmożoną aktywność szlaku zależnego od mtor stwierdzono w szeregu chorób związanych z wiekiem, takich jak cukrzyca typu II, nowotwory, choroba Alzheimera, Parkinsona czy choroby układu krążenia. Restrykcja kaloryczna, która 210

5 Rycina 3. Szlaki zależne od AMPK i mtor prowadzące do autofagii i wzrostu. AMP adenozynomonofosforan; ATP adenozynotrifosforan; (FIP200, ULK1, Atg13) białka inicjujące procesy powstania autofagosomu; mtorc1 kompleks 1 mtor sprzyja długowieczności, prowadzi do obniżenia aktywności mtor. Wynika z tego, że hamowanie aktywności tej kinazy może naśladować działanie restrykcji kalorycznej, a tym samym korzystnie wpływać na wydłużenie życia. Istotnie, taką zależność zaobserwowano u zwierząt modelowych, takich jak np. nicień, muszka owocowa czy mysz [26,27]. Nie tylko poprzez niskokaloryczną dietę można wpływać na aktywność mtor, ale także stosując różnego rodzaju związki pochodzenia naturalnego, jak i uzyskane syntetycznie. Jednym z takich związków jest rapamycyna, wyizolowana z bakterii Streptomyces hygroscopius szczepu AY B994, stosowana po przeszczepach w immunosupresji. Podawana z pożywieniem myszom zarówno 9. i 20. miesięcznym prowadziła do wydłużenia ich życia. U myszy tych zaobserwowano spadek zachorowalności na nowotwory. Ponadto stwierdzono, że rapamycyna wpłynęła korzystnie na szereg zmian patologicznych pojawiających się z wiekiem. Zaobserwowano u tych zwierząt mniejsze zmiany degeneracyjne wątroby, ścięgna Achillesa czy łagodniejszą hiperplazję endometrium. Jednak pojawiły się też zmiany niekorzystne, jak zmętnienie soczewki czy zaburzenia spermatogenezy [27,28]. Podobnie, zaburzenia spermatogenezy pod wpływem rapamycyny zaobserwowano również u mężczyzn po transplantacji nerek [29]. Długoterminowe podawanie myszom rapamycyny może przeciwdziałać rozwojowi chorób wieku podeszłego. Podawana przez 10 tygodni prowadziła do zmiany profilu białkowego w sercu do takiego, jaki jest charakterystyczny dla myszy dużo młodszych. Jest to przykład swego rodzaju działania odmładzającego tego związku u myszy zdrowych [30]. Hamowanie aktywności mtor może mieć także istotne znaczenie w chorobach charakteryzujących się przyspieszonym starzeniem u ludzi. Jedną z nich jest zespół Hutchinson a-gilford a (ang. Hutchinson-Gilford progeria syndrome). W chorobie tej w wyniku mutacji w genie LMNA, kodującym laminę A, powstaje progeryna, białko o zmienionej strukturze, akumulujące się w komórce i tworzące agregaty. Prowadzi to do uszkodzeń jądra komórkowego i przyspieszonego skracania telomerów. Następstwem tego są uszkodzenia DNA prowadzące do aktywacji ścieżki DDR i zatrzymania cyklu komórkowego (ścieżka DDR jest omówiona szerzej w rozdziale Z. Korwka). Rapamycyna nie tylko spowalniała proces starzenia fibroblastów HGPS in vitro, ale też prowadziła do aktywacji autofagii i do autofagosomalnej degradacji agregatów progeryny [31,32]. W związku z tym autorzy sugerują, że rapamycyna może być skuteczna w walce z rozwojem HGPS. Jednakże ze względu na jej szereg skutków ubocznych, zastosowanie rapamycyny jest raczej ograniczone. Dlatego zsyntetyzowano wiele jej pochodnych tzw. rapalogów, powodujących mniejsze skutki uboczne. Na aktywność mtor hamująco mogą działać również polifenole zawarte w oliwie z oliwek. W ten sposób, jak również przez aktywację kinazy AMPK, mogą one prowadzić do wzrostu poziomu autofagii, a to z kolei do wzmożonej degradacji nagromadzających się z wiekiem uszkodzonych białek i organelli komórkowych. Taki rodzaj oczyszczania mógłby przeciwdziałać starzeniu [33]. Wraz z wiekiem spada zarówno poziom autofagii, jak też aktywność proteasomu. Prowadzi to do nagromadzania się uszkodzonych białek, jak również sprzyja tworzeniu się agregatów białkowych oraz wzrostowi stresu siateczki śródplazmatycznej. Dlatego wzrost poziomu autofagii pozwala na skuteczniejszą ochronę komórki przed gromadzeniem uszkodzeń. Taki pozytywny skutek indukcji autofagii poprzez zahamowanie aktywności mtor zaobserwowano w prawidłowych fibroblastach, w których podanie resweratrolu zapobiegało starzeniu tych komórek [34]. Istnieją jednak przypadki, w których to właśnie aktywacja mtor i starzenia komórkowego może mieć korzystne przeciwnowotworowe działanie. Osoby z marskością wątroby bardzo często zapadają na nowotwory tego narządu. Wykazano, że wzbogacenie diety aminokwasami (szczególnie leucyną) prowadziło u osób z marskością wątroby do spadku zachorowań na nowotwory tego narządu [35]. W tym przypadku wzrost aktywności mtor i indukcja starzenia komórkowego, które wiąże się z trwałym zatrzymaniem proliferacji komórek, jest formą ochrony przed neoplazją. Wzmożoną autofagię często obserwuje się w komórkach nowotworowych zwłaszcza po zastosowaniu związków cytotoksycznych. Komórki w ten sposób starają się przetrwać stres. Często działanie podawanych związków powoduje śmierć komórek nowotworowych, ale też zdarza się, że komórki te przeżywają. Autofagia może prowadzić do śmierci tzw. śmierci typu II (typ I to apoptoza). Dlatego hamowanie aktywności mtor stanowi jeden z celów terapii przeciwnowotworowej, który wydaje się mieć szczególne znaczenie w przypadku nowotworów opornych na indukcję apoptozy [36]. Komórki oporne na radioterapię stawały się na nią wrażliwe, gdy doprowadziło się w nich do wzrostu poziomu autofagii przez zahamowanie aktywności mtor np. rapamycyną [37,38]. Podobnie kurkumina, polifenol otrzymywany z kłączy ostrzyża długiego (Curcuma longa), składnik pochodzącej z Indii przyprawy curry, wzmacniała działanie radioterapii stosowanej w leczeniu białaczki. Kurkumina powodowała zatrzymanie ko- Postępy Biochemii 60 (2)

6 mórek nowotworu w fazie G2/M cyklu komórkowego, wzrost syntezy p21 WAF1/CIP1 i p53 oraz spadek aktywności mtor [39]. Zahamowanie kinazy mtor może również wzmacniać działanie leków przeciwnowotworowych. Taki efekt obserwowano w przypadku komórek raka piersi. Polifenole z winogron, resweratrol, kwercetyna i katechina nie tylko wzmagały działanie gefitinibu, leku przeciwnowotworowego, inhibitora receptora dla czynnika wzrostu naskórka (EGF, ang. epidermal growth factor), ale również przełamywały oporność na ten lek. Działanie to potwierdziły badania in vivo na myszach. Powyższe polifenole podawane równolegle z gefitinibem prowadziły do zahamowania wzrostu guzów, zapobiegały ich przerzutom działając przez hamowanie szlaku mtor/akt i aktywację AMPK [40]. Analogicznie sama kwercetyna przeciwdziałała wzrostowi i angiogenezie nowotworu prostaty u myszy [41]. Przeciwnowotworowe działanie kurkuminy zarówno in vitro jak i in vivo jest bardzo dobrze udokumentowane. Na przykład hamując szlak PI3K/AKT/FOXO, indukowała ona zależną od kaspaz apoptozę w komórkach kilku linii złośliwych białaczek [42]. Podawana w dawce 250mg/kg/dzień przez 14 dni myszom z wszczepionym ludzkim mięsakiem gładkokomórkowym (ang. uterine leiomyosarcoma) hamowała aktywność mtor i proliferację nowotworu [43]. W Pracowni Molekularnych Podstaw Starzenia Instytutu im. Marcelego Nenckiego od wielu lat prowadzone są badania dotyczące wpływu kurkuminy na wzrost, starzenie i śmierć komórek nowotworowych i prawidłowych. Liczne prace wskazują na hormetyczne działanie tego polifenolu tzn. korzystne w niższych dawkach, a zgubne w dawkach wysokich [44,45]. Jednak kurkumina nie tylko działa przeciwnowotworowo przez indukcję apoptozy. Może ona także prowadzić do starzenia komórek nowotworowych powodując zahamowanie ich wzrostu. Starzenie takie wywołano kurkuminą podawaną w niskich dawkach 7,5 mm - 15 mm, które tylko w nieznacznym stopniu powodują śmierć w komórkach mięsaka kościopochodnego U2OS, raka okrężnicy HCT116 oraz raka piersi MCF-7 [46]. Starzenie komórkowe obserwowano zarówno w linii komórek HCT116 posiadających p53, jak i pozbawionych genu tego białka. W obu przypadkach dochodziło do zatrzymania cyklu komórkowego i wzrostu syntezy p21 WAF1/CIP1, choć w komórkach HCT116 bez funkcjonalnego p53 indukcja syntezy p21 WAF1/CIP1 zachodziła na drodze niezależnej od p53. Starzeniu temu towarzyszył wzrost poziomu autofagii, której zahamowanie przez sirna skierowane przeciwko Atg5, białku biorącemu udział w tworzeniu autofagosomu, przeciwdziałało indukcji starzenia komórkowego. Wskazuje to na ścisły związek autofagii i starzenia [46]. Podobnie, indukcję autofagii i starzenia zaobserwowano pod wpływem melatoniny i jej pochodnej, odpowiednio w komórkach HCT116 i MCF-7 [47], (wyniki nieopublikowane). Innym związkiem naturalnym o działaniu przeciwnowotworowym jest berberyna, alkaloid występujący m.in. w różnych odmianach berberysu. Jak wykazano, alkaloid ten może powodować śmierć komórek nowotworowych wątroby HepG2 i MHCC97-L, indukując w nich apoptozę bądź śmierć w wyniku nadmiernej autofagii [48]. Powyższe przykłady wskazują na możliwości wykorzystania substancji pochodzenia naturalnego modulujących szlaki zależne od mtor, w tym prowadzące do starzenia i autofagii, zarówno w opóźnianiu starzenia, jak i przeciwdziałaniu chorobom wieku podeszłego oraz w terapii przeciwnowotworowej. TELOMERY I TELOMERAZA Jedną z postulowanych przyczyn starzenia się organizmów i spadku ich zdolności do regeneracji wraz z wiekiem jest starzenie replikacyjne. Starzeniu replikacyjnemu nie ulegają komórki nowotworowe. Ponad 85% nowotworów posiada dostatecznie wysoki poziom telomerazy, enzymu o aktywności odwrotnej transkryptazy, który dobudowuje powtarzalne sekwencje telomerowe do końca chromosomów i zapobiega starzeniu replikacyjnemu. Natomiast w wielu komórkach somatycznych poziom telomerazy jest zbyt niski by chronić telomery przed skracaniem [49]. Indukowanie starzenia bądź śmierci komórek nowotworowych poprzez hamowanie aktywności telomerazy jest kolejnym celem terapeutycznym. Odkrywamy coraz więcej naturalnych związków, które właśnie poprzez regulację aktywności telomerazy, są w stanie hamować proliferację i indukować apoptozę komórek nowotworowych. Jest to główny mechanizm przeciwnowotworowego działania katechin z herbaty, co ciekawe w stężeniu zbliżonym do tego, które osiągane jest we krwi w wyniku spożycia kilku filiżanek zielonej herbaty [50]. Najwyższą aktywność przeciwnowotworową wśród składników zielonej herbaty wykazuje galusan epigallokatechiny (EGCG). Jak wykazali Berletch i wsp. [51] związek ten w komórkach nowotworu piersi MCF-7 powoduje spadek poziomu mrna htert (ang. human telomerase reverse transcriptase), katalitycznej podjednostki telomerazy, odpowiedzialnej za aktywność tego enzymu. Jak wiadomo ekspresja genów zależna jest nie tylko od aparatu transkrypcyjnego, ale również od dostępności sekwencji DNA, która wynika z jej modyfikacji epigenetycznych np. metylacji. W wyniku traktowania komórek MCF-7 EGCG obserwowano spadek metylacji miejsc wiązania czynnika E2F-1 do promotora genu htert, jak również spadek acetylacji histonu H3 (lys9). Oba te procesy prowadzą do przyłączenia czynnika transkrypcyjnego E2F-1 do genu telomerazy, a E2F-1 w tym wypadku działa jako supresor transkrypcji. Podobne właściwości do katechin wykazują inne związki naturalne, jak na przykład witamina E. Występuje ona w postaci ośmiu form związków, które dzielimy na dwie grupy tokoferole i tokotrienole, różniące się obecnością wiązań nienasyconych w łańcuchu bocznym. Możliwe, że to właśnie nienasycony łańcuch tokotrienoli umożliwia im lepsze przenikanie przez błony komórkowe i większą aktywność przeciwnowotworową [52]. Eitsuka i wsp. [53] wykazali, że δ-tokotrienol znacząco hamuje aktywność telomerazy w komórkach gruczolakoraka jelita grubego DLD-1 poprzez spadek poziomu mrna htert. Co więcej, otrzymane przez nich wyniki sugerują możliwy mechanizm tego procesu. Tokotrienole znane są z regulacji syntezy takich białek jak kinaza AKT, związana ze wzrostem, proliferacją i przeżyciem komórek oraz NF-κB, czynnik transkrypcyjny biorący udział w odpowiedzi komórki na stres. Mogą one wpływać także na poziom kinazy białkowej C (PKC, ang. protein kinase C), która poprzez fosforylację reguluje aktywność róż

7 nych białek. Zahamowanie syntezy białka PKC powoduje obniżenie poziomu onkogenu c-myc, który jako czynnik transkrypcyjny zaangażowany jest w regulację syntezy podjednostki katalitycznej htert telomerazy. Również kurkumina wpływa hamująco na aktywność telomerazy, co wiąże się z przełamaniem nieśmiertelności komórek nowotworowych, które w przeciwieństwie do komórek somatycznych charakteryzują się wysokim poziomem syntezy i aktywności tego enzymu. Po traktowaniu kurkuminą komórek nowotworu piersi MCF-7 zauważono istotny spadek przeżywalności komórek w porównaniu do prawidłowych komórek nabłonkowych sutka MCF-10A. Dodatkowo, w wyniku traktowania 100 μm kurkuminą drastycznie spadał (o 81%) poziom mrna htert w komórkach MCF-7. Natomiast komórki MCF-10A nie wykazywały istotnych zmian proliferacji oraz syntezy białek w wyniku działania kurkuminy [54]. Szereg badań wskazuje na możliwość przywrócenia aktywności telomerazy w komórkach prawidłowych i zahamowania ich starzenia. Doświadczenia przeprowadzone na modelach mysich wskazują na poprawę zdolności do regeneracji tkanek, zwiększenie średniej długości życia zwierząt oraz opóźnienie starzenia w wyniku nadprodukcji telomerazy. Znane są też aktywatory telomerazy. Pierwszym, opisanym aktywatorem tego enzymu zarówno in vitro jak i in vivo był pochodzący z korzenia traganka (Astragalus membranaceus) związek, znany pod nazwą handlową jako TA-65 (ang. Telomerase Activator-65) [55]. Ekstrakt z traganka używany był od stuleci w medycynie chińskiej, natomiast wyizolowanie z niego substancji aktywnej (TA-65) oraz potwierdzenie jej przeciwstarzeniowych właściwości nadało mu nowe znaczenie; stał się cennym suplementem diety. TA-65 powoduje wzrost średniej długości telomerów oraz spadek odsetka krytycznie krótkich odcinków telomerowych w zarodkowych mysich fibroblastach. Suplementacja diety tym związkiem prowadzi do poprawy stanu zdrowia i wyższego poziomu telomerazy w niektórych tkankach myszy, co ważne nie zwiększając u nich ryzyka rozwoju nowotworów [56]. Badania nad dodatkiem TA-65 do diety ludzi potwierdzają jego pozytywny wpływ na organizm. U ochotników przyjmujących ten związek zauważono poprawę parametrów funkcjonowania układu krążenia, metabolizmu, wzmocnienie odporności oraz zwiększenie gęstości kości [55]. Przywrócenie aktywności telomerazy może być także celem terapii prowadzącej do odmłodzenia starych komórek w organizmie. Traktowanie starych fibroblastów ludzkich mieszaniną bogatą w tokotrienole wydłuża ich telomery, przywraca im morfologię komórek młodych, obniża odsetek komórek SA-β-gal (SA-β-gal, ang. senescence-associated β-galactosidase, marker starych komórek) pozytywnych oraz powoduje wznowienie podziałów komórkowych [57]. Możliwość odmłodzenia komórek starych jest dużą szansą w walce z chorobami wieku podeszłego oraz postępującą dysfunkcją tkanek pojawiającą się z wiekiem. Prowadzone badania nad telomerazą dążą do wykorzystania jej regulacji poprzez związki naturalne zarówno w indukcji starzenia w komórkach nowotworowych (katechiny, witamina E, kurkumina), zahamowania lub opóźnienia starzenia komórek prawidłowych oraz odwrócenia fenotypu komórek starych (TA-65, tokotrienole). Istnieją także ograniczenia wykorzystania takich związków, ponieważ aktywacja telomerazy w komórkach prawidłowych wiąże się ze wzrostem ryzyka rozwoju nowotworów. U myszy transgenicznych z nadprodukcją telomerazy oprócz wzrostu średniej długości życia o 10%, zaobserwowano zwiększoną zapadalność na nowotwory skóry oraz większą wrażliwość na czynniki kancerogenne [58]. Chociaż Bernardes de Jesus i wsp. [56,59] wykazali, iż aktywacja telomerazy u myszy poprzez podanie związku TA-65, bądź adenowirusa, kodującego białko TERT, wydłuża życie tych zwierząt, nie powodując u nich wzrostu zachorowania na nowotwory. Wydaje się więc, że niezwykle istotne jest dokładne poznanie mechanizmów tego procesu oraz opracowanie bezpiecznej formy aktywacji telomerazy. MODYFIKACJE EPIGENETYCZNE Ze względu na identyczne sekwencje DNA, jakie posiadają komórki jednego organizmu różna ekspresja genów spowodowana jest między innymi modyfikacjami epigenetycznymi np. metylacją i acetylacją [60]. Zmiany te obserwowane są w komórkach od procesu embriogenezy po starzenie komórkowe. W mysich, ludzkich i szczurzych komórkach starzejących się replikacyjnie oraz ludzkich fibroblastach indukowanych do starzenia nadtlenkiem wodoru stwierdzono spadek metylacji DNA [61,62]. Wraz z globalną hipometylacją DNA w komórkach starych obserwowana jest także hipermetylacja specyficznych miejsc, tak zwanych wysp CpG, odpowiedzialnych za wzrost, proliferację oraz ochronę komórek przed transformacją nowotworową [60]. Podczas starzenia komórek zachodzą również zmiany w acetylacji histonów, za które odpowiedzialne są acetylotransferaza histonów (HAT, ang. histone acetyltransferase) oraz deacetylaza histonów (HDAC, ang. histone deacetylase) [63]. Co ciekawe podobne zmiany epigenetyczne jak w komórkach starych obserwowane są także w komórkach nowotworowych. Spadek metylacji DNA powoduje niestabilność materiału genetycznego, wzrost liczby mutacji, co może inicjować kancerogenezę. Natomiast hipermetylacja wybranych genów prowadzi do wyciszenia w komórkach nowotworowych m.in. genów supresorowych nowotworów, genów związanych z cyklem komórkowym, naprawą DNA czy apoptozą, zwiększając oporność tych komórek na chemio- i radioterapię. Detekcja zmian epigenetycznych bądź ingerencja w takie zmiany w komórkach wzbudza duże zainteresowanie jako potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej [63]. W przeciwieństwie do wyciszenia genów poprzez mutacje (jak na przykład genów supresorowych nowotworów) inaktywacja niektórych genów w wyniku zmian epigenetycznych jest procesem odwracalnym. Ekspresja genów może być reaktywowana w wyniku działania różnych związków [63]. Istotnym związkiem w procesie metylacji DNA jest donor grupy metylowej, dlatego też istnieje szereg badań dotyczących wpływu suplementacji diety kwasem foliowym, który jest prekursorem takiego związku. Kwas foliowy, witamina z grupy B, jest niezbędny m.in. do utrzymania właściwego poziomu metylacji DNA, a tym samym zapobiega niestabilności i uszkodzeniom materiału genetycznego [64]. Jednakże jego nadmiar, jak wykazał Duthie [65] może prowadzić do zwiększenia ryzyka rozwoju nowotworów. Nie powinien zatem stanowić on suplementu codziennej diety, jeśli jesteśmy w stanie wraz z pożywieniem (np. warzywa liściaste) dostarczyć potrzebną jego ilość. Postępy Biochemii 60 (2)

8 EGCG oraz inne polifenole z zielonej herbaty powodują spadek aktywności enzymu odpowiedzialnego za metylację DNA, metylotransferazy DNA (DNMT, ang. DNA methyltransferase). Aczkolwiek istnieją sprzeczne doniesienia na temat mechanizmu działania polifenoli na proces metylacji DNA [63]. Jak wykazał Fang i wsp. [66] EGCG bezpośrednio hamuje aktywność DNMT, przyłączając się do jej miejsca aktywnego. Natomiast grupa Lee wykazała [67], że hamowanie tej metylotransferazy przez polifenole herbaty i inne flawonoidy z ugrupowaniem katecholowym jest zależne od ich metylacji, podczas której powstaje S-adenozylo-L- -homocysteina, niekompetycyjny inhibitor DNMT. Genisteina, związek z grupy izoflawonoidów, występujący w dużych ilościach w nasionach soi oraz innych roślinach z rodziny bobowatych (Fabaceae) także wpływa na aktywność enzymów metylujących i acetylujących DNA. Dane epidemiologiczne wskazują na odwrotną zależność między stosowaniem tradycyjnej niskotłuszczowej, zaś bogatej w soję diety azjatyckiej, a ryzykiem rozwoju nowotworów piersi i prostaty u ludzi [63]. Wpływ genisteiny na modyfikacje epigenetyczne DNA po raz pierwszy opisali Majid i wsp. [68], wyjaśniając w ten sposób mechanizm jej działania przeciwnowotworowego. Związek ten w komórkach raka prostaty człowieka (zarówno w linii komórek androgenozależnych jak i nie) powoduje wzrost syntezy inhibitorów cyklu komórkowego białek p21 WAF1/CIP1 oraz p16 Ink4a. Proces ten jest wynikiem braku metylacji w promotorze genu CDKN1A, kodującego p21 WAF1/CIP1 oraz wzrostu acetylacji histonów 3 i 4 w miejscach startu transkrypcji genów obu białek, co ułatwia dostęp do tych fragmentów nici DNA, a tym samym aktywuje ich tranksrypcję. W komórkach nowotworu piersi MCF-7 traktowanych genisteiną obserwowano spadek syntezy DNMT [69]. Kolejnym związkiem o podobnym działaniu jest partenolid, seskwiterpenowy lakton występujący w liściach złocienia maruna (Tanacetum parthenium). Oprócz właściwości przeciwzapalnych i przeciwmigrenowych wykazuje on również działanie przeciwnowotworowe. Dzięki obecności egzocyklicznej grupy metylenowej, partenolid może reagować z biologicznie ważnymi nukleofilami, zawierającymi grupę tiolową, jak na przykład L-cysteina. Związek ten obniża aktywność DNMT, prawdopodobnie poprzez alkilacje grupy tiolowej Cys1226 w miejscu katalitycznym tej metylotransferazy oraz powoduje spadek syntezy białka DNMT w komórkach białaczkowych MV4-11 przez blokowanie przyłączenia się czynnika transkrypcyjnego Sp-1 do promotora genu DNMT [70]. Co więcej, w badaniach in vitro komórek białaczki, raka skóry i piersi traktowanych partenolidem wykazano, że poprzez aktywację kinazy ATM kieruje on deacetylazę histonową HDAC1 na drogę degradacji proteosomalnej zależną od ubikwityny, zwiększając w ten sposób poziom acetylacji białek istotnych w rozwoju nowotworu [71]. Podobnym mechanizmem działania charakteryzuje się kurkumina, która blokuje miejsce aktywne metylotransferazy DNMT. Kurkumina powoduje w ten sposób globalną hipometylację DNA w komórkach białaczki [72]. Również niektóre antybiotyki, jak na przykład plikamycyna, produkowana przez Streptomyces plicatus czy apicydyna otrzymywana z Fusarium sp., wpływają na aktywność enzymów związanych z metylacją i acetylacją DNA [63]. Istotne znaczenie epigenetyki w starzeniu się organizmów oraz w procesie starzenia komórkowego potwierdzają również badania dotyczące białek z rodziny sirtuin. Wykazano, że aktywacja Sir2 wydłuża życie drożdży, muszek owocowych i nicieni. U ssaków opisano siedem ortologów tego genu - SIRT1-7. Białka SIRT są NAD + -zależnymi deacetylazami lizyny, zaangażowanymi w różnorodne procesy komórkowe, takie jak metabolizm glukozy, starzenie i kancerogeneza [73]. SIRT deacetylują m.in. histony przez co mogą wpływać na ekspresję różnych genów. SIRT1 działa hamująco na transkrypcję genów kodujących m.in. czynniki transkrypcyjne z rodzin FOXO i p53, związane z odpowiedzią na stres (omówione szerzej w rozdziale E. Sikory). Natomiast w odpowiedzi na uszkodzenia DNA białko to deacetyluje czynnik transkrypcyjny FOXO3, co prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, zahamowania apoptozy zależnej od FOXO by umożliwić naprawę DNA (Ryc. 2). Co więcej, komórki pozbawione SIRT1 charakteryzują się upośledzoną odpowiedzią na uszkodzenia DNA i nieprawidłowym systemem jego naprawy [63]. W wyniku zahamowania aktywności SIRT1 może dojść do wzrostu liczby komórek ulegających apoptozie, co stanowi potencjalną drogę walki z nowotworem. Dihydrokumaryna, używana jako środek aromatyzujący, występująca w nostrzyku żółtym (Melilotus officinalis), jest inhibitorem SIRT1. Olaharski i wsp. [74] wykazali wzrost acetylacji p53, wyższą wrażliwość na cytotoksyczne działanie tego związku oraz wzrost apoptozy w ludzkich komórkach limfoblastycznych TK6 traktowanych dihydrokumaryną. SIRT1 reguluje ekspresję genów bezpośrednio przez deacetylacje histonów lub pośrednio przez aktywację innych białek. Białko to wykazuje zwiększoną aktywność szczególnie w warunkach restrykcji kalorycznej, bądź w obecności określonych związków, aktywatorów. Li i Tollefsbold [75] badając fibroblasty ludzkie, hodowane w pożywce z obniżoną zawartością glukozy, co naśladowało warunki restrykcji kalorycznej, wykazali wpływ SIRT1 na białko p16 Ink4a. W komórkach tych spada synteza białka p16 Ink4a oraz istotnie wzrasta poziom mrna i białka SIRT1. Komórki z ograniczonym dostępem do glukozy wykazywały również większą aktywność SIRT1 oraz wzrost wiązania SIRT1 do promotora genu kodującego białko p16 Ink4a. Wraz ze spadkiem poziomu p16 Ink4a następowała aktywacja ścieżki AKT/mTOR/S6K1, związanej m.in. z długowiecznością. Wskazuje to na ważną rolę SIRT1 w regulacji starzenia, zarówno dzięki jej zdolności do deacetylacji histonów w promotorze genu INK4A, jak i możliwość aktywacji ścieżki sygnałowej AKT/mTOR/S6K1 (Ryc. 2 i 3). W komórkach z nadprodukcją SIRT1 wzrasta aktywacja kinaz ERK i S6K1, natomiast w starych fibroblastach linii 2BS spada zarówno synteza SIRT1, jak i fosforylacja ERK i S6K1. Może to świadczyć o zaangażowaniu ścieżki ERK/ mtor/s6k1 w zależną od SIRT1 regulację starzenia [76]. Oprócz restrykcji kalorycznej aktywująco na SIRT1 działa również resweratrol. Jak wykazali Yamashita i wsp. [77] traktowane resweratrolem komórki HUC-F2 charakteryzowały się wzrostem aktywności SIRT1 oraz wzrostem transkrypcji htert. Monakolina K, fitostatyna pochodząca z czerwonego ryżu poddanego fermentacji przez grzyby Monascuc purpureus, również jest w stanie aktywować SIRT1. Co więcej, aktywuje ona ścieżkę SIRT1/AMPK/FOXO1, w wyniku czego zmniejsza poziom lipidów przez hamowanie syntazy kwasów tłuszczowych (FAS, ang. fatty acid synthase) [78]

9 Zarówno komórki stare jak i nowotworowe charakteryzują się globalną hipometylacją DNA, spadkiem aktywności metylotransferazy DNMT oraz hipermetylacją konkretnych obszarów DNA, zwykle kodujących kluczowe dla rozwoju nowotworu geny. Próbuje się zapobiegać tym zmianom poprzez dostarczenie związku będącego prekursorem donora grupy metylowej (kwas foliowy), zwiększając w ten sposób poziom metylacji DNA w komórkach starych lub hamując aktywność DNMT (polifenole, partenolid, kurkumina) w komórkach nowotworowych. Służy to zapobieganiu hipermetylacji genów kluczowych w eliminacji tych komórek na drodze starzenia lub apoptozy (TP53, INK4a). Inną modyfikacją epigenetyczną DNA jest jego acetylacja, w której ważną rolę odgrywają białkowe deacetylazy sirtuiny. Ich aktywacja (np. resweratrolem) zwiększa efektywność mechanizmów naprawy DNA, zmniejszając w ten sposób odsetek komórek ulegających apoptozie. Modyfikacje epigenetyczne stały się jednym z głównych celów działania w kierunku odmłodzenia organizmu. Starzenie jest nie tylko wynikiem zmian zależnych od czynników genetycznych i środowiskowych. Postuluje się możliwość odwrócenia działania zegara biologicznego poprzez tzw. reprogramowanie epigenetyczne komórek lub tkanek. Niezbędne w tym celu jest lepsze poznanie modyfikacji epigenetycznych oraz określenie profilu epigenetycznego komórek starych i młodych [79]. USZKODZENIA BIAŁEK I DNA STRES OKSYDACYJNY Wraz z wiekiem w organizmie spada efektywność mechanizmów odpowiedzialnych za odpowiedź i ochronę komórek przed stresem. Źródła czynników stresowych mogą być zarówno zewnętrzne, pochodzące ze środowiska (promieniowanie, zanieczyszczenia), diety (cukry redukujące, aldehydy), jak i wewnątrzkomórkowe (procesy zapalne, nadmierna aktywność oksydazy NADPH oraz uszkodzenia mitochondriów) [1]. W komórkach starych dochodzi do zaburzenia homeostazy białek. Mimo wielu mechanizmów kontroli jakości i funkcjonalności proteomu, niektóre białka są nieprawidłowo fałdowane lub zagregowane i stanowią zbędny, czasem toksyczny dla komórki składnik. W wyniku ich nagromadzenia może dochodzić do rozwinięcia stanu zapalnego lub śmierci komórki. Wykazano, że chroniczna ekspresja nieprawidłowych białek prowadzi do rozwoju chorób związanych z wiekiem takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona czy zaćma [13]. Stąd w terapii tych schorzeń poszukuje się związków, które byłyby w stanie kierować zbędne białka na drogę degradacji, bądź prowadzić do ich naprawy. W komórkach starych spada także wydajność systemów naprawy uszkodzeń DNA i dochodzi do ich nagromadzenia Stąd oprócz uszkodzeń białek często obserwowanym markerem starzenia są uszkodzenia nici DNA, związane ze wzrostem produkcji reaktywnych form tlenu (RFT) i azotu (RFA) oraz narażeniem na działanie promieniowania UV [13]. RFT w odpowiednim, fizjologicznym stężeniu są niezbędne w wielu procesach komórkowych, natomiast wzrost ich produkcji, prowadzący do rozległych lub niemożliwych do naprawy uszkodzeń DNA może być przyczyną transformacji nowotworowej komórek, bądź indukcji ich starzenia. Aczkolwiek przyczynowa rola RFT w starzeniu została ostatnio mocno podważona (parz artykuł E. Bartnik). Regulacja poziomu reaktywnych form tlenu stała się zatem celem w zapobieganiu zmianom nowotworowym w organizmie [1]. Poprzez swoją niestabilność genomową oraz zwiększone tempo proliferacji komórki nowotworowe są bardziej wrażliwe na działanie czynników uszkadzających DNA, a ze względu na ich upośledzony system naprawy DNA częściej niż w komórkach prawidłowych uszkodzenia te prowadzą do śmierci komórki [80]. Natomiast by ochronić komórki prawidłowe organizmu przed nadmiernymi uszkodzeniami poszukuje się związków będących inhibitorami reaktywnych form tlenu, antyoksydantów. Wiele związków naturalnych dostarczanych z pożywieniem, bądź produkowanych przez sam organizm ma właściwości antyoksydacyjne. Hormon ssaczy melatonina czy polifenole, jak na przykład kurkumina, EGCG, kwasy fenolowy np. z suszonych owoców i kawowy z jemioły pospolitej (Viscum album) są efektywnymi zmiataczami wolnych rodników, co oznacza że neutralizują one reaktywne formy tlenu lub azotu [1]. Melatonina ma również właściwości antyoksydacyjne [81]. Tan i wsp. [82] wykazali zdolność melatoniny do neutralizacji wysoko toksycznych rodników hydroksylowych ( OH). Oprócz bezpośredniej neutralizacji wielu toksycznych form tlenu i azotu melatonina stymuluje również obronę antyoksydacyjną [83]. Hormon ten powoduje wzrost poziomu mrna enzymów antyoksydacyjnych [84,85] oraz hamowanie enzymów prooksydacyjnych [86]. Melatonina chroni białka oraz kwasy nukleinowe przed uszkodzeniami, a także hamuje syntezę nieprawidłowych cząsteczek białek np. β-amyloidu [87]. Podobne właściwości neutralizujące wolne rodniki ma kurkumina, która zapobiega peroksydacji lipidów błony komórkowej, a tym samym chroni ją przed utratą integralności. Co ciekawe, produkty metabolizmu lub reakcji rozkładu kurkuminy, jakimi są kwas ferulowy i wanilina również wykazują właściwości antyoksydacyjne [88]. Kurkumina stała się także potencjalnym lekiem w chorobie Alzheimera, gdyż hamuje tworzenie się złogów amyloidowych w organizmie [89,90]. Kurkumina hamuje również aktywność indukowalnej formy syntazy tlenku azotu inos [88]. Ponadto powszechnie występujące inne polifenole pochodzenia roślinnego z grupy flawonoidów, jak kwercetyna, kemferol i fizetyna są także przeciwutleniaczami [1]. Wykazano też istnienie wielu związków powodujących wzrost odporności komórek na czynniki stresowe. Na przykład kwas taninowy przyczynia się do zwiększonej oporności na stres termiczny, oksydacyjny bez wpływu na zdolność do reprodukcji u Caenorhabditis elegans [91]. Ciekawą grupą związków są metabolity pochodzące z mikroorganizmów i organizmów morskich, które często stanowią składniki preparatów kosmetycznych skierowanych przeciw starzeniu się skóry. Powodem jest ich zdolność do zapobiegania fotostarzeniu, czyli przyśpieszonemu starzeniu wywołanemu promieniowaniem UV. Florotanina izolowana z algi brunatnej (Eckloina cava) chroni fibroblasty ludzkie przed starzeniem i uszkodzeniami indukowanymi promieniowaniem UV-B [92]. Również opisywany już wcześniej galusan epigallokatechiny chroni fibroblasty ludzkie poddane działaniu promieniowania UV-B przed degradacją kolagenu, hamuje produkcję kolagenazy i metaloproteinaz [93]. Niektóre zmiatacze wolnych rodników jak np. polifenole, w pewnych warunkach paradoksalnie są w stanie Postępy Biochemii 60 (2)

10 generować reaktywne formy tlenu i powodować uszkodzenia oksydacyjne DNA w komórkach nowotworowych [94]. Komórki nowotworowe charakteryzują się upośledzonym systemem naprawy DNA, stąd kolejnym celem terapii przeciwnowotworowej stała się wywołana przez związki antyoksydacyjne generacja RFT, prowadząca do nadmiernych uszkodzeń DNA tych komórek [80]. Istotne znaczenie w procesie produkcji reaktywnych form tlenu w komórkach ma też wewnątrzkomórkowe stężenie metali. Khan i wsp. [95] wykazali, że apoptoza komórek nowotworowych pod wpływem polifenoli ma swoje podłoże w uszkodzeniach DNA wywołanych wzrastającą liczbą RFT. W badanych przez nich komórkach nowotworu piersi MDA- -MB-468, prostaty PC3 oraz trzustki BxPC-3 traktowanych EGCG, apigeniną oraz luteoliną wzrastała wewnątrzkomórkowa produkcja reaktywnych form tlenu. Jest to związane z właściwościami chelatującymi tych polifenoli. Aczkolwiek niektóre związki naturalne ze względu na słabe wiązanie przez nie jonów, działają bardziej jako mobilizatory niż chelatory jonów. Odrywają one jony od rozmaitych cząsteczek białek, DNA w komórkach chwilowo je wiążąc, by następnie uwolnić je do cytoplazmy, zwiększając w ten sposób stężenie wolnych jonów metali we wnętrzu komórki [96]. Zatem komórki nowotworowe często posiadające podwyższony poziom jonów miedzi i cynku w stosunku do komórek prawidłowych, są o wiele bardziej narażone na stres oksydacyjny prowadzący do powstawania wolnych rodników oraz reaktywnych form tlenu i azotu. Ze względu na to, że mobilizacja jonów metali w komórkach indukowała starzenie, rozpoczęto poszukiwania związków, które by regulowały homeostazę metali w komórce, a tym samym opóźniały starzenie. Właściwości takie wykazują metalotioneiny opóźniając procesy związane ze starzeniem zarówno in vitro jak i in vivo. Białka te biorą udział w detoksykacji organizmu z metali ciężkich, szczególnie cynku, które mogą generować stres oksydacyjny. Ze względu na to, szczególnie ważne wydają się związki wpływające na wzrost poziomu metalotionein. Wzrost taki można również osiągnąć przez przejściową ekspozycję komórek na wyższe stężenia cynku [97]. W ochronie organizmu przed stresem oksydacyjnym duże znaczenie mają również mieszaniny związków. Nie we wszystkich przypadkach znane są substancje czynne, bądź dane związki uzyskują konkretne, pozytywne dla organizmu właściwości dopiero w obecności innych substancji. Duże zainteresowanie budzą więc ekstrakty z ziół, na przykład olejek z róży damasceńskiej (Rosa damascena), z liści miłorzębu dwuklapowego (Ginkgo biloba), cynomorium (Cynomorium songaricum), które mają właściwości antyoksydacyjne oraz wydłużają życie muszki owocowej czy C. elegans [1]. Znane i używane od stuleci w medycynie chińskiej mieszanki ziołowe, np.: korzeń piwonii, kłącze selernicy, kwiat krokosza, kłącze cibory, korzeń saussurei i korzeń szałwi chińskiej (Paeoniae radix, Cnidii rhizoma, Carthami flos, Cyperi rhizoma, Saussureae radix i Salviae miltiorrhizae radix) opóźniają starzenie ludzkich fibroblastów w warunkach stresu oksydacyjnego oraz zapobiegają u szczurów związanemu z wiekiem nadmiernemu odkładaniu się tłuszczów [98]. Ponadto wiele spożywanych przez nas warzyw i owoców zawiera związki lub całe grupy związków o ochronnych właściwościach przeciwutleniających. Zarówno szpinak, oregano, fasola jak i kakao wydłużają życie organizmów doświadczalnych (muszka owocowa, nicienie) oraz chronią je przed stresem i uszkodzeniami DNA [1]. Istnieje szereg związków wykazujących właściwości antyoksydacyjne, które stanowią potencjalne leki w walce z chorobami związanymi z wiekiem oraz nowotworami. Ważne jest też dwojakie działanie polifenoli, silnych antyoksydantów, które w komórkach prawidłowych działają jako zmiatacze wolnych rodników. Zaś w komórkach nowotworowych o podwyższonym wewnątrzkomórkowym stężeniu jonów miedzi, polifenole są słabymi chelatorami, które zamiast wiązać te jony prowadzą do ich mobilizacji. W ten sposób dochodzi do wzrostu stężenia wewnątrzkomórkowego wolnych jonów i w konsekwencji do wzrostu produkcji reaktywnych form tlenu. Już od stuleci w lecznictwie używano różnych ekstraktów z ziół, zawierających antyoksydanty. Wiele z substancji przeciwutleniających zawartych jest w powszechnie stosowanych składnikach pożywienia jak przyprawy (kurkumina), owoce (resweratrol), warzywa, herbaty, zioła, dlatego zdrowa, przemyślana dieta jest ważnym elementem profilaktyki przeciwnowotworowej. Co prawda antyoksydanty opóźniały starzenie indukowane w komórkach w hodowli in vitro, natomiast nie wykazano ich działania wydłużającego życie zwierząt. Zatem są one odpowiedzialne jedynie za ochronę organizmu przed czynnikami stresowymi i nadmiernymi uszkodzeniami, zmniejszając w ten sposób ryzyko wystąpienia mutacji, stanów zapalnych bądź zmian nowotworowych, nie mogą jednak być uznane za związki wydłużające życie. CHRONICZNY STAN ZAPALNY Istotnym elementem procesu starzenia jest fenotyp sekrecyjny komórek (SASP, ang. senescence associated secretory phenotype). Wzmożone wydzielanie m.in. cytokin czy czynników wzrostu przez komórki stare może być przyczyną indukcji starzenia bądź kancerogenezy w komórkach sąsiadujących. SASP wiązany jest z występującym w starszym wieku chronicznym stanem zapalnym, do którego przyczynia się nagromadzanie liczby starych komórek [99]. Zatem zahamowanie SASP stało się ważnym celem w walce ze starzeniem i chorobami z nim związanymi, w tym z nowotworami. Choć nieznane są związki, które bezpośrednio hamują sekrecję (SASP), istnieją natomiast takie, które regulują wydzielanie cytokin prozapalnych, działając głównie poprzez ścieżkę zależną od czynnika transkrypcyjnego NF-κB (biorącego udział w odpowiedzi komórki na stres oraz regulację proliferacji i adhezję komórek). Jednym z takich związków jest metformina, otrzymywana z rutwicy lekarskiej (Galega officinalis). Ten często stosowany lek przeciw cukrzycy, hamuje aktywację czynnika NF-κB, nie zmieniając przy tym wydzielania cytokin przeciwnowotworowych takich jak interferon. Zmniejsza przez to ryzyko rozwoju przewlekłego stanu zapalnego oraz zachorowania na nowotwory [100]. Innymi modulatorami SASP są steroidy. Należą do nich kortykosteron oraz kortyzol, hormony produkowane przez korę nadnerczy, które zmniejszają sekrecję prozapalnych czynników w ludzkich starzejących się fibroblastach hamując aktywność NF-κB [101]. Spadek poziomu NF-κB, zachodzi również przez zmiany epigenetyczne wywołane traktowaniem komórek glukozaminą, prekursorem glikozaminoglikanów [102]. Istnieje wiele badań dotyczących przeciwzapalnego wpływu kurkuminy na 216

11 organizm. Ten polifenol nie tylko hamuje aktywację NF-κB (Ryc. 2), ale również zapobiega jego przyłączeniu do DNA. Kurkumina hamuje również kinazę IKK, która poprzez fosforylację inhibitora IκB może aktywować czynnik NF-κB. Związek ten zapobiega w ten sposób zarówno konstytutywnej, jak i indukowanej aktywacji NF-κB. Potęguje ona również apoptozę komórek nowotworowych indukowaną czynnikiem TNFα [103]. Na procesy zapalne w organizmie wpływ mają także enzymy, takie jak cyklooksygenaza COX-2, lipooksygenaza LOX oraz syntaza tlenku azotu inos. Są one zaangażowane w syntezę prostaglandyn, których wzrost jak wykazano, sprzyja rozwojowi nowotworów zarówno u zwierząt modelowych, jak i u ludzi. Kurkumina, oprócz właściwości omawianych wcześniej, może powodować spadek syntezy enzymu COX-2 oraz hamować aktywność enzymu LOX, a tym samym zmniejszać syntezę prostaglandyn [88]. Podobnie plejotropowe działanie na procesy prozapalne ma melatonina. W chorobach związanych z wiekiem, jaką jest choroba Alzheimera, obserwuje się aktywację mikrogleju wywołaną akumulacją β-amyloidu, której konsekwencją jest nadprodukcja prozapalnych cytokin. Melatonina podawana doustnie powoduje obniżenie poziomu cytokin takich jak interleukiny IL-1β i IL-6 oraz czynnika transkrypcyjnego NF-κB i tlenku azotu w mózgu szczurów [104]. Melatonina u starych myszy obniża również poziom NF-κB w gałce bladej, części kresomózgowia do poziomu, jaki obserwowany jest u myszy młodych [105]. W walce z chorobami związanymi z wiekiem dużą rolę odgrywa również starzenie układu odpornościowego prowadzące do osłabienia odporności swoistej i nieswoistej. Wraz ze starzeniem następuje inwolucja grasicy, zaburzenie proporcji między liczbą limfocytów naiwnych, pamięci oraz efektorowych. Natomiast melatonina, jako hormon o szerokim spektrum działania, jest stymulatorem układu odpornościowego. Oprócz modulacji poziomu pro- i przeciwzapalnych cytokin, reguluje również liczbę leukocytów i aktywuje monocyty. Co więcej, zwiększa stosunek liczby limfocytów CD4 + do CD8 + w węzłach chłonnych, co świadczy o dobrym stanie układu odpornościowego i jego zdolności do obrony organizmu przed infekcją [24]. Związki naturalne mogą w różny sposób wpływać na fenotyp wydzielniczy komórek. Poprzez hamowanie czynnika NF-κB, enzymów prozapalnych COX, LOX oraz działanie antyoksydacyjne możliwe jest obniżenie poziomu wydzielanych cytokin, a tym samym zapobieganie rozwojowi chronicznego stanu zapalnego. Nie jest także udokumentowane by samo hamowanie wydzielania cytokin prozapalnych (SASP) wydłużało życie organizmów. Zwykle związki naturalne jak na przykład berberyna czy kurkumina o aktywności przeciwzapalnej mogą działać na wiele procesów w organizmie. Oprócz hamowania kinazy IKK mogą one aktywować kinazę AMPK, co również prowadzi do zahamowania aktywności NF-κB oraz uruchomienia innych szlaków sygnałowych związanych z długowiecznością (mtor) [103,106]. Można więc uznać, że związki naturalne, hamujące stan zapalny, chronią organizm przed chorobami związanymi z wiekiem w tym nowotworami. Natomiast ich aktywność przeciwzapalna jedynie wspomaga działanie w kierunku wydłużania życia. Badanie stulatków wykazało, że mają oni podniesiony poziom cytokin i łagodny stan zapalny, jednocześnie wzrasta aktywność układu odpornościowego, co pozwala utrzymać homeostazę w organizmie i opóźnić procesy starzenia [24]. Dlatego związki, które stymulują odpowiedź immunologiczną organizmu, w tym melatonina, cieszą się dużym zainteresowaniem w zakresie opóźniania starzenia. PODSUMOWANIE Większość naturalnych związków bioaktywnych jest znana i stosowana w medycynie naturalnej już od wielu lat, bądź też są one składnikami diety, jak przyprawy (kurkumina). Dlatego z ich użyciem wiąże się mniejsze, bądź znikome, ryzyko wystąpienia skutków ubocznych nawet tych, które mogą być obserwowane dopiero po długotrwałym np. kilkuletnim stosowaniu. Mimo tego jest wiele wątpliwości dotyczących stosowania powyższych związków w terapii u ludzi. Większość badań była przeprowadzana in vitro, a więc w warunkach dalekich od tego, co może się stać w organizmie. W niektórych przypadkach stosowane dawki substancji aktywnych są niemożliwe do osiągnięcia w warunkach fizjologicznych, poprzez ich metabolizm bądź ograniczone wchłanianie. Podawane związki są metabolizowane w organizmie, a powstałe produkty mogą działać inaczej np. słabiej. Choć czasem metabolity mogą wykazywać wyższą bioreaktywność, jak jest w przypadku kurkuminy. Niektóre związki zwiększają swą biodostępność w obecności innych substancji. Jak wykazano, piperyna z pieprzu podwyższa biodostępność kurkuminy o 2000%. Wykazano to zarówno w badaniach przeprowadzonych na zwierzętach, jak i u wolontariuszy [107]. Z drugiej strony jest szereg badań takich związków przeprowadzonych na zwierzętach, lecz nie zawsze można ich wyniki bezpośrednio odnieść do człowieka. Tak jest w przypadku wpływu związków pochodzenia naturalnego na wydłużanie życia zwierząt. Należą do nich rapamycyna czy polifenole, jak resweratrol i EGCG z zielonej herbaty. Niektórzy badacze sugerują, że u ludzi raczej nie można spodziewać się podobnego efektu jak u myszy czy rezusów [9]. Na szczególną uwagę zasługują także doniesienia dotyczące właściwości przeciwnowotworowych licznych związków naturalnych. Zarówno tych dotyczących działania samych związków jak i w połączeniu ich z chemioterapią. W walce z rakiem olbrzymie znaczenie ma przełamanie oporności na radio- czy chemioterapię dzięki zastosowaniu takich związków jak rapanologi czy polifenole roślinne [37-40]. Ostatnio duże zainteresowanie budzi także możliwość walki z nowotworami przez indukcję starzenia komórek nowotworowych, ponieważ nie wymaga to stosowania tak dużych dawek leków jak w standardowej terapii. Chociaż istnieje niebezpieczeństwo, że komórki nowotworowe poddane starzeniu mimo wszystko wznowią proliferację. Wiele związków naturalnych będących składnikami naszego pożywienia ma z pewnością wpływ na jakość naszego życia, aczkolwiek mało jeszcze wiemy o ich działaniu modulującym jego długość. PIŚMIENNICTWO 1. Argyropoulou A, Aligiannis N, Trougakos IP, Skaltsounis AL (2013) Natural compounds with anti-ageing activity. Nat Prod Rep 30: Fontana L, Partridge L, Longo VD (2010) Extending healthy life span - from yeast to humans. Science 328: Canto C, Auwerx J (2011) Caloric restriction: is AMPK a key sensor and effector? Physiology 26: Postępy Biochemii 60 (2)

12 4. Willcox DC, Willcox BJ, Todoriki H, Curb JD, Suzuki M (2006) Caloric restriction and human longevity: what can we learn from the Okinawans? Biogerontology 7: Jansen RJ, Robinson DP, Stolzenberg-Solomon RZ, Bamlet WR, de Andrade M, Oberg AL, Hammer TJ, Rabe KG, Anderson KE, Olson JE, Sinha R, Petersen GM (2011) Fruit and vegetable consumption is inversely associated with having pancreatic cancer. Cancer Causes Control 22: Colman RJ, Anderson RM, Johnson SC, Kastman EK, Kosmatka KJ, Beasley TM, Allison DB, Cruzen C, Simmons HA, Kemnitz JW, Weindruch R (2009) Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science 325: Mattison JA, Roth GS, Beasley TM, Tilmont EM, Handy AM, Herbert RL, Longo DL, Allison DB, Young JE, Bryant M, Barnard D, Ward WF, Qi W, Ingram DK, de Cabo R (2012) Impact of caloric restriction on health and survival in rhesus monkeys from the NIA study. Nature 489: Zhao G, Guo S, Somel M, Khaitovich P (2014) Evolution of human longevity uncoupled from caloric restriction mechanisms. PLoS One 9: e Shanley DP, Kirkwood TB (2006) Caloric restriction does not enhance longevity in all species and is unlikely to do so in humans. Biogerontology 7: Phelan JP, Rose MR (2006) Caloric restriction increases longevity substantially only when the reaction norm is steep. Biogerontology 7: Fontana L, Meyer TE, Klein S, Holloszy JO (2004) Long-term calorie restriction is highly effective in reducing the risk for atherosclerosis in humans. Proc Natl Acad Sci 101: Lefevre M, Redman LM, Heilbronn LK, Smith JV, Martin CK, Rood JC, Greenway FL, Williamson DA, Smith SR, Ravussin E (2009) Caloric restriction alone and with exercise improves CVD risk in healthy non- -obese individuals. Artherosclerosis 203: Lopez-Otin C, Serrano M, Prtridge L, Blasco MA, Kroemer G (2013) The Hallmarks of Aging. Cell 153: Maya-Vetencourt JF, Baroncelli L, Viegi A, Tiraboschi E, Castren E, Cattaneo A, Maffei L (2012) IGF-1 restores visual cortex plasticity in adult life by reducing local GABA levels. Neuronal Plasticity 2012: Brown-Borg HM, Bode AM, Bartke A (1999) Antioxidative mechanisms and plasma growth hormone levels: potential relationship in the aging process. Endocrine 11: Foukas LC, Bilanges B, Bettedi L, Pearce W, Ali K, Sancho S, Withers DJ, Vanhaesebroeck B (2013) Long-term p110α PI3K inactivation exerts a beneficial effect on metabolism. EMBO Mol Med 5: Shevah O, Laron Z (2007) Patients with congenital deficiency of IGF-I seem protected from the development of malignancies: a preliminary report. Growth Horm IGF Res 17: Suh Y, Atzmon G, Cho MO, Hwang D, Liu B, Leahy DJ, Barzilai N, Cohen P (2008) Functionally significant insulin-like growth factor I receptor mutations in centenarians. Proc Natl Acad Sci 105: Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, Boss O, Gwinn D, Wang M, Ramaswamy S, Fishbein KW, Spencer RG, Lakatta EG, Le Couteur D, Shaw RJ, Navas P, Puigserver P, Ingram DK, de Cabo R, Sinclair DA (2006) Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature 444: Chen W, Sudji IR, Wang E, Joubert E, van Wyk BE, Wink M (2013) Ameliorative effect of aspalathin from rooibos (Aspalathus linearis) on acute oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Phytomedicine 20: Shukitt-Hale B, Lau FC, Carey AN, Galli RL, Spangler EL, Ingram DK, Joseph JA (2008) Blueberry polyphenols attenuate kainic acid-induced decrements in cognition and alter inflammatory gene expression in rat hippocampus. Nutr Neurosci 11: Cameron AR, Anton S, Melville L, Houston NP, Dayal S, McDougall GJ, Stewart D, Rena G (2008) Black tea polyphenols mimic insulin/ insulin-like growth factor-1 signalling to the longevity factor FOXO1a. Aging Cell 7: Agil A, Reiter RJ, Jiménez-Aranda A, Ibán-Arias R, Navarro-Alarcon M, Marchal JA, Adem A, Fernández-Vázquez G (2013) Melatonin ameliorates low-grade inflammation and oxidative stress in young Zucker diabetic fatty rats. J Pineal Res 54: Hardeland R (2013) Melatonin and the theories of aging: a critical appraisal of melatonin s role in antiaging mechanisms. J Pineal Res 55: Houtkooper RH, Auwerx J (2010) Obesity: New life for antidiabetic drugs. Nature 466: Johnson SC, Rabinovitch PS, Kaeberlein M (2013) mtor is a key modulator of ageing and age-related disease. Nature 493: Wilkinson JE, Burmeister L, Brooks SV, Chan CC, Friedline S, Harrison DE, Hejtmancik JF, Nadon N, Strong R, Wood LK, Woodward MA, Miller RA (2012) Rapamycin slows aging in mice. Aging Cell 11: Harrison DE, Strong R, Sharp ZD, Nelson JF, Astle CM, Flurkey K, Nadon NL, Wilkinson JE, Frenkel K, Carter CS, Pahor M, Javors MA, Fernandez E, Miller RA (2009) Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature 460: Zuber J, Anglicheau D, Elie C, Bererhi L, Timsit MO, Mamzer-Bruneel MF, Ciroldi M, Martinez F, Snanoudj R, Hiesse C, Kreis H, Eustache F, Laborde K, Thervet E, Legendre C (2008) Sirolimus may reduce fertility in male renal transplant recipients. Am J Transplant 8: Dai DF, Karunadharma PP, Chiao YA, Basisty N, Crispin D, Hsieh EJ, Chen T, Gu H, Djukovic D, Raftery D, Beyer RP, Maccoss MJ, Rabinovitch PS (2014) Altered proteome turnover and remodeling by short-term caloric restriction or rapamycin rejuvenate the aging heart. Aging Cell, doi: /acel Cao K, Graziotto JJ, Blair CD, Mazzulli JR, Erdos MR, Krainc D, Collins FS (2011) Rapamycin reverses cellular phenotypes and enhances mutant protein clearance in Hutchinson-Gilford progeria syndrome cells. Sci Transl Med 3: 89ra Blagosklonny MV (2011) Progeria, rapamycin and normal aging: recent breakthrough. Aging (Albany NY) 3: Menendez JA, Joven J, Aragonès G, Barrajon-Catalán E, Beltrán-Debon R, Borrás-Linares I, Camps J, Corominas-Faja B, Cufí S, Fernández-Arroyo S, Garcia-Heredia A, Hernández-Aguilera A, Herranz-Lopez M, Jiménez-Sánchez C, Lopez-Bonet E, Lozano-Sánchez J, Luciano-Mateo F, Martin-Castillo B, Martin-Paredero V, Pérez-Sánchez A, Oliveras- -Ferraros C, Riera-Borrull M, Rodríguez-Gallego E, Quirantes-Piné R, Rull A, Tomás-Menor L, Vazquez-Martin A, Alonso-Villaverde C, Micol V, Segura-Carretero A (2013) Xenohormetic and anti-aging activity of secoiridoid polyphenols present in extra virgin olive oil: a new family of gerosuppressant agents. Cell Cycle 12: Blagosklonny MV (2009) Inhibition of S6K by resveratrol: in search of the purpose. Aging (Albany NY) 1: Nakano M, Nakashima A, Nagano T, Ishikawa S, Kikkawa U, Kamada S (2013) Branched-chain amino acids enhance premature senescence through mammalian target of rapamycin complex I-mediated upregulation of p21 protein. PLoS One 8: e Easton JB, Houghton PJ (2006) mtor and cancer therapy. Oncogene 25: Nam HY, Han MW, Chang HW, Kim SY, Kim SW (2013) Prolonged autophagy by MTOR inhibitor leads radioresistant cancer cells into senescence. Autophagy 9 (10): Nagata Y, Takahashi A, Ohnishi K, Ota I, Ohnishi T, Tojo T, Taniguchi S (2010) Effect of rapamycin, an mtor inhibitor, on radiation sensitivity of lung cancer cells having different p53 gene status. Int J Oncol 37: Qiao Q, Jiang Y, Li G (2013) Curcumin enhances the response of non- -Hodgkin s lymphoma cells to ionizing radiation through further induction of cell cycle arrest at the G2/M phase and inhibition of mtor phosphorylation. Oncol Rep 29: Castillo-Pichardo L, Dharmawardhane SF (2012) Grape polyphenols inhibit Akt/mammalian target of rapamycin signaling and potentiate the effects of gefitinib in breast cancer. Nutr Cancer 64:

13 41. Pratheeshkumar P, Budhraja A, Son YO, Wang X, Zhang Z, Ding S, Wang L, Hitron A, Lee JC, Xu M, Chen G, Luo J, Shi X (2012) Quercetin inhibits angiogenesis mediated human prostate tumor growth by targeting VEGFR- 2 regulated AKT/mTOR/P70S6K signaling pathways. PLoS One 7: e Hussain AR, Al-Rasheed M, Manogaran PS, Al-Hussein KA, Platanias LC, Al Kuraya K, Uddin S (2006) Curcumin induces apoptosis via inhibition of PI3-kinase/AKT pathway in acute T cell leukemias. Apoptosis 11: Wong TF, Takeda T, Li B, Tsuiji K, Kondo A, Tadakawa M, Nagase S, Yaegashi N (2014) Curcumin targets the AKT-mTOR pathway for uterine leiomyosarcoma tumor growth suppression. Int J Clin Oncol 19: Bielak-Żmijewska A, Koronkiewicz M, Skierski J, Piwocka K, Radziszewska E, Sikora E (2000) Effect of curcumin on apoptosis of rodent and human non-proliferating and proliferating lymphoid cells. Nutr Cancer 38: Piwocka K, Bielak-Żmijewska A, Sikora E (2002) Curcumin induces caspase-3 independent apoptosis in human multidrug resistant cells. Ann NY Acad Sci 973: Mosieniak G, Adamowicz M, Alster O, Jaśkowiak H, Szczepankiewicz AA, Wilczyński GM, Ciechomska IA, Sikora E (2012) Curcumin induces permanent growth arrest of human colon cancer cells: link between senescence and autophagy. Mech Ageing Dev 133: Hong Y, Won J, Lee Y, Lee S, Park K, Chang KT, Hong Y (2014) Melatonin treatment induces interplay of apoptosis, autophagy, and senescence in human colorectal cancer cells. J Pineal Res 56: Wang N, Feng Y, Zhu M, Tsang CM, Man K, Tong Y, Tsao SW (2010) Berberine induces autophagic cell death and mitochondrial apoptosis in liver cancer cells: the cellular mechanism. J Cell Biochem 111: Campisi J, d Adda di Fagagna F (2007) Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol 8: Naasani I, Seimiya H, Tsuruo T (1998) Telomerase inhibition, telomere shortening, and senescence of cancer cells by tea catechins. Biochem Biophys Res Commun 249: Berletch JB, Liu C, Love WK, Adrews LG, Katiyar SK, Tollefsbol TO (2008) Epigenetic and genetic mechanisms contribute to telomerase inhibition by EGCG. J Cell Biochem 103: Theriault A, Chao JT, Wang Q, Gapor A, Adeli K (1999) Tocotrienol: a review of its therapeutic potential. Clin Biochem 32: Eitsuka T, Nakagawa K, Miyazawa T (2006) Down-regulation of telomerase activity in DLD-1 human colorectal adenocarcinoma cells by tocotrienol. Biochem Biophys Res Commun 348: Ramachandran C, Fonseca HB, Jhabvala P, Escalon EA, Melnich SJ (2002) Curcumin inhibits telomerase activity through human telomerase reverse transcriptase in MCF-7 breast cancer cell line. Cancer Lett 184: Boccardi V, Paolisso G (2014) Telomerase activation: A potential key modulator for human healthspan and longevity. Ageing Res Rev 15C: Bernardes de Jesus B, Schneeberger K, Vera E, Tejera A, Harley CB, Blasco MA (2011) The telomerase activator TA-65 elongates short telomeres and increases health span of adult/old mice without increasing cancer. Aging Cell 10: Makpol S, Durrani LW, Chua KH, Mohd Yusof YA, Ngah WZ (2011) Tocotrienol-rich fraction prevents cell cycle arrest and elongates telomere length in senescent human diploid fibroblasts. J Biomed Biotechnol 2011: Gonzalez-Suarez E, Geserick C, Flores JM, Blasco MA (2005) Antagonistic effects of telomerase on cancer and aging in K5-mTert transgenic mice. Oncogene 24: Bernardes de Jesus B, Vera E, Schneeberger K, Tejera AM, Ayuso E, Bosch F, Blasco MA (2012) Telomerase gene therapy in adult and old mice delays aging and increase longevity without increasing cancer. EMBO Mol Med 4: Provinciali M, Cardelli M, Marchegiani F, Pierpaoli E (2013) Impact of Cellular Senescence in Aging and Cancer. Curr Pharm Des 19: Vanyushin BF, Nemirovsky LE, Klimenko VV, Vasiliev VK, Belozersky AN (1973) The 5-methylcytosine in DNA of rats. Tissue and age specifity and the changes induced by hydrocortisone and other agents. Gerontologia 19: Decottignies A, d Adda di Fagagna F (2011) Epigenetic alterations associated with cellular senescence: a barrier against tumorigenesis or red carpet for cancer? Semin Cancer Biol 21: Huang J, Plass C, Gerhauser C (2011) Cancer Chemoprevention by Targeting the Epigenome. Curr Drug Targets 12: Davis CD, Ross SA (2008) Evidence for dietary regulation of micror- NA expression in cencer cells. Nutr Rev 66: Duthie SJ (2011) Folate and cancer: how DNA damage, repair and methylation impact on colon carcinogenesis. J Inherit Metab Dis 34: Fang MZ, Wang Y, Ai N (2003) Tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate inhibits DNA methyltransferase and reactivates methylation-silenced genes in cancer cell lines. Cancer Res 63: Lee WJ, Shim JY, Zhu BT (2005) Mechanisms for the inhibition of DNA methyltransferases by tea catechins and bioflavonoids. Mol Pharmacol 68: Majid S, Kikuno N, Nelles J (2008) Genistein induces the p21waf1/ CIP1 and p16ink4a tumor suppressor genes in prostate cencer cells by epigenetic mechanisms involving active chromatin modification. Cancer Res 68: Li Y, Liu L, Andrews LG, Tollefsbol TO (2009) Genistein depletes telomerase activity through cross-talk between genetic and epigenetic mechanisms. Int J Cancer 125: Liu Z, Liu S, Xie Z (2009) Modulation of DNA methylation by a sesquiterpene lactone parthenolide. J Pharmacol Exp Ther 329: Koprowska K, Czyż M (2010) Molekularne mechanizmy działania partenolidu - stary lek z nową twarzą. Postępy Hig Med Dośw 64: Liu Z, Xie Z, Jones W (2009) Curcumin is a potent DNA hypomethylation agent. Bioorg Med Chem Lett 19: Park S, Mori R, Shimokawa I (2013) Do sirtuins promote mammalian longevity: A critical review in its relevance to the longevity effect induced by calorie restriction. Mol Cells 35: Olaharski AJ, Rine J, Marshall BL (2005) The flavoring agent dihydrocoumarin reverses epigenetic silencing and inhibits sirtuin deacetylases. PLoS Genet 1: e Li Y, Tollefsbol TO (2011) p16 INK4a suppression by glucose restriction contributes to human cellular lifespan extension through SIRT1-mediated epigenetic and genetic mechanisms. PLoS One 6: e Huang J, Qini G, Han L, Jian L, Zhang H, Sun Y, Zhang Z, Tong T (2008) SIRT1 overexpression antagonizes cellular senescence with activated ERK/S6K1 signaling in human diploid fibroblasts. PLoS One 3: e Yamashita S, Ogawa K, Ikei T, Udono M, Fujiki T, Katakura Y (2012) SIRT1 prevents replicative senescence of normal human umbilical cord fibroblast through potentiating the transcription of human telomerase reverse transcriptase gene. Biochem Biophys Res Commun 417: Huang CH, Shiu SM, Wu MT, Chen WL, Wang SG, Lee HM (2013) Monacolin K affects lipid metabolism through SIRT1/AMPK pathway in HepG2 cells. Arch Pharm Res 36: Rando TA, Chang HY (2012) Aging, rejuvenation, and epigenetic reprogramming: resetting the aging clock. Cell 148: Rajendran P, Ho E, Williams DE, Dashwood RH (2011) Dietary phytochemicals, HDAC inhibition, and DNA damage/repair defects in cancer cells. Clin Epigenetics 3: Sainz RM, Mayo JC, Rodriguez C, Tan DX, Lopez-Burillo S, Reiter RJ (2003) Melatonin and cell death: differential actions on apoptosis in normal and cancer cells. Cell Mol Life Sci 60: Postępy Biochemii 60 (2)

14 82. Tan DX, Chen LD, Poeggeler B, Manchester LC, Reiter RJ (1993) Melatonin: a potent, endogenous, hydroxyl radical scavenger. Endocrine J 1: Reiter RJ, Acuna-Castroviejo D, Tan DX, Burkhardt S (2001) Free radical-mediated molecular damage. Mechanisms for the protective actions of melatonin in the central nervous system. Ann NY Acad Sci 939: Pablos MI, Agapito MT, Gutierrez R, Recio JM, Menendez-Pelaez A (1995) Melatonin stimulates the activity of the detoxifying enzyme glutathione peroxidase in several tissues of chicks. J Pineal Res 19: Antolin I, Rodriguez C, Sainz RM, Mayo JC, Uria H, Kotler M (1996) Neurohormone melatonin prevents cell damage: effect on gene expression for antioxidative enzymes. FASEB J 10: Pozo D, Reiter RJ, Calvo JR, Guerrero JM (1997) Inhibition of cerebellar nitric oxide synthase and cyclic GMP production by melatonin via complex formation with calmodulin. J Cell Biochem 65: Pappola MA, Bozner P, Soto C, Shao H, Robakis N, Zagorski M (1998) Inhibition of Alzheimer -fibrillogenesis by melatonin. J Biol Chem 273: Menon VP, Sudheer AR (2007) Antioxidant and anti-inflammatory properties of curcumin. Adv Exp Med Biol 595: Monroy A, Lithgow GJ, Alavez S (2013) Curcumin and Neurodegenerative Diseases. IUBMB 39: Hamaguchi T, Ono K, Yamada M (2010) Curcumin and Alzheimer s Disease. CNS Neuroscience & Therapeutics 16: Saul N, Pietsch K, Menzel R, Sturzenbaum SR, Steinberg CEW (2010) The longevity effect of tannic acid in Caenorhabditis elegans: Disposable Soma meets hormesis. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 65: Heo SJ, Ko SC, Cha SH, Kang DH, Park HS, Choi YU, Kim D, Jung WK, Jeon YJ (2009) Effect of phlorotannins isolated from Ecklonia cava on melanogenesis and their protective effect against photo-oxidative stress induced by UV-B radiation. Toxicol In Vitro 23: Bae JY, Choi JS, Choi YJ, Shin SY, Kang SW, Han SJ, Kang YH (2008) (-) Epigallocatechin gallate hampers collagen destruction and collagenase activation in ultraviolet-b-irradiated human dermal fibroblasts: involvement of mitogen-activated protein kinase. Food Chem Toxicol 46: Babich HA, Schuck G, Weisburg JH, Zuckerbraun HL (2011) Research strategies in the study of the pro-oxidant nature of polyphenol nutraceuticals. J Toxicol 2011: Khan HY, Zubair H, Faisal M, Ullah MF, Farhan M, Sarkar FH, Ahmad A, Hadi SM (2013) Plant polyphenol induced cell death in human cancer cells involves mobilization of intracellular copper ions and reactive oxygen species generation: A mechanism for cancer chemopreventive action. Mol Nutr Food Res 58: Khan HY, Zubair H, Ullah MF, Ahmad A (2012) A prooxidant mechanism for the anticancer and chemopreventive properties of plant polyphenols. Curr Drug Targets 13: Mocchegiani E, Costarelli L, Basso A, Giacconi R, Piacenza F, Malavolta M (2013) Metallothioneins, ageing and cellular senescence: a future therapeutic target. Curr Pharm Des 19: Cho EJ, Yokozawa T, Okamoto T (2007) Protective effect of Chinese prescription Kangen-karyu and its crude drug Tanjin against age-related lipidosis in rats. J Pharm Pharmacol 59: Campisi J, Andersen JK, Pankaj K, Melov S (2011) Cellular senescence: a link between cancer and age-related degenerative disease? Semin Cancer Biol 21: Moiseeva O, Deschenes-Simard X, Pollak M, Ferbeyre G (2013) Metformin, aging and cancer. Aging 5: Laberge RM, Zhou L, Sarantos MR, Rodier F, Freund A, de Keizer PL, Liu S, Demaria M, Cong YS, Kapahi P, Desprez PY, Hughes RE, Campisi J (2012) Glucocorticoids suppress selected components of the senescence-associated secretory phenotype. Aging Cell 11: Imagawa K, de Andres MC, Hashimoto K, Pitt D, Itoi E, Goldring MB, Roach HI, Oreffo RO (2011) The epigenetic effect of glucosamine and a nuclear factor-kappa B (NF-kB) inhibitor on primary human chondrocytes implication for osteoarthritis. Biochem Biophys Res Commun 405: Sarkar FH, Li Y (2004) Cell signaling pathways altered by natural chemopreventive agents. Mutat Res 555: Lin L, Huang QX, Yang SS, Chu J, Wang JZ, Tian Q (2013) Melatonin in Alzheimer s Disease. Int J Mol Sci 14: Jun Z, Fengzhen Y, Li Z, Jiang-gang W, Puyuan W, Hao L, Wenwen L, Zhi S, Sharman EH, Bondy SC (2014) Dietary melatonin attenuates age-related changes in morphology and in levels of key proteins in globus pallidus of mouse barin. Brain Res 1546: Li Z, Geng YN, Jiang JD, Kong WJ (2014) Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Berberine in the Treatment of Diabetes Mellitus. Evid Based Complement Alternat Med 2014: Shoba G, Joy D, Joseph T, Majeed M, Rajendran R, Srinivas PS (1998) Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers. Planta Med 64: Natural compounds modulators of senescence and cell death Magdalena Dudkowska 1,*, Karolina Kucharewicz 2 1 Laboratory of the Molecular Bases of Aging, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 3 Pasteura St., Warsaw, Poland 2 College of Inter-Faculty Individual Studies in Mathematics and Natural Sciences, University of Warsaw, 93 Żwirki i Wigury St., Warsaw, Poland * m.dudkowska@nencki.gov.pl Key words: natural compounds, caloric restriction, cellular senescence, cell death, longevity, rejuvenation ABSTRACT For hundreds of years natural compounds have been used in herbal medicine. They have been known for their antibacterial, antifungal, anticancer activities as well as for enhancing wound healing and improving immunity. Recently growing interest in natural compounds has been observed, due to their ability to modulate cellular senescence. Particularly interesting are these compounds that can induce tumor senescence, delay senescence of normal cells or reverse changes associated with senescence acting as rejuvenation agents. It has been shown that some of the natural compounds can both promote senescence of tumor cells as well as prevent it in normal cells. Thus, they can be useful in therapy of age-related diseases. Natural compounds can regulate nutrient and energy sensing signaling pathways that are involved in senescence. They can also influence the synthesis of reactive oxygen species, secretion of cytokines, telomere shortening or epigenetic changes of DNA. Natural agents often act in a pleiotropic manner. They can modulate cellular senescence in many ways e.g. by direct neutralization of free radicals and affecting other regulatory signaling pathways. Furthermore natural compounds, commonly used for years e.g. as spices, usually don t have any side effects. Therefore, their use as dietary supplements or in long term therapy appears to be relatively safe