(2)D ata zgłoszenia:

Transkrypt

1 R Z E C Z P O S P O L IT A ( 12) OPIS PATENTOWY(19) P L (11) P O L S K A (13) B1 Numer zgłoszenia: (51)IntC l5: A61K 35/10 (2)D ata zgłoszenia: (54) Sposób otrzymywania biostymulatora z torfu (43) Z głoszenie ogłoszon o: B U P 24/90 (45)O udzieleniu p aten tu ogłoszono: W U P 09/92 (73)U praw niony z patentu: Tarchomińskie Zakłady Farmaceutyczne "P O L F A ", Warszawa, PL (72) T w órcy wynalazku: Kazimierz Dzięgielewski, Warszawa, PL Aniela Białobrzewska, Warszawa, PL Jerzy Szymański, Warszawa, PL Justyna Szudzichowska, Warszawa, PL Edward Cieszyński, Warszawa, PL PL B1 (57) 1. Sposób otrzymywania biostym ulatora z torfu drogą ekstrakcji torfu w środowisku wodnym, znamienny tynk, że ekstrakcję torfu prowadzi się w zakresie ph 2,0-7,0 i w tem peraturze 10 C do +60 C, a następnie oddziela się wyekstrahowaną tkankę torfową i poddaje otrzymany ekstrakt torfu odwróconej osmozie i/lu b ultrafiltracji przy użyciu membran odcinających związki chemiczne w zakresie 500 do 10000, po czym oczyszcza się uzyskany półprodukt metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej pod ciśnieniem 0,05 do 10,0 MPa z użyciem fazy ruchomej o wartości ph 2,0-9,0 zawierającej wodę, alkohol alifatyczny mieszający się z wodą i składnik buforujący.

2 SPOSÓB OTRZYMYWANIA BIOSTYMULATORA Z TORFU Z a s t r z e ż e n i a p a t e n t o w e 1. Sposób otrzymywania biostymulatora z torfu drogą ekstrakcji torfu w środowisku wodnym, z n a m i e n n y t y m, że ekstrakcję torfu prowadzi się w zakresie ph 2,0-7,0 i w temperaturze 10 C do + 60 C, a następnie oddziela się wyekstrahowaną tkankę torfową i poddaje otrzymany ekstrakt torfu odwróconej osmozie i/lub ultrafiltracji przy użyciu membran odcinających związki chemiczne w zakresie 500 do 10000, po czym oczyszcza się uzyskany półprodukt metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej pod ciśnieniem 0,05 do 10,0 MPa z użyciem fazy ruchomej o wartości ph 2,0-9,0 zawierającej wodę, alkohol alifatyczny mieszający się z wodą i składnik buforujący. 2. Sposób według zastrz.1, z n a m i e n n y t y m, że ekstrakcję torfu prowadzi się w obecności kwasu mineralnego lub organicznego. 3. Sposób według zastrz.1, z n a m i e n n y t y m, że do odwróconej osmozy i/lub ultrafiltracji używa się spiralne układy membranowe. 4. Sposób według zastrz.1, z n a m i e n n y t y m, że w skład fazy ruchomej użytej do wysokosprawnej chromatografii cieczowej, wchodzi alkohol etylowy. 5. Sposób według zastrz.1 albo 4, z n a m i e n n y t y m, że chromatografię prowadzi się w gradiencie ph i/lub rozpuszczalnika. 6. Sposób według zastrz.1 albo 2 albo 3 albo 4, z n a m i e n n y tym, że proces otrzymywania biostymulatora prowadzi się z ekstraktu otrzymanego w warunkach naturalnego torfowiska. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wyciągu z torfu o własnościach bio- s tymulatora. W literaturze podano sposób otrzymywania z torfu mieszaniny polisacharydów o własnościach przeciwnowotworowych, polegający na ekstrakcji tkanki torfowej wodnym roztworem NaOH, usunięciu z ekstraktu części zanieczyszczeń w środowisku kwaśnym, a następnie i chromatografii /Chem.Abstr. 1974, vol.80,41027 j/. Z opisu patentowego nr znany dializie jest sposób otrzymywania preparatu torfowego polegający na wtórnej hydrolizie alkalicznej kwaśnego przesączu uzyskanego z torfu, ponownym zakwaszeniu przesączu, zagęszczeniu do sucha, ekstrakcji i dalszym oczyszczeniu. Przedmiotem naszego wynalazku jest ekonomiczna metoda otrzymywania biostymulatora z torfu, eliminująca wady znanych rozwiązań i umożliwiająca jego masowe wytwarzanie polegające na ekstrakcji torfu w środowisku kwaśnym, zagęszczaniu metodą odwróconej osmozy i/lub ultrafiltracji oraz oczyszczaniu przy pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Sposobem według wynalazku torf ekstrahuje się w środowisku wodnym w przedziale ph 2,0 do 7,0, w temperaturze +10 C do + 60 C, a następnie zagęszcza się otrzymany ekstrakt metodą odwróconej osmozy i/lub ultrafiltracji w temperaturze nie przekraczającej +80 C, uzyskując koncentrat zawierający mieszaninę związków organicznych/polisacharydy i glikoproteidy/ z mikroelementami lub tylko związki organiczne w zależności od doboru parametrów procesu membranowego. Mieszaninę związków chemicznych otrzymaną w taki sposób można efektywnie rozdzielić metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej niskociśnieniowej lub wysokociśnieniowej. Co ekstrakcji używa się torf o stopniu rozkładu powyżej 20% według normy resortowej BN-77/ Intensywną ekstrakcję torfu wykonuje się korzystnie po Jego wstępnym rozdrobnieniu i przy

3 ciągłym mieszaniu. D la pełnego wykorzystania tkankę torfową ekstrahuje się 2-3 razy z użyciem kwasu mineralnego lub organicznego. Można również prowadzić ekstrakcję torfu statycznie w naturalnych warunkach torfowiska i chociaż proces ten trwa długo, nie wymaga jednak instalowania aparatury do ekstrakcji, usuwania odpadów i substancji szkodliwych dla środowiska naturalnego. Efektywne oczyszczanie i zagęszczanie ekstraktu torfowego uzyskuje się przy zastosowaniu membran odcinających związki chemiczne o ciężarze cząsteczkowym 500 do /"cut off" 500 do 10000/ w zakresie ph polecanym przez wytwórców membran i przy zastosowaniu odczynników chemicznych dopuszczalnych do pracy z układami membranowymi. Korzystne jest stosowanie układów membranowych spiralnych wyróżniających się bardzo dobrymi własnościami mechanicznymi i chemicznymi. Otrzymany w procesie membranowym koncentrat torfowy może być zliofilizowany, wysuszony rozpyłowo, wytrącony rozpuszczalnikiem organicznym lub bezpośrednio poddany dalszemu oczyszczaniu przy pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej przy zastosowaniu wypełnień miękkich, utwardzonych lub twardych. Przy zastosowaniu wypełnień miękkich stosuje się zwykle ciśnienia 0,025 do 0,2 MPa, przy wypełnieniach utwardzonych od 0,2 do 2 MPa/MPLC/, a wypełnienia twarde wymagają zwykle ciśnień 0,5-10 MPa/HPLC/ w zależności od stopnia rozdrobnienia wypełnienia i rodzaju fazy ruchomej. Do oczyszczania wyciągu z torfu stosuje się wypełnienie do filtracji żelowej i/lub anionowymiennej chromatografii przy użyciu fazy ruchomej zawierającej wodę, składnik buforujący i alkohol alifatyczny mieszający się z wodą w zakresie ph 2,0 do 9,0 /układ izokratyczny/ lub z zastosowaniem gradientu ph i/lub siły jonowej i/lub rozpuszczalnika organicznego. W wyniku zastosowania sposobu według wynalazku otrzymuje się mieszaninę polis a chary- dów i glikoproteidów z solami metali w ielowartościowych /a/, mieszaninę polisacharydów z glikoproteidami /b/ lub rozdzielone na drodze chromatografii polisacharydy /c/ i glikwpro- teidy /d/. Bez względu na skład otrzymane mieszaniny są nietoksyczne w badaniach na zwierzętach i ochotnikach w stężeniu do 0,1 g/kg wagi ciała, przy podaniu doustnym /mieszaniny o składzie /a/ i /b/ oraz w stężeniu do 0,01 g/kg wagi ciała przy podaniu domięśniowym /mieszaniny o składzie /a/, /b/, /c/ i /d/. Obserwacje wykazały, że otrzymane według wynalazku mieszaniny oddziaływują na układ odpornościowy nieswoiście i swoiście nasilając reakcje immunologiczne komórkowe i humoralne. Mogą one być zastosowane w przypadkach ciężkich i chronicznych zakażeń bakteryjnych jako terapia wspomagająca zasadnicze leczenie w sytuacjach obniżonej bariery immunologicznej lub profilaktycznie przed przewidywanym spadkiem odporności, np. przed zabiegiem operacyjnym czy kontaktem z promieniowaniem jonizującym. Bardzo korzystną stroną biostymulujących mieszanin jest możliwość użycia ich w środkach spożywczych, używkach oraz w postaci farmaceutyków przyrządzonych według procedur nie niszczących biologicznie aktywnych składników. Otrzymywane przez nas mieszaniny biosty- mulujące mogą być również używane z dodatkiem innych biostymulatorów oraz niektórych pierwiastków śladowych takich jak selen, cynk i miedź użytych w ilościach korzystnych fizjologicznie. Niżej podane przykłady ilustrują sposób według wynalazku. P r z y k ł a d I. W reaktorze / 1/ o pojemności 1 m³ umieszcza się 0,8 m wody ze studni głębinowej, a następnie włącza się mieszadło Turrax i dodaje w ciągu 15 minut kolejno 100 kg torfu, 4 dm³ H3PO4 i uzupełnia wodą do 1 m³, po czym wyłącza się mieszadło tnące, włącza mieszadło wolnoobrotowe i ogrzewa mieszaninę. Ekstrakcję torfu prowadzi się przy ph 2,85 i w temperaturze + 40 C przez 12 godzin, po czym oddziela się tkankę torfową przy pomocy wirówki samowyładowczej z szybkością 500 dcm³/ godzin ę. Oddzielony płyn kieruje się do zbiórn ika kwasoodpornego /2/ z mieszadłem o pojemności 2 m³, a masę torfową rozcieńcza się 0,5 m³ wody w reaktorze /3/ o pojemności 1 m ³,dodaje się 0,5 dcm H3PO4, miesza przez 2 godziny w temperaturze + 40 C i wiruje. Wyekstrahowany torf odrzuca się, a ekstrakty w ilości 1,25 m³ łączy się w zbiorniku /2/ i poddaje dalszej obróbce w następujący sposób: a/ do 0,15 m³ ekstraktu pobranego ze zbiornika /2/ dodaje się 0,15 dcm³ 10% NaOH do uzyskania ph 3,78, a następnie podaje się na bateryjny zestaw filtracyjny wyposażony w membrany T 2A firmy PCI / cut off" 2000/ o powierzchni 2,7 m2 pod ciśnieniem 0,475 MPa, w stałej temperaturze +15 C

4 i przy szybkości zbie rania wycisku 2,0 dcm³ /minutę. Po 68 minutach zmniejsza się powierzchnię ultrafiltracyjną do 1/3 wyjściowej wartości i kontynuuje proces dodając pięciokrotnie co 5 minut po 5 dcm³ wody demineralizowanej, a następnie zagęszcza się ostatecznie do uzys- kania 3 dcm koncentratu o ph 5,25 i przewodnictwie 0,12 ms. Koncentrat suszy się rozpyłowo przy temperaturze powietrza wlotowego C i wylotowego +85 C, otrzymując 150 g wyciągu torfowego o wilgotności 2,5% i zawartości popiołu siarczanowego 5%, b/ 1 m³ ekstraktu ze zbiornika /2/ poddaje się ultrafiltracji na systemie SP 480 firmy Grace wyposażonym we wkłady spiralne S 4OY3 "cut off ' 3000 o powierzchni 44 m² pod ciśnieniem 0,19 MPa w temperaturze + 30 C i przy szybkości zbierania wycieku 30 dcm³/godzinę/m. Po 32 minutach ultrafiltracji redukuje się powierzchnię ultrafiltracyjną do 1/4 wyjściowej powierzchni. W sposób ciągły dozuje się do zagęszczanego roztworu 500 dcm³ wody demineralizowanej z szybkością 330 dcm³ / godzinę, a następnie zagęszcza się ekstrakt torfu do końcowej objętości 11,5 dcm³. Roztwór liofilizuje się w gradiencie temperatury od -40 C do + 42 C przez 22 godziny, otrzymując 1,42 kg liofilizowanego wyciągu z torfu, c/ 10 dcm³ ekstraktu ze zbiornika /2/ o ph 3,78 1 przewodnictwie 1,5 ms zagęszcza się na układzie do odwróconej osmozy ze spiralnym wkładem NF 50 / cut off" 500/ o powierzchni 0,3 m² w temperaturze + 18 C i przy szybkości wycieku 50 cm³ /minutę pod ciśnieniem 3 MPa. Po zagęszczeniu ekstraktu torfu do objętości 1 dcm³ dozu je się do niego 7 dcm³ wody demineralizowanej z szybkością 50 cm³ /minutę, następnie zagęszcza sięostateczniedobjętości0,6dcm³, uzyskującoph=3,63iprzewodnictwie9,5 ms W roztworze wyjściowym, koncentracie i wycieku stwierdzono metodą płomieniowej fotometrii następujące ilości kationów metali / w µ g/ml / : kation próba wyjściowa konce ntrat wyciek Na K Mg ,19 Ca ,0 P r z y k ł a d II. Na torofowisku o powierzchni 1 ha zdejmuje się zewnętrzną warstwę torfu o grubości 40 cm, a następnie wykopuje się w środku tego torfowiska dół o głę bokości 2,0 m i objętości 100 m³, przy miąższości torfowiska 3,5 m. Przy pomocy pompy dozującej zrasza się torfowisko wodą głębinową o ph 6,5 doprowadzoną 0,001 N HCl do ph 5,35 w ilości 2 m /godzinę przez 24 godziny. Woda przenikając warstwę torfu ekstrahuje z niego składniki aktywne przenikające do wykopanego dołu. Z dołu tego pobiera się 25 dcm³ wody torfowej o ph 6,18 i przewodnictwie 230 u S. Klarowny ekstrakt torfu poddaje się ultrafiltracji na układzie S1Y3 / "cut off" 3000/ o powierzchni 0,09 m2 w temperaturze 22 C, pod ciśnieniem 0,195 MPa i z szybkością zbierania wycieku 111 cm³ /minutę. Po zagęszczeniu do objętości 0,5 dcm³ prowa dzi się d iafiltrację z utrzymaniem stałej objętości zagęszczanego roztworu z użyciem 5 dcm³ wody, a następnie zagęszcza się ekstrakt torfu do końcowej objętości 0,3 dcm³ i odparowuje do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze +45 C. Uzyskuje się 15 gramów wyciągu z torfu pozbawionego soli mineralnych. P r z y k ł a d III. Chromatografię półproduktów torfowych otrzymywanych w przykładach I i II przeprowadza się następująco; a/ 1 g wyciągu z torfu z przykładu II rozpuszcza 3 się w 20 cm wody destylowanej i podaje na kolumnę K 50/100 firmy Pharmacia Fine Chemicals wypełnioną Sephadex'em LH - 20 pod ciśnieniem 0,1 MPa. Chromatografię prowadzi się w mieszaninie etanol : woda = 1 : 1 ν/ν, ph = 6,5. Uzyskuje się rozdzielenie dwu grup związków chemicznych /załącznik nr 1/; b/ 1 g wyciągu z torfu uzyskanego w przykładzie I/a/ rozpuszcza się w 20 cm³ wody destylowanej i podaje na kolumnę K 26/100 wypełnioną hydrofilowym polimerem winylowym TSK HW-50. Faza ruchoma zawiera wodę destylowaną 0,1% NaCl i 5% v/v etanolu ph 3,5. Pod ciśnieniem 0,25 MPa i przy przepływie 1,2 cm /minutę uzyskano rozdzielenie składników wyciągu z torfu ilustrowane w załączniku 2 ; c/ 1 g wyciągu z torfu uzyskany w przykładzie I/b/ rozpuszcza się w 20 cm wody destylowanej i podaje na kolumnę o średnicy 4,6 mm i długości

5 mm wypełnioną b iożelem TSK 125. Faza ruchoma zawiera wodę destylowaną, Tris x HCl oraz 10% v/v izopropanolu ph = 8,0 rozdział składników prowadzi się w gradiencie Tris 0,01-0,1 pod ciśnieniem 3 MPa. Załącznik 3 zawiera graficzny obraz chromatografii wyciągu z torfu.

6 Załącznik nr 3 Graficzny obraz chromatografii wyciągu z torfu na TSK 125

7 Załącznik nr 2 Graficzny obraz chromatografii wyciągu z torfu na TSK HW - 50

8 Załącznik nr 1 Graficzny obraz chromatografii wyciągu z torfu na Sepfadex LH - 20 Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 5000 zł.