(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2008/31 EP B1 (51) Int. Cl. C07K1/20 C07K1/22 C07K14/47 C07K14/715 C07K14/54 C07K19/00 A61K38/04 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Sposób oczyszczania białka nie będącego immunoglobuliną zawierającego domenę immunoglobulinopodobną (IG-podobną) (30) Pierwszeństwo: IL (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/18 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 01/2009 (73) Uprawniony z patentu: Laboratoires Serono SA, Coinsins, CH PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: SCHWARTSBURD Boris, Rehovot, IL BELZER Ilana, Rishon-Le-Zion, IL (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Kossowska Janina Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania białek, które nie są immunoglobulinami zawierających jedną lub więcej domen immunoglobulinopodobnych (Ig-podobnych). TŁO WYNALAZKU [0002] Znaczną liczbę białek człowieka i innych ssaków, w tym, przykładowo, ludzki hormon wzrostu, ludzkie białko C, czynnik krzepliwości VII i IL-18BP, wytworzono w komórkach gospodarza przy pomocy transfekowania tych komórek kodującym te białka DNA i hodowania zrekombinowanych komórek w warunkach sprzyjających ekspresji białka. Zrekombinowane białka mogą też być wytwarzane przez zwierzęta transgeniczne i wydzielane do mleka. Komórki wydzielają zrekombinowane białka do podłoża hodowlanego, do mleka, albo są obecne w lizatach komórkowych i muszą zostać oddzielone od innych składników komórki, takich jak zbyteczne produkty przemiany materii komórek, szczątki komórek, białka lub inne zebrane materiały. Oczyszczanie białka zwykle wymaga zastosowania pewnego rodzaju rozdziału chromatograficznego (patrz artykuł przeglądowy Constans 2002). Powszechnie stosuje się następujące rodzaje rozdziału chromatograficznego: sączenie molekularne (GF), chromatografię jonowymienną (IEX), chromatografię oddziaływań hydrofobowych (HI), chromatografię powinowactwa oraz HPLC (wysokosprawną chromatografię cieczową). Oczyszczanie białka zwykle przebiega w trzech etapach: etapie wychwytu, w którym żądane białko jest oddzielane od innych składników komórkowych, takich jak DNA i RNA; etapie pośrednim, w którym białka są oddzielane od zanieczyszczeń o podobnym rozmiarze lub innych właściwościach fizycznych/chemicznych i ostatecznym etapie doczyszczania (ang. polishing ). Dla każdego etapu oczyszczania istnieją najbardziej odpowiednie dla konkretnego oczyszczanego białka techniki chromatograficzne i rozmiary ziaren złoża. Początkowy etap wychwytu obejmuje zwykle izolację białka z surowego lizatu komórkowego lub z podłoża hodowlanego i wymaga zastosowania żywicy o dużej pojemności i szybkości przepływu. Odpowiednie do tego celu są żywice o szybkim przepływie o dużych cząstkach i znacznym zakresie rozmiaru cząstek (zakres może znacznie odbiegać od średniego rozmiaru cząstek). Immunoglobulinę (Ig) definiuje się jako dowolny z komórkowych strukturalnych receptorów antygenowych i dzieli się na pięć klas (IgM, IgG, IgA, IgD i IgE) na podstawie struktury i aktywności biologicznej. Podstawowa jednostka strukturalna cząsteczki immunoglobuliny, zwana monomerem, jest cząsteczką w kształcie litery Y złożoną z dwóch łańcuchów ciężkich (H) zawierających po 4 domeny każdy: jedną domenę zmienną V H i trzy domeny stałe C H oraz dwóch łańcuchów lekkich (L) zawierających po dwie domeny: jedną domenę zmienną V L i jedną domenę stałą C L. V H i V L tworzą miejsce wiązania antygenu. Zasadniczy model domen immunoglobulinowych składa się z dwóch przeciwbieżnie skręconych β-kartek, które otaczają wewnętrzną przestrzeń ciasno upakowaną hydrofobowymi łańcuchami bocznymi (tzn. rdzeń hydrofobowy). Zależnie od stopnia wygięcia tych kartek, ogólny kształt domeny można opisać jako cylindryczny (β-baryłka) albo, gdy obie warstwy są płaskie, jako strukturę podobną do kanapki. Obie β-kartki połączone są kowalencyjnie silnym ale nie rygorystycznie zachowywanym ewolucyjnie wewnątrzłańcuchowym mostkiem disiarczkowym (Encyclopedia of Immunology, red. Roitt i Delves, 1992, s i s ). 1

3 Domeny Ig-podobne zidentyfikowano w białkach pochodzących z różnych królestw, w tym, z eukariontów i prokariontów, obejmujących wirusy, grzyby i rośliny (Halaby i wsp., 1998). Domeny Ig-podobne znaleziono w wielu białkach, przykładowo w bakteryjnych enzymach β-galaktozydazie i chitynazie A, w ludzkich receptorach, takich jak receptor hormonu wzrostu, w receptorach cytokin, takich jak receptor IL-1 (McMahan i wsp. 1991), receptor IL-6 (Vollmer i wsp. 1999) oraz receptor ludzkiego czynnika tkankowego (HTF) (Halaby i wsp 1999), w receptorach kinazy tyrozynowej przekazujących zależne od czynników wzrostu sygnały do środowiska wewnątrzkomórkowego (Wiesmann i wsp. 2000), w białkach pokrewnych immunoglobulinom, takich jak CD4 oraz w białkach macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak fibronektyna typu III (Halaby i wsp. 1999). [0003] Domeny Ig-podobne są zwykle złożone z 7-10 nici β rozmieszczonych między dwiema kartkami o konkretnej topologii i połączeniach. Porównano 52 struktury 3-D domen Ig-podobnych tworzących rodzinę fałdu immunoglobulinowego (IgFF) (Halaby i wsp. 1999) i wyniki wykazały, że większość domen Igpodobnych wykazuje mniej niż 10% identyczności sekwencji, i że w domenach Ig-podobnych większość tworzących wspólny rdzeń reszt ma charakter hydrofobowy. Domeny Ig-podobne wykazują zatem większe podobieństwo strukturalne niż sekwencyjne. Rdzeń hydrofobowy ma zasadnicze znaczenie dla wyjątkowego charakteru i stabilności fałdu Ig. Mimo znacznych różnic domen Ig-podobnych stabilność fałdu Ig wydaje się być zwiększona dzięki zachowanej geometrii wiązań wodorowych. W niektórych białkach występuje więcej niż jedna domena Ig-podobna. Przykładowo w dojrzałym receptorze IL-1 typu II występują trzy domeny immunoglobulinopodobne (McMahan i wsp. 1991), a cząsteczka adhezyjna VCAM ma 7 domen Igpodobnych (Osborn i wsp. 1994). [0004] Przykładami istotnych białek zawierających domeny Ig-podobne są: cząsteczki adhezyjne, takie jak NCAM (5 domen Ig-podobnych), fibronektyna typu III, ICAM-1, mad CAM-1, PE CAM-1, VCAM-1, tityna i kadheryna, neurokan, zewnątrzkomórkowe domeny receptorów cytokin, takich jak LIFR, CNTFR, IL-3R, IL5R, IL-6R, IL-12R, GM-CSFR i OSMR, receptory czynników wzrostu, takie jak receptor naczyniowego śródbłonkowego czynnika wzrostowego (VEGF) (7 domen Ig-podobnych), receptor czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), receptor ludzkiego płytkowego czynnika wzrostu (hpdgf), receptory związane z układem odpornościowym, takie jak receptor komórek T, białka głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), receptor czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów 1 (CSF-1R), mikroglobulina-β, CTLA4 receptor cząsteczek B7 w komórkach T (dwie domeny Ig-podobne), B7 czynnik aktywujący komórek B, który reguluje proliferację komórek T, i inne, takie jak neuregulina, czynnik krzepnięcia XIII, NF-κB, dysmutaza ponadtlenkowa i białko wiążące IL-18. [0005] Białka wiążące cytokiny składają się zwykle z zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligand pochodzących z ich odpowiednich receptorów cytokin z powierzchni komórki (rozpuszczalne receptory cytokin). Rozpuszczalne receptory są wytwarzane albo w wyniku alternatywnego składania, albo proteolitycznego cięcia receptorów powierzchni komórki. Takie rozpuszczalne receptory opisano w przeszłości: przykładowo rozpuszczalne receptory IL-6 i IFN-γ (Novick i wsp. 1989), TNF (Engelmann i wsp i Engelmann i wsp. 1990), IL-1 i IL-4 (Maliszewski i wsp. 1990) i IFN-α/β (Novick i wsp. 1994, Novick i wsp. 1992). Jedno z białek wiążących cytokiny, zwane osteoprotegeryną (OPG, znaną także jako czynnik hamujący osteoklasty OCIF), członek rodziny TNFR/Fas, wydaje się być pierwszym przykładem rozpuszczalnego receptora istniejącego jedynie w postaci białka wydzielanego (Anderson i wsp. 1997, 2

4 Simonet i wsp. 1997, Yasuda i wsp. 1998). [0006] Znane jest białko wiążące interleukinę 18 (IL-18BP), które znosi indukcję IFN-γ przez IL-18 oraz aktywację NF-κB przez IL-18 in vitro (Novick i wsp. 1999). IL-18BP jest rozpuszczalnym receptorem istniejącym jedynie jako białko wydzielane. IL-18BP ma pojedynczą domenę Ig-podobną i przypomina zewątrzkomórkowy odcinek receptorów cytokin zawierających domeny Ig-podobne. [0007] Innym niebędącym immunoglobuliną białkiem zawierającym domenę Ig-podobną jest receptor interleukiny 6 (IL-6R). W literaturze sugeruje się, że interleukina 6 jest zarówno cytokiną pro-, jak i przeciwzapalną (zebrane w Heinrich i wsp., 1998, Jones i wsp i Pedersen i wsp. 2001). Kompleks receptorowy pośredniczący w przekazywaniu aktywności IL-6 składa się z dwóch różnych glikoprotein związanych z błoną, spokrewnionej podjednostki receptorowej o masie 80 kda (IL-6R) oraz elementu przekazującego sygnał o masie 130 kda (gp130, CD130). Ekspresja gp130 jest powszechna, natomiast komórkowa dystrybucja IL-6R jest ograniczona i zachodzi głównie w hepatocytach i subpopulacjach leukocytów. Poza receptorem związanym z błoną, rozpuszczalną postać IL-6R (sil-6r) oczyszczono z ludzkiej surowicy i z moczu. Ten rozpuszczalny receptor wiąże IL-6 i przedłuża jej czas półtrwania w osoczu. Co ważniejsze, kompleks sil-6r/il-6 jest zdolny do aktywacji komórek przez oddziaływanie z gp130. Ta właściwość czyni z kompleksu sil-6r/il-6 agonistę dla tych rodzajów komórek, które chociaż wyrażają gp130, zdolne do odpowiedzi odpowiadać na samą IL-6. sil-6r ma zatem zdolność poszerzania repertuaru typów komórek odpowiadających na IL-6. [0008] Przez połączenie całych regionów kodujących cdna kodującego rozpuszczalny receptor IL-6 (sil- 6R) oraz IL-6 wytworzono zrekombinowane białko chimeryczne IL6-IL6R w komórkach człowieka (Chebath i wsp. 1997). Ta chimera IL6-IL6R ma wzmocnione aktywności biologiczne typu IL-6 i wiąże się in vitro z łańcuchem gp130 ze znacznie większą wydajnością, niż mieszanina IL-6 z sil-6r (Kollet i wsp. 1999). Merkaptoetylopirydyna (MEP) HyperCel (BioSepra) jest żywicą stosowaną w chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku (HCIC). Żywicę tę zaprojektowano specjalnie z myślą o wychwytywaniu immunoglobulin (Boschetti 2000 i Life technologies Inc. 2000). W ph obojętnym hydrofobowe wychwytywanie zachodzi w żywicy HCIC zachodzi zarówno przez alifatyczny hydrofobowy odstępnik, jak i obojętny (nienaładowany) pierścień pirydynowy. W przeciwieństwie do chromatografii HI, adsorpcja przeciwciał z supernatantów hodowli komórkowych na żywicy HCIC zachodzi bez konieczności jakiejkolwiek regulacji ph lub siły jonowej. Po obniżeniu ph z ph 7,2 do ph 4 pierścień pirydynowy w żywicy i związane przeciwciało uzyskują ładunek dodatni i na skutek odpychania ładunków immunoglobulina się odłącza i jest wymywana z kolumny. Choć ta metoda chromatograficzna jest stosowana do wychwytywania immunoglobulin, nie można było przewidzieć, czy zadziała ona w przypadku wychwytywania białek niebędących immunoglobulinamizawierających domenę IgG-podobną, ponieważ immunoglobuliny mają inne sekwencje, a ponadto ponieważ domena IgG-podoba w 52 niebędących immunoglobulinami białkach wykazuje mniej niż 10% identyczności sekwencji (Halaby i wsp. 1999). [0009] Schwartz i wsp. (J. Chromatography A, 908 (2001) ) opisał sposób oczyszczania przeciwciał za pomocą chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku, w którym przeciwciała eluowano octanem sodu o ph 4,0. [0010] Chromatografię hydrofobową z indukowaniem ładunku wykorzystano także do oczyszczania białek innych niż przeciwciała. Przykładowo, Burton i Harding (J. Chromatography A, 814 (1998) 71-81) opisują 3

5 oczyszczanie mioglobiny, rybonukleazy, chymotrypsynogenu, lizozymu, ferrytyny i chymozyny za pomocą chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku. Elucję tych białek przeprowadzano buforami wodnymi. [0011] Weatherly i wsp. (J. Chromatography A, 952 (2002) ) oczyścili fragmenty neurotoksyny botulinowej za pomocą chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku. Elucję prowadzono w buforach, octanie sodu lub cytrynianie sodu w kwasowym ph. [0012] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania białek niebędących immunoglobulinami posiadających domeny Ig-podobne z płynów biologicznych. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0013] Wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania lub wychwytywania białek niebędących immunoglobulinami, które są przedmiotem zainteresowania, zawierających od jednej do dziesięciu domen immunoglobulinopodobnych (Ig-podobnych) z płynu biologicznego, obejmującego etapy: a) kontaktowania płynu biologicznego zawierającego będące przedmiotem zainteresowania białko z żywicą do chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku (HCIC), b) płukania żywicy w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń, c) eluowania białka będącego przedmiotem zainteresowania przez traktowanie żywicy roztworem zawierającym rozpuszczalnik organiczny. [0014] W jednym z wykonań sposobu według wynalazku żywicą HCIC jest MEP-HyperCel. [0015] W innym wykonaniu sposobu według wynalazku rozpuszczalnikiem organicznym wykorzystywanym w etapie c) jest glikol propylenowy, korzystnie w roztworze zawierającym glikol propylenowy w stężeniu między około 25 a 50%. [0016] W dalszym wykonaniu wynalazku etap a) jest przeprowadzany przy kwasowym ph, korzystnie między około 3 a 6,8. [0017] W drugim dalszym wykonaniu wynalazku etap b) jest przeprowadzany za pomocą roztworu o kwasowym ph, korzystnie między około 3 a 6,8. [0018] W jednym z aspektów wynalazku białko będące przedmiotem zainteresowania znajduje się w płynie biologicznym wybranym z: kondycjonowanego komórkami podłoża hodowlanego, lizatu komórkowego, ekstraktu komórkowego, ekstraktu tkankowego, osocza krwi, surowicy, mleka, moczu, płynu puchlinowego, płynu mózgowo-rdzeniowego, soku roślinnego, ekstraktów roślinnych lub frakcji uzyskanej we wcześniejszym etapie rozdziału chromatograficznego. [0019] W dalszym wykonaniu wynalazku białko będące przedmiotem zainteresowania zawiera 1 do 7 domen Ig-podobnych. [0020] Wynalazek dostarcza sposobu oczyszczania lub wychwytywania białka będącego przedmiotem zainteresowania, takiego jak I NCAM, Fibronektyna typu III, ICAM-1, mad CAM-1, PE CAM-1, VCAM-1, tityna, kadheryna, neurokan, LIFR, CNTFR, IL-1R, IL-3R, IL5R, Il-6R, IL-12R, GM-CSFR, OSMR, receptor VEGF, receptor FGF, receptor hpdgf, receptor komórek T, białka MHC, mikroglobulina-β, CTLA4, czynnik aktywujący B7, neuregulina, czynnik krzepliwości XIII, NF-κB, IL6-IL6R, dysmutaza ponadtlenkowa i korzystnie IL-18BP, chimera IL6-IL6R lub beta galaktozydaza albo izoforma, muteina, białko fuzyjne, ich 4

6 funkcyjna pochodna lub fragment zawierający przynajmniej jedną domenę Ig-podobną. [0021] W jednym z wykonań sposób według wynalazku pozwala na uzyskanie oczyszczonego białka o współczynniku oczyszczenia w zakresie od 11 do 94 razy, korzystnie 94 razy. [0022] W dalszym wykonaniu wynalazek pozwala na uzyskanie oczyszczonego białka o współczynniku zatężenia w zakresie od 1,5 do 3,1 razy, korzystnie 3,1 razy. [0023] Sposób według wynalazku pozwala także na uzyskanie oczyszczonego białka z wydajnością w zakresie od 73 do 98%, korzystnie około 85%. [0024] Dodatkowo wynalazek dostarcza zastosowania żywicy do chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku (HCIC) do wychwytywania z płynu biologicznego białka niebędącego immunoglobuliną, które jest przedmiotem zainteresowania i zawiera od jednej do dziesięciu domen immunoglobulinopodobnych (Ig-podobnych), obejmującego etapy: a) kontaktowania płynu biologicznego zawierającego białko będące przedmiotem zainteresowania z żywicą HCIC, b) płukania żywicy w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń, c) eluowania białka będącego przedmiotem zainteresowania przez traktowanie żywicy roztworem zawierającym rozpuszczalnik organiczny. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0025] Figura 1 przedstawia chromatogram uzyskany przy wychwytywaniu IL-18BP w dwuetapowej (35%- 50%) elucji glikolem proylenowym (PG) na kolumnie MEP-HyperCel. Dane procedury: Objętość złoża kolumny: 5ml. Bufor do równoważenia: PBS (buforowany fosforanem roztwór soli), 10 mm fosforan sodu, 150 mm chlorek sodu, ph 7,2, przygotowany przez rozcieńczenie w stosunku 1:10 10x PBS, IPL nr kodu S88RD005. szybkość przepływu 3 ml/min. Nakładanie: zatężony surowy materiał (CCM) zawierający 0,50 mg/ml r-hil-18bp (ELISA) i 32 mg/ml całkowitego białka (Bradford) szybkość przepływu 1 ml/min. Płukania: 1) PBS ph 7,2, 2) 50 mm octan ph 4,5 (pik 1), 3) woda do iniekcji (WFI) szybkość przepływu wszystkich płukań 3 ml/min. Pierwsza elucja: 35% glikol propylenowy w 20 mm buforze fosforanowym o ph 8,4 (pik 2) szybkość przepływu 1 ml/min. Druga elucja: w 50% glikolu propylenowym. Lewa oś rzędnych wskazuje absorbcję przy A280 (jednostki mau białka), prawa oś rzędnych wskazuje przewodność (jednostki ms/cm), na osi odciętych oznaczono objętość przepływu przez kolumnę (ml). Figura 2 przedstawia analizę SDS-PAGE frakcji uzyskiwanych przy wychwytywaniu IL-18BP za pomocą kolumny MEP HyperCel. Rozdzielone frakcje pochodzą z eksperymentu przedstawionego na Fig. 1. Ścieżki 1) nałożona, 2) niezwiązana, 3) płukanie 50 mm octanem ph 4,5, 4) płukanie WFI, 5) pik elucji 35% glikolem propylenowym, 6) wzorzec rhil18bp, 7) wzorce masy cząsteczkowej. 5

7 Długa strzałka wskazuje prążek r-hil-18bp. Figura 3 przedstawia chromatogram frakcjonowania piku elucji r-hil18-bp na kolumnie MEP HyperCel. Dane procedury: Objętość złoża kolumny: 5ml. Bufor do równoważenia: PBS ph 6,1 szybkość przepływu 3 ml/min. Nakładanie: zatężony surowy materiał CCM CH008 doprowadzony do ph 6,1 szybkość przepływu 3 ml/min. Płukania: 1) PBS ph 6,1, 2) 50 mm octan ph 4,1, 3) woda do iniekcji (WFI) szybkość przepływu wszystkich płukań 3 ml/min Elucja: 35% glikol propylenowy w 20 mm buforze fosforanowym o ph 8,4 szybkość przepływu 1 ml/min. Na rysunku przedstawiono rozwinięcie piku elucyjnego zebranego we 3 ml frakcjach. Lewa oś rzędnych wskazuje absorbcję przy A280, prawa oś rzędnych wskazuje przewodność (jednostki ms/cm), na osi odciętych oznaczono objętość przepływu przez kolumnę (ml). Lewa oś rzędnych wskazuje absorbcję przy A280 (jednostki mau białka), prawa oś rzędnych wskazuje przewodność (jednostki ms/cm), na osi odciętych oznaczono objętość przepływu przez kolumnę (ml). Figura 4 przedstawia chromatogram wychwytywania r-hil6-il6r na kolumnie MEP HyperCel. Dane procedury: Objętość złoża kolumny: 1 ml. Bufor do równoważenia: PBS szybkość przepływu 1 ml/min. Nakładanie: surowy materiał zawierający 0,81 mg/ml r-hil6-il6r (ELISA) szybkość przepływu 0,5 ml/min. Płukanie: PBS szybkość przepływu 0,5 ml/min Elucja: 35% glikol propylenowy w 20 mm buforze fosforanowym o ph 8,4 szybkość przepływu 0,5 ml/min. Detekcja przy A280. Lewa oś rzędnych wskazuje absorbcję przy A280 (jednostki mau białka), prawa oś rzędnych wskazuje przewodność (jednostki ms/cm), na osi odciętych oznaczono objętość przepływu przez kolumnę (ml). Figura 5 przedstawia analizę SDS-PAGE frakcji nałożonej i wyeluowanej z kolumny MEP HyperCel załadowanej białkiem chimerycznym r-hil6-il6r w zawierającym FBS surowym materiale. Frakcje nałożono na żel -20 mcg/ścieżkę. Ścieżka 1) nakładania, 2) i 3) niezwiązany materiał, 4) pik elucji 35% glikolem propylenowym, 5) oczyszczony wzorzec r-hil6-il6r, 5 mcg/ścieżkę 6) wzorce masy cząsteczkowej. Strzałka wskazuje prążek r-hil6-il6r. Figura 6 przedstawia chromatogram wychwytywania beta-galaktozydazy na kolumnie MEP HyperCel. Dane procedury: Objętość złoża kolumny: 1 ml. Bufor do równoważenia: PBS szybkość przepływu 1 ml/min. Nakładanie: pozbawione surowicy podłoże (SFM) zawierające 0,625 mg/ml beta-galaktozydazy szybkość przepływu 0,5 ml/min. 6

8 Płukanie: PBS szybkość przepływu 0,5 ml/min. Elucja: 35% glikol propylenowy w 20 mm buforze fosforanowym o ph 8,4 szybkość przepływu 0,5 ml/min. Detekcja przy A280. Lewa oś rzędnych wskazuje absorbcję przy A280 (jednostki mau białka), prawa oś rzędnych wskazuje przewodność (jednostki ms/cm), na osi odciętych oznaczono objętość przepływu przez kolumnę (ml). Figura 7 przedstawia analizę SDS-PAGE frakcji nakłożonej i wyeluowanej z kolumny MEP HyperCel załadowanej beta-galaktozydazą w SFM (ProCHO5). Frakcje naniesiono na żel według oznaczenia całkowitego białka po 20 mcg/ścieżkę. Ścieżki 1) nakładania, 2) - 4) niezwiązany materiał, 5) pik elucji 35% glikolem propylenowym, 6) oczyszczony wzorzec beta-galaktozydazy, 5 mcg/ścieżkę, 7) wzorce masy cząsteczkowej. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0026] Niniejszy wynalazek oparty jest na stwierdzeniu, że niebędące immunoglobulinami białka, które zawierają jedną lub więcej domen Ig-podobnych, są skutecznie wychwytywane z płynów biologicznych na żywicy MEP HyperCel, która jest zwykle stosowana do wychwytywania immunoglobulin. [0027] Wynalazek dotyczy zatem sposobu oczyszczania i lub wychwytywania z płynu biologicznego, białka nie będącego immunoglobuliną, które jest przedmiotem zainteresowania, które zawiera od jednej do dziesięciu domen immunoglobulinopodobnych (Ig-podobnych) obejmującego etapy: a) kontaktowania płynu biologicznego zawierającego białko będące przedmiotem zainteresowania z żywicą do chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku (HCIC), b) płukania żywicy w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń, c) eluowania białka będącego przedmiotem zainteresowania przez traktowanie żywicy roztworem zawierającym rozpuszczalnik organiczny. [0028] Merkaptoetylopirydyna (MEP) HyperCel (BioSepra) jest żywicą stosowaną w chromatografii hydrofobowej z indukowaniem ładunku (HCIC). Żywicę tę opracowano specjalnie z myślą o wychwytywaniu immunoglobulin (Boschetti 2000 i Life technologies Inc. 2000). W ph obojętnym wychwytywanie hydrofobowe w żywicy HCIC zachodzi zarówno przez alifatyczny hydrofobowy odstępnik, jak i obojętny (nienaładowany) pierścień pirydynowy. W przeciwieństwie do chromatografii HI, adsorpcja przeciwciał z supernatantów hodowli komórkowych na żywicy HCIC zachodzi bez konieczności jakiejkolwiek potrzeby regulacji ph lub siły jonowej. Po obniżeniu ph z ph 7,2 do ph 4 pierścień pirydynowy w żywicy i związane przeciwciało uzyskują ładunek dodatni i na skutek odpychania ładunków immunoglobulina odłącza się i jest wymywana z kolumny. Choć metoda ta jest stosowana do wychwytywania immunoglobulin, nie można było przewidzieć czy zadziała ona w przypadku wychwytywania białek nie będących immunoglobulinami mających domenę IgG-podobną, ponieważ immunoglobuliny mają inne sekwencje, a ponadto ponieważ domena IgG-podoba w 52 białkach nie będących immunoglobulinami wykazuje mniej niż 10% identyczności sekwencji (Halaby i wsp. 1999). W jednym z wykonań wynalazku możliwość wychwycenia na żywicy HCIC, MEP HyperCel, białka niebędącego immunoglobuliną zawierającego domenę Ig-podobną zilustrowano na przykładzie IL-18BP. IL-18BP jest białkiem silnie glikozylowanym i w związku z tym bardziej kwaśnym (punkt 7

9 izoelektryczny około 3) i mniej hydrofobowym niż immunoglobulin. Z jednej strony wiązanie immunoglobulin z MEP HyperCel oparte jest na hydrofobowości, a w przeciwieństwie do immunoglobulin, IL-18BP nie jest białkiem bardzo hydrofobowym. Z drugiej strony, nawet jeżeli IL-18BP zwiąże się z taką żywicą, to nie można oczekiwać, że warunki zalecane do elucji przeciwciał będą odpowiednie w przypadku IL-18BP, gdyż zmiana ph z wartości ph 7,2 na ph 4 nie spowoduje, że IL-18BP stanie się dodatnio naładowane, zatem w takich warunkach ph oczekuje się, że IL-18BP pozostanie związane z kolumną. Specjaliści uznaliby zatem zastosowanie żywicy MEP HyperCel do wychwytywania IL-18BP za niewłaściwe ze względu na właściwości fizykochemiczne tego białka i zasady wiązania i elucji tej żywicy. W jednym z wykonań stężony surowy materiał (CMM) (Przykład 1, Fig. 1) zawierający IL-18BP naniesiono na kolumnę MEP HyperCel zrównoważoną uprzednio (buforem (PBS) ph 7,2). Kolumnę przepłukano tym samym buforem w celu usunięcia niezwiązanych białek. Wykorzystując różne właściwości fizykochemiczne immunoglobulin (punkt izoelektryczny w zakresie 6-6,5) i IL-18BP (punkt izoelektryczny około 3) i zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi oczyszczania immunoglobulin, odpłukano zanieczyszczenia immunoglobulinowe przez kolumny obniżenie ph do 4,5, przy którym IL-18BP pozostaje związane z żywicą. Ostatecznie, w celu odzyskania IL-18BP z kolumny, z sukcesem zastosowano roztwór zawierający glikol propylenowy (około 35% glikol propylenowy w buforze fosforanowym) o ph 8,4. Uzyskane wyniki wykazują, że IL-18BP wydajnie wiąże się z żywicą MEP HyperCel, i że białko jest eluowane z żywicy w postaci odrębnego piku. Wykazano, że wychwytywanie białek nie będących immunoglobulinami zawierających domenę Ig-podobną na kolumnie MEP HyperCel może być zoptymalizowane, jak wykazano to w poniższych przykładach, za pomocą zmiany parametrów chromatografii, takich jak szybkość przepływu, skład buforów, ph nakładanego materiału, pojemność kolumny itp. Przykładowo, właściwość wymywania frakcji immunoglobulin z kolumny MEP HyperCel przy kwasowym ph (ph 4, Boschetti 2000 i Life technologies Inc. 2000) wykorzystano dla zwiększenia pojemności wypełniania kolumny białkiem IL-18BP. ph nakładanego materiału można doprowadzić do bardziej kwasowego ph (jak ph 6,1), aby adsorpcji na kolumnie podczas nakładania ulegało mniej immunoglobulin i więcej r-hil-18bp, usuwając jak najwięcej zanieczyszczających immunoglobulin. W poniższych przykładach wykazano, że dzięki nakładaniu surowego materiału przy niższym ph uzyskano około dwukrotny i większy wzrost pojemności względem IL-18BP. Jak wykazano to w analizie SDS-PAGE (Przykład 5), RP-HPLC (Przykład 7) i oznaczeniu immunoenzymatycznym (ELISA) (Przykład 6), etap wychwytu na kolumnie MEP HyperCel cechuje się dobrą pojemnością nakładania (około 6 mg IL-18BP/ml żywicy), wysokim odzyskiem ( 85%) i wydajnością oczyszczania IL-18BP. Oczyszczona frakcja r-hil-18bp ulega też elucji w postaci wąskiego piku. Wysoka skuteczność żywicy MEP HyperCel przy wychwytywaniu IL-18BP jest najprawdopodobniej związana z wybiórczym wiązaniem r-hil-18bp z żywicą, skutecznym etapem płukania przy kwasowym ph i wybranymi warunkami elucji (elucja glikolem propylenowym). Ponadto, stosując różne partie żywicy MEP HyperCel do wychwytywania r-hil-18bp wykazano spójność wyników uzyskiwanych dla różnych partii. Dodatkowe eksperymenty wykazały, że skuteczność kolumny MEP HyperCel jest zbliżona przy zastosowaniu materiału wytworzonego w podłożu pozbawionym surowicy oraz w podłożu uzupełnionym surowicą. Obecność lub nieobecność surowicy w wyjściowym materiale lub surowym nie wpływa zatem na wiązanie 8

10 białka z kolumną MEP HyperCel. W innym wykonaniu wynalazku możliwość wychwycenia na żywicy MEP HyperCel białka niebędącego immunoglobuliną, które zawiera domenę Ig-podobną, zilustrowano na przykładzie chimerycznego białka r- hil6-il6r wytwarzanego przez komórki CHO. Białko chimeryczne hil6-il6r (zwane także IL6R/IL6 lub chimerą IL-6 ) jest chimeryczną cząsteczką obejmującą rozpuszczalną część receptora interleukiny-6 (sil- 6R) niosącą domenę Ig-podobną, połączoną z interleukiną-6. Naniesionym na kolumnę materiałem był surowy materiał wytworzony przez zrekombinowane komórki CHO, zawierający 2% FBS, uzyskany po sklarowaniu i 20-krotnym zatężeniu (Przykład 8). Konkretniej, surowy materiał chimery r-hil6-il6r wytworzonej w komórkach CHO naniesiono na kolumnę MEB HyperCel zrównoważoną PBS. Po przepłukaniu kolumny związany materiał wyeluowano 35% glikolem propylenowym. Ilość białka w wyeluowanej frakcji analizowano za pomocą ELISA oraz SDS-PAGE. Wyniki wykazują, że kolumna MEP HyperCel ma pojemność ponad 2 mg r-hil6-il6r na ml żywicy, wydajność około 72% i współczynnik oczyszczenia około 94 razy dla wychwytywania r-il6-il6r. Za pomocą SDS-PAGE (Fig. 5) wykazano, że chimerar-hil6-il6r, która była zasadniczo niewykrywalna w surowym materiale, pojawia się jako jeden z głównych prążków we frakcji wyeluowanej z MEP HyperCel (94- krotne oczyszczenie przez ELISA). W celu sprawdzenia wkładu domeny Ig-podobnej w chimerze r-hil6-il6r w wiązanie się z kolumną MEP HyperCel, zbadano wiązanie samej IL-6 z kolumną MEP HyperCel. W tym celu na kolumnę MEP HyperCel naniesiono surowy materiał ze zrekombinowanych komórek CHO w warunkach podobnych do zastosowanych dla nienaruszonej chimery. Stwierdzono, że w przeciwieństwie do zawierającej domenę Igpodobną chimery IL6-IL6R, sama IL-6 nie wiąże się z kolumną. W dalszym wykonaniu wynalazku zastosowanie żywicy MEP HyperCel do wychwycenia białek niebędących immunoglobulinami, zawierających domenę Ig-podobną zilustrowano na przykładzie bakteryjnego enzymu, r-beta-galaktozydazy. Enzym ten zawiera Ig-podobną domenę typu C3 (Halaby i wsp. 1999). r-betagalaktozydazę dodano do pozbawionego surowicy podłoża (przykład 9) i naniesiono na kolumnę MEP HyperCel. Po przepłukaniu kolumny związany materiał wyeluowano 35% PG. Frakcje odpowiadające niezwiązanemu i wyeluowanemu materiałowi zebrano i analizowano za pomocą SDS-PAGE. Uzyskane wyniki wykazują, że żywica MEP HyperCel skutecznie wychwytuje enzym beta-galaktozydazę z roztworu, Powyższe przykłady wykazują, że żywica HyperCel może być wykorzystana do oczyszczania różnych białek niebędących immunoglobulinami zawierających domenę Ig-podobną. Wynalazek dotyczy wychwytywania białek niebędących immunoglobulinami zawierających jedną lub więcej domen Ig-podobnych na MEP HyperCel albo na żywicach HCIC posiadających takie same lub podobne właściwości co MEP HyperCel, pozwalające na wychwytywanie białek zawierających jedną lub więcej domen Ig-podobnych. Wynalazek dotyczy także wychwytywania białek niebędących immunoglobulinami, które naturalnie nie zawierają domen Ig-podobnych, ale do których taką domenę dołączono metodami rekombinacji DNA. Białka zawierające domeny Ig-podobne mogą być wychwytywane z płynu biologicznego lub lizatu komórkowego przy zastosowaniu żywicy HCIC, takiej jak MEP HyperCel. Wychwytywanie w ogólnym znaczeniu obejmuje kontaktowanie płynu biologicznego lub ekstraktu komórkowego z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania zawierającym domenę Ig-podobną z żywicą HCIC, taką jak MEP HyperCel, płukanie żywicy w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń i elucję związanego materiału 9

11 przez zmianę ph środowiska, lub, jak opisano to w konkretnym wykonaniu, przez zastosowanie rozpuszczalnika organicznego, takiego jak przykładowo, alkohol izopropylowy lub glikol propylenowy i/lub polialkohole, przykładowo glicerol, glikol polietylenowy (np. w stężeniu około 25-50%). Kontaktowanie płynu biologicznego lub ekstraktu komórkowego z HCIC można przeprowadzić w ph surowego materiału lub ph obojętnym, albo alternatywnie, przed kontaktowaniem ph kolumny oraz surowego materiału może być doprowadzone do ph kwasowego, np. ph między 3 6,8, jak w przypadku oczyszczania IL-18BP, albo do ph zasadowego. Przy płukaniu żywicy w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń można zastosować roztwory mające takie samo ph, jak naniesiony materiał (np. PBS 7,2) i/lub można stosować ph obojętne, i/lub roztwór o ph kwasowym (np. ph 3-6,8) lub ph zasadowym. Zrekombinowane białka zawierające domeny Ig-podobne mogą być wytwarzane w bakteryjnych lub eukariotycznych (np. CHO) hodowanych komórkach gospodarza, transfekowanych wektorami kodującymi takie białka, albo w transgenicznych zwierzętach lub roślinach. Gdy wykorzystuje się zwierzęta transgeniczne szczególnie korzystne jest wytwarzanie heterologicznych białek w ich mleku. Korzystnymi gospodarzami są zatem zwierzęta dające mleko, takie jak bydło, owce i kozy. Patrz, przykładowo, publikacje WIPO WO 88/00239, WO 90/05188, WO 91/02318 i WO 92/11757; oraz patenty USA nr 4,873,191; 4,873,316; i 5,304,489, które są niniejszym w całości włączone przez odniesienie. Niebędące immunoglobulinami białka zawierające domeny Ig-podobne, w tym izoformy, muteiny, białka fuzyjne, ich pochodne funkcyjne lub fragmenty pod warunkiem, że zachowują przynajmniej jedną domenę Igpodobną, mogą być wychwytywane za pomocą sposobu według niniejszego wynalazku z podłoża hodowli zrekombinowanych komórek, lizatów komórkowych, z mleka zwierząt transgenicznych, z transgenicznych roślin, moczu, płynu puchlinowego, soku roślinnego, ekstraktów roślinnych itp. Wykorzystując sposób oczyszczania białek będących przedmiotem zainteresowania, które nie są immunoglobulinami, zgodnie z wynalazkiem można zatem uzyskać oczyszczony preparat białkowy z NCAM (5 domen Ig-podobnych), fibronektyny typu III, ICAM-1, mad CAM-1, PE CAM-1, VCAM-1, tityny i kadheryny, neurokanu, zewnątrzkomórkowych domen receptorów cytokin, takich jak LIFR, CNTFR, IL-3R, IL5R, IL-6R, IL6-IL6R, IL-12R, GM-CSFR i OSMR, receptorów czynników wzrostu, takich jak receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) (7 domen Ig-podobnych), receptor czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), receptor ludzkiego płytkowego czynnika wzrostu (hpdgf), receptorów związanych z układem odpornościowym, takich jak receptor komórek T, białek głównego układu zgodności tkankowej (MHC), mikroglobuliny β, receptora CTLA4, receptor w komórkach T dla cząsteczek B7 (dwie domeny Ig-podobne), B7 czynnika aktywującego komórek B, który reguluje proliferację komórek T, i innych, takich jak neuregulina, czynnik krzepnięcia XIII, NF-κB, dysmutaza ponadtlenkowa i IL-18BP (jedna domena Ig-podobna). Korzystnie, w sposobie wychwytywania i/lub oczyszczania białka niebędącego immunoglobuliną, posiadającego jedną lub więcej domen Ig-podobnych, według niniejszego wynalazku, współczynnik oczyszczenia uzyskanego białka mieści się w zakresie od 11 do 94 razy, korzystniej około 94 razy, współczynnik zatężenia uzyskanego białka mieści się w zakresie od 1,5 do 3,1 razy, korzystniej około 5 razy, a wydajność uzyskanego białka mieści się w zakresie od 73 do 85%, korzystniej około 98%. Domeny immunoglobulinopodobne (Ig-podobne) są zwykle złożone z 7-10 nici β rozmieszczonych między dwiema kartkami konkretnej topologii i połączeniach. W wyniku porównania 52 struktur 3D domen Igpodobnych tworzących rodzinę fałdu immunoglobulinowego (IgFF) (Halaby i wsp. 1999) wykazano, że 10

12 większość domen Ig-podobnych wykazuje mniej niż 10% identyczności sekwencji, i że w domenach Igpodobnych większość tworzących wspólny rdzeń reszt ma charakter hydrofobowy. Domeny Ig-podobne wykazują zatem większe podobieństwo strukturalne niż sekwencyjne. Rdzeń hydrofobowy ma zasadnicze znaczenie dla wyjątkowego charakteru i stabilności fałdu Ig. Mimo znacznych różnic sekwencji domen Igpodobnych stabilność fałdu Ig wydaje się być zwiększona dzięki zachowanej geometrii wiązań wodorowych. Niektóre białka mają więcej niż jedną domenę Ig-podobną. Przykładowo w dojrzałym receptorze IL-1 typu II występują trzy domeny immunoglobulinopodobne (McMahan i wsp. 1991), a cząsteczka adhezyjna VCAM ma 7 domen Ig-podobnych (Osborn i wsp. 1994). [0029] Przykładami istotnych białek zawierających domeny Ig-podobne są: cząsteczki adhezyjne, takie jak NCAM (5 domen Ig-podobnych), fibronektyna typu III, ICAM-1, mad CAM-1, PE CAM-1, VCAM-1, tityna i kadheryna, neurokan, zewnątrzkomórkowe domeny receptorów cytokin, takich jak LIFR, CNTFR, IL-3R, IL5R, IL-6R, IL-12R, GM-CSFR i OSMR, receptory czynników wzrostu, takie jak receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) (7 domen Ig-podobnych), receptor czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), receptor ludzkiego płytkowego czynnika wzrostu (hpdgf), receptory związane z układem odpornościowym, takie jak receptor komórek T, białka głównego układu zgodności tkankowej (MHC), receptor czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów 1 (CSF-1R), mikroglobulina-β, CTLA4 receptor cząsteczek B7 w komórkach T (dwie domeny Ig-podobne), B7 czynnik aktywujący komórek B, który reguluje proliferację komórek T i inne, takie jak neuregulina, czynnik krzepnięcia XIII, NF-κB, dysmutaza ponadtlenkowa i białko wiążące IL-18. Stosowany tutaj termin muteiny odnosi się do analogów białka niebędącego immunoglobuliną posiadającego domenę Ig-podobną, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych białka, np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazy, jest zastąpionych innymi resztami aminokwasowymi lub jest usuniętych, lub jedna albo więcej reszt aminokwasowych jest dodanych do nich, bez znaczącej zmiany aktywności powstałych produktów w porównaniu z IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazą, i/lub pod warunkiem, że zachowają one co najmniej jedną domenę Ig-podobną. Konkretniej, zastąpionych innymi aminokwasami, usuniętych, lub dodanych może być jeden lub więcej aminokwasów w białkach, lecz nie więcej niż 30, korzystnie nie więcej niż 20, korzystniej nie więcej niż 10, a najkorzystniej jeden lub dwa aminokwasy. Muteiny te wytwarza się znanymi metodami syntezy i/lub technikami mutagenezy ukierunkowanej, lub dowolnymi innymi znanymi technikami odpowiednimi do tego celu. Do mutein według niniejszego wynalazku należą zatem białka kodowane przez kwas nukleinowy, taki jak DNA lub RNA, który hybrydyzuje z DNA lub RNA, kodujący białko niebędące immunoglobuliną, które posiada co najmniej jedną domenę Ig-podobną, np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazę, według niniejszego wynalazku, w ostrych warunkach. Termin ostre warunki dotyczy warunków hybrydyzacji i późniejszego przemywania, które specjaliści w dziedzinie zazwyczaj definiują jako ostre. Patrz Ausubel i wsp.., Current Protocols in Molecular Biology, powyżej, Interscience, N.Y., 6.3 i 6.4 (1987, 1992) i Sambrook i wsp., powyżej. Bez ograniczenia, przykłady takich ostrych warunków obejmują warunki przemywania w C poniżej obliczonej Tm dla badanej hybrydy w np. 2 x SSC i 0,5% SDS przez 5 minut, 2 x SSC i 0,1% SDS przez 15 minut; 0,1 x SSC i 0,5% SDS w temperaturze 37 C przez minut i następnie, 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 68 C przez minut. Dla specjalistów w dziedzinie będzie jasne, że te ostre warunki zależą również od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (jak zasad) lub zmieszanych sond oligonukleotydowych. Jeśli stosuje się zmieszane sondy, korzystniejsze jest użycie 11

13 chlorku tetrametyloamoniowego (TMAC) zamiast SSC. Patrz Ausubel, powyżej. Każda taka muteina korzystnie ma sekwencję aminokwasową dostatecznie dublującą sekwencję białka niebędącego immunoglobuliną, które zawiera co najmniej jedną domenę Ig-podobną, takiego jak np. IL- 18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydaza, tak aby wykazywać aktywność zasadniczo podobną do IL- 18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazy i/lub pod warunkiem, że ma zachowaną co najmniej jedną domenę Ig-podobną. W korzystnym wykonaniu, każda z takich mutein ma przynajmniej 40% identyczności lub homologii z sekwencją aminokwasową np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazy. Korzystniej, ta identyczność lub homologia powinna wynosić co najmniej 50%, co najmniej 60%, co najmniej 70%, co najmniej 80%, lub najkorzystniej 90%. Muteiny, które można oczyszczać zgodnie z niniejszym wynalazkiem, lub kodujący je kwas nukleinowy obejmują skończony zestaw zasadniczo odpowiednich sekwencji podstawionych peptydów lub polinukleotydów, które może rutynowo otrzymać zwykły specjalista w tej dziedzinie, bez zbędnego eksperymentowania, w oparciu o podane tutaj uwagi i wskazówki. [0030] Korzystne zmiany w budowie mutein zgodnie z niniejszym wynalazkiem są znane jako podstawienia konserwatywne. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe białka niebędącego immunoglobuliną, które posiada co najmniej jedną domenę Ig-podobną, takiego jak np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydaza mogą obejmować synonimiczne aminokwasy z grupy posiadającej dostatecznie podobne właściwości fizykochemiczne, tak, że podstawienie między członkami tej grupy zachowuje biologiczną funkcję cząsteczki (Grantham, 1974) i/lub pod warunkiem zachowania co najmniej jednej domeny Igpodobnej. Jest oczywiste, że można dokonać wstawienia lub usunięcia aminokwasów w powyżej określonych sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie jeśli to wstawienie lub usunięcie obejmuje tylko kilka aminokwasów, np. poniżej trzydziestu, i korzystnie poniżej dziesięciu, i nie usuwa lub nie przemieszcza aminokwasów, które są krytyczne dla funkcjonalnej konformacji, np. reszty cysteinowe i/lub pod warunkiem zachowania co najmniej jednej domeny Ig-podobnej. Białka i muteiny wytwarzane przez takie usuwania i/lub wstawienia wchodzą w zakres niniejszego wynalazku. Korzystnie, synonimicznymi grupami aminokwasów są te, które zdefiniowano w Tabeli A. Korzystniej, synonimicznymi grupami aminokwasów są te, które zdefiniowano w Tabeli B; i najkorzystniej synonimicznymi grupami aminokwasów są te, które zdefiniowano w Tabeli C. TABELA A Korzystne grupy synonimicznych aminokwasów Aminokwas Ser Arg Leu Pro Thr Ala Grupa synonimiczna Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gln, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala 12

14 Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp Tabela B Bardziej korzystne grupy synonimicznych aminokwasów Aminokwas Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Grupa synonimiczna Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp 13

15 Tabela C Najkorzystniejsze grupy synonimicznych aminokwasów Aminokwas Grupa synonimiczna Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly Ile Ile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Met Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasowych w białku niebędącym immunoglobuliną posiadającym domenę Ig-podobną, które można stosować do otrzymywania mutein np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazy, do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują dowolne znane etapy metod, takie jak przedstawiono w patentach USA: 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462 Mark i wsp.; 5,116,943 Koths i wsp.; 4,965,195 Namen i wsp.; 4,879,111 Chong i wsp. oraz 5,017,691 Lee i wsp.; oraz podstawione lizyną białka przedstawione w patencie USA Nr 4,904,584 (Shaw i wsp.). Termin białko fuzyjne odnosi się do białka niebędącego immunoglobuliną posiadającego domenę Igpodobną, np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazę, lub jego muteiny lub jego fragmentu, połączonego z innym białkiem niebędącym immunoglobuliną, które, np., ma przedłużony czas przebywania w płynach ustrojowych. Np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydaza mogą więc być połączone z innym nie będącym immunoglobuliną białkiem, polipeptydem, itp. W stosowanym tu znaczeniu termin pochodne funkcyjne obejmuje pochodne białek zawierających domenę Ig-podobną, np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazy i ich mutein oraz białek fuzyjnych, które można wytworzyć z grup funkcyjnych występujących jako łańcuchy boczne reszt lub z grup N- lub C- końcowych sposobami znanymi w dziedzinie, i które są objęte wynalazkiem, dopóki pozostają 14

16 farmaceutycznie dopuszczalnymi, t.j. nie niszczą aktywności białka, która jest znacząco podobna do aktywności np. IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydazy i/lub pod warunkiem że mają one zachowaną co najmniej jedną domenę Ig-podobną. Do takich pochodnych należą np. pochodne z łańcuchami bocznymi glikolu polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i przedłużać czas przebywania białka w płynach ustrojowych. Inne pochodne obejmują estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych uzyskiwane w reakcji z amoniakiem lub z pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi aminami, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych utworzone z grupami acylowymi (np. grupami alkanoilowymi lub karbocyklicznymi grupami aroilowymi) lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych (np. w resztach seryny lub treoniny) uzyskiwane w reakcji z grupami acylowymi. Terminem fragmenty białka zawierającego domenę Ig-podobną i/lub jego mutein i białek fuzyjnych niniejszy wynalazek obejmuje dowolny fragment lub prekursory łańcucha polipeptydowego cząsteczki białka same lub razem z przyłączonymi do nich cząsteczkami lub resztami, np. resztami cukrowymi lub fosforanowymi albo agregaty cząsteczki białka jako takie lub agregaty z resztami cukrowymi pod warunkiem, że taka frakcja ma zasadniczo podobną aktywność do białka, takiego jak IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydaza i/lub pod warunkiem, że mają one zachowaną co najmniej jedną domenę Ig-podobną. Wynalazek dotyczy także białek zawierających domenę Ig-podobną, takich jak IL-18BP, IL6-IL6R, IL-6R i beta galaktozydaza lub ichizoformy, muteiny, białka fuzyjnego, pochodnej funkcyjnej, frakcji aktywnej lub kołowo permutowanej pochodnej, pod warunkiem, że mają one zachowaną co najmniej jedną domenę Igpodobną. Przykładami istotnych białek zawierających domeny Ig-podobne są: cząsteczki adhezyjne, takie jak NCAM (5 domen Ig-podobnych), fibronektyna typu III, ICAM-1, mad CAM-1, PE CAM-1, VCAM-1, tityna i kadheryna, neurokan, zewnątrzkomórkowe domeny receptorów cytokin, takich jak LIFR, CNTFR, IL-3R, IL5R, IL-6R, IL-12R, GM-CSFR i OSMR, receptory czynników wzrostu, takie jak receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) (7 domen Ig-podobnych), receptor czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), receptor ludzkiego płytkowego czynnika wzrostu (hpdgf), receptory związane z układem odpornościowym, takie jak receptor komórek T, białka głównego układu zgodności tkankowej (MHC), mikroglobulina-β, CTLA4 receptor cząsteczek B7 w komórkach T (dwie domeny Ig-podobne), B7 czynnik aktywujący komórek B, który reguluje proliferację komórek T i inne, takie jak neuregulina, czynnik krzepnięcia XIII, NF-κB, dysmutaza ponadtlenkowa i IL-18BP (jedna domena Ig-podobna). Termin białko wiążące IL-18 stosuje się tutaj równoznacznie z określeniem IL-18BP. Termin ten obejmuje białka wiążące IL-18, takie jak zdefiniowano w WO 99/09063 lub w pracy Novick a i wsp., 1999, w tym warianty powstające w wyniku alternatywnego składania transkryptu i/lub izoformy białek wiążących IL-18, takie jak zdefiniowane w publikacji Kim i wsp., Zwłaszcza ludzkie izoformy a i c IL-18BP są użyteczne według niniejszego wynalazku. Białka użyteczne według niniejszego wynalazku mogą być glikozylowane lub nie, mogą pochodzić ze źródeł naturalnych, takich jak mocz lub mogą być korzystnie wytwarzane metodą rekombinacji. Ekspresję rekombinacyjną można prowadzić w prokariotycznych układach ekspresyjnychjak np. w E. coli, lub w układach eukariotycznych, i korzystnie w ssaczych układach ekspresyjnych. Termin płyn biologiczny oznacza dowolny płyn uzyskany z lub zawierający komórki, składniki komórek lub produkty komórek. Płyny biologiczne obejmują, bez ograniczania, supernatanty hodowli komórkowych, lizaty 15

17 komórkowe, sklarowane lizaty komórkowe, ekstrakty komórkowe, ekstrakty tkankowe, krew, osocze, surowica, mleko, mocz, płyn z puchliny, sok roślinny, ekstrakty roślinne i ich frakcje a także frakcje pochodzące z innego etapu rozdziału chromatograficznego. Płyn biologiczny wykorzystywany jako surowy materiał w etapie wychwytu białek niebędących immunoglobulinami, które zawierają co najmniej jedną domenę Ig-podobną, według wynalazku może być zatężony, niezatężony lub rozcieńczony. Supernatanty hodowli komórkowych lub kondycjonowane komórkami podłoże hodowlane w etapie wychwytu białek niebędących immunoglobulinami, które zawierają co najmniej jedną domenę Ig-podobną, według wynalazku mogą pochodzić z komórek hodowanych w obecności surowicy, takiej jak płodowa surowica cielęca lub surowica końska, albo hodowanych w podłożu pozbawionym surowicy. Termin podłoże hodowlane kondycjonowane komórkami oznacza podłoże odżywcze, w którym były hodowane komórki i które zawiera produkty komórkowe. Przy pracy z płynami biologicznymi zawierającymi komórki, szczątki komórek itp. korzystnie uprzednio poddaje się płyn filtracji i/lub ultrawirowaniu w celu usunięcia bardzo drobnych zanieczyszczeń. Zastosowanie żywicy HCIC do wychwytywania białek niebędących immunoglobulinami, które zawierają co najmniej jedną domenę Ig-podobną można wykorzystać na większą skalę oraz korzystnie łączyć je z innymi technikami oczyszczania i zatężania, takimi jak chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa z ligandem, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia na złożach hydroksyapatytowych, ultrafiltrowanie i wytrącanie różnicowe dla uzyskania czystego białka. Liczne białka człowieka i innych ssaków, w tym, przykładowo, ludzki hormon wzrostu, ludzkie białko C, czynnik krzepliwości VII oraz IL-18BP wytworzono w komórkach gospodarza przez transfekcję tych komórek DNA kodującym te białka, hodowanie tych komórek i zebranie białka. W WO ujawniono wytwarzanie IL-18BP w komórkach ssaków. Rekombinowane białka mogą też być wytwarzane przez zwierzęta transgeniczne i wydzielane do mleka. Rekombinowane białka są wydzielane przez komórki do podłoża do hodowli komórkowej (podłoże hodowlane kondycjonowane komórkami), do mleka, albo obecne są w lizatach komórkowych i muszą być oddzielone od innych składników komórki, takich jak odpadowe produkty przemiany materii komórek, szczątki komórek, białka i inne zebrane materiały. Wychwycone za pomocą MEP HyperCel białka niebędące immunoglobulinami, które zawierają domeny Igpodobne, mogą być następnie oczyszczone za pomocą rozdziału chromatograficznego. Powszechnie stosuje się następujące rodzaje rozdziału chromatrograficznego: sączenie molekularne (GF), chromatografię jonowymienną (IEX), chromatografię oddziaływań hydrofobowych (HI), chromatografię powinowactwa oraz HPLC (wysokosprawną chromatografię cieczową). Jak opisano powyżej, oczyszczanie białka na ogół przebiega w trzech etapach: etapie wychwytu, w którym pożądane białko jest izolowane z surowego lizatu komórek lub z podłoża do hodowli komórkowej; etapie pośrednim, w którym białka są oddzielane od zanieczyszczeń o podobnym rozmiarze lub innych właściwościach fizykochemicznych i etapie ostatecznego doczyszczania( polishing ). Dla każdego etapu oczyszczania istnieją najbardziej odpowiednie dla konkretnego oczyszczanego białka techniki chromatograficzne i rozmiary ziaren złoża. Etap pośredni wymaga wyższej rozdzielczości dla lepszego rozdziału składników. Na ogół istnieje odwrotna korelacja rozmiaru ziaren złoża i rozdzielczości, zatem na tym etapie odpowiedniejsze są złoża o mniejszych 16